JPS6261040B2 - - Google Patents

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JPS6261040B2
JPS6261040B2 JP54150803A JP15080379A JPS6261040B2 JP S6261040 B2 JPS6261040 B2 JP S6261040B2 JP 54150803 A JP54150803 A JP 54150803A JP 15080379 A JP15080379 A JP 15080379A JP S6261040 B2 JPS6261040 B2 JP S6261040B2
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JP
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interferon
column
propanol
buffer
gradient
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JP54150803A
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JPS5594320A (en
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Pesutoka Shidonii
Rubinshutain Menahemu
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of JPS5594320A publication Critical patent/JPS5594320A/ja
Publication of JPS6261040B2 publication Critical patent/JPS6261040B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】
タンパク質の精製は長い間ペプチド化学におけ
る１つの問題であつた。これまで用られてきた技
術の例は、沈殿、ゲル過、イオン交換クロマト
グラフイー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラ
フイーおよび述べるには多過ぎる他の方法であ
る。 天然に産出する、極めて低濃度で生物学的試料
中に存在する高分子量のタンパク質を単離しよう
とする計画は、前述の技術の検定（assay）を利
用する多工程法であつた。多数のこのような場合
において、極めて大量の粗製出発物質を蓄積およ
び処理しなくてはならず、これには精製後の工程
において多量の生成物が失われるため高い経費と
通常多くの労力を要する。 問題の１つの適当なケースはインターフエロン
（interferon）を単離および特徴づける多数の試
みの歴史である。アイザツク（Isaacs）およびリ
ンデンマン（Lindenmann）による最初の発見以
来、20年にわたつて全世界の研究者達はインター
フエロンを白血球または線維芽細胞
（fibroblast）の形で、均質なペプチドとして、そ
の特定の生物学的または化学的性質を特徴づけ且
つ同定できるのに十分な量で単離しようとした
が、不成功に終つた。 アイザツクおよびインデンマンのインターフエ
ロンを用いる元の研究に関する米国特許第
3699222号において、活性物質の精製は硫酸アル
ミニウムの沈殿およびそれに引き続く透析に限定
されている。このような方法は比較的非特定的で
あり、こうしてそれによつて得られる生成物はな
お極めて粗製状態である。 インターフエロンを精製する多工程法は米国特
許第3414651号に開示されており、この多工程法
は非晶質アルミノーシリケート上の選択的吸着、
ヨウ素またはチオシアネートの溶液を用いる溶
離、さらにHCl水溶液、次いでNaOHを用いる望
まないタンパク質の沈殿、水混和性溶媒、たとえ
ばメタノール、エタノールまたはアセトンを用い
るインターフエロンの塩基溶液からの沈殿、およ
び最後の２−ジエチルアミノエチル−セルロース
のような陰イオン交換樹脂による再溶解したイン
ターフエロンのクロマトグラフイーを用いて、そ
の比活性がこの全プロセスにより6000倍に高めら
れたと示されるインターフエロンを生成する。例
示された特定のインターフエロンはヒヨコとサル
のインターフエロンであつた。 ほかの精製法は米国特許第3975344号に教示さ
れており、ここでは細胞培養の培地から誘導され
た粗製の人の線維芽細胞のインターフエロン溶液
が区域密度勾配の超遠心分離によつて精製されて
いる。この技術はセフアデツクス（Sephadex）
Ｇ−100を用いる普通のカラムクロマトグラフイ
ーで得られるより高い収率および精製を与えるこ
とが示された。 インターフエロンの精製および特性づけに関す
る最近の科学文献は、次のように要約することが
できる： Knight，E.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA73，520−
３（1976）； Ｔｏ¨rmａ¨，E.T.et al.，J.Biol.Chem.2514810−
６（1976）； Bridgen，P.J.et al.，J.Biol.Chem，252，6585−
７（1977）； DeMaeyer−Guignard，J.et al.，Nature271，
622−５（1978）； Kawakita，M.et al.，J.Biol.Chem.253，598−
602（1978）； Berthold，W.et al.，J.Biol.Chem.253，5206−11
（1978）； Jankowski，W.J.et al.，J.Virology16，1124−
30（1975）； Davey，M.W.et al.，J.Biol.Chem.251，7620−
５（1976）；Chadha，K.C.et al.，）
Biochemistry17，196−200（1978）。 上記の文献のいくつかはマウスまたは人のイン
ターフエロンを均質に精製したと述べているが、
タンパク質の均質性の古典的証明が与えられてお
らず、あるいは記載されている純粋といわれる化
合物の性質は記載されていない。 タンパク質の精製に高性能液体クロマトグラフ
イー（HPLC）を使用することは一般に技術的に
知られている。これらの参考書は特定的にタンパ
ク質の精製におけるイオン交換および大きさ排除
型のカラムを記載している。たとえば、
Regnier，F.E.et al.，J.Chromatog.Sci.14，316
−20（1976）およびChang，S.−H.et al.，Anal.
Chem.48，1839−45（1976）参照。 逆相（rcverse phase）分配クロマトグラフイ
ーにおけるリクロソルブ（Lichrosorb）RP−18
（オクタデシル結合シリカ微粒子カラム）の使用
は、β−エンドルフインのようなペプチドを精製
するために成功したものである〔たとえば、
Rubinstein，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，
USA74，4969−72（1977）〕。最後に、マウスの
Ehrlich腹水症の腫瘍細胞からのインターフエロ
ンの３種（分子量＝33000、26000および20000）
の部分的特性づけは、Cabrer，B.et al.，J.Biol.
Chem.254，3681−４（1979）に記載されてい
る。 本発明は、 (1) Ａ 不純な状態のヒト白血球インタフエロン
の水溶液を、緩衝液で平衡化した、シアノプロ
ピル、シクロヘキシル、フエニル、オクチル、
またはオクタデシル基が結合した、シリカマト
リツクスカラムに、高速液体クロマトグラフイ
ー条件下に通してインタフエロンをカラム上に
吸着させ、その後インタフエロンを増加する勾
配の水性の水混和性溶媒で溶離し、そしてイン
タフエロンを溶出液の選定フラクシヨン中に高
純度の状態で得、 Ｂ 工程Ａで得たインタフエロンの水溶液を、緩
衝液で平衡化した、シアノプロピルまたはグリ
セリル基が結合したシリカマトリツクスカラム
に、高速液体クロマトグラフイー条件下に通し
てインタフエロンをカラム上に吸着させ、その
後インタフエロンを減少する勾配の水性の水混
和性溶媒で溶離し、そしてインタフエロンを溶
出液の選定フラクシヨン中に高純度の状態で得 工程Ｂで得たインタフエロンを再び工程Ａにか
け、所望により、この工程を完全な均質性が得ら
れるまで繰返すことを特徴とする均質ヒト白血球
インタフエロンの製造方法に関する。 この医薬として重要な物質の化学的特性づけを
初めて可能にする十分量の自由に使用できる純す
いなヒト白血球インタフエロンは本発明の新規製
造方法により得られた。インタフエロンの化学的
特性づけを可能にしたことはこの物質の開発にお
ける有為な進歩を表わす。なぜなら、これにより
普通のペプチド合成法により、或いはインターフ
エロンアミノ酸序列に相当するDNAを合成し、
そしてこのようなDNAを適当な有機体、好まし
くはバクテリア中に、DNA−再結合技術により
導入することによつて、インターフエロンを合成
できるからである。次いで、生ずる有機体はイン
ターフエロンを生成する能力を有し、これは発酵
技術を応用して商業的なレベルで従来まれな化合
物の便利な源を提供するように規模を大きくする
ことができる。 本発明の均質ヒト白血球インタフエロンを製造
する特定の方法は次のとおりである。 (A) 不純なヒト白血球インタフエロンの水溶液
を、緩衝液で平衡化したオクチル結合シリカマ
トリツクスカラムに高速液体クロマトグラフイ
ー条件下に通してインタフエロンをカラム上に
吸着させ、その後インタフエロンをカラムから
増加する勾配の水性の緩衝した水混和性溶媒で
溶離し、そしてインタフエロンを溶出液の選定
フラクシヨン中に高純度の状態で得； (B) 工程(A)において得られる選ばれたインタフエ
ロンのフラクシヨンを、緩衝液で平衡化したグ
リセリル結合シリカマトリツクスカラムに、高
速液体クロマトグラフイー条件下に通してイン
タフエロンをカラム上に吸着させ、その後イン
タフエロンをカラムから減少する勾配の水性の
緩衝した水混和性溶媒で溶離し、そしてインタ
フエロンを明確な主ピークとして溶出液の選定
フラクシヨン中に高純度の状態で得； (C) 工程(B)において得られる明確な主ピークの１
つに相当するインタフエロンの選定フラクシヨ
ンの緩衝溶液を、緩衝液で平衡化したオクチル
結合シリカマトリツクスカラムに、高速液体ク
ロマトグラフイー条件下に通してインタフエロ
ンをカラム上に吸着させ、その後インタフエロ
ンをカラムから増加する勾配の水性の緩衝した
水混和性溶媒で溶離し、そしてインタフエロン
を単一の明確なピークとして溶出液の選定フラ
クシヨン中に均質なタンパク質の状態で得、そ
して、必要に応じて、工程(C)の操作を反復して
究極の均質性を達成する； 本発明の実施において使用するオクチルまたは
グリセリル変性多孔質シリカの微粒子のカラム
（粒度＝10μ；平均孔大きさ＝100Å）は、アメリ
カ合衆国ニユーヨーク州エルムスフオードのEM
ラボラトリーズ（EM Laboratories of
Elmsford，N.Y.，USA）から、商標Lichrosorb
RP−８およびLichrosorbジオールとして入手で
きる商品である。同等のオクチル変性多孔質カラ
ム（Chromegabond Ｃ−８として識別される）
は、アメリカ合衆国ニユージヤージー州マールト
ンのE.Sインダストリーズ（E.S.Industries，
Marlton，N.J.，USA）から入手することができ
る。 前述のカラムを利用する便利な高圧液体クロマ
トグラフイー系は米国特許第4116046号に記載さ
れている。 本発明の方法を実施する場合、不純な高分子量
のペプチドの、好ましくは問題のタンパク質の性
質と適合するPHにおける緩衝水溶液中の溶液をシ
リカのマトリツクスのカラムに通す。通常、この
操作は加圧下に、好ましくは約50〜約5000psi
（3.4〜340気圧）の範囲において実施する。タン
パク質をカラムに吸着させ、次いで水と混和性の
溶媒の勾配を用いて選択的方式で継続して溶離す
る。この目的に適した水混和性の溶媒の例は、ア
ルカノール、たとえばｎ−プロパノール、２−プ
ロパノール、エタノール、メタノール、ｔ−ブタ
ノールまたは環式エーテル、たとえばジオキサン
である。溶離液の分別は、フアクシヨン・コレク
ターを使用し、それ自体知られた方法により、各
フラクシヨン中のタンパク質含量を、高感度で動
作するペプチドモニターで同時に監視することに
よつて達成する。この目的に適当な系はBohlen
et al.，Anal.Biochem.67，438（1975）に開示さ
れている。また、ターゲツト・タンパク質の存在
を適当な生物検定により監視することが好まし
い。 両方のカラム（「正常」分配クロマトグラフイ
ーのためのカラムおよび逆相クロマトグラフイー
のためのカラム）を用いるかどうか、そうする場
合どの順序を選ぶかについての決定は、大部分精
製すべきタンパク質の性質に依存する。たとえ
ば、人の白血球のインターフエロンの特性の場合
において、初め下純なインターフエロンの溶液を
オクチル結合シリカマトリツクスカラム（逆相ク
ロマトグラフイー）に通し約7.5緩衝液のPH、好
ましくは1Mの酢酸ナトリウム−酢酸系を用いて
分割（resolve）し、増加するｎ−プロパノール
濃度の勾配で溶離し、次いで集めた活性なフラク
シヨンを0.1Mの酢酸ナトリウム中のグリセリル
結合シリカマトリツクスカラムに通し、低下する
ｎ−プロパノールの勾配で溶離し、最後に分離し
たインターフエロン成分をオクチル結合シリカマ
トリツクスカラムに、約4.0の緩衝液のPH、好ま
しくは1Mのピリジン−2Mのギ酸系を用いて通
し、そして増加するｎ−プロパノールの勾配で溶
離することによつて、最良の結果が達成されるこ
とがわかつた。このようにして、人の白血球のイ
ンターフエロンの３つの別々の形態（α，βおよ
びγ）の各々は均質なタンパク質を表わす別々の
鋭いピークに分割することができる。第２のオク
チル結合シリカマトリツクスクロマトグラフイー
工程に対する培地を用いて出発する全体の精製
は、60000〜80000倍であつたが、グリセロール結
合シリカマトリツクスのクロマトグラフイー工程
を通した累積収率は30〜50％の範囲であつた。 人の白血球のインターフエロンの精製法の特定
の態様において、工程Ｂからの選定ピークフラク
シヨンを集め、ｎ−プロパノールをｎ−ヘキサン
で抽出して除去し、そして微量のｎ−ヘキサンを
工程Ｃへ進む前に水相から除去する。 本発明の方法の実施により得られる均質な人の
白血球のインターフエロンの種の各々は、前述の
HPLCカラム上の鋭いピークと、２−メルカプト
エタノールの存在下のドデシル硫酸ナトリウム
（NaDodSO4）ポリアクリルアミドゲル電気泳動上
の単一の狭い帯とを示した。このゲルを抽出する
と、タンパク質帯と一致する抗ウイルス活性の単
一の鋭いピークが得られた。この純粋なインター
フエロンの種の比活性は、MDBKの牛の細胞で
約0.9〜4.0×108の範囲であり、そしてAg1732の
人の細胞系統（human cell line）で約２×106〜
４×108であることがわかつた。分子量は表４に
見られるように約16000〜21000の範囲であつた。
アミノ酸分析の結果は表５に要約されている。 インターフエロン類は抗ウイルス活性、制癌活
性、発育阻害活性および免疫抑制活性を示した。
これらの活性は、人のインターフエロンが１％よ
り少ない比較的粗製の製剤を用いて１〜10×106
単位／日を用いる臨床レベルにおいてさえ得られ
た。本発明の１つの面である精製された均質なイ
ンターフエロン類は、従来用いられた粗製の製剤
と同じ方法で投与量を調整して望むレベルのイン
ターフエロン単位を与えるようにして使用するこ
とができる。個々の種はそのまま使用することが
でき、或いはこのような種の２種以上の混合物を
使用することもできる。このような混合物は単離
した種を望むように混合することによつて得るこ
とができ、或いはインターフエロンの幾つかの種
が存在するが、非インターフエロンの活性なタン
パク質が存在しないところで精製を停止し、組成
物が均質なインターフエロンタンパク質の混合物
であるようにすることによつて、得ることができ
る。 インターフエロンの製造の誘導、インターフエ
ロンの初期濃度およびゲル過を含むインターフ
エロンの分別はこの分野でよく知られた方法を用
いて達成することができる。不純な状態のインタ
ーフエロンの水溶液を生成するこれらの操作は本
発明の一部分ではない。 本発明をさらに以下の実施例により例証する。 実施例 １ １正常の提供者（donor）からの均質な人の自
血球のインターフエロン Ａ インターフエロンの製造 カゼイン（10mg／ml）を含有する血清不含最小
必須培地中で、正常の提供者の血液からのヒト白
血球（107細胞／ml）を、ニユーカツスル
（Newcastle）病気ウイルス（15血球凝集単位／
ml）で16時間培養することによつて、インターフ
エロンを製造した。5000単位／mlの平均のインタ
ーフエロンの力価を得た。用いた操作は
Mogensen，K.E.et al.，Pharmacology and
Therapeutics Ａ，1977，369−381；
Wheelock，E.F.，J. Bacteriol.92，1415−1421
（1966）およびCantell，K.et al.，Appl.
Microbiol.22，625−628（1971）に報告されたも
のを多少変更したものであつた。インターフエロ
ンの力価は、細胞変性効果−阻止検定によつて測
定し、この検定は16時間以内で実施することがで
きた。すべてのインターフエロンの力価は参照単
位／mlで表わし、これはナシヨナル・インスシチ
ユート・オブ・ヘルス〔the National Institute
of Health（USA）〕により提供された人の白血
球のインターフエロンのための参照標準に対して
補正した。 Ｂ インターフエロンの濃度および初期の分画 特に示さないかぎり、これらの操作は０〜４℃
で実施した。培養の終りにおいて、細胞および残
屑（debris）を低速遠心分離（15分、500×ｇ）
により除去した。カゼインをHClでPH4.0に酸性
化することによつて沈殿した。２時間後、この混
合物を遠心分離（10分、12000×ｇ）し、そして
ペレツトを廃棄した。上層（10）をトリクロロ
酢酸でその最終濃度1.5％（Ｗ／Ｖ）に調整し
た。１時間後、沈殿を遠心分離（10分、12000×
ｇ）により集め、そして50mlの0.1MのNaHCO3
中に再溶解した。トリトン×−100（0.5ｇ）を加
え、次いで酢酸（1.5ml）をかきまぜながら滴々
加えた。この混合物を０℃で１時間、次いで−20
℃で16時間貯蔵した。次いでそれを解凍し、遠心
分離（10分、17000×ｇ）した。ペレツトを廃棄
し、上層をトリクロロ酢酸でその最終濃度４％に
調整した。１時間後、この混合物を遠心分離（10
分、12000×ｇ）した。沈殿物を集め、そして５
mlの0.5MのNaHCO3中に再溶解した。 Ｃ ゲル過 尿素（1.5ｇ）をインターフエロンの濃縮物に
加え、そしてこの溶液を4Mの尿素／0.1Mの酢酸
ナトリウムの緩衝液で前もつて平衡化したセフエ
デツクス（Sephadex）Ｇ−100の微細粒子のカラ
ム（2.6×90cm）に通した。このカラムを4Mの尿
素／0.1Mの酢酸ナトリウム、PH7.5で、室温にお
いて0.5ml／分の流速で溶離した。12.5mlのフラ
クシヨンを集めた。インターフエロンの活性はフ
ラクシヨン19−23中に溶出された。 Ｄ 高速液体クロマトグラフイー セフアデツクスＧ−100の試験のフラクシヨン
19−23を合わせ、直接ポンプを経てリクロソルブ
（Lichrosorb）RP−８カラム（10μ、4.6×250
mm）に通した。このカラムは0.01％（Ｖ／Ｖ）の
チオジグリコールを含有する1Mの酢酸ナトリウ
ム緩衝液（PH7.5）で前もつて平衡化し、次いで
ｎ−プロパノールの直線の勾配で同一緩衝液中で
0.25ml／分の流速で溶離した〔１時間、０〜20
％；３時間、20〜40％（Ｖ／Ｖ）〕。0.75mlのフラ
クシヨンを集めた。インターフエロンはフラクシ
ヨン23〜40〔25〜30％（Ｖ／Ｖ）のｎ−プロパノ
ール〕中に溶出された。 インターフエロン活性のほとんどを含有するフ
ラクシヨン27〜33を合わせ、ｎ−プロパノールを
80％（Ｖ／Ｖ）の最終濃度まで加え、そしてこの
溶液を、80％（Ｖ／Ｖ）のｎ−プロパノールを含
有する0.1Mの酢酸ナトリウムの溶液で前もつて
平衡化したリクロソルブ・ジオールのカラム（10
μ、4.6×250mm）にポンプを経て通した。次いで
このカラムを0.1Mの酢酸ナトリウム中で４時間
の直線の勾配の72〜50％（Ｖ／Ｖ）のプロパノー
ルで0.25ml／分の流速で溶離した。0.75mlのフラ
クシヨンを集めた。インターフエロン活性は３つ
の明確な主ピークとして溶出され、それらのピー
クは各操作ごとに定量的に変化した。これらのピ
ークは溶出の順序に従つてα，βおよびγと表示
した。α−フラクシヨンは68％のｎ−プロパノー
ルの濃度で、β−フラクシヨンは66.5％のｎ−プ
ロパノールで、γ−フラクシヨンは65.5％のｎ−
プロパノールで溶出された。インターフエロンの
活性の合計の回収率は80％より高かつた。 各ピークからなるフラクシヨンを別々に集め、
継続する工程を経て個々に精製した。ピークγは
多量で存在しそして他の成分からよく分割される
ように思われたので、それをさらに精製するため
に選んだ。ジオールカラムからのピークγからな
るフラクシヨン54−56を集め、そして１−プロパ
ノールを等体積のヘキサンで２回抽出することに
よつて除去した。微量のヘキサンを窒素流のもと
に除去した。ピリジンとギ酸をそれぞれ1Mと2M
の最終濃度に加え、そしてこの溶液を1Mのピリ
ジンおよび2Mのギ酸（PH4.0）で前もつて平衡化
したリクロソルブRP−８カラム（10μｍ；4.6×
250mm）に加える。このカラムを1Mのピリジン／
ホルメート緩衝液中で直線の20〜40％の１−プロ
パノールの勾配で３時間以内で0.2ml／分の流速
で溶離した。0.6mlのフラクシヨンを集めた。活
性の主ピークはタンパク質のピークと一致した。
このピークからなるフラクシヨン45および46（32
％、Ｖ／Ｖ、プロパノール）を合わせ、同様な条
件で再クロマトグラフ処理した。インターフエロ
ンはフラクシヨン31（32％、Ｖ／Ｖ、プロパノー
ル）中に溶出された。このフラクシヨンの比活性
は牛血清アルブミンに関して４×108単位／mgで
あると計算された。この物質（フラクシヨン31）
はさらに以下に述べるアミノ酸分析等に使用し
た。この高速液体クロマトグラフイーのパターン
を蛍光検出にかけたところ、この再現性は顕著
で、そのパターンの同一性を証明することができ
た。 精製の結果を表１に要約する。最初の培地から
第２のRP−８カラムまでの全体の精製度は60000
〜80000倍であつた。工程１からジオール工程を
通じた累積収率は30〜50％の範囲であつた。この
工程を越えると、インターフエロンの３つのピー
クの各々は別々に精製した。
【表】 Ｅ ポリアクリルアミドゲルの電気泳動 インターフエロンの試料（1.5×105単位）を
NaDodSO4および２−メルカプトエタノール中に
インキユベートし、次いでスラブ・ゲル（slab
gel）に加えた。電気泳動後、クーマツシー・ブ
ルー（Coomassie blue）を用いて着色すると単
一の鋭い帯が得られた。見掛けの分子量は標準の
タンパク質と比較して17500と推定された。次い
でゲルを１mmの薄片に切つた。各薄片を0.4mlの
0.5MのNaHCO3／0.1％のNaDodSO4中で均質化
し、そしてインターフエロンの活性を測定した。
抗ウイルス活性の単一ピークが得られ、これは上
記単一のタンパク質の帯と一致した。活性の他の
ピークは観測されなかつた。 Ｆ アミノ酸の分析 均質な人の白血球のインターフエロン（ピーク
γ）のアミノ酸分析を、フルオレスカミン
（fluorescamine）のアミノ酸分析器で、0.5〜１
μｇの生来の（native）インターフエロンおよび
Ｓ−カルボキシメチル化したインターフエロンの
試料について実施した。システイン／シスチンの
比を測定するため、生来のインターフエロンをカ
ルボキシメチル化し、次いで6MのHCl中で還元
条件（0.1％のチオグリコール酸）のもとで加水
分解した。これらの条件下で、システインはＳ−
カルボキシメチル化システインとして測定され、
これに対しシスチンは遊離のシステインとして測
定される。アミノ酸の分析値を表２中に要約す
る。アミノ酸含量に基づく比活性は２〜４×108
単位／mgであることがわかつた。
【表】 実施例 ２ 白血病の患者の白血球からの均質な人の白血球
のインターフエロン ロイコフオレシス（leukophoresis）により、
白血病の患者（慢性の骨髄性の白血病、CML）
の血液から単離した人の白血球を、カゼイン含有
血清不含培地中でニユーカツスル病ウイルスと培
養することによつてインターフエロンを製造し
た。5000〜40000単位／mlのインターフエロンの
力価が普通の試験で得られた。 精製操作は正常の血液（実施例１）からのイン
ターフエロンについて記載したものと同一であ
り、そしてトリトンＸ−100の存在下の0.5Mの酢
酸による沈殿、4Mの尿素中のセフアデツクスＧ
−100を用いるゲル過、PH7.5におけるリクロソ
ルブRP−８を用いるHPLC、リクロソルブ・ジ
オールを用いるHPLCおよびPH4.0におけるリク
ロソルブRP−８を用いるHPLCを包含してい
た。 リクロソルブ・ジオールのカラムからのα−、
β−およびγ−ピークからなるフラクシヨンを
別々に集め、そして継続する工程で個々に精製し
た。 フラクシヨン43−46（α−ピーク）を集め、ｎ
−プロパノールを等体積のｎ−ヘキサンで２回抽
出することによつて除去した。微量のヘキサンを
窒素流のもとで除去した。ピリジンとギ酸をそれ
ぞれ1Mと2Mの最終濃度に加え、この溶液を1M
のピリジン／2Mのギ酸（PH4.0）で前もつて平衡
化したリクロソルブRP−８カラム（10μ、4.6×
250mm）に通し、このカラムを1Mのピリジンホル
メート緩衝液中で直線の20〜40％（Ｖ／Ｖ）ｎ−
プロパノールの勾配で３時間以内に0.2ml／分の
流速で溶離した。0.6mlのフラクシヨンを集め
た。インターフエロンの活性を31〜35％（Ｖ／
Ｖ）ｎ−プロパノールの範囲の広いピークとして
溶離した。これらのフラクシヨンを合わせ、同一
条件下に再クロマトグラフ処理した。インターフ
エロンの活性は31％および32％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プ
ロパノールにおいて２つの主ピーク（α１および
α２）中に溶出された。少量の成分は34％（Ｖ／
Ｖ）ｎ−プロパノールにより溶出された。 リクロソルブ・ジオールのカラムからのフラク
シヨン47〜50（ピークβ）を集め、ピークαにつ
いて前述したように処理し、リクロソルブRP−
８でクロマトグラフ処理した。インターフエロン
の活性は２つの主ピーク：32％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プ
ロパノールにおいてβ２および34％（Ｖ／Ｖ）ｎ
−プロパノールにおいてβ３中に溶出された。こ
の場合、再クロマトグラフ処理は不必要であつ
た。いくつかの製造において、31％（Ｖ／Ｖ）ｎ
−プロパノールで溶出されるβ１と表示するピー
クが観測された。 リクロソルブ・ジオールのカラムからのフラク
シヨン52−54（ピークγ）を集め、そしてピーク
αについて前述したように処理し、リクロソルブ
RP−８でクロマトグラフ処理した。インターフ
エロン活性は５つの主ピーク、すなわち：γ１
（31％ｎ−プロパノール、Ｖ／Ｖ）、γ２（32％ｎ
−プロパノール、Ｖ／Ｖ）、γ３（34％、ｎ−プ
ロパノール、Ｖ／Ｖ）、γ４（35％ｎ−プロパノ
ール、Ｖ／Ｖ）およびγ５（35.5％ｎ−プロパノ
ール、Ｖ／Ｖ）中に溶出された。この場合、再ク
ロマトグラフ処理は不要であつた。
【表】 インターフエロンの個々の種を生成するための
精製の結果を表３に要約する。 種α２およびβ２はリクロソルブ・ジオールの
カラムの溶出特性によつてさらに区別される：α
２は68％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールで、そして
β２は66.5％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールで、そ
れぞれ溶出される。 インターフエロンの種の試料（1.5×105単位）
をNaDodSO4および２−メルカプトエタノール中
にインキユベートし、次いでスラブ・ゲルに加え
た。電気泳動後、ピークα１、α２、β２、γ
１、γ２およびγ４は単一の帯を与えたが、ピー
クβ３、γ３およびγ５は２つの帯を与えた。見
掛けの分子量はすべて16000〜18000の範囲に入る
が、ただしβ３は16500と21000の帯を与え、そし
てγ４は21000の帯を与えた（表４参照）。 精製した人の白血球のインターフエロンのフラ
クシヨンのアミノ酸分析は、フルオレスカミン
（fluorescamine）アミノ酸分析器を用い0.5〜１
μｇのインターフエロンの試料について実施し
た。加水分解を6NのHCl中で還元条件（0.1％の
チオグリコール酸）下に行つた。分析の結果を表
５に要約する。
【表】
【表】
【表】 精製した人の白血球のインターフエロンのいろ
いろな種（300ピコモル、６μｇ）を重炭酸ナト
リウムの水溶液（50mM、PH8.5、50μ）中に
溶かした。トリプシン（２μのHCl、PH３、中
の0.1μｇ）を加え、この混合物を37℃で14時間
培養した。酢酸（５μ）を加え、この混合物を
リクロソルブRP−８カラム（10μの粒度、4.6×
250mm）に通した。このカラムを0.5ml／分におい
て１時間0.1Mのギ酸／0.03Mのピリジン緩衝液
（PH３）中で０〜40％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノー
ルの直線の勾配を用いて溶離した。ペプチドをフ
ルオレスカミン監視系により検知した。結果は表
６に記載されており、そして％ｎ−プロパノール
およびピークの相対大きさ（Ｓ＝小、Ｍ＝中、Ｌ
＝大）で表わされている。 表 ６ 人の白血球のインターフエロンのトリプシンペ
プチド種 溶 出 位 置 （％ｎ−プロパノール） α１ 3L，4L，4.2M，11.5M，12.5S，14.5M，
16S，18M，20S，21S，22.5S，29M α２ 3L，4L，4.2M，11.5M，12.5S，14.5M，
16S，18M，27S，29M β２ 3L，4L，4.2M，11.5M，12.5S，14.5M，
16S，17.5S，18M，29M β３ 3L，4L，4.2M，4.5S，10M，12.5S，
14S，14.5M，16S，18L，19.5M，27M32M γ１ 3L，4L，4.2M，4.5S，5S，6.5S，11.5S，
12.5S，14.5M，16S，17.5M.18M，29M γ２ 3L，4L，4.2M，4.5S，5S，11.5S，
12.5S，14.5S，16S，18L，29M γ３ 3M，4M，4.2M，11.5M，12.5S，13.5S，
14.5M，16S，18L，20S，32M γ５ 3L，4L，4.2M，4.5M，7S，7.5S，10S，
11.5L，12.5S，14S，14.5M，16S，18L，
24.5S，25.5S，32S 精製した人の白血球のインターフエロンの種
を、アミノ糖を50〜100ピコモルのレベルで同定
できるアミノ糖分析に付した。すべての場合にお
いて、グルコースアミンおよびガラクトース／マ
ンノースアミンは１残基／分子より小であつた。
ほとんどの場合において、アミノ糖の近くに溶出
される多くの小さなペプチドがこの分析を妨げ
た。こうして、アミノ糖に割当てられたピークで
さえも少なくともこの一部はペプチドによるもの
でありうる。 最後に、逆加水分解（back hydrolysis）およ
びフルオレスカミンを用いるアミノ酸分析を含む
エドマン（Edman）法により１ナノ１モルの純
粋なγ２インターフエロンの配列を決定する試み
は、サイクル１および２についてアミノ酸を与え
なかつた。100ピコモルの純粋なγ２の人の白血
球のインターフエロンをロインシンアミノペプチ
ダーゼおよびアミノペプチダーゼＭで37℃で20時
間処理したが、生物学的活性は影響を受けず、そ
していかなるアミノ酸も反応液中に検出されなか
つた。誘導培地（最小必須培地、白血球およびニ
ユーカツスル病ウイルス）の上清をアミノペプチ
ダーゼで処理しても、インタフエロン活性の損失
はみられなかつた。このことはインターフエロン
分子は精製前にさえブロツクされたNH2末端を有
することを示す。対照として粗製インターフエロ
ンならびに純粋なインターフエロンおよびインシ
ユリンのβ−鎖をアミノペプチダーゼＭと一緒に
インキユベートした。インシユリンはアミノ酸の
放出によつてわかるように部分的に消化された
が、インターフエロンの活性の損失は観測されな
かつた。 参考例 (a) ２×108単位／mgの比活性をもつ均質な人の
白血球のインターフエロンの合計で３mgを、５
％の正常な人の血清アルブミンの25ml中に溶か
した。この溶液を細菌学的フイルターに通し、
過した溶液を無菌的に100個の小びんに分割
して入れた。各小びんは、非経口投与に適した
６×106単位の純粋なインターフエロンを含有
した。小びんは使用前冷蔵（−20℃）すること
が好ましい。 (b) 各々がほぼ自然に得られる比率で存在する、
1.5mgの集めた均質なインターフエロンの種α
１、α２、β２、γ１およびγ２を含有し、こ
の貯蔵した混合物が約２×108単位／mgの比活
性を有し、そしてさらに100mgの正常な人血清
アルブミンを含有する水溶液を細菌学的フイル
ターに通し、そして過した溶液を無菌的に
100個の小びんに分割して入れた。各小びんは
約３×106単位の純粋な集めたインターフエロ
ンと１mgの人血清アルブミンを含有するであろ
う。非経口投与に適したインターフエロンを含
有する小びんは使用前冷蔵（−20℃）すること
が好ましい。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ Ａ 不純な状態のヒト白血球インタフエロン
    の水溶液を、緩衝液で平衡化した、シアノプロ
    ピル、シクロヘキシル、フエニル、オクチル、
    またはオクタデシル基が結合した、シリカマト
    リツクスカラムに、高速液体クロマトグラフイ
    ー条件下に通してインタフエロンをカラム上に
    吸着させ、その後インタフエロンを増加する勾
    配の水性の水混和性溶媒で溶離し、そしてイン
    タフエロンを溶出液の選定フラクシヨン中に高
    純度の状態で得、 Ｂ 工程Ａで得たインタフエロンの水溶液を、緩
    衝液で平衡化した、シアノプロピルまたはグリ
    セリル基が結合したシリカマトリツクスカラム
    に、高速液体クロマトグラフイー条件下に通し
    てインタフエロンをカラム上に吸着させ、その
    後インタフエロンを減少する勾配の水性の水混
    和性溶媒で溶離し、そしてインタフエロンを溶
    出液の選定フラクシヨン中に高純度の状態で
    得、 工程Ｂで得たインタフエロンを再び工程Ａにか
    け、所望により、この工程を完全な均質性が得ら
    れるまで繰返すことを特徴とする均質ヒト白血球
    インタフエロンの製造方法。 ２ シリカマトリツクスに結合した基がオクチル
    またはグリセリルである特許請求の範囲第１項の
    方法。 ３ (A) 不純な状態のヒト白血球インタフエロン
    の水溶液を、緩衝液で平衡化したオクチル結合
    シリカマトリツクスカラムに高速液体クロマト
    グラフイー条件下に通してインタフエロンをカ
    ラム上に吸着させ、その後インタフエロンをカ
    ラムから増加する勾配の水性の緩衝した水混和
    性溶媒で溶離し、そしてインタフエロンを溶出
    液の選定フラクシヨン中に高純度の状態で得； (B) 工程(A)において得られる選ばれたインタフエ
    ロンのフラクシヨンを、緩衝液で平衡化したグ
    リセリル結合シリカマトリツクスカラムに、高
    速液体クロマトグラフイー条件下に通してイン
    タフエロンをカラム上に吸着させ、その後イン
    タフエロンをカラムから減少する勾配の水性の
    緩衝した水混和性溶媒で溶離し、そしてインタ
    フエロンを明確な主ピークとして溶出液の選定
    フラクシヨン中に高純度の状態で得； (C) 工程(B)において得られる明確な主ピークの１
    つに相当するインタフエロンの選定フラクシヨ
    ンの緩衝溶液を、緩衝液で平衡化したオクチル
    結合シリカマトリツクスカラムに、高速液体ク
    ロマトグラフイー条件下に通してインタフエロ
    ンをカラム上に吸着させ、その後インタフエロ
    ンをカラムから増加する勾配の水性の緩衝した
    水混和性溶媒で溶離し、そしてインタフエロン
    を単一の明確なピークとして溶出液の選定フラ
    クシヨン中に均質なタンパク質の状態で得、そ
    して、必要に応じて、工程(C)の操作を反復して
    究極の均質性を達成する； 工程の組合せからなる特許請求の範囲第１項の方
    法。 ４ 水混和性溶媒がアルカノールまたは環式エー
    テルから選ばれる特許請求の範囲第３項の方法。 ５ 水混和性溶媒がｎ−プロパノールであり、工
    程(A)における緩衝液のPHが約7.5であり、そして
    工程(C)における緩衝液のPHが約4.0である特許請
    求の範囲第３項の方法。 ６ 工程(A)における緩衝液が1Mの酢酸ナトリウ
    ム／酢酸であり、そしてｎ−プロパノールの勾配
    を０から約40％（Ｖ／Ｖ）まで増加させ、工程(B)
    における緩衝液が0.1Mの酢酸ナトリウムであ
    り、そしてｎ−プロパノールの勾配を約72.5％か
    ら約50％（Ｖ／Ｖ）まで減少させ、工程(C)におけ
    る緩衝液が1Mのピリジン／2Mのギ酸であり、そ
    してｎ−プロパノールの勾配を約20％から約40％
    （Ｖ／Ｖ）まで増加させる特許請求の範囲第５項
    の方法。 ７ 工程(B)からの選定したピークのフラクシヨン
    を集め、ｎ−プロパノールをｎ−ヘキサンで抽出
    して除去し、そして微量のｎ−ヘキサンを水相か
    ら除去した後、工程(C)を行なう特許請求の範囲第
    ６項の方法。
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA796175B (en) * 1978-11-24 1980-11-26 Hoffmann La Roche Purified proteins and process therefor
WO1982000588A1 (en) * 1980-08-22 1982-03-04 Illinois Univ Delivery of biologically active components of heterologous species interferon isolates
US4526782A (en) * 1981-02-17 1985-07-02 The Green Cross Corporation Process for recovering interferon
GB2108510B (en) * 1981-10-03 1984-12-12 Ciba Geigy Ag Dnas, recombinant dnas, hosts containing them, polypeptides and processes for the production thereof
CA1190148A (en) * 1981-10-13 1985-07-09 Samuel S. Asculai Interferon-containing compositions
ZA828917B (en) * 1981-12-07 1983-09-28 Hoffmann La Roche Crystalline human leukocyte interferon
US4534906A (en) * 1982-11-01 1985-08-13 Genentech, Inc. Removal of impurities from human leukocyte interferon preparations
IL67896A (en) * 1983-02-13 1987-03-31 Yeda Res & Dev Two biologically active human gama interferon subtypes,purification thereof and pharmaceutical compositions containing them
DE3515336C2 (de) * 1985-04-27 1994-01-20 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon
JPH0245952A (ja) * 1988-08-05 1990-02-15 Nec Kyushu Ltd 半導体基板の収納箱
JPH0350337U (ja) * 1989-09-20 1991-05-16

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US963257A (en) * 1909-03-05 1910-07-05 Alison B Stirling Superheating-boiler.
ZA796175B (en) * 1978-11-24 1980-11-26 Hoffmann La Roche Purified proteins and process therefor

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