JPS59231097A - 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ２１ｋおよびその製造法 - Google Patents
均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ２１ｋおよびその製造法Info
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- JPS59231097A JPS59231097A JP59024943A JP2494384A JPS59231097A JP S59231097 A JPS59231097 A JP S59231097A JP 59024943 A JP59024943 A JP 59024943A JP 2494384 A JP2494384 A JP 2494384A JP S59231097 A JPS59231097 A JP S59231097A
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/362—Cation-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/145—Ultrafiltration
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- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/18—Apparatus therefor
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
各種タイプのヒト インターフェロンの中テ、免疫イン
ターフェロン（工ＦＮ−γ）は最も特徴付けされていな
い。このインターフェロンはリンパ球をマイトジェン（
有糸分裂誘発因子）または特異抗原で刺戟することによ
シ生産されるものであって、ウィルス誘発α−およびβ
−インターフェロンとはその構造および性質が重大に異
なっている。
ターフェロン（工ＦＮ−γ）は最も特徴付けされていな
い。このインターフェロンはリンパ球をマイトジェン（
有糸分裂誘発因子）または特異抗原で刺戟することによ
シ生産されるものであって、ウィルス誘発α−およびβ
−インターフェロンとはその構造および性質が重大に異
なっている。
近年、”ｐ等はリンパ球をホルボール エステル１２−
０−テトラデカノイル−ホルボール−１６アセテート（
ＴＰＡ）およびフィトヘムアグルチニン（植物性血球凝
集素）（ＰＨＡ）の組合せにょシ刺戟することにもとづ
くヒトエＦＮ−γの生産方法を報告した（１）。その後
、Ｙｉｐ等は分取Ｎａ ＤＯｄＳＯ４／ポリアクリルア
ミド グル電気泳動によシエＦＮ−γの２種のサブタイ
プを精製することができた。しかしながら、この工程中
に生物学的活性のほとんど完全な損失が生じた（２．３
）。このサグタイプは２０，０００および２５，０００
の見掛分子質量を有し、これはコマシー グルー（Ｏｏ
ｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ ）染色性帯に相当し、そして
抗原的に交差活性化性である。約４３，０００ダルトン
の見掛分子質量を有する第６の少量成分がまた検出され
た。
０−テトラデカノイル−ホルボール−１６アセテート（
ＴＰＡ）およびフィトヘムアグルチニン（植物性血球凝
集素）（ＰＨＡ）の組合せにょシ刺戟することにもとづ
くヒトエＦＮ−γの生産方法を報告した（１）。その後
、Ｙｉｐ等は分取Ｎａ ＤＯｄＳＯ４／ポリアクリルア
ミド グル電気泳動によシエＦＮ−γの２種のサブタイ
プを精製することができた。しかしながら、この工程中
に生物学的活性のほとんど完全な損失が生じた（２．３
）。このサグタイプは２０，０００および２５，０００
の見掛分子質量を有し、これはコマシー グルー（Ｏｏ
ｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ ）染色性帯に相当し、そして
抗原的に交差活性化性である。約４３，０００ダルトン
の見掛分子質量を有する第６の少量成分がまた検出され
た。
別の研究において、Ｇｒａｙ等はヒト エＦＮ−γ相補
性ＤＮＡのクローン化および説明を報告している。ヌク
レオチド配列はとの工ＦＮ−γが１４６個のアミノ酸を
有する単純ポリペプチドよシなるものであって、１７，
０００ダルトンの計算分子質量を有することを示した。
性ＤＮＡのクローン化および説明を報告している。ヌク
レオチド配列はとの工ＦＮ−γが１４６個のアミノ酸を
有する単純ポリペプチドよシなるものであって、１７，
０００ダルトンの計算分子質量を有することを示した。
さらにまた、遺伝子図書館でしらべても、その他の構造
上関連したＤＮＡ配列を見出せなかった（４）。このデ
ータは工ＦＮ−γに関して１つだけのポリペプチド配列
が存在し、そして天然工ＦＮ−γは部分的に二量体化し
ていることがあることを示唆していた。
上関連したＤＮＡ配列を見出せなかった（４）。このデ
ータは工ＦＮ−γに関して１つだけのポリペプチド配列
が存在し、そして天然工ＦＮ−γは部分的に二量体化し
ていることがあることを示唆していた。
）’＋９８ｔｋａおよびＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎは以前に
、米国特許第４，２８９，６９０ 号ＶＣ１ｘ Ｆ Ｎ
−ｒ 全均質Ｋ ｆ ７：ｒ Ｎ製および逆相高性能
液クロマトグラフィ（ＨＰＬＯ）による８種の異なるサ
グタイプの分離を開示している（５．６．７）。この方
法は工ＦＮ−γが有機溶剤および低重に対して不安定で
あるために、工ＦＮ−γの精製には適しない。最近利用
できるようになったタンパク質の分別に適するイオン交
換ＨＰＬＯカラムは工ＦＮ−γ生産物の高分割クロマト
グラフィを可能にした。
、米国特許第４，２８９，６９０ 号ＶＣ１ｘ Ｆ Ｎ
−ｒ 全均質Ｋ ｆ ７：ｒ Ｎ製および逆相高性能
液クロマトグラフィ（ＨＰＬＯ）による８種の異なるサ
グタイプの分離を開示している（５．６．７）。この方
法は工ＦＮ−γが有機溶剤および低重に対して不安定で
あるために、工ＦＮ−γの精製には適しない。最近利用
できるようになったタンパク質の分別に適するイオン交
換ＨＰＬＯカラムは工ＦＮ−γ生産物の高分割クロマト
グラフィを可能にした。
工ＦＮ−γの生産、精製および構造研究に関する最近の
科学論文は次のとお漫にまとめて示すことができる： （１） Ｙｉｐ、 Ｙ、 ｖ、、、、Ｐａｎｇ、 Ｒ
，Ｈ，Ｌ、、Ｕｒｂａｎ 。
科学論文は次のとお漫にまとめて示すことができる： （１） Ｙｉｐ、 Ｙ、 ｖ、、、、Ｐａｎｇ、 Ｒ
，Ｈ，Ｌ、、Ｕｒｂａｎ 。
Ｃ６およびＶｉｌｃｅｋ、 Ｊ、 （１９８１年）二Ｐ
ｒｏｃ。
ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、ＵＳＡ７８．１６
ｏ１〜１６０５ ； （２） Ｙｉｐ、 Ｙ、 Ｋ、、Ｂａｒｒｏｗｃｌ
ｏｕｇｈ １Ｂ、 Ｓ’、、Ｕｒｂａｎ 、 Ｏ，およ
びＶｉｌｃｅｋ、 Ｊ、 （１９８２年）：５ｃｉｅｎ
ｃｅ ２１５，４１１〜４１３；（３） Ｙｉｐ、
ｙ、 ｘ、、ＢａｒｒＯＷＣｌｏｕｇｈ 、 Ｂ、
Ｓ、、Ｕｒｂａｎ 、 Ｏ，およびＶｉｌｃｅｋ、
：ｒ、 （１９８２年）：Ｐｒ０Ｏ，Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ ７９．１８２ｏ〜１
８２４； （４） Ｇｒａｙ、 Ｐ、 Ｗ、、Ｌｅｕｎｇ、
Ｄ、 Ｎ、、Ｐｅｎｎ１ｃａ 。
ｏ１〜１６０５ ； （２） Ｙｉｐ、 Ｙ、 Ｋ、、Ｂａｒｒｏｗｃｌ
ｏｕｇｈ １Ｂ、 Ｓ’、、Ｕｒｂａｎ 、 Ｏ，およ
びＶｉｌｃｅｋ、 Ｊ、 （１９８２年）：５ｃｉｅｎ
ｃｅ ２１５，４１１〜４１３；（３） Ｙｉｐ、
ｙ、 ｘ、、ＢａｒｒＯＷＣｌｏｕｇｈ 、 Ｂ、
Ｓ、、Ｕｒｂａｎ 、 Ｏ，およびＶｉｌｃｅｋ、
：ｒ、 （１９８２年）：Ｐｒ０Ｏ，Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ ７９．１８２ｏ〜１
８２４； （４） Ｇｒａｙ、 Ｐ、 Ｗ、、Ｌｅｕｎｇ、
Ｄ、 Ｎ、、Ｐｅｎｎ１ｃａ 。
Ｄ、、Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ 、 Ｆ！、、Ｎａｊａｒ
ｉａｎ 、 Ｒ，、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ １０． Ｏ，
、Ｐｅｒｙｎｃｋ 、 Ｒ，、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ 。
ｉａｎ 、 Ｒ，、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ １０． Ｏ，
、Ｐｅｒｙｎｃｋ 、 Ｒ，、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ 。
Ｐ、 Ｊ、、Ｗａｌｌａｃｅ 、 Ｄ、 Ｍ、、Ｂｅ
ｚｇｅｒ １Ｂａ Ｌ、、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、Ａ、 Ｄ
、およびＧｏｅｄｄｅｌ 、 Ｄ、 Ｖ。
ｚｇｅｒ １Ｂａ Ｌ、、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、Ａ、 Ｄ
、およびＧｏｅｄｄｅｌ 、 Ｄ、 Ｖ。
（１９８２年） ： Ｎａｔｕｒｅ ２９５．５０３〜
５０８；（５） Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ 、 Ｍ
、、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ 、 Ｅｌ、、Ｆａｍｉｌ
ｌｅｔｔｉ 、 Ｐ、０． 、 Ｍｉｌｌｅｒ 、
Ｒ，Ｅｌ、、Ｗａｌｄｍａｎ 、 Ａ、 Ａ、およ
びＰｅ５ｔｋａＳｓ、 （１９７９年） ： Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７１
） 。
５０８；（５） Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ 、 Ｍ
、、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ 、 Ｅｌ、、Ｆａｍｉｌ
ｌｅｔｔｉ 、 Ｐ、０． 、 Ｍｉｌｌｅｒ 、
Ｒ，Ｅｌ、、Ｗａｌｄｍａｎ 、 Ａ、 Ａ、およ
びＰｅ５ｔｋａＳｓ、 （１９７９年） ： Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７１
） 。
６４０〜６４４ ：
（６） Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ 、 Ｍ、 （１９７
９年） ： Ａｎａ’ｉ。
９年） ： Ａｎａ’ｉ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、９７、１〜７ ；
（７） Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ １ Ｍ、、 Ｌｅ
ｖｙ 、 Ｗ、Ｐ、。
ｖｙ 、 Ｗ、Ｐ、。
Ｍｏ５ｃｈｅｒａ 、 Ｊ、Ａ、、 Ｌａ１−０．Ｙ
、 、 Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ。
、 、 Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ。
Ｒ，Ｄ、、Ｂａｒｔｌｅｔｔ １Ｒ，およびＰｅ５ｔｋ
＆ 、 ８゜（１９８１年） ： Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ。
＆ 、 ８゜（１９８１年） ： Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ。
２１０．６０７〜６１８゜
前記論文のいくつかはヒト免疫インターフェロンを均質
に精製したと主張しているが、生物学的活性のほとんど
完全な損失（８０〜９０％）が認められている。さらに
また。断言できるほど純粋な化合物の性質も開示された
ことはない。
に精製したと主張しているが、生物学的活性のほとんど
完全な損失（８０〜９０％）が認められている。さらに
また。断言できるほど純粋な化合物の性質も開示された
ことはない。
タンパク質の精製に高性能液クロマトグラフィを使用す
ることは一般的に当業者に既知である。
ることは一般的に当業者に既知である。
本発明はヒト免疫インターフェロンの改善された精製方
法およびかくして生成された新規な均質ヒト免疫インタ
ーフェロン（工ＦＮ−γ）に関する。
法およびかくして生成された新規な均質ヒト免疫インタ
ーフェロン（工ＦＮ−γ）に関する。
本発明の改善方法は制御されだ細孔を有するガラス上に
おけるクロマトグラフィ、限外濾過およびカチオン交換
高性能液クロマトグラフイエ程の組合せを包含し、工Ｆ
Ｎ−γの効果的な精製を達成させる。
おけるクロマトグラフィ、限外濾過およびカチオン交換
高性能液クロマトグラフイエ程の組合せを包含し、工Ｆ
Ｎ−γの効果的な精製を達成させる。
工ＦＮ−γの精製における処理工程として制御された細
孔を有するガラス上でのクロマトグラフィを使用するこ
とは当技術で既知であった（前記引用文献２．３参照）
、）限外濾過は以前に、タンパク質の濃縮および脱塩に
広く使用されていた。かなシの場合に、限外濾過は限外
濾過膜のカット−オフ値よシ小さい分子量を有するペゾ
チドおよびタンパク質の除去に使用できる。、Ｍｏｎｏ
−８カチオン交換ＨＰＬＯカラムは特にタンパク質の分
別用にＰｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓにより設計され、市販されているものである。しか
しながら、工ＦＮ−ｒの分別用に、制御された細孔を有
するガラス クロマトグラフィおよび限外濾過と組合せ
て、これらのＨＰＬＣ！カラムは使用されたことはない
か、またはその使用が示唆されたこともない。
孔を有するガラス上でのクロマトグラフィを使用するこ
とは当技術で既知であった（前記引用文献２．３参照）
、）限外濾過は以前に、タンパク質の濃縮および脱塩に
広く使用されていた。かなシの場合に、限外濾過は限外
濾過膜のカット−オフ値よシ小さい分子量を有するペゾ
チドおよびタンパク質の除去に使用できる。、Ｍｏｎｏ
−８カチオン交換ＨＰＬＯカラムは特にタンパク質の分
別用にＰｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓにより設計され、市販されているものである。しか
しながら、工ＦＮ−ｒの分別用に、制御された細孔を有
するガラス クロマトグラフィおよび限外濾過と組合せ
て、これらのＨＰＬＣ！カラムは使用されたことはない
か、またはその使用が示唆されたこともない。
工ＦＮ−γの国際標準はまだ存在しないので、本発明の
全体にわたって示されている生物学的活性はＮａｔｉｏ
ｎａｌ工ｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （
Ｂｅｔｈｅｓｄａ 。
全体にわたって示されている生物学的活性はＮａｔｉｏ
ｎａｌ工ｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （
Ｂｅｔｈｅｓｄａ 。
Ｍａｒｙｌａｎｄ、 、 Ｕ、ｓ、Ａ、 ）にょシ供
給されているインｐ −７ｘ ｏ ７− （ｚ参照標準
Ｇ−０２３−９０１−５２７を基準にし、ヒトＷ工ＳＨ
細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
！ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｏａｔ、 ＮＯ，Ｃ！ＯＬ −
２３）および水胞性口内炎ウィルスをウィルス細胞変性
作用の阻止に基づく分析に使用した。その他のセルライ
ン、その他のウィルス、およびその他の標準の使用が非
常に広範囲の比活性値全与えうろことは当業者にとって
一般に既知である。もう１つの変数には種々の方法で測
定できるタンパク質含有量がある。本発明におけるタン
パク質含有量は絶対方法として広く受容されているアミ
ノ酸分析に基づいて測定した。
給されているインｐ −７ｘ ｏ ７− （ｚ参照標準
Ｇ−０２３−９０１−５２７を基準にし、ヒトＷ工ＳＨ
細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
！ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｏａｔ、 ＮＯ，Ｃ！ＯＬ −
２３）および水胞性口内炎ウィルスをウィルス細胞変性
作用の阻止に基づく分析に使用した。その他のセルライ
ン、その他のウィルス、およびその他の標準の使用が非
常に広範囲の比活性値全与えうろことは当業者にとって
一般に既知である。もう１つの変数には種々の方法で測
定できるタンパク質含有量がある。本発明におけるタン
パク質含有量は絶対方法として広く受容されているアミ
ノ酸分析に基づいて測定した。
粗製工ＦＮ−γ製剤に対して制御されだ細孔を有するガ
ラス クロマトグラフィを使用すると、約４倍の精製が
達成される。すなわち、この工程によシ生成された工Ｆ
Ｎ−γは約２ Ｘ １０５単位／Ｉｎｙの比活性を有す
る。制御された細孔を有するガラス（０ＰＧ）処理には
、次の方法を使用できる。
ラス クロマトグラフィを使用すると、約４倍の精製が
達成される。すなわち、この工程によシ生成された工Ｆ
Ｎ−γは約２ Ｘ １０５単位／Ｉｎｙの比活性を有す
る。制御された細孔を有するガラス（０ＰＧ）処理には
、次の方法を使用できる。
ＣＰＧビーズをポリプロピレン遠心用ビン中ノＩＦＮ−
ｒ 含有培養物上澄液（３，０００〜１６０００単位／
ゴ：８〜２０ Ｘ １０’単位／ｍｇ）に１＝粍〇（容
量／容量）の比率で加える。混合物を４℃で６時間攪拌
し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、次いでビ
ーズをシリコン化ガラス カラムに詰める。このカラム
を先ず数カラム容量のリン酸塩緩衝塩類溶液で洗浄し、
次いで工ＦＮ−γを０．５Ｍテトラメチルアンモニウム
クロリド（ｐＨ７）によシ溶出する。
ｒ 含有培養物上澄液（３，０００〜１６０００単位／
ゴ：８〜２０ Ｘ １０’単位／ｍｇ）に１＝粍〇（容
量／容量）の比率で加える。混合物を４℃で６時間攪拌
し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、次いでビ
ーズをシリコン化ガラス カラムに詰める。このカラム
を先ず数カラム容量のリン酸塩緩衝塩類溶液で洗浄し、
次いで工ＦＮ−γを０．５Ｍテトラメチルアンモニウム
クロリド（ｐＨ７）によシ溶出する。
ご本ん
テトラメチルアンモニウム クロリドＣＰＧからの溶出
によシ得られた、生成する精製インターフェロンは約２
Ｘ １０’単位／ηの比活性を示し、回収率は約５０
〜１００％である。０ＰＧ−クロマドグラフィからの工
ＦＮ−γ活性を含有するクラクションを集め、ＰＭ−１
０膜（Ａｍ１ｃｏｎ ）上での限外濾過によシ塩を除去
する。保持クラクションを数容量の２ｍＭリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７，４）で洗浄し、元の培養物容量の約０．
５％まで濃縮する。不溶性タンパク質を遠心分離にょシ
除去し、清明な上澄液を使用時まで＋４℃で保存する。
によシ得られた、生成する精製インターフェロンは約２
Ｘ １０’単位／ηの比活性を示し、回収率は約５０
〜１００％である。０ＰＧ−クロマドグラフィからの工
ＦＮ−γ活性を含有するクラクションを集め、ＰＭ−１
０膜（Ａｍ１ｃｏｎ ）上での限外濾過によシ塩を除去
する。保持クラクションを数容量の２ｍＭリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７，４）で洗浄し、元の培養物容量の約０．
５％まで濃縮する。不溶性タンパク質を遠心分離にょシ
除去し、清明な上澄液を使用時まで＋４℃で保存する。
限外濾過により得られた生成するインターフェロン濃縮
物は９ Ｘ １０５単位／ｍｙの比活性を示し、回収率
は約６０〜１００％である。
物は９ Ｘ １０５単位／ｍｙの比活性を示し、回収率
は約６０〜１００％である。
限外濾過により生成されたインターフェロン濃縮物をさ
らに精製するために、このインターフェロンを高分割能
を有するカチオン交換高圧液クロマトグラフィ（ＨＰＬ
Ｏ）工程に１回または２回通す。この液クロマトグラフ
イエ程では、スルホアルキル基が結合している単分散有
機重合体系マトリックスを含有するカラムを使用する。
らに精製するために、このインターフェロンを高分割能
を有するカチオン交換高圧液クロマトグラフィ（ＨＰＬ
Ｏ）工程に１回または２回通す。この液クロマトグラフ
イエ程では、スルホアルキル基が結合している単分散有
機重合体系マトリックスを含有するカラムを使用する。
これらのカラムは順次的に、および…勾配およびイオン
強度勾配の変化する条件下におよびエチレングリコール
のような種々の安定化剤の存在下に使用できるものであ
って、ヒト免疫インターフェロンをナトリウム−硫酸ド
デシル（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド デル電気泳動に
おける単一吸収帯、および活性およびタンパク質レベル
についてスーパーインポーズできるＨＰＬｃでの一定の
比活性および単一ピークを得ることにより測定して、均
質に精製できる。
強度勾配の変化する条件下におよびエチレングリコール
のような種々の安定化剤の存在下に使用できるものであ
って、ヒト免疫インターフェロンをナトリウム−硫酸ド
デシル（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド デル電気泳動に
おける単一吸収帯、および活性およびタンパク質レベル
についてスーパーインポーズできるＨＰＬｃでの一定の
比活性および単一ピークを得ることにより測定して、均
質に精製できる。
本発明を実施する際に使用する有機マトリックスカチオ
ン−交換ＨＰＬＯカラムは市販物品である。適当なカラ
ムはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ（Ｕｐｐｓａｌａ 、 Ｓｗｅｄｅｎ ）にょシ生
産され、市販されているＭｏｎｏ −８である。前記カ
ラムを使用する高圧液クロマトグラフィ系はＰｈａｒｍ
ａｃｉａ、Ｖａｒｉａｎ 、 Ｂｅｃｋｍａｎ 、
Ｗａｔｅｒｓ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍａｒｓ等のような
多くの製造業者から入手できる。
ン−交換ＨＰＬＯカラムは市販物品である。適当なカラ
ムはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ（Ｕｐｐｓａｌａ 、 Ｓｗｅｄｅｎ ）にょシ生
産され、市販されているＭｏｎｏ −８である。前記カ
ラムを使用する高圧液クロマトグラフィ系はＰｈａｒｍ
ａｃｉａ、Ｖａｒｉａｎ 、 Ｂｅｃｋｍａｎ 、
Ｗａｔｅｒｓ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍａｒｓ等のような
多くの製造業者から入手できる。
本発明において、ＨＰＬＯカラムからのインター７エロ
ンーγの溶出に好適な緩衝系はＰＨ７，０の１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム−２ｏ％（容量／容量）エチレングリコ
ールである。処理は約１ｏ〜約１０００ＰＳ工の中圧で
行なう。標準５Ｘ５０ｍｍカラムに使用する流速は０．
１〜１．０ｍｌ／分であシ、処理は一１０℃〜＋６０℃
の温度範囲で実施できる。インターフェロン−γ（０，
１７Ｑ〜１０ｍ９タンパク質）はとのカラムに吸着させ
、次いで増大する塩濃度勾配を使用して選択的様式で順
次溶出する。この目的に適する塩としては、Ｎａ（Ｊ
、ＫＣＪ、ＭｇＣｆ２ 、Ｍｇ８０４ 、テトラメチル
アンモニウム クロリド等を包含する。分離は約ＰＨ５
〜約ＰＨ８，５で変化するＰ［′１値範囲のいづれかで
達成できる。別法として、塩濃度を一定に保持し、ＰＨ
をｐＨ５〜ＰＨ１０の間で増加勾配にして変えることも
できる。同じカラムにおいて前記で概述した中で同じ条
件または異なる条件のどちらかで２回または６回以上連
続分別すること（Ｃよりさらに精製することができる。
ンーγの溶出に好適な緩衝系はＰＨ７，０の１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム−２ｏ％（容量／容量）エチレングリコ
ールである。処理は約１ｏ〜約１０００ＰＳ工の中圧で
行なう。標準５Ｘ５０ｍｍカラムに使用する流速は０．
１〜１．０ｍｌ／分であシ、処理は一１０℃〜＋６０℃
の温度範囲で実施できる。インターフェロン−γ（０，
１７Ｑ〜１０ｍ９タンパク質）はとのカラムに吸着させ
、次いで増大する塩濃度勾配を使用して選択的様式で順
次溶出する。この目的に適する塩としては、Ｎａ（Ｊ
、ＫＣＪ、ＭｇＣｆ２ 、Ｍｇ８０４ 、テトラメチル
アンモニウム クロリド等を包含する。分離は約ＰＨ５
〜約ＰＨ８，５で変化するＰ［′１値範囲のいづれかで
達成できる。別法として、塩濃度を一定に保持し、ＰＨ
をｐＨ５〜ＰＨ１０の間で増加勾配にして変えることも
できる。同じカラムにおいて前記で概述した中で同じ条
件または異なる条件のどちらかで２回または６回以上連
続分別すること（Ｃよりさらに精製することができる。
溶出液の分別は２１０〜２８０ ｎｍの範囲、好ましく
は２１０ ｎｍまたは２８０ ｎｍの波長で作動する紫
外線検知器のようなタンパク質監視器により、分別中の
タンパク質含有量を付随監視するそれ自体既知の方法で
フラクション採集器を使用して行なう。
は２１０ ｎｍまたは２８０ ｎｍの波長で作動する紫
外線検知器のようなタンパク質監視器により、分別中の
タンパク質含有量を付随監視するそれ自体既知の方法で
フラクション採集器を使用して行なう。
シリカおよびガラスに対する吸着による工ＦＮ−γの損
失が可能であるので、本発明で使用する全ての管、容器
および試験管はテフロン、ポリプロピレンまたはポリエ
チレンのいづれかかう作る。
失が可能であるので、本発明で使用する全ての管、容器
および試験管はテフロン、ポリプロピレンまたはポリエ
チレンのいづれかかう作る。
高度に精製された生成物はポリプロピレン試験管で２０
％（容量／容量）エチレングリコールの存在下に＋４℃
で保存した場合に最も安定である。
％（容量／容量）エチレングリコールの存在下に＋４℃
で保存した場合に最も安定である。
生物学的活性の有意の損失が反復凍結−解凍サイクルで
検出される。
検出される。
０．１５．０．２０．０．２５および０．２６モルのＮ
ａＣ１濃度で溶出して（ｐＨ７，０）、生物学的活性の
４つの主要ピークが２０〜４０％の総画収率で得られる
。この分離は非変性条件下に行なわれるので、各ピーク
はｆ（ｕ工ＦＮ−γの異なるザブタイプを示している。
ａＣ１濃度で溶出して（ｐＨ７，０）、生物学的活性の
４つの主要ピークが２０〜４０％の総画収率で得られる
。この分離は非変性条件下に行なわれるので、各ピーク
はｆ（ｕ工ＦＮ−γの異なるザブタイプを示している。
β−メルカプトエタノールの存在または不存在のどちら
かでＨａ Ｄｏｄ、 Ｓｏ、−ポリアクリルアミド ケ
９ル電気泳動によシ分析すると、０．２５ Ｍおよび０
．２６ Ｍ ＮａＣＪで溶出するピークは２６．０００
（２６Ｋ ）および２１，０００（２１Ｋ）の見掛分
子質量をそれぞれ有する単一タンノ々り質吸収帯を含有
することが判シ、他方、０．１５Ｍおよび０．２０ Ｍ
のピークは純度が低い。２６におよび２１にの両すグタ
イゾの比活性は７ Ｘ １０６単位／Ｉｎ９であった。
かでＨａ Ｄｏｄ、 Ｓｏ、−ポリアクリルアミド ケ
９ル電気泳動によシ分析すると、０．２５ Ｍおよび０
．２６ Ｍ ＮａＣＪで溶出するピークは２６．０００
（２６Ｋ ）および２１，０００（２１Ｋ）の見掛分
子質量をそれぞれ有する単一タンノ々り質吸収帯を含有
することが判シ、他方、０．１５Ｍおよび０．２０ Ｍ
のピークは純度が低い。２６におよび２１にの両すグタ
イゾの比活性は７ Ｘ １０６単位／Ｉｎ９であった。
粗製またはいづれかの精製工ＦＮ−γサシタイプを非変
性条件下にＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４カラムでデ
ル濾過により分析すると、４５．０００ダルトンの分子
質量に相当する比活性のピークが得られる。サグタイプ
２６におよび２１にのアミノ酸分析はＧｒａｙ等により
開示されている（前記文献４ ）ｃＤＮＡクローンの順
序から計算した理論値と一般的類似を示した。しかしな
がら、プロリン、グリシンおよびパニルアラニンのレベ
ルにおける有意の差違が見られた。サグタイプ２６にお
よび２１にはほとんど同一のアミノ酸組成およびヘプチ
ドマップを示した。
性条件下にＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４カラムでデ
ル濾過により分析すると、４５．０００ダルトンの分子
質量に相当する比活性のピークが得られる。サグタイプ
２６におよび２１にのアミノ酸分析はＧｒａｙ等により
開示されている（前記文献４ ）ｃＤＮＡクローンの順
序から計算した理論値と一般的類似を示した。しかしな
がら、プロリン、グリシンおよびパニルアラニンのレベ
ルにおける有意の差違が見られた。サグタイプ２６にお
よび２１にはほとんど同一のアミノ酸組成およびヘプチ
ドマップを示した。
インターフェロン−γは抗ウィルス活性、抗細胞活性、
天然および抗体依存キラー細胞（ｋｉｌｌ−ｅｒｃｅｌ
’ｌ ）活性に対抗子る能力、成る種のＨＬＡ表面マー
カー抗原を誘発させる能力を示した。これらの活性は多
くの生物学的活性リンホカインを含有する比較的粗製の
製剤によっても得られている。
天然および抗体依存キラー細胞（ｋｉｌｌ−ｅｒｃｅｌ
’ｌ ）活性に対抗子る能力、成る種のＨＬＡ表面マー
カー抗原を誘発させる能力を示した。これらの活性は多
くの生物学的活性リンホカインを含有する比較的粗製の
製剤によっても得られている。
本発明の精製された均質ヒト免疫インターフェロンは工
ＦＮ−γ固有に属するこれらの活性の同定に使用できる
。本発明の精製工ＦＮ−γを含有する製剤は種々のウィ
ルス性および腫瘍性病気におけるそれらの有用性を評価
するだめの臨床研究に使用できる。
ＦＮ−γ固有に属するこれらの活性の同定に使用できる
。本発明の精製工ＦＮ−γを含有する製剤は種々のウィ
ルス性および腫瘍性病気におけるそれらの有用性を評価
するだめの臨床研究に使用できる。
本発明の方法および生成物を次側によシさらに説明する
。
。
例１
ヒト１ＦＮ−γの生産
単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（ｇｒａ
ｄｉｅｎｔ ）上での遠心分離（４００Ｘｇ；３０分）
によシ野牛皮（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔｓ ）から単離す
る。血清を含有しないＲＰＭｌ−１６４０メジユウム中
の単核細胞ノ培養物（５ｘ １０６／１ｎｌりに１２−
〇−テトラデカノイル ホルボール−１６−アセテート
（５μｇ／ｍｌ）および精製フイトヘムアグルテニン（
５μｇ／ｍｌ＞を添加することによシエＦＮ−γを産生
させる。６７℃および５％ＣＯ２雰囲気で２４時間イン
キュベーションした後に、細胞を塩心分離によシ除去し
、培養物上澄液を採取し、＋４℃で保存する。
ｄｉｅｎｔ ）上での遠心分離（４００Ｘｇ；３０分）
によシ野牛皮（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔｓ ）から単離す
る。血清を含有しないＲＰＭｌ−１６４０メジユウム中
の単核細胞ノ培養物（５ｘ １０６／１ｎｌりに１２−
〇−テトラデカノイル ホルボール−１６−アセテート
（５μｇ／ｍｌ）および精製フイトヘムアグルテニン（
５μｇ／ｍｌ＞を添加することによシエＦＮ−γを産生
させる。６７℃および５％ＣＯ２雰囲気で２４時間イン
キュベーションした後に、細胞を塩心分離によシ除去し
、培養物上澄液を採取し、＋４℃で保存する。
例２
０ＰＧビーズをポリプロピレン遠心用管中の工ＦＮ−γ
含有培養物上澄液（３，０００〜１６，０００単位／ｍ
ｌ ； ８〜２０ ｘ １０’単位／ｍｌ）に１：１０
０（容量／容量）の比率で加える。混合物を４℃で６時
間保持し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、ビ
ーズをシリコン化ガラス カラムに詰める。とのカラム
を先ず数カラム容量のリン酸塩緩衝塩類溶液で洗浄し、
次いで工ＦＮ−γを０．５Ｍテトラメチル アンモニウ
ム クロリド（ＰＨ７）によシ溶出する。０ＰＧ−クロ
マトグラフィから工ＦＮ−γ活性を含有するクラクショ
ンを集め、塩をＰＭ −１Ｑ膜（Ａｍ１ｃｏｎ ）上で
の限外濾過によシ除去する。保持７ラクシヨンを数容量
の２１１１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７−４）で洗浄し
、次いで元の培養物容量の約０．５％に濃縮する。不溶
性タンパク質を遠心分離によシ除去し、清明な上澄液を
使用時まで＋４℃で保存する。
含有培養物上澄液（３，０００〜１６，０００単位／ｍ
ｌ ； ８〜２０ ｘ １０’単位／ｍｌ）に１：１０
０（容量／容量）の比率で加える。混合物を４℃で６時
間保持し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、ビ
ーズをシリコン化ガラス カラムに詰める。とのカラム
を先ず数カラム容量のリン酸塩緩衝塩類溶液で洗浄し、
次いで工ＦＮ−γを０．５Ｍテトラメチル アンモニウ
ム クロリド（ＰＨ７）によシ溶出する。０ＰＧ−クロ
マトグラフィから工ＦＮ−γ活性を含有するクラクショ
ンを集め、塩をＰＭ −１Ｑ膜（Ａｍ１ｃｏｎ ）上で
の限外濾過によシ除去する。保持７ラクシヨンを数容量
の２１１１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７−４）で洗浄し
、次いで元の培養物容量の約０．５％に濃縮する。不溶
性タンパク質を遠心分離によシ除去し、清明な上澄液を
使用時まで＋４℃で保存する。
例６
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＯ）ＨＰＬＯはＡｌ
ｔｅｘ Ｍｏｄｅｌ ３３０液クロマトグラフ（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ工ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ）上で行なう。ＭＯ
ｎｏ−８ＨＰＬＯカチオン−交換カラム（５Ｘ ５０
ｍｍ）をｉＱｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）−２
０％（容量／容量）エチレン−グリコール（緩衝剤Ａ）
で平衡にする。前記工程からの工ＦＮ−γ生成物を０．
５ｍ／／分の流速で加える。カラムを次いで緩衝剤Ａで
６０分間、次いで緩衝剤Ａ中にＮａＣＪを直藏勾配（０
〜４００ ｍＭ ）で含有する液で６０分間洗浄する。
ｔｅｘ Ｍｏｄｅｌ ３３０液クロマトグラフ（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ工ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ）上で行なう。ＭＯ
ｎｏ−８ＨＰＬＯカチオン−交換カラム（５Ｘ ５０
ｍｍ）をｉＱｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）−２
０％（容量／容量）エチレン−グリコール（緩衝剤Ａ）
で平衡にする。前記工程からの工ＦＮ−γ生成物を０．
５ｍ／／分の流速で加える。カラムを次いで緩衝剤Ａで
６０分間、次いで緩衝剤Ａ中にＮａＣＪを直藏勾配（０
〜４００ ｍＭ ）で含有する液で６０分間洗浄する。
各７ラクシヨン（ｉｍＩりを次いでタンパク質標準とし
て仔牛血清アルグミンを使用して、工ＦＮ−γ活性およ
びタンパク質含有量について分析ｆる。エチレン グリ
コールが溶出緩衝剤中に含まれている場合にだけ高度の
分割が達成された。
て仔牛血清アルグミンを使用して、工ＦＮ−γ活性およ
びタンパク質含有量について分析ｆる。エチレン グリ
コールが溶出緩衝剤中に含まれている場合にだけ高度の
分割が達成された。
０．１５ Ｍ、 ０．２０ Ｍ、 ０．２５ Ｍおよび
０．２６ ＭのＮａ（Ｊ濃度で溶出する生物学的活性の
数ピークが連続的に得られる。通常、０．２５Ｍにおけ
るピークが最も支配的である。０．２５ Ｍおよび０．
２６ Ｍにおける生物学的活性のピークは２種の異なる
タンパク質ピークを付随し、種々の生成物におけるそれ
らの比活性は７ Ｘ １０６単位／Ｉｎ９であった。低
い方のＮａＣＪ濃度（０，１５Ｍおよび０．２０ Ｍ
）における生物学的活性のピークは比活性がさらに低く
、分離したタンパク質ピークを付随しない。生物学的活
性の総画収率は最後の工程で主として損失が生じて、２
０〜４０チであった。
０．２６ ＭのＮａ（Ｊ濃度で溶出する生物学的活性の
数ピークが連続的に得られる。通常、０．２５Ｍにおけ
るピークが最も支配的である。０．２５ Ｍおよび０．
２６ Ｍにおける生物学的活性のピークは２種の異なる
タンパク質ピークを付随し、種々の生成物におけるそれ
らの比活性は７ Ｘ １０６単位／Ｉｎ９であった。低
い方のＮａＣＪ濃度（０，１５Ｍおよび０．２０ Ｍ
）における生物学的活性のピークは比活性がさらに低く
、分離したタンパク質ピークを付随しない。生物学的活
性の総画収率は最後の工程で主として損失が生じて、２
０〜４０チであった。
例４
タンパク質資料を先ず２ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７
，４）に対して透析し、８ｐｅｅｄｖａｃ ０ｏｎｃｅ
ｎｔ−ｒａｔｏｒ （Ｅｌａｖａｎｔ ）中で乾燥させ
、２チβ−メルカプトエタノールを含有する新たに製造
した試料緩衝液に溶解し、１００℃で５分間加熱する。
，４）に対して透析し、８ｐｅｅｄｖａｃ ０ｏｎｃｅ
ｎｔ−ｒａｔｏｒ （Ｅｌａｖａｎｔ ）中で乾燥させ
、２チβ−メルカプトエタノールを含有する新たに製造
した試料緩衝液に溶解し、１００℃で５分間加熱する。
１５％ポリアクリルアミドのスラグ デルを使用する。
電気泳動の後に、タンパク質吸収帯がＯｏｏｍａｓｓｉ
ｅ ｂｌｕθまたは銀染色のどちらかにより目に見える
。０．２６ Ｍ塩で溶出するクラクションは２１，００
０ダルトンの見掛分子質量を有する単一タンパク質吸収
帯を示した（サグタイプ２１にλ０．２５ Ｍ塩で溶出
する７ラクシヨンは２６，０００の見掛分子質量を有す
る主要タンパク質吸収帯を示すが、非常に低い分子質量
の若干の少量吸収帯が場合によシ見られる（サグタイプ
２６Ｋ）。このクラクションを同じＨＰＬＯカラム上で
再クロマトグラフィ処理すると、これらの汚染物を除去
できる。低い塩濃度（０，１５〜０．２０ Ｍ ）で溶
出する生物学的活性のピークはＭｒ ２６０００に相当
する吸収帯を含む数個の主要タンパク質吸収帯を示した
。ピーク２１におよび２６にの見掛分子質量はデル電気
泳動前のβ−メルカゾトエタノールによる処理によシ影
響されない。
ｅ ｂｌｕθまたは銀染色のどちらかにより目に見える
。０．２６ Ｍ塩で溶出するクラクションは２１，００
０ダルトンの見掛分子質量を有する単一タンパク質吸収
帯を示した（サグタイプ２１にλ０．２５ Ｍ塩で溶出
する７ラクシヨンは２６，０００の見掛分子質量を有す
る主要タンパク質吸収帯を示すが、非常に低い分子質量
の若干の少量吸収帯が場合によシ見られる（サグタイプ
２６Ｋ）。このクラクションを同じＨＰＬＯカラム上で
再クロマトグラフィ処理すると、これらの汚染物を除去
できる。低い塩濃度（０，１５〜０．２０ Ｍ ）で溶
出する生物学的活性のピークはＭｒ ２６０００に相当
する吸収帯を含む数個の主要タンパク質吸収帯を示した
。ピーク２１におよび２６にの見掛分子質量はデル電気
泳動前のβ−メルカゾトエタノールによる処理によシ影
響されない。
Ｍｏｎｏ −Ｓ カラムからの工ＦＮ−７含有（１０
〜３０μｙ）試料にアセトン（４〜５容量）を加える。
〜３０μｙ）試料にアセトン（４〜５容量）を加える。
混合物を一２０℃で６〜１６時間放置し、回転処理しく
１３，０００ｘ、！ｉ／；５分間）、沈殿を減圧で乾燥
させる。アミノ酸分析は加水分解（６Ｎａｃに１１０℃
；２４時間）の後にＤｕｒｒｕｍ ５ Ｑ Ｏ分析機で
行なった。セリンまたはセレオニンについての補正は行
なわない。サグタイプ２１におよび２６にの両ザグタイ
プのアミノ酸分析は遺伝子の配列から計算されたものと
全く類似の結果を与えた。グリシンの高い含有量は多分
、汚染物質および加水分解中のその他のアミノ酸の分解
によるものである。
１３，０００ｘ、！ｉ／；５分間）、沈殿を減圧で乾燥
させる。アミノ酸分析は加水分解（６Ｎａｃに１１０℃
；２４時間）の後にＤｕｒｒｕｍ ５ Ｑ Ｏ分析機で
行なった。セリンまたはセレオニンについての補正は行
なわない。サグタイプ２１におよび２６にの両ザグタイ
プのアミノ酸分析は遺伝子の配列から計算されたものと
全く類似の結果を与えた。グリシンの高い含有量は多分
、汚染物質および加水分解中のその他のアミノ酸の分解
によるものである。
ＩＦＮ−γのアミノ酸組成
アミノ酸 サグタイプ２１Ｋ サグタイプ２６ＫＡ
８Ｘ １４．６±１．３ １６．５±０．４Ｔ
ｈｒ ７−９±０．４ ７．４±０．
６８ｅｒ ９ 、１±１．４ １０．８
±１．０ＧＩＸ １５−６±０．７ １６．４
±１．４Ｐｒｏ ９．７±１．４ｓ、ｏ 、：ｌ
：０．４Ｇｌｙ １４．４ ±０．３ １
４．３ ±１．９Ａｌａ １２．０ ±１．５
１１．３ ｆ Ｏ，７Ｃ！ｙｓ、 ０．６
ｆ Ｏ，５０，６ｆ Ｏ，４Ｖａｌ ７ 、
４±０．７ ８．９±０．９ｎｅｔ ２
．３±１．０ ０．８±０．６エｌｅ５．Ｑ±０．
３ ６．０±０．３Ｌｅｕ ９．２ ±０
．３ １２．９ ±０．１Ｔｙｒ ２ 、
９±０．４ ２．１±ｏ、１Ｐｈｅ ４
．９ ±１−０ ５．２ ±０−８Ｈ１ｓ
５．５±０．７ ２．２±０．３Ｌｙｓ
２０．３ ±０．４ １３．６ ±３．ＩＡｒｇ
５．７ ｆ Ｏ，４、８，４±１．０例５ ７×１０６単位／ｍｇの比活性を有する均質ヒト免疫イ
ンターフェロン サブタイプ２６に総量１０９を正常血
清アルジミン（ヒト）ＵＳＰ ３５ｍに溶解する。溶液
をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して２〜６変化させて透析
して低分子量汚染物質を除去し、次いで細菌学的フィル
ターに通す。濾過した溶液を１４０のバイアル中に吸引
によシ分配する。各バイアルは非経口投与に適する純粋
インターフェロン５×１０５単位を含有する。これらの
バイアルは使用前は冷所（−２０°〜−７０℃）で保存
すると好ましい。
８Ｘ １４．６±１．３ １６．５±０．４Ｔ
ｈｒ ７−９±０．４ ７．４±０．
６８ｅｒ ９ 、１±１．４ １０．８
±１．０ＧＩＸ １５−６±０．７ １６．４
±１．４Ｐｒｏ ９．７±１．４ｓ、ｏ 、：ｌ
：０．４Ｇｌｙ １４．４ ±０．３ １
４．３ ±１．９Ａｌａ １２．０ ±１．５
１１．３ ｆ Ｏ，７Ｃ！ｙｓ、 ０．６
ｆ Ｏ，５０，６ｆ Ｏ，４Ｖａｌ ７ 、
４±０．７ ８．９±０．９ｎｅｔ ２
．３±１．０ ０．８±０．６エｌｅ５．Ｑ±０．
３ ６．０±０．３Ｌｅｕ ９．２ ±０
．３ １２．９ ±０．１Ｔｙｒ ２ 、
９±０．４ ２．１±ｏ、１Ｐｈｅ ４
．９ ±１−０ ５．２ ±０−８Ｈ１ｓ
５．５±０．７ ２．２±０．３Ｌｙｓ
２０．３ ±０．４ １３．６ ±３．ＩＡｒｇ
５．７ ｆ Ｏ，４、８，４±１．０例５ ７×１０６単位／ｍｇの比活性を有する均質ヒト免疫イ
ンターフェロン サブタイプ２６に総量１０９を正常血
清アルジミン（ヒト）ＵＳＰ ３５ｍに溶解する。溶液
をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して２〜６変化させて透析
して低分子量汚染物質を除去し、次いで細菌学的フィル
ターに通す。濾過した溶液を１４０のバイアル中に吸引
によシ分配する。各バイアルは非経口投与に適する純粋
インターフェロン５×１０５単位を含有する。これらの
バイアルは使用前は冷所（−２０°〜−７０℃）で保存
すると好ましい。
例６
７×１０６単位／ｍｙの比活性を有する均質ヒト免疫イ
ンターフェロン サブタイプ２１に総量１０〜を正常面
前アルグミン（ヒ） ）ＵＳＰ ３５ｍＪに溶解する。
ンターフェロン サブタイプ２１に総量１０〜を正常面
前アルグミン（ヒ） ）ＵＳＰ ３５ｍＪに溶解する。
溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して２〜６変化させて
透析し、低分子量汚染物質を除去し、次いで細菌学的フ
ィルターに通す。濾過した溶液を１４０のバイアルに吸
引によシ分配する。各バイアルは非経口投与に適する純
粋インターフェロン５ Ｘ １０５単位を含有する。こ
れらのバイアルは使用前は、冷所（−２０°Ｃ〜−７０
°Ｃ）で保存すると好ましい。
透析し、低分子量汚染物質を除去し、次いで細菌学的フ
ィルターに通す。濾過した溶液を１４０のバイアルに吸
引によシ分配する。各バイアルは非経口投与に適する純
粋インターフェロン５ Ｘ １０５単位を含有する。こ
れらのバイアルは使用前は、冷所（−２０°Ｃ〜−７０
°Ｃ）で保存すると好ましい。
例７
両方共に７ Ｘ １０６単位／ｍｇの比活性を有する均
質ヒト免疫インターフェロン サブタイプ２１に５ダお
よび均質ヒト免疫インターフェロン ザブタイプ２６に
５１ｎ９の組合せを正常血清アルブミン（ヒ））ＵＳＰ
３５ｒｍに溶解する。溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対
して２〜６変化させて透析して、低分子量汚染物質を除
去し、次いで細菌学的フィルターに通す。濾過した溶液
を１４０のバイアルに吸引によシ分配する。各バイアル
は非経口投与に適する純粋インターフェロン５×１０５
単位を含有する。これらのバイアルは使用前は冷所（−
２０℃〜−７０℃）で保存すると好ましい。
質ヒト免疫インターフェロン サブタイプ２１に５ダお
よび均質ヒト免疫インターフェロン ザブタイプ２６に
５１ｎ９の組合せを正常血清アルブミン（ヒ））ＵＳＰ
３５ｒｍに溶解する。溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対
して２〜６変化させて透析して、低分子量汚染物質を除
去し、次いで細菌学的フィルターに通す。濾過した溶液
を１４０のバイアルに吸引によシ分配する。各バイアル
は非経口投与に適する純粋インターフェロン５×１０５
単位を含有する。これらのバイアルは使用前は冷所（−
２０℃〜−７０℃）で保存すると好ましい。
代理人 浅 村 皓
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） ヒト免疫インターフェロン（工ＦＮ−γ）サ
グタイプ２６におよび２１Ｋを実質的に均質なタンパク
質として製造する方法であって、 ａ）不純な状態の（工ＦＮ−γ）の水溶液を制御された
細孔を有するガラス材料と混合して、インターフェロン
をこの吸着剤上に吸着させ、その後、この吸渚剤からイ
ンターフェロンを溶出し、この溶出液の選ばれたクラク
ション中に増大した純度の状態でインターフェロンを採
取し、ｂ）工程ａ）で得られた選ばれたフラクションを
約ｉ ｏ、ｏ ｏ ｏダルトンの分子量カット−オフ値
を有する膜上での限外濾過により濃縮し、この膜に保持
されているクラクション中におけるさらに高い濃度およ
び増大した純度の状態でのインターフェロンを採取し； Ｃ）工程ｂ）で得られたクラクションを低イオン強度緩
衝剤で平衡化されている有機基材性カチオン交換マトリ
ックスに通し、その後、このカラムから増加する塩濃度
勾配を用いてインターフェロンを溶出し、この溶出液の
選ばれたクラクション中の数種の異なるピークとして、
工ＮＦ−γのサグタイプ２６におよび２１Ｋを均質タン
パク質状態で得る； 工程の組合せからなる方法。 （２） カラムがＭｏｎｏ −Ｓ カチオン交換カ
ラムであシ、緩衝剤が２０％（容量／容量）エチレン
グリコールを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ
７−０）であシ、そして勾配力０〜４００ ｍＭの直線
状に増加させたＮａＣＪ濃度の６０分である特許請求の
範囲第１項の方法。 （３） 工ＦＮ−γサグタイプ２６Ｋを含有する集め
た活性フラクションをＭｏｎｏ −Ｅｌ カラムで再
クロマトグラフィ処理する特許請求の範囲第２項の方法
。 （４） サグタイ７’２１ Ｋを集め、Ｍｏｎｏ −
Ｓ カラムで再クロマトグラフィ処理する特許請求の
範囲第２項の方法。 （５）本明細書および実施例に実質的に記載されている
、クロマトグラフィ、限外濾過およびイオン交換クロマ
トグラフィによシ、ヒト インターフェロン（工ＦＮ−
γ）サブタイプ２６におよび２１Ｋを実質的に純粋なタ
ンパク質として製造する方法。 （６ン 特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１
つに記載の方法により得られる、実質的に純粋な形のヒ
ト免疫インターフェロン（工ＦＮ−γ）サブタイプ２１
におよび２６に０ （７）約７ Ｘ １０６単位／■の比活性、約２６・０
００ダルトンの見掛分子質量および実質的に一下表のア
ミノ酸組成を有する、実質的に均質なタンパク質として
のヒト免疫インターフェロン（サブタイプ２６Ｋ）： ＡＳＸ １ ６．５
＝ｔ： ０−４Ｔｈｒ ７．４±０．
６ Ｓθｒ １０．８±１．０Ｇｌｘ
１ ６．４±１．４Ｐｒｏ
８．０ ±０．４Ｇｌｙ
１ ４．３±１．９Ａ１ａ
１１．３±０．７ Ｃｙｓ Ｏ０６±０．４Ｖａｌ
８．９±０．９ Ｍｅｔ ０．８±０．６エ１
ｅ ６．０±０．６Ｌｅｕ
１ ２．９±０．１Ｔｙｒ
２．１±０．１ Ｐｈａ ５．２±０．８Ｈ１
ｓ ２．２±０．６Ｌｙｓ
１ ３．６±６．１Ａｒｇ８．４
±１８０ （８） ウィルス性および腫瘍病気状態の処置用に非
経口投与するのに適する医薬製剤であって、少割合を占
める特許請求の範囲第７項に記載のとおシの均質タンパ
ク質としてのヒト免疫インターフェロン サブタイプ２
６にの有効量および多割合を占める慣用の医薬用非経口
投与担体材料を含む医薬製剤。 （９）約７ Ｘ １０６単位／ｍｙの比活性、約２１，
０００ダルトンの見掛分子質量および実質的に下表のア
ミノ酸組成を有する、実質的に均質なタンパク質として
のヒト免疫インターフェロン（サブタイプ２１Ｋ）： ＡＳＸ １４．６±１．６ Ｔｈｒ ７．９±０゜４Ｂｅ
ｒ ９ 、１ ±１．４ＧＩ
Ｘ １ ５．６±０．７Ｐｒｏ
９．７±１．４Ｇ１７
１ ４．４±０．６Ａ１ａ
１２．０±１．５ ０７日 ０．６±０．５ Ｖａｌ ７．４±０．７Ｍｅｔ
２．３±１．０工１ｅ
５．Ｑ±０．６ｈｅｕ
９．２±０．６ Ｔｙｒ ２．９±０．４Ｐｈ
θ ４゜９±１．０Ｈ１ｓ
３．５±０．７Ｌｙｓ
２ ０．３−ｋ Ｏ，４Ａｒｇ
５．７±０．４αＱ ウィルス性
および腫瘍病気状態の処置用に非経口投与するのに適す
る医薬製剤であって、少割合を占める特許請求の範囲第
９項に記載の均質タンパク質としてのヒト免疫インター
フェロン サグタイプ２１にの有効量および多割合を占
める慣用の医薬用非経口投与担体材料を含む医薬製剤。 αめ ウィルス性および腫瘍病気状態の処置用に非経口
投与するのに適する医薬製剤であって、少割合を占める
特許請求の範囲第１項の方法によシ得られる２種のヒト
免疫インターフェロン サグタイプ２６におよび２１に
の有効量および多割合を占める慣用の医薬用非経口投与
担体材料を含む医薬製剤。 α→ 本明細書および実施例に実質的に記載されている
とおシの、実質的に純粋な形のヒト インターフェロン
ザブタイプ２１におよびサグタイプ２６に０
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| IL67896A IL67896A (en) | 1983-02-13 | 1983-02-13 | Two biologically active human gama interferon subtypes,purification thereof and pharmaceutical compositions containing them |
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