JPH031320B2

JPH031320B2 -

Info

Publication number: JPH031320B2
Application number: JP62310788A
Authority: JP
Inventors: Pesutoka Shidonii; Rubinshutain Menahemu
Original assignee: EFU HOFUMAN RA ROSHU AG
Current assignee: EFU HOFUMAN RA ROSHU AG
Priority date: 1978-11-24
Filing date: 1987-12-08
Publication date: 1991-01-10
Also published as: JPS5594320A; JPS6338330B2; ZA796175B; MW3379A1; JPS58192896A; JPS6261040B2; MTP857B; AT367769B; JPS63164897A; ATA745379A; HU182500B

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質の精製は長い間ペプチド化学におけ
る大きな問題であつた。これまで用いられてきた
技術としては、沈澱、ゲル濾過、イオン交換クロ
マトグラフイー、ゲル電気泳動、親和性クロマト
グラフイーおよびその他非常に多くの方法があ
る。天然に産出する、極めて低濃度で生物学的試料
中に存在する高分子量のタンパク質を単離しよう
とする計画は、前述の技術を利用する多工程法で
あつた。このような多くの場合、精製の後段階に
おいて生成物のかなりのロスがあるので、極めて
大量の粗製出発物質を集め、そして処理しなくて
はならない。これには高い経費と通常多くの労力
を要する。問題の１つの適当なケースはインターフエロン
（interferon）を単離および特徴づける多数の試
みの歴史である。アイザツク（Isaacs）およびリ
ンデンマン（Lindenmann）による最初の発見以
来、20年にわたつて全世界の研究者達はインター
フエロンをそれが白血球型であろうとまた線維芽
細胞型であろうと、均質なペプチドとして、その
特定の生物学的または化学的性質を特徴づけ且つ
同定できるのに十分な量で単離しようとしたが、
不成功に終つた。アイザツクおよびリンデンマンのインターフエ
ロンを用いる元の研究に関する米国特許第
3699222号において、活性物質の精製は硫酸アン
モニウムの沈殿およびそれに引き続く透析に限定
されている。このような方法は比較的非特定的で
あり、こうしてそれによつて得られる生成物はな
お極めて粗製状態である。インターフエロンを精製する多工程法は米国特
許第3414651号に開示されており、この多工程法
は非晶質アルミノ−シリケート上の選択的吸着、
ヨウ素またはチオシアネートの溶液を用いる溶
離、さらにHCI水溶液、次いでNaOHを用いる
望まないタンパク質の沈殿、水混和性溶媒、たと
えばメタノール、エタノールまたはアセトンを用
いるインターフエロンの塩基溶液からの沈殿、お
よび最後に２−ジエチルアミノエチル−セルロー
スのような陰イオン交換樹脂による再溶解したイ
ンターフエロンのクロマトグラフイーを用いて、
その比活性がこの全プロセスにより6000倍に高め
られたと示されるインターフエロンを生成する。
例示された特定のインターフエロンはヒヨコとサ
ルのインターフエロンであつた。ほかの精製法は米国特許第3975344号に教示さ
れており、ここでは細胞培養の培地から誘導され
た粗製の人の線維芽細胞のインターフエロン溶液
が区域密度勾配の超遠心分離によつて精製されて
いる。この技術はセフアデツクス（Sephdex）Ｇ
−100を用いる普通のカラムクロマトグラフイー
で得られるより高い収率および精製を与えること
が示された。インターフエロンの精製および特性づけに関す
る最近の科学文献は、次にように要約することが
できる： Knight，E.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73，
520−３（1976）；Ｔｏ¨rmａ¨，E.T.et al.，J.Biol. Chem.2514810
−６（1976）； Bridgen，P.J.et al.，J.Biol.Chem，252，
6585−７（1977）； DeMaeyer−Guignord，J.et al.，Nature
271，622−５（1978）； Kawaketa，M.et al.，J.Biol.Chem.253，598
−602（1978）； Berthold，W.at al.，J.Biol.Chem.253，5206
−11（1978）； Jankowaki，W.J.et al.，J.Virology 16，
1124−30（1975）； Davey，M.W.et al.，J.Biol.Chem.251，7620
−５（1976）；Chadha，K.C.et al.，
Biochemistry 17，196−200（1978）。上記の文献のいくつかはマウスまたは人のイン
ターフエロンを均質に精製したと述べているが、
タンパク質の均質性の古典的証明が与えられてお
らず、あるいは記載されている純粋といわれる化
合物の性質は記載されていない。タンパク質の精製に高性能液体クロマトグラフ
イー（HPLC）を使用することは一般に技術的に
知られている。これらの参考書は特定的にタンパ
ク質の精製におけるイオン交換および大きさ排除
型のカラムを記載している。たとえば、 Regnier，F.E.et al.，J.Chromatog.Sci.14、
316−20（1976）およびChang、S.−11.et al.，
Anal.Chem.48，1839−45（1976）参照。逆相（reverse phase）分配クロマトグラフイ
ーにおけるリクロソルブ（Lichrosorb）RP−18
（オクタデシル結合シリカ微粒子カラム）の使用
は、β−エンドルフインのようなペプチドを精製
するために成功したものである。［たとえば、
Rubinstein，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，
USA74，4969−72（1977）］。最後に、マウスの
Ehrlich腹水症の腫瘍細胞からのインターフエロ
ンの３種（分子量＝33000、26000および20000）
の部分的特性づけは、Cabrer，B.et al.，Biol.
Chem.254，3681−４（1979）に記載されている。本発明は均質なタンパク質としてのヒト白血球
インタフエロンに関する。より詳細には、本発明
は (a) ドデシル硫酸ナトリウムを含まず； (b) 順相および／または逆相高速液体クロマトグ
ラフイーにおいてヒト白血球インタフエロン活
性に合致するピークを示し； (c) 分子量約16200±1000〜約21000±1000であ
り；ならびに (d) 次の工程、Ａヒト白血球インタフエロンを含む水溶液
を、緩衝液で平衡化した、シアノプロピル、シ
クロヘキシル、フエニル、オクチル、またはオ
クタデシル基が結合した、シリカマトリクスカ
ラムに、高速液体クロマトグラフイー条件下に
通してインタフエロンをカラムに吸着させ、そ
の後インタフエロンを増加する勾配の水性の水
混和性溶媒で溶離し、そしてインタフエロンを
溶出液の選定フラクシヨン中に高純度の状態で
得、Ｂヒト白血球インタフエロンの水溶液を、緩
衝液で平衡化した、シアノプロピルまたはグリ
セリル基が結合した、シリカマトリクスカラム
に、高速液体クロマトグラフイー条件下に通し
てインタフエロンをカラムに吸着させ、その後
インタフエロンを減少する勾配の水性の水混和
性溶媒で溶離し、そしてインタフエロンを溶出
液の選定フラクシヨン中に高純度の状態で得、
およびＣ工程Ａ）を反復し、ならびに、所望により
工程Ａ）および／または工程Ｂ）を繰返すこと
により最終的に均質性を得る、を組合せることからなる方法により得ることが
できる；均質な蛋白質としてのヒト白血球インタフエロ
ンに関する。本発明の均質なタンパク質としてのインタフエ
ロンは、この医薬として重要な物質の化学特性づ
けを初めて可能にする純すいなインタフエロンを
十分な量で提供する新規製造方法により得られ
た。インタフエロンの化学的特性づけを可能にし
たことはこの物質の開発における有意な進歩を表
わす。なぜなら、これにより、普通のペプチド合
成法により、或いはインタフエロンアミノ酸配列
に相当するDNAを合成し、そしてこのような
DNAを適当な有機体、好ましくはバクテリア中
に、DNA−組換え技術により導入することによ
つて、インタフエロンを合成できるからである。
次いで、生ずる有機体はインタフエロンを生成す
る能力を有し、これは醗酵技術を応用して商業的
なレベルで従来まれな化合物の便利な源を提供す
るように規模を大きくすることができる。インタフエロンを均質なタンパク質として製造
する方法は、不純な状態のインタフエロンの水溶
液をシアノプロピル、シクロヘキシル、フエニ
ル、オクチル、オクタデシルまたはグリセリル基
を結合した多孔質シリカのマトリツクスの緩衝液
で平衡化したカラムに、高速液体クロマトグラフ
イー（HPLC）の条件下に通してインターエロン
をカラム上に吸着させ、その後このインタフエロ
ンを増加する勾配または減少する勾配の水性の水
混和性溶媒で溶離し、そしてインタフエロンを溶
出液の選定フラクシヨン中に高純度の状態で得る
ことからなる。インターフエロンを均質のタンパク質として製
造する方法の例としては、次の工程の組み合わせ
からなる方法をあげることができる：Ａ不純な状態のヒト白血球インターフエロンの
水溶液を緩衝液で平衡化したオクチル基が結合
したシリカのマトリツクスのカラムに、高速液
体クロマトグラフイー条件下に通してインター
フエロンをカラム上へ吸着させ、その後インタ
フエロンをカラムから増加する勾配の水性の緩
衝した水混和性溶媒で溶離し、そしてインタフ
エロンを溶出液の選定フラクシヨン中に高純度
の状態で得；Ｂ工程Ａ）において得られる選ばれたインター
フエロンのフラクシヨンを、緩衝液で平衡化し
たグリセリル基が結合したシリカのマトリツク
スのカラムに高速液体クロマトグラフイー条件
下に通してインターフエロンをカラム上へ吸着
させ、その後インターフエロンをカラムから減
少する勾配の水性の緩衝した水混和性溶媒で溶
離し、そしてインターフエロンを明確な主ピー
クとして溶出液の選定フラクシヨン中に高純度
の状態で得；Ｃ工程Ｂにおいて得られる明確な主ピークの１
つに相当するインタフエロンの選定フラクシヨ
ンの緩衝溶液を、緩衝液で平衡化したオクチル
結合シリカのマトリツクスのカラムに、高速液
体クロマトグラフイー条件下に通してインタフ
エロンをカラム上へ吸着させ、その後インター
フエロンをカラムから増加する勾配の水性の緩
衝した水混和性溶媒で溶離し、そしてインター
フエロンを単一の明確なピークとして溶出液の
選定フラクシヨン中に均質なタンパク質の状態
で得、そして、必要に応じて、工程Ｃの操作を
反復して究極の均質性を達成する。本発明はまたこの改良された方法によつて得ら
れる純すいかつ均質なインタフエロン種に関す
る。この方法において使用するオクチルまたはグリ
セリル変性多孔質シリカの微粒子のカラム（粒度
＝10μ；平均孔大きさ＝100Å）としては、アメ
リカ合衆国ニユーヨーク州エルムスフオードの
EMラボラトリーズ（EM Laboratories of
Elmsford，N.Y.，USA）から、商標Lichrosorb
RP−８およびLichresorbジオールとして入手で
きる商品が例示できる。同等のオクチル変性多孔
質カラム（Chromegabond Ｃ−８として識別さ
れる）は、アメリカ合衆国ニユージヤージー州マ
ールトのE.Sインダストリーズ（E.S.Industries，
Marlton，N.J.，USA）から入手することができ
る。前述のカラムを利用する便利な高圧液体クロマ
トグラフイー系は米国特許第4116046号に記載さ
れている。この方法を実施する場合、不純な高分子量のペ
プチドの、好ましくは問題のタンパク質の性質と
適合するPHにおける緩衝水溶液中の溶液をシリカ
のマトリツクスのカラムに通す。通常、この操作
は加圧下に、好ましくは約50〜約5000psi（3.4〜
340気圧）の範囲において実施する。タンパク質
をカラムに吸着させ、次いで水と混和性の溶媒の
勾配を用いて選択的方式で継続して溶離する。こ
の目的に適した水混和性の溶媒の例は、アルカノ
ール、たとえばｎ−プロパノ−ル、２−プロパノ
ール、エタノール、メタノール、ｔ−ブタノール
または環式エーテル、たとえばジオキサンであ
る。溶離液の分別は、フラクシヨン・コレクター
を使用し、それ自体知られた方法により、各フラ
クシヨン中のタンパク質含量を、高感度で動作す
るペプチドモニターで同時に監視することによつ
て達成する。この目的に適当な系はBohlen et
al.，Anal.Biochem.67，438（1975）に開示されて
いる。また、ターゲツト・タンパク質の存在を適
当な生物検定により監視することが好ましい。両方のカラム（「順相」分配クロマトグラフイ
ーのためのカラムおよび逆相クロマトグラフイー
のためのカラム）を用いるかどうか、そうする場
合どの順序を選ぶかについての決定は、大部分精
製すべきタンパク質の性質に依存する。たとえ
ば、人の白血球のインターフエロンの特定の場合
において、まず不純なインターフエロン溶液を、
PH約7.5の緩衝液、望ましくは1Mの酢酸ナトリウ
ム−酢酸系を用いるオクチル結合シリカマトリク
スカラムに通して分離し、増加する濃度勾配のｎ
−プロパノールで溶離し、次いで集めた活性なフ
ラクシヨンを0.1Mの酢酸ナトリウム中のグリセ
リル結合シリカマトリツクスカラムに通し、低下
する濃度勾配のｎ−プロパノールで溶離し、最後
に分離したインターフエロン成分をオクチル結合
シリカマトリツクスカラムに、約4.0の緩衝液の
PH、好ましくは1Mのピリジン−2Mのギ酸系を用
いて通し、そして増加する濃度勾配のｎ−プロパ
ノールで溶離することによつて、最良の結果が達
成されることがわかつた。このようにして、人の
白血球のインターフエロンの３つの別々の形態
（α，βおよびγ）の各々は均質なタンパク質を
表わす別々の鋭いピークに分離することができ
る。第２のオクチル結合シリカマトリツクスクロ
マトグラフイー工程に対する培地を用いて出発す
る全体の精製は、60000〜80000倍であつたが、グ
リセロール結合シリカマトリツクスのクロマトグ
ラフイー工程を通した累積収率は30〜50％の範囲
であつた。人の白血球のインターフエロンの精製法の特定
の態様において、工程Ｂからの選定ピークフラク
シヨンを集め、ｎ−プロパノールをｎ−ヘキサン
で抽出して除去し、そして微量のｎ−ヘキサンを
工程Ｃへ進む前に水相から除去する。この新規方法により得られる均質な人の白血球
のインターフエロンの種の各々は、前述のHPLC
カラム上の鋭いピークと、２−メルカプトエタノ
ールの存在下のドデシル硫酸ナトリウム
（NaDodSO₄）ポリアクリルアミドゲル電気泳動
上の単一の狭い帯とを示した。このゲルを抽出す
ると、タンパク質帯と一致する抗ウイルス活性の
単一の鋭いピークが得られた。この純粋なインタ
ーフエロンの種の比活性は、MDBKの牛の細胞
で約0.9〜4.0×10⁸の範囲であり、そしてAG1732
の人の細胞系で約２×10⁶〜４×10⁸であることが
わかつた。各インターフエロン種の比活性を表４
に示す。この比活性は、ウイルスの細胞変性効果
に基づくインターフエロンの抗ウイルス活性の測
定方法であるCPE分析（細胞変性効果阻止検定）
により測定した。用いた細胞系はウシ細胞MDBKおよびヒト細
胞AG1732であり、これらはイーグルの最小必須
倍地MEM−10に単層培養されているものであ
る。用いたウイルスは、マウスＬ細胞の単層培養
中に生育させ、MEM−10中に凍結保存した水疱
性口内炎ウイルス（VSV）である。被験インタ
ーフエロンサンプルはMEM−10を用いて希釈す
る。マイクロタイタープレートにまずインターフエ
ロンサンプルを注入し、MEM−10中のMDBK
およびAG1732細胞系を加え、VSVを接種し、そ
して37℃で16時間アンキユベートする。VSVに
よる細胞変性を50％抑制するインターフエロン濃
度（ID₅₀）を1U／mlとし、この値に希釈倍率を
乗じ、更に同時に測定した標準インターフエロン
のID₅₀を示す濃度（Ｕ／ml）に基づく補正を行な
つてインターフエロンサンプルの抗ウイルス活
性、つまり表４に示す比活性を得た。分子量は表
４に見られるように約16000〜21000の範囲であつ
た。アミノ酸分析の結果は表５に要約されてい
る。インターフエロン類は抗ウイルス活性、制癌活
性、発育阻害活性および免疫抑制活性を示す。こ
れらの活性、人のインターフエロンが１％より少
ない比較的粗製の製剤を用いて１〜10×10⁶単
位／日を用いる臨床レベルにおいてさえ得られ
た。本発明の精製された均質なインターフエロン
類は、従来用いられた粗製の製剤と同じ方法で投
与量を調整して望むレベルのインターフエロン単
位を与えるようにして使用することができる。個
個の種はそのまま使用することができ、或いはこ
のような種の２種以上の混合物を使用することも
できる。このような混合物は、単離した種を望む
ように混合することによつて得ることができ、或
いはインターフエロンの幾つかの種が存在する
が、非インターフエロンの活性なタンパク質が存
在しなにいところで精製を停止し、組成物が均質
なインターフエロンタンパク質の混合物であるよ
うにすることによつて、得ることができる。インターフエロンの産生の誘導、インターフエ
ロンの初期濃度およびゲル濾過を含むインターフ
エロンの分別はこの分野でよく知られた方法を用
いて達成することができる。不純な状態のインタ
ーフエロンの水溶液を生成するこれらの操作は本
発明の一部分ではない。本発明をさらに以下の実施例により例証する。実施例１正常提供者からの均質なヒト白血球のインター
フエロンＡインターフエロンの製造カゼイン（10mg／ml）を含有する血清不含最小
必須培地中で、正常の提供者の血液からのヒト白
血球（10⁷細胞／ml）を、ニユーカツスル
（Newcastle）病ウイルス（15血球凝集単位／ml）
と16時間培養することによつて、インターフエロ
ンを産生させた。5000単位／mlの平均インターフ
エロンの力価を得た。用いた操作はMogensen，
K.E.et al.，Pharmacology and Therapeutics
Ａ，1977，369−381；Wheelock，E.F.，J.
Bactariol.92，1415−1421（1966）およびCantell，
K.et al.，Appl.Microbiol.22，625−628（1971）
に報告された方法を多少変更したものであつた。
インターフエロンの力価は、細胞変性効果−阻止
検定によつてい測定し、この検定は16時間以内で
実施することができた。すべてのインターフエロ
ンの力価は参照単位／mlで表わし、これはナシヨ
ナル・インスシチユート・オブ・ヘルス［the
Natioinal Institute of Health（USA）］により
提供されたヒト白血球インターフエロンの参照標
準品に対して補正した。Ｂインターフエロンの濃度および初期の分画特に示さないかぎり、これらの操作は０〜４℃
で実施した。培養の終りにおいて、細胞および残
屑（debris）を低速遠心分離（15分、500×ｇ）
により除去した。カゼインをHCIでPH4.0に酸性
化することによつて沈殿した。２時間後、この混
合物を遠心分離（10分、12000×ｇ）し、そして
ペレツトを廃棄した。上層（10）を15％（Ｗ／
Ｖ）のトリクロロ酢酸に調整した。１時間後、沈
殿を遠心分離（10分、12000×ｇ）により集め、
そして50mlの0.1MのNaHCO₃中に再溶解した。
トリトン×−100（0.5ｇ）を加え、次いで酢酸
（15ml）をかきまぜながら滴々加えた。この混合
物を０℃で１時間、次いで−20℃で16時間貯蔵し
た。次いでそれを解凍し、遠心分離（10分、
17000×ｇ）した。ペレツトを廃棄し、上層を４
％のトリクロロ酢酸に調整した。１時間後、この
混合物を遠心分離（10分、12000×ｇ）した。沈
殿物を集め、そして５mlの0.5モルのNaHCO₃中
に再溶解した。Ｃゲル濾過尿素（1.5ｇ）をインターフエロンの濃縮物に
加え、そしてこの溶液を4Mの尿素／0.1Mの酢酸
ナトリウム緩衝液で前もつて平衡化したセフアデ
ツクス（Sephadex）Ｇ−100の微細粒子のカラム
（2.6×90cm）に通した。このカラムを4Mの尿
素／0.1Mの酢酸ナトリウム、PH7.5で、室温にお
いて0.5ml／分の流速で溶離した。12.5mlのフラ
クシヨンを集めた。インターフエロンの活性はフ
ラクシヨン19−23中に溶出された。Ｄ高速液体クロマトグラフイーセフアデツクスＧ−100の試験のフラクシヨン
19−23を合わせ、直接ポンプを経てリクロソルブ
（Lichrosorb）R.P−８カラム（10μ、4.6×250
mm）に通した。このカラムは0.01％（Ｖ／Ｖ）の
チオジグリコールを含有する１モルの酢酸ナトリ
ウム緩衝液（PH7.5）で前もつて平衡化し、次い
で直線の濃度勾配のｎ−プロパノールで同一緩衝
液中で0.25ml／分の流速で溶離した［１時間、０
〜20％；３時間、20〜40％（Ｖ／Ｖ）］。0.75mlの
フラクシヨンを集めた。インターフエロンはフラ
クシヨン23〜40［25〜30％（Ｖ／Ｖ）のｎ−プロ
パノール］中に溶出された。インターフエロン活性のほとんどを含有するフ
ラクシヨン27〜33を合わせ、ｎ−プロパノールを
80％（Ｖ／Ｖ）の最終濃度まで加え、そしてこの
溶液を、80％（Ｖ／Ｖ）のｎ−プロパノールを含
有する0.1Mの酢酸ナトリウムの溶液で前もつて
平衡化したリクロソルブ・ジオールのカラム
（10μ、4.6×250mm）にポンプを経て通した。次い
でこのカラムを0.1Mの酢酸ナトリウム中で４時
間の直線の勾配の72〜50％（Ｖ／Ｖ）のプロパノ
ールで0.25ml／分の流速で溶離した。0.75mlのフ
ラクシヨンを集めた。インターフエロン活性は３
つの明確な主ピークとして溶出され、それらのピ
ークは製造ごとに定量的に変化した。これらのピ
ークは溶出の順序に従つてα、βおよびγと表示
した。α−フラクシヨンは68％のｎ−プロパノー
ルの濃度で、β−フラクシヨンは66.5％のｎ−プ
ロパノールで、γ−フラクシヨンは65.5％のｎ−
プロパノールで溶出された。インターフエロンの
活性の合計の回収率は80％より高かつた。各ピークからなるフラクシヨンを別々に集め、
継続する工程を経て個々に精製した。ピークγは
多量で存在しそして他の成分からよく分割される
ように思われたので、それをさらに精製するため
に選んだ。ジオールカラムからのピークγからな
るフラクシヨン54−56を集め、そして１−プロパ
ノールを等体積のヘキサンで２回抽出することに
よつて除去した。微量のヘキサンを窒素流のもと
に除去した。ピリジンとギ酸をそれぞれ1Mと2M
の最終濃度に加え、そしてこの溶液を1Mのピリ
ジンおよび2Mのギ酸（PH4.0）で前もつて平衡化
したリクロソルブR.P−８カラム（10μ；4.6×
250mm）に加える。このカラムを1Mのピリジン／
ホルメート緩衝液中で直線の20〜40％の１−プロ
パノールの勾配で３時間以内で0.2ml／分の流速
で溶離した。0.6mlのフラクシヨンを集めた。活
性の主ピークはタンパク質のピークと一致した。
このピークからなるフラクシヨン45および46（32
％、Ｖ／Ｖ、プロパノール）を合わせ、同様な条
件で再クロマトグラフ処理した。インターフエロ
ンはフラクシヨン31（32％、Ｖ／Ｖ、プロパノー
ル）中に溶出された（第１図参照）。このフラク
シヨンの比活性は牛血清アルブミンに関して４×
10⁸単位／mgであると計算された。この物質（フ
ラクシヨン31）はさらに以下に述べるアミノ酸分
析等に使用した。この高速液体クロマトグラフイ
ーのパターンを蛍光検出にかけたところ、その再
現性は顕著で、そのパターンの同一性を証明する
ことができた。精製の結果を表１に要約する。最初の培地から
第２のR.P−８カラムまでの全体の精製度は
60000〜80000倍であつた。工程１からジオール工
程を通じた累積収率は30〜50％の範囲であつた。
この工程以降は、インターフエロンの３つのピー
クの各々は別々に精製した。【表】各フラクシヨン中に回収されたタンパク質を測
定するため、牛血清アルブミンを標準として使用
した。工程10の均質なピークのアミノ酸分析によ
つて測定した絶対比活性は２〜４×10⁸単位／mg
であることがわかつた（明細書参照）。工程９は
工程８のピークγについて実施した。工程10はい
くつかの調製物の工程９から集めた物質について
実施した。ND＝測定せず。Ｅポリアクリルアミドゲル電気泳動インターフエロンの試料（1.5×10⁵単位）を
NaDodSO₄および２−メルカプトエタノール中
にインキユベートし、次いでスラブ・ゲル（slab
gel）に加えた。電気泳動後、クーマツシー・ブ
ルー（Coomassie blue）を用いて着色すると単
一の鋭い帯が得られた。見掛けの分子量は標準タ
ンパク質と比較して17500と推定された。次いで
ゲルを１mmの薄片に切つた。各薄片を0.4mlの
0.5MのNaHCO₃／0.1％のNaDodSO₄中で均質化
し、そしてインターフエロンの活性を測定した。
抗ウイルス活性の単一ピークが得られ、これは上
記単一のタンパク質の帯と一致した（第２図参
照）。その他の活性ピークは観測されなかつた。Ｆアミノ酸の分析均質なヒト白血球インターフエロン（ピーク
γ）のアミノ酸分析を、フルオレスカミン
（fluorescamine）のアミノ酸分析器で、0.5〜1μ
ｇの生来の（native）インターフエロンおよびＳ
−カルボキシメチル化したインターフエロンの資
料について実施した。システイン／シスチンの比
を測定するため、生来のインターフエロンをカル
ボキシメルチル化し、次いで6MのHCI中で還元
条件（0.1％のチオグリコール酸）のもとで加水
分解した。これらの条件下で、システインはＳ−
カルボキシメチル化システインとして測定され、
これに対しシスチンは遊離のシステインとして測
定される。アミノ酸の分析値を表２中に要約す
る。アミノ酸含量に基づく比活性は２〜４×10⁸
単位／mgであることがわかつた。表２ヒト白血球インターフエロンのアミノ酸組成アミノ酸残基 Asx 15.2±1.2 Thr^* 7.5±0.5 Ser^* 8.0±0.5 Glx 24.0±0.6 Pro 6.3±0.3 Gly 5.5±0.5 Ala 8.2±0.2 Cys（合計） 3.3±0.7 1/2シスチン⁺ 1.8±0.2 システイン⁺ 1.5±0.5 Val 7.8±0.2 Met 3.9±0.2 Ile 8.9±0.4 Leu 21.8±1.3 Tyr 5.1±0.2 Phe 9.1±0.3 His 3.3±0.4 Lys 11.6±0.5 Arg 7.3±0.5 TrP⁺⁺ 0.7±0.1 ＊時間０に補正した。＋生来のインターフエロンのカルボキシメチル
化後に測定した。＋＋６モルのHCl／４％のチオグリコール酸中で
加水分解後に測定した。実施例２白血病患者の白血球からの均一なヒトの白血球
のインターフエロンロイコフオレシス（leukopheresis）により、
白血病患者（慢性骨髄性白血病、CML）の血液
から単離したヒトの白血球を、カゼイン含有血清
不含培地中でニユーカツスル病ウイルスと培養す
ることによつてインターフエロンを製造した。
5000〜40000単位／mlのインターフエロンの力価
が普通の試験で得られた。精製操作は正常の血液（実施例１）からのイン
ターフエロンについて記載したものと同一であ
り、そしてトリトンＸ−100の存在下の0.5Mの酢
酸による沈殿、4Mの尿素中のセフアデツクスＧ
−100を用いるゲル濾過、PH7.5におけるリクロソ
ルブRP−８を用いるHPLC、リクロソルブ・ジ
オールを用いるHPLCおよびPH4.0におけるリク
ロソルブRP−８を用いるHPLCを包含していた。リクロソルブ・ジオールのカラムからのα−、
βおよびγ−ピークからなるフラクシヨンを別々
に集め、そして継続する工程で個々に精製した。フラクシヨン43−46（α−ピーク）を集め、ｎ
−プロパノールを等体積のｎ−ヘキサンで２回抽
出することによつて除去した。微量のヘキサンを
窒素流のもとでで除去した。ピリジンとギ酸をそ
れぞれ1Mと2Mの最終濃度に加え、この溶液を
1Mのピリジン／2Mのギ酸（PH4.0）で前もつて
平衡化したリクロソルブRP−８カラム（10μ、
4.6×250mm）に通し、このカラムを1Mのピリジ
ンホルメート緩衝液中で直線の20〜40％（Ｖ／
Ｖ）ｎ−プロパノールの勾配で３時間以内に0.2
ml／分の流速で溶離した。0.6mlのフラクシヨン
を集めた。インターフエロンの活性を31〜35％
（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールの範囲の広いピーク
として溶離した。これらのフラクシヨンを合わ
せ、同一条件下に再クロマトグラフ処理した。イ
ンターフエロンの活性は31％および32％（Ｖ／
Ｖ）ｎ−プロパノールにおいて２つの主ピーク
（α₁およびα₂）中に溶出された。少量の成分は34
％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールにより溶出され
た。リクロソルブ・ジオールのカラムからのフラク
シヨン47〜50（ピークβ）を集め、ピークαにつ
いて前述したように処理し、リクロソルブRP−
８でクロマトグラフ処理した。インターフエロン
の活性は２つの主ピーク：32％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プ
ロパノールにおいてβ₂および34％（Ｖ／Ｖ）ｎ−
プロパノールにおいてβ₃中に溶出された。この場
合、再クロマトグラフ処理は不必要であつた。い
くつかの製造において、31％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロ
パノールで溶出されるβ₁と表示するピークが観測
された。リクロソルブ・ジオールのカラムからのフラク
シヨン52−54（ピークγ）を集め、そしてピーク
αについて前述したように処理し、リクロソルブ
RP−８でクロマトグラフ処理した。インターフ
エロン活性は５つの主ピーク、すなわち：γ₁（31
％ｎ−プロパノール、Ｖ／Ｖ）、γ₂（32％ｎ−プロ
パノール、Ｖ／Ｖ）、γ₃（34％ｎ−プロパノール、
Ｖ／Ｖ）、γ₄（35％ｎ−プロパノール、Ｖ／Ｖ）、
およびγ₅（35.5％ｎ−プロパノール、Ｖ／Ｖ）中
に溶出された。この場合、再クロマトグラフ処理
は不必要であつた。【表】いて測定したタンパク質
インターフエロンの個々の種を得た精製の結果
を表３に要約する。種α₂およびβ₂はリクロソルブ・ジオールのカラ
ムの溶出特性によつてさらに区別される：α₂は68
％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールで、そしてβ₂は
66.5％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールで、それぞれ
溶出される。インターフエロン種の試料（1.5×10⁵単位）を
NaDodSO₄および２−メルカプトエタノール中
にインキユベートし、次いでスラブ・ゲルに加え
た。電気泳動後、ピークα₁，α₂，β₂，γ₁，γ₂およ
びγ₄は単一の帯を与えたが、ピークβ₃，γ₃および
γ₅は２つの帯を与えた。見掛けの分子量はすべて
16000〜18000の範囲に入るが、ただしβ₃は16500
と21000の帯を与え、そしてγ₄は21000の帯を与え
た（表４参照）。精製したヒト白血球インターフエロンのフラク
シヨンのアミノ酸分析は、フルオレスカミン
（fluorescamine）アミノ酸分析器を用い0.5〜1μ
ｇのインターフエロンの試料について実施した。
加水分解を6NのHCl中で還元条件（0.1％のチオ
グリコール酸）下に行つた。分析の結果を表５に
要約する。【表】この方法は感受性のヒトリンパダウデイセルラ
イン（バーキツトリンパ腫細胞）に対するインタ
ーフエロン発育阻害作用を測定するものである。
同発育阻害作用は、１〜２×10⁵ダウデイ細胞／
mlにインターフエロンを加え、37℃で３日間培養
後、細胞数を測定し、無処理培養中の細胞数とイ
ンターフエロン処理培養物中の細胞数とを比較し
て細胞数減少を示すものを＋とした。【表】【表】精製したヒトの白血球のインターフエロンのい
ろいろな種（300ピコモル、6μｇ）を重炭酸ナト
リウムの水溶液（50mM、PH8.5、50μ）中に溶
かした。トリプシン（2μのHCl、PH３、中の
0.1μｇ）を加え、この混合物を37℃で14時間培養
した。酢酸（5μ）を加え、この混合物をリク
ロソルブRP−８カラム（10μの粒度、4.6×250
mm）に通した。このカラムを0.5ml／分において
１時間0.1Mのギ酸／0.03Mのピリジン緩衝液
（PH３）中で０〜40％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノー
ルの直線の勾配を用いて溶離した。ペプチドをフ
ルオレスカミン監視系により検知した。結果は表
６に記載されており、そして％ｎ−プロパノール
およびピークの相対大きさ（Ｓ＝小、Ｍ＝中、Ｌ
＝大）で表わされている。【表】【表】精製したヒト白血球インターフエロンの種を、、
アミノ糖を50〜100ピコモルのレベルで同定でき
るアミノ糖分析に付した。すべての場合におい
て、グルコースアミンおよびガラクトース／マン
ノースアミンは１残基／分子より小であつた。ほ
とんどの場合において、アミノ糖の近くに溶出さ
れる多くの小さなペプチドがこの分析をさまたげ
た。こうして、アミノ糖に割当てられたピークで
さえも少なくともこの一部はペプチドによるもの
でありうる。最後に、逆加水分解（back hydrolysis）およ
びフルオレスカミンを用いるアミノ酸分析を含む
エドマン（Edman）法によより１ナノモルの純
粋なγ₂インターフエロンの配列を決定する試み
は、サイクル１および２についてアミノ酸を与え
なかつた。100ピコモルの純粋なγ₂のヒト白血球
のインターフエロンをロイシンアミノペプチダー
ゼおよびアミノペプチダーゼＭで37℃で20時間処
理したが、生物学的活性は影響を受けず、そして
いかなるアミノ酸も反応液中に検出されなかつ
た。誘導培地（最小必須培地中の白血球およびニ
ユーカツスル病ウイルス）の上清をアミノペプチ
ダーゼで処理しても、インターフエロンの活性の
損失はみられなかつた。このことはインターフエ
ロン分子は精製前にさえブロツクされたNH₂末
端を有することを示す。対照として粗製インター
フエロンならびに純粋なインターフエロンおよび
インシユリンのβ−鎖をアミノペプチダーゼＭと
一緒にインキユベートした。インシユリンはアミ
ノ酸の放出によつてわかるように部分的に消化さ
れたが、インターフエロン活性の損失は観測され
なかつた。実施例３ (a) ２×10⁸単位／mgの比活性をもつ均質なヒト
の白血球のインターフエロンの合計で３mgを、
５％の正常な人の血清アルブミンの25ml中に溶
かした。この溶液を細菌学的フイルターに通
し、濾過した溶液を無菌的に100個の小びんに
分割して入れた。各小びんは、非経口投与に適
した６×10⁶単位の純粋なインターフエロンを
含有した。小びんは使用前冷蔵（−20℃）する
ことが好ましい。 (b) 各々がほぼ自然に得られる比率で存在する、
1.5mgの集めた均質なインターフエロンの種α₁，
α₂，β₂，γ₁およびγ₂を含有し、この貯蔵した混
合物が約２×10⁸単位／mgの比活性を有し、そ
してさらに100mgの正常なヒト血清アルブミン
を含有する水溶液を細菌学的フイルターに通
し、そして濾過した溶液を無菌的に100個の小
びんに分割して入れた。各小びんは約３×10⁶
単位の純粋な集めたインターフエロンと１mgの
ヒト血清アルブミンを含有するであろう。非経
口投与に適したインターフエロンを含有する小
びんは使用前冷蔵（−20℃）することが好まし
い。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト白血球インタフエロン活性に合致
するピークを示す本発明のヒト白血球インタフエ
ロンの高速液体クロマトグラフイーである。第２
図は本発明のヒト白血球インタフエロンが単一の
バンドを示すドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動図である。

Claims

【特許請求の範囲】１(a) ドデシル硫酸ナトリウムを含まず； (b) 順相および／または逆相高速液体クロマトグ
ラフイーにおいてヒト白血球インタフエロン
活性に合致するピークを示し； (c) 分子量約16200±1000〜約21000±1000であ
り； (d) 次の工程Ａヒト白血球インタフエロンを含む水溶液
を、緩衝液で平衡化した、シアノプロピ
ル、シクロヘキシル、フエニル、オクチ
ル、またはオクタデシル基が結合した、シ
リカマトリクスカラムに、高速液体クロマ
トグラフイー条件下に通してインタフエロ
ンをカラムに吸着させ、その後インタフエ
ロンを増加する勾配の水性の水混和性溶媒
で溶離し、そしてインタフエロンを溶出液
の選定フラクシヨン中に高純度の状態で
得、Ｂヒト白血球インタフエロンの水溶液を緩衝
液で平衡化した、シアノプロピルまたはグ
リセリル基が結合した、シリカマトリクス
カラムに、高速液体クロマトグラフイー条
件下に通してインタフエロンをカラムに吸
着させ、その後インタフエロンを減少する
公配の水性の水混和性溶媒で溶離し、そし
てインタフエロンを溶出液の選定フラクシ
ヨン中に高純度の状態で得、およびＣ工程Ａを反復し、ならびに、所望により工程Ａ）および／または工程
Ｂ）を繰返すことにより最終的に均質性を
得る、を組合せることからなる方法により得ることが
できる；均質な蛋白質としてのヒト白血球インタフエロ
ン。２１または２以上の種を含有する請求項１に記
載のヒト白血球インタフエロン。