JPS63164897A

JPS63164897A - ヒト白血球インタフエロン

Info

Publication number: JPS63164897A
Application number: JP62310788A
Authority: JP
Inventors: シドニイ・ペストカ; メナヘム・ルビンシユタイン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1978-11-24
Filing date: 1987-12-08
Publication date: 1988-07-08
Also published as: JPS5594320A; JPS6338330B2; ZA796175B; JPH031320B2; MW3379A1; JPS58192896A; JPS6261040B2; MTP857B; AT367769B; ATA745379A; HU182500B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質の精製は長い間ペプチド化学における大きな
問題であった。これまで用いられてきた技術としては、
沈殿、°ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ル電気泳動、親和性クロマトグラフィーおよびその他非
常に多くの方法がある゛。

天然に産出する、極めて低濃度で生物学的試料中に存在
する高分子量のタンパク質を単離しようとする計画は、
前述の技術を利用する多工程法であった。このような多
くの場合、精製の後段階において生成物のかなりのロス
があるので、極めて大量の粗製出発物質を集め、そして
処理しなくてはならない。これには高い経費と通常多く
の労力を要する。

問題の１つの適当なケースはインターフェロン（１ｎｔ
ｅｒｆｅｒｏｎ）を単離および特徴づける多数の試みの
歴史である。アイザック（ｌ５ａａｃｓ）およびリンデ
ンマン（Ｌｉｎｄｅｎｌｌｌａｎｎ）による最初の発見
以来、２０年にわたって全世界の研究音速はインターフ
ェロンをそれが白血球型であろうとまた線維芽細胞型で
あろうと、均質なペプチドとして、その特定の生物学的
または化学的性質を特徴づけ且つ同定できるのに十分な
量で単離しようとしたが、不成功に終った。

アイザックおよびリンデンマンのインターフェロンを用
いる元の研究に関する米国特許第３，６９９．２２２号
において、活性物質の精製は硫酸アンモニウムの沈殿お
よびそれに引き続く透析に限定されている。このような
方法は比較的非特定的であり、こうしてそれによって得
られる生成物はなお極めて粗製状態である。

インターフェロンを精製する多工程法は米国特許第３．
４１４．６５１号に開示されており、この多工程法は非
晶質アルミノ−シリケート上の選択的吸着、ヨウ素また
はチオシアネートの溶液を用いる溶離、さらにＭＣＩ水
溶液、次いでＮａＯＨを用いる望まないタンパク質の沈
殿、水混和性溶媒、たとえばメタノール、エタノールま
たはアセトンを用いるインターフェロンの塩基溶液から
の沈殿、および最後に２−ジエチルアミノエチル−セル
ロースのような陰イオン交換樹脂による再溶解したイン
ターフェロンのクロマトグラフィーを用いて、その比活
性がこの全プロセスにより６．０００倍に高められたと
示されるインターフェロンを生成する。例示された特定
のインターフェロンはヒヨコとサルのインターフェロン
であった。

ほかの精製法は米国特許第３．９７５，３４４号に教示
されてお゛す、ここでは細胞培養の培地から誘導された
粗製の人の線維芽細胞のインターフェロン溶液が区域密
度勾配の超遠心分離によって精製されている。この技術
はセファデックス（ｓｅｐｈｔｉｅｘ　）　Ｇ　−１０
０を用いる普通のカラムクロマトグラフィーで得られる
より高い収率および精製を与えることが示された。

インターフェロンの精製および特性づけに関する最近の
科学文献は、次のように要約することができる：Ｋｎｉｇｈｔ、Ｅ、、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７旦、５２０−３　（１９
７６）：Ｔｉ１ｉｒａ＋ｊ、　　Ｅ、Ｔ、　　ｅｔ　ａｔ、、　
　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｔ　　２５１４８１０
−６　　（１９７６）　　：Ｂｒｉｄｇｅｎ、　　Ｐ、　　Ｊ、　　ｅｔ　ａｔ、、
　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｎ＋、　　２５２　
。

６５８５−７　　（１９７７）：ＤｅＨａｅｙｅｒ−Ｇｕｉｇｎｏｒｄ、　　Ｊ、　　ｅ
ｔ　　ａｌ、、　　Ｎａｔｕｒｅ　　２７１　。

６２２−５　　（１９７８）　　；にａｗａｋｅｔａ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋＋、　ｚ旦ユ。

５９８−６０２　　（１９７８）：Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、　Ｉｌ、　　ａｔ　ａｌ、、　　Ｊ
、　　Ｂｉｏｌ、　　ＣｈｅＩＩｌ、　　２５３　。

５２０６−１１　　（１９７８）　　：ＪａｎｋＯＷａ
ｋｉ、　１４．　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　ＶｉｒＯ
ＩＯ！ＩＶ　ｊＪＪ、　　１１２４−３０　　（１９７
５）　　：Ｄａｖｅｙ、　Ｈ，Ｌ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　ｚ旦１゜７６２０−５　　（１９
７６）；Ｃｈａｄｈａ、　　に、　　Ｃ，ａｔａｔ、、
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　工ｌ、１９６−２０
０　（１９７８）。

上記の文献のいくつかはマウスまたは人のインターフェ
ロンを均質に精製したと述べているが、タンパク質の均
質性の古典的証明が与えられておらず、あるいは記載さ
れている純粋といわれる化合物の性質は記載されていな
い。

タンパク質の精製に高性能液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）を使用することは一般に技術的に知られている
。これらの参考書は特定的にタンパク質の精製における
イオン交換および大きさ排除型のカラムを記載している
。たとえば、ＲｅＣ１ｎ１ｅｒ、　Ｆ、　Ｅ、　１ｌｌ
ｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ＣｈｒＯＩａｔＯＩＪ、　Ｓｅｔ
、　　１４．３１６−２０　（１９７６）およびＣｈａ
ｎｇ。

Ｓ、−Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｌ、　
４８．１８３９−４５（１９７６）参照。

逆相（ｒ１３Ｖｅｒｓｅ　ＤｈａＳｅ　）分配りＯＶト
ゲラフイーにおけるリクロソルブ（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒ
ｂ）　ＲＰ　−１８（オクタデシル結合シリカ微粒子カ
ラム）の使用は、β−エンドルフィンのようなペプチド
を精製するために成功したものである［たとえば、Ｒｕ
ｂｉｎｓｔｅｉｎ、　Ｈ，ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　７４．４９６９−７２　（１９７７
）］。

最後に、マウスのＥｈｒｌｉｃｈ腹水症の腫瘍細胞から
のインターフェロンの３種（分子１ｔ−３３，０００，
２６，０００Ｊ５よび２０．０００）１７）部分的特性
づけは、Ｃａｂｒｅｒ、　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ　。

２５４．３６８１−４　（１９７９）に記載されている
。

本発明は、均質タンパク質であり、ドデシル硫“　酸ナ
トリウムを含まず、分子暖が約１６．２００±１，００
０〜約２１．０００±１．０００であり、インターフェ
ロン活性がウシ細胞ＭＤＢＫの場合、比活性０．９Ｘ１
０８−４．０ｘｌＯ８単位／ηタンパク質であり、かつ
ヒト細胞系ＡＧ１７３２の場合、比活性２ｘ１０６−４
．０ｘ１０８単位／ｍｇタンパク質であることを特徴と
するヒト白血球インターフェロンに関する。

本発明の均質なタンパク質としてのインターフェロンは
、この医薬として重要な物質の化学特性づけを初めて可
能にする純すいなインターフェロンを十分な量で提供す
る新規製造方法により得られた。インターフェロンの化
学的特性づけを可能にしたことはこの物質の開発におけ
る有意な進歩を表わす。なぜなら、これにより、誘過の
ペプチド合成法により、或いはインターフェロンアミノ
酸配列に相当するＤＮＡを合成し、そしてこのようなり
ＮＡを適当な有機体、好ましくはバクテリア中に、ＤＮ
Ａ−組換え技術により導入することによって、インター
フェロンを合成できるからである。次いで、生ずる有機
体はインターフェロンを生成する能力を有し、これはｆ
ｆｌ酢技術を応用して商業的なレベルで従来まれな化合
物の便利な源を提供するように規模を大きくすることが
できる。

インターフェロンを均質なタンパク質として製造する方
法は、不純な状態のインターフェロンの水溶液をシアノ
プロピル、シクロヘキシル、フェニル、オクチル、オク
タデシルまたはグリセリル基を結合した多孔質シリカの
マトリックスの緩衝液で平衡化したカラムに、高速液体
クロマトグラフィー（）（ＰＬ（ｊ）の条件下に通して
インターフェロンをカラム上に吸着させ、その後このイ
ンターフェロンを増加する勾配または減少する勾配の水
性の水混和性溶媒で溶離し、そしてインターフェロンを
溶出液の選定フラクション中に高純度の状態で得ること
からなる。

インターフェロンを均質のタンパク質として製造する方
法の例としては、次の工程の組み合わせからなる方法を
あげることができる：Ａ）不純な状態のヒト白血球インターフェロンの水溶液
を緩衝液で平衡化したオクチル基が結合したシリカのマ
トリックスのカラムに、高速液体クロマトグラフィー条
件下に通してインターフェロンをカラム上へ吸着させ、
その後インターフェロンをカラムから増加する勾配の水
性の緩衝した水混和性溶媒で溶離し、そしてインターフ
ェロンを溶出液の選定フラクション中に高純度の状態で
得：Ｂ）　工程へにおいて得られる選ばれたインターフ
ェロンのフラクションを、緩衝液で平衡化したグリセリ
ル基が結合したシリカのマトリックスのカラムに高速液
体りＯマドグラフィー条件下に通してインターフェロン
をカラム上へ吸着させ、その後インターフェロンをカラ
ムから減少する勾配の水性の緩衝した水混和性溶媒で溶
離し、そしてインターフェロンを明確な主ピークとして
溶出液の選定フラクション中に高純度の状態で得；Ｃ）
工程Ｂにおいて得られる明確な主ピークの１つに相当す
るインターフェロンの選定フラクションの緩衝溶液を、
緩衝液で平衡化したオクチル結合シリカのマトリックス
のカラムに、高速液体り０マドグラフイ一条件下に通し
てインターフェロンをカラム上へ吸着させ、その後イン
ターフェロンをカラムから増加する勾配の水性の緩衝し
た水混和性溶媒で溶離し、そしてインターフェロンを単
一の明確なピークとして溶出液の選定クラクション中に
均質なタンパク質の状態で得、そして、必要に応じて、
工程Ｃの操作を反復して究極の均セリル変性多孔質シリ
カの微粒子のカラム（粒度＝１０μ；平均孔大きさ＝１
００人）としては、アメリカ合衆国ニューヨーク州エル
ムスフォード１７）ＥＭ７ボラトリーズ（ＥＨｔａｂｏ
ｒａｔｏｒｔｅｓ　ｏｆＥｌｍｓｒｏｒｄ、　Ｎ、Ｙｌ
、　ｌｌ５Ａ　）から、商標ＬｉＣｈｒＯ３ＯｒｂＲＰ
−８およびＬｉｃｈｒｅｓｏｒｂジオールトシテ入手テ
きる商品が例示できる。同等のオクチル変性多孔質カラ
ム（Ｃｈｒｏｍｍｅｇａｂｏｎｄ　　Ｃ−８として識別
される）は、アメリカ合衆国ニューシャーシー州マール
トのＥ、　　Ｓインダストリーズ（Ｅ、　Ｓ。

Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｈａｒｌｔｏｎ、　Ｎ、　Ｊ
、、　ＵＳＡ）から入手することができる。

前述のカラムを利用する便利な高圧液体クロマトグラフ
ィー系は米国特許第４．１１６．０４６号に記載されて
いる。

この方法を実施する場合、不純な高分子量のペプチドの
、好ましくは問題のタンパク質の性質と適合するｐＨに
おける緩衝水溶液中の溶液をシリカのマトリックスのカ
ラムに通す。通常、この操作は加圧下に、好ましくは約
５０〜約５，０００ｐｓｉ（３，４〜３４０気圧）の範
囲において実施する。タンパク質をカラムに吸着させ、
次いで水と混和性の溶媒の勾配を用いて選択的方式で継
続して溶離する。この目的に適した水混和性の溶媒の例
は、アルカノール、たとえばｎ−ブロパノール、２−プ
ロパノール、エタノール、メタノール、ｔ−ブタノール
または環式エーテル、たとえばジオキサンである。溶離
液の分別は、フラクション・コレクターを使用し、それ
自体知られた方法により、各フラクション中のタンパク
質含量を、高感度で動作するペプチドモニターで同時に
監視することによって達成する。この目的に適当な系は
Ｂｏｈｌｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　八ｎａ１．　　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　６　７　、　４３　８（１９７５
）に開示されている。また、ターゲット・タンパク質の
存在を適当な生物検定により監視することが好ましい。

両方のカラム（「順相」分配クロマトグラフィーのため
のカラムおよび逆相クロマトグラフィーのためのカラム
）を用いるかどうか、そうする場合どの順序を選ぶかに
ついての決定は、大部分精製すべきタンパク質の性質に
依存する。たとえば、人の白血球のインターフェロンの
特定の場合において、まず不純なインターフェロン溶液
を、ｐＨ約７．５の緩衝液、望ましくは１Ｍの酢酸ナト
リウム−酢酸系を用いるオクチル結合シリカマトリクス
カラムに通して分離し、増加する濃度勾配のｎ−プロパ
ノールで溶離し、次いで集めた活性なフラクションを０
．１Ｍの酢酸ナトリウム中のグリセリル結合シリカマト
リックスカラムに通し、低下する濃度勾配のｎ−プロパ
ノールで溶離し、最後に分離したインターフェロン成分
をオクチル結合シリカマトリックスカラムに、約４．０
の緩衝液のｐＨ１好ましくは１Ｍのピリジン−２Ｍのギ
酸系を用いて通し、そして増加する濃度勾配のｎ−プロ
パノールで溶離することによって、最良の結果が達成さ
れることがわかった。このようにして、人の白血球のイ
ンターフェロンの３つの別々の形態（α、βおよびγ）
の各々は均質なタンパク質を表わす別々の鋭いピークに
分離することができる。第２のオクチル結合シリカマト
リックスクロマトグラフィ一工程に対する培地を用いて
出発する全体の精製は、６０，０００〜８０．０００倍
であったが、グリセロール結合シリカマトリックスのク
ロマトグラフィ一工程を通した累積収率は３０〜５０％
の範囲であった。

人の白血球のインターフェロンの精製法の特定の態様に
おいて、工程Ｂからの選定ピークフラクションを集め、
ｎ−プロパノールをｎ−ヘキサンで抽出して除去し、そ
して微量のｎ−ヘキサンを工程Ｃへ進む前に水相から除
去する。

この新規方法により得られる均質な人の白血球のインタ
ーフェロンの種の各々は、前述のＨＰＬＣカラム上の鋭
いピークと、２−メルカプトエタノールの存在下のドデ
シル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４）ポリアクリル
アミドゲル電気泳動上の単一の狭い帯とを示した。この
ゲルを抽出すると、タンパク買得と一致する抗ウィルス
活性の単一の鋭いピークが得られた。この純粋なインタ
ーフェロンの種の比活性は、ＭＤＢＫの牛の細胞で約０
．９〜４．０Ｘ１０８の範囲であり、そしてＡＧ１７３
２の人の細胞系で約２Ｘ１０６〜４×１０８であること
がわかった。各インターフェロン種の比活性を表４に示
す。この比活性は、ウィルスの細胞変性効果に基づくイ
ンターフェロンの抗ウィルス活性の測定方法であるＣＰ
Ｅ分析（細胞変性効果阻止検定）により測定した。

用いた細胞系はウシ細胞ＭＤＢＫおよびヒト細胞ＡＧ１
７３２であり、これらはイーグルの最小必須信地ＭＥＭ
−１０に単層培養されているものである。用いたウィル
スは、マウスＬｉ［ｌ胞の単層培養中に生育させ、ＭＥ
Ｍ−１０中に凍結保存した水庖性口内炎ウィルス（ＶＳ
Ｖ）である。被験インターフェロンサンプルはＭＥＭ−
１０を用いて希釈する。

マイクロタイタープレートにまずインターフェロンサン
プルを注入し、ＭＥＭ−１０中のＭＤＢＫおよびＡＧ１
７３２細胞系を加え、ｖＳｖを接種し、そして３７℃で
１６時間インキュベートする。ＶＳＶによるＩＩ胞変性
を５０％抑制するインターフェロン濃度（ＩＤ５ｏ）を
ＩＵ／ｒＲ１とし、この値に希釈倍率を乗じ、更に同時
に測定した標準インターフェロンのＩＤ５ｏを示す濃度
（ｔＪ／ｄ）に基づく補正を行なってインターフェロン
サンプルの抗ウィルス活性、つまり表４に示す比活性を
得た。分子量は表４に見られるように約１６．Ｏ００〜
２１．０００の範囲であった。アミノ酸分析の結果は表
５に要約されている。

インターフェロン類は抗ウィルス活性、制癌活性、発育
阻害活性および免疫抑制活性を示す。これらの活性、人
のインターフェロンが１％より少ない比較的粗製の製剤
を用いて１〜１０×１０６単位／日を用いる臨床レベル
においてさえ得られた。本発明の精製された均質なイン
ターフェロン類は、従来用いられた粗製の製剤と同じ方
法で投与量を調整して望むレベルのインターフ上０ン単
位を与えるようにして使用することができる。個個の種
はそのまま使用することができ、或いはこのような種の
２種以上の混合物を使用することもできる。このような
混合物は、単離した種を望むように混合することによっ
て得ることができ、或いはインターフェロンの幾つかの
種が存在するが、非インターフェロンの活性なタンパク
質が存在しないところで精製を停止し、組成物が均質な
インターフェロンタンパク質の混合物であるようにする
ことによって、得ることができる。

インターフェロンの産生の誘導、インターフェロンの初
期濃度およびゲル濾過を含むインターフェロンの分別は
この分野でよく知られた方法を用いて達成することがで
きる。不純な状態のインターフェロンの水溶液を生成す
るこれらの操作は本発明の一部分ではない。

本発明をさらに以下の実施例により例証する。

フエ０ン＾、インターフェロンの製゛カゼイン（１０■／ｄ＞を含有する血清不含最小必須培
地中で、正常の提供者の血液からのヒト白血球（１０７
［１胞／ｍｅ）を、ニューカッスル（Ｎｅｗｃａｓｔｌ
ｅ　）病ウィルス（１５血球凝集単位／ｉｄ＞と１６時
間培養することによって、インターフェロンを産生させ
た。５．０００単位／ｒｄ、の平均インターフェロンの
力価を得た。用いた操作はＨｏｇｅｎａｅｎ、に、　Ｅ
、　ｅｔ　ａｌ、、　ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｏＶ　ａｎ
ｃｌＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　　Ａ、　　１９７７、
３６９−３８１　：１ｅｅｌｏｃｋ、　　Ｅ、　　Ｆ、
、　　Ｊ、　　Ｂａｃｔａｒｉｏｌ　　、　　隻２．　
１４１５−１４２１　（１９６６）およびＣａｎｔｅｌ
ｌ、に、　ｅｔａｌ、、　　Ａｐｐｌ、　Ｈｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、１２．６２５−６２８（１９７１）に報告され
た方法を多少変更したものであった。インターフェロン
の力価は、細胞変性効果−阻止検定によってい測定し、
この検定は１６時間以内で実施することができた。すべ
てのインターフェロンの力価は参照単位／Ｉｄで表わし
、これはナショナル・インスシチュート・オプ・ヘルス
［ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｉｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　
ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ（ＵＳＡ　’）　］により提供され
たヒト白血球インターフェロンの参照標準品に対して補
正した。

Ｂ、インターフェロンの８１度および初期の分特に示さ
ないかぎり、これらの操作は０〜４℃で実施した。培養
の終りにおいて、細胞および残層（ｄｅｂｒｉ３）を低
速遠心分離（１５分、５００Ｘシ）により除去した。カ
ゼインをＨＣＩでＤＨ４，０に酸性化することによって
沈殿した。２時間後、この混合物を遠心分１１ｔ（１０
分、１２，０００Ｘｇ）Ｌ、そしてベレットを廃棄した
。上層（１０１）を１５％（Ｗ／Ｖ）のトリクロロ酢酸
に調整した。１時間後、沈殿を遠心分１１１（１０分、
１２．０００Ｘｇ）により集め、そして５０厩の０．１
ＭのＮ　ａ　ＨＣＯ３中に再溶解した。トリトンｘ−１
００（０，５ｇ）を加え、次いで酢酸（１５ａｅ）をか
きまぜながら満々加えた。この混合物を０℃で１時間、
次いで一２０℃で１６時間貯蔵した。。次いでそれを解
凍し、遠心分離（１０分、１７．ＯＯＯＸｇ）した。ペ
レットを廃棄し、上層を４％のトリクロロ酢酸に調整し
た。１時間後、この混合物を遠心分ｌＩ！（１０分、１
２゜０００Ｘ９）ｕた。沈ｌ股物を集め、そして５ｍｌ
の０．５モルのＮａＨＣＯ３中に再溶解した。

Ｃ，ゲル濾過尿素＜１．５ｇ）をインターフェロンの濃縮物に加え、
そしてこの溶液を４Ｍの尿素１０．１Ｍの酢酸ナトリウ
ムの緩衝液で前もって平衡化したセファテックス（５ｅ
ｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−１００の微細粒子のカラム（２
，６Ｘ９０Ｃ１）に通した。このカラムを４Ｍの尿素１
０．１Ｍの酢酸ナトリウム、１）Ｈ７，５で、室温にお
いて０．５ｍ／分の流速で溶離した。１２．５ｍのフラ
クションを集めた。

インターフェロンの活性はフラクション１９−２３中に
溶出された。

Ｄ、　　液　クロマトグラフィーセファデックスＧ−１００の試験のフラクション１９−
２３を合わせ、直接ポンプを経てリクロソルブ（Ｌｉｃ
ｈｒｏｓｏｒｂ）　Ｒ、Ｐ　−８カラム（１０μ、４．
６×２５０ｍｍ）に通した。このカラムは０．０１％（
Ｖ／Ｖ　）のチオジグリコールを含有する１モルの酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で前もって平衡化し、
次いで直線の濃度勾配のｎ−プロパノールで同一緩衝液
中で０．２５ｍｌ／分の流速で溶離した［１時間、０〜
２０％；３時間、２０〜４０％（Ｖ／Ｖ）］。０．７５
１ｄのフラクションを集めた。インターフェロンはフラ
クション２３〜４０［２５〜３０％（Ｖ／Ｖ　）のｎ−
プロパノール］中に溶出された。

インターフェロン活性のほとんどを含有するフラクショ
ン２７〜３３を合わせ、ｎ−プロパノールを８０％（Ｖ
／Ｖ）の最終濃度まで加え、そしてこの溶液を、８０％
（Ｖ／Ｖ）のｎ−プロパノールを含有する０、１Ｍの酢
酸ナトリウムの溶液で前もって平衡化したりクロソルブ
・ジオールのカラム（１０μ、４．６Ｘ２５０＋ｘ）に
ポンプを経て通した。次いでこのカラムを０．１Ｍの酢
酸ナトリウム中で４時間の直線の勾配の７２〜５０％（
Ｖ／Ｖ）のプロパツールで０．２５ａｉ！／分の流速で
溶離した。０．７５ｍのフラクションを集めた。インタ
ーフェロン活性は３つの明確な主ピークとして溶出され
、それらのピークは製造ごとに定量的に変化した。これ
らのピークは溶出の順序に従ってα、βおよびγと表示
した。α−フラクションは６８％のｎ−プロパノールの
８１度で、β−フラクションは６６．５％のｎ−プロパ
ノールで、γ−フラクションは６５．５％のｎ−プロパ
ノールで溶出された。インターフェロンの活性の合計の
回収率は８０％より高かった。

各ピークからなるフラクションを別々に集め、継続する
工程を経て個々に精製した。ピークγは多量で存在しそ
して他の成分からよく分割されるように思われたので、
それをさらに精製するために選んだ。ジオールカラムか
らのピークγからなるフラクション５４−５６を集め、
そして１−プロパノールを等体積のヘキサンで２回抽出
することによって除去した。微量のヘキサンを窒素流の
もとに除去した。ピリジンとギ酸をそれぞれ１Ｍと２Ｍ
の最終濃度に加え、そしてこの溶液を１Ｍのピリジンお
よび２Ｍのギ酸（１）Ｈ４，Ｏ＞で前もって平衡化した
りクロソルブＲ，Ｐ−８カラム（１０μ層：４．６ｘ２
５０ｍ）に加える。このカラムを１Ｍのごリジン／ホル
メート緩衝液中で直線の２０〜４０％の１−プロパノー
ルの勾配で３時間以内で０．２ｍ／分の流速で溶離した
。

０．６ｄのフラクションを集めた。活性の主ピークはタ
ンパク質のピークと一致した。このピークからなるフラ
クション４５および４６（３２％、Ｖ／Ｖ、プロパツー
ル）を合わせ、同様な条件で再クロマトグラフ処理した
。インターフェロンはフラクション３１　（３２％、Ｖ
／Ｖ、プロパツール）中に溶出された。このフラクショ
ンの比活性は牛血清アルブミンに関して４×１０８単位
／ｍｇであると計算された。この物質（フラクション３
１）はさらに以下に述べるアミノ酸分析等に使用した。

この高速液体クロマトグラフィーのパターンを蛍光検出
にかけたところ、その再現性は顕著で、そのパターンの
同一性を証明することができた。

精製の結果を表１に要約する。最初の培地から第２のＲ
，Ｐ−８カラムまでの全体の精製度は６ｏ、ｏｏｏ〜ｓ
ｏ、ｏｏｏ倍であった。工程１がらジオール工程を通じ
た累積収率は３０〜５０％の範囲であった。この工程以
降は、インターフェロンの３つのピークの各々は別々に
精製した。

Ｅ、ポリアクリルアミド゛ル電　泳動インターフェロンの試料（１，５Ｘ１０５単位）をＮａ
ＤｏｄＳＯ４および２−メルカプトエタノール中にイン
キュベートし、次いでスラブ・ゲル（ｓｌａｂ　ｇｅｌ
）に加えた。電気泳動後、クーマツシー・ブルー（Ｃｏ
ｏｉ＋ａｓｓｉｅ　ｂ＃ｕｅ）を用いて着色すると単一
の鋭い帯が得られた。見掛けの分子量は標準タンパク質
と比較して１７．５００と推定された。次いでゲルを１
ａ１１の薄片に切った。各薄片を０．４−の０．５Ｍの
Ｎａ）ＩｃＯ３１０，１％のＮａＤｏｄＳＯ４中で均質
化し、そしてインターフェロンの活性を測定した。抗ウ
ィルス活性の単一ピークが得られ、これは上記単一のタ
ンパク質の帯と一致した。その他の活性ピークは観測さ
れなかった。

Ｆ、７Ａニコ１死次ｌ均質なヒト白血球インターフェロン（ピークγ）のアミ
ノ酸分析を、フルオレスカミン（ｆｌＵＯｒｅｓｃａｌｉｎｅ　）のアミノ酸分析器で
、０．５〜１μりの生来の（ｎａｔｉｖｅ）インターフ
ェロンおよびＳ−カルボ主ジメチル化したインターフェ
ロンの資料について実施した。システィン／シスチンの
比を測定するため、生来のインターフェロンをカルボ主
ジメチル化し、次いで６ＭのＨＣｌ中で還元条件（０，
１％のチオグリコール酸）のもとで加水分解した。これ
らの条件下で、システィンはＳ−カルボキシメチル化シ
スティンとして測定され、これに対しシスチンは遊離の
システィンとして測定される。アミノ酸の分析値を表２
中に要約する。アミノ酸含量に基づく比活性は２〜４×
１０８単位／ＩＩＩであることがわがった。

表２ヒト白血球インターフェロンのアミノ酸組成Ｇｌｘ　　
　　　　　　　　　　　　　　２４．０±０．６Ｐｒｏ
　　　　　　　　　　　　　　　　６．３±０．３Ｖａ
ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　７．ａ±０．
２Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　３，９±
０．２１１ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　８．
９±０．４Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　　　　２
１．８±１．３Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　　　
　　５．１±０．２ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　
　　　　９．１＋０．３ｌ−１ｉｓ　　　　　　　　　
　　　　　　　　３．３±０．４Ｌｙｓ　　　　　　　
　　　　　　　　　１１．６±０．５傘　時間Ｏに補正
した。

測定した。

実施例２０イコフオレシス（１ｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ　）に
より、白血病患者（慢性骨髄性白血病、ＣＭＬ）の血液
から単離したヒトの白血球を、カゼイン含有血清不含培
地中でニューカッスル病ウィルスと培養することによっ
てインターフェロンを製造した。５゜０００〜４０，０
００単位／ｍ！のインターフェロンの力価が普通の試験
で得られた。

精製操作は正常の血液（実施例１）からのインターフェ
ロンについて記載したものと同一であり、そしてトリト
ンＸ−１００の存在下の０．５Ｍの酢酸による沈殿、４
Ｍの尿素中のセファデックスＧ−１００を用いるゲル濾
過、ｐＨ７，５におけるリフ０ソルブＲＰ−８を用いる
ＨＰＬＣ１リクロソルブ・ジオールを用いるＨＰＬＣお
よびｐＨ４，０におけるリクロソルプＲＰ−８を用いる
ＨＰＬＣを包含していた。

リクロソルブ・ジオールのカラムからのα−１βおよび
γ−ピークからなるフラクションを別々に集め、そして
継続する工程で個々に精製した。

フラクション４３−４６　（α−ピーク）を集め、ｎ−
プロパノールを等体積のｎ−へキサンで２回抽出するこ
とによって除去した。微量のヘキサンを窒素流のもとで
除去した。ピリジンとギ酸をそれぞれ１Ｍと２Ｍの最終
濃度に加え、この溶液を１Ｍのピリジン／２Ｍのギ酸（
１）Ｈ４，（ｊ）で前もって平衡化したりクロソルプＲ
Ｐ−８カラム（１０μ、４．６Ｘ２５０Ｊ１１１１）に
通し、このカラムを１Ｍのピリジンホルメートｍ＊液中
で直線の２０〜４０％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールの勾
配で３時間以内に０．２ｍ／分の流速で溶離した。０゜
６ｍのフラクションを集めた。インターフェロンの活性
を３１〜３５％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールの範囲の広
いビークとして溶離した。これらのフラクションを合わ
せ、同一条件下に再り０マドグラフ処理した。インター
フェロンの活性は３１％および３２％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プ
ロパノールにおいて２つの主ピーク（α　およびα２）
中に溶出された。少量の成分は３４％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プ
ロパノールにより溶出された。

リクロソルブ・ジオールのカラムからの７ラクシヨン４
７〜５０（ビークβ）を集め、ビークαについて前述し
たように処理し、リクロソルブＲＰ−８でクロマトグラ
フ処理した。インターフェロンの活性は２つの主ピーク
＝３２％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールにおいてβ２およ
び３４％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールにおいてβ３中に
溶出された。この場合、再クロマトグラフ処理は不必要
であった。いくつかの製造において、３１％（■／Ｖ）
ｎ−プロパノールで溶出されるβ１と表示するビークが
観測された。

リクＯソルブ・ジオールのカラムからの７ラクシヨン５
２−５４　（ビークγ）を集め、そしてビークαについ
て前述したように処理し、リクロソルブＲＰ−８でクロ
マトグラフ処理した。インターフェロン活性は５つの主
ピーク、すなわち：γ　（３１％ｎ−プロパノール、ｖ
／ｖ）、γ２（３２％ｎ−プロパノール、Ｖ／Ｖ）、γ
３（３４％ｎ−プロパノール、Ｖ／Ｖ）、γ４　（３５
％ｎ−プロパノール、Ｖ／ｖ）、およびｒ５　　（３５
゜５％ｎ−プロパノール、Ｖ／Ｖ　）中に溶出された。

この場合、再クロマトグラフ処理は不必要であった。

インターフェロンの個々の種を得た精製の結果を表３に
要約する。

種α　およびβ２はリクロソルブ・ジオールのカラムの
溶出特性によってさらに区別される：α２は６８％（Ｖ
／Ｖ）ｎ−プロパノールで、そしてβ２は６６．５％（
Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールで、それぞれ溶出される。

インターフェロン種の試料（１，５Ｘ１０５単位）をＮ
ａＤＯｄＳＯ４および２−メルカプトエタノール中にイ
ンキュベートし、次いでスラブ・ゲルに加えた。電気泳
動後、ビークα　、α２、β　、γ１、γ　およびγ４
は単一の帯を与えたが、ピークβ　、γ　およびγ５は
２つの帯を与えた。見掛けの分子曾はすべて１６，００
０〜１ｓ、ｏｏｏの範囲に入るが、ただしβ３は１６．
５００と２１．０００の帯を与え、モしてγ４は２１．
０００の帯を与えたく表４参照）。

精製したヒト白血球インターフェロンのフラクションの
アミノ酸分析は、フルオレスカミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ａｓｉｎｅ　）アミノ酸分析器を用い０．５〜１μびの
インターフェロンの試料について実施した。加水分解を
６ＮのＨＣｌ中で還元条件（０，１％のチオグリコール
酸）下に行った。分析の結果を表５に要約する。

精製したヒトの白血球のインターフェロンのいろいろな
種（３００ピコモル、６μ９）を重炭酸ナトリウムの水
溶液（５０ｍＭ、　ｐＨ８、５，５０μｌ）中に溶かし
た。トリプシン（２μｌのＨＣＩ、ｐＨ３、中の０．１
Ｍｇ）を加え、この混合物を３７℃で１４時間培養した
。酢酸（５μｍ）を加え、この混合物をリクロソルブＲ
Ｐ−８カラム（１０μの粒度、４．６ｘ２５０ｍｍ）に
通した。

このカラムを０．５ｍｌ／分において１時間０．１Ｍの
ギ酸１０．０３Ｍのピリジン緩衝液（ｐＨ３）中で０〜
４０％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパノールの直線の勾配を用い
て溶離した。ペプチドをフルオレスカミン監視系により
検知した。結果は表６に記載されており、そして％ｎ−
プロパノールおよびピークの相対大きさくＳ−小、Ｍ＝
中、Ｌ−大）で表わされている。

去一旦 γ５３ｍ、４Ｌ、４．２Ｍ、４．５Ｍ、７Ｓ、７．５８
．１Ｏ８゜１１．５Ｌ、１２．５８，１４８．１４．５
Ｍ、１６８．１８Ｌ。

２４．５８，２５．５８．３２８精製したヒト白血球インターフェロンの種を、アミノ糖
を５０〜１００ピコモルのレベルで同定できるアミノ糖
分析に付した。すべての場合において、グルコースアミ
ンおよびガラクトース／マンノースアミンは１残基／分
子より小であった。

はとんどの場合において、アミノ糖の近くに溶出される
多くの小さなペプチドがこの分析をさまたげた。こうし
て、アミノ糖に割当てられたピークでさえも少なくとも
この一部はペプチドによるものでありうる。

最後に、逆側水分解（ｂａｃｋ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
　）およびフルオレスカミンを用いるアミノ酸分析を含
むエドマン（Ｅｄｌａｎ　）法により１ナノモルの純粋
なγ２インターフェロンの配列を決定する試みは、サイ
クル１および２についてアミノ酸を与えなかった。１０
０ピコモルの純粋なγ２のヒト白血球のインターフェロ
ンをロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノペプチダ
ーゼＭで３７℃で２０時間処理したが、生物学的活性は
影響を受けず、そしていかなるアミノ酸も反応液中に検
出されなかつた。誘導培地（最小必須培地中の白血球お
よびニューカッスル病ウィルス）の上清をアミノペプチ
ダーゼで処理しても、インターフェロンの活性の損失は
みられなかった。このことはインターフェロン分子は精
製前にさえブロックされたＮ　Ｈ２末端を有することを
示す。対照として粗製インターフェロンならびに純粋な
インターフェロンおよびインシュリンのβ−鎖をアミノ
ペプチダーゼＭと一緒にインキュベートした。インシュ
リンはアミノ酸の放出によってわかるように部分的に消
化されたが、インターフェロン活性の損失は観測されな
かった。

ＸＩ３ユ＠　　２×１０８単位／ＷＩの比活性をもつ均質なヒト
の白血球のインターフェロンの合計で３５１９を、５％
の正常な人の血清アルブミンの２５ｍｌ中に溶かした。

この溶液を細菌学的フィルターに通し、濾過した溶液を
無菌的に１００個の小びんに分割して入れた。８小びん
は、非経口投与に適した６×１０６単位の純粋なインタ
ーフェロンを含有した。小びんは使用前冷蔵（−２０℃
）することが好ましい。

０　各々がほぼ自然に得られる比率で存在する、１．５
■の集めた均質なインターフェロンの種α１、α２、β
２、γ１およびγ２を含有し、この貯蔵した混合物が約
２×１０８単位／ｍｇの比活性を有し、そしてさらに１
００Ｍｇの正常なヒト血清アルブミンを含有する水溶液
を細菌学的フィルターに通し、そして濾過した溶液を無
菌的に１００個の小びんに分割して入れた。８小びんは
約３×１０６単位の純粋な集めたインターフェロンと１
ｍｇのヒト血清アルブミンを含有するであろう。

非経口投与に適したインターフェロンを含有する小びん
は使用前冷蔵（−２０℃）することが好ましい。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）均質タンパク質であり、ドデシル硫酸ナトリウム
を含まず、分子量が約１６，０００±１，０００〜約２
１，０００±１，０００であり、インタフエロン活性が
ウシ細胞ＭＤＢＫの場合、比活性０．９×１０＾８−４
．０×１０＾８単位／ｍｇタンパク質であり、かつヒト
細胞系ＡＧ１７３２の場合、比活性２×１０＾６−４．
０×１０＾８単位／ｍｇタンパク質であることを特徴と
するヒト白血球インタフエロン。
（２）陽性の発育阻害活性を有する特許請求の範囲第１
項のインタフエロン。
（３）（ａ）１Ｍのピリジン／２Ｍのギ酸緩衝水溶液中
の３１％のｎ−プロパノール（０〜４０％の勾配）の濃
度においてオクチル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ４
．６×２５０ｍｍのカラムから室温および０．２ｍｌ／
分の流速で単一のピークとして溶離され；（ｂ）ロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノペプチ
ダーゼＭを用いる処理による不活性化に対して抵抗性で
あり；（ｃ）トリプシンで処理したときにペプチド・フラグメ
ントを与え、該フラグメントは反応媒体をオクチル結合
シリカマトリックスＨＰＬＣ４．６×２５０ｍｍカラム
（１０μの粒度）に室温において０．０３Ｍのピリジン
／０．１Ｍのギ酸緩衝水溶液（ｐＨ３）を用い０．５ｍ
ｌ／分の流速にて０〜４０％のｎ−プロパノールの勾配
で通過させたとき、３．４，４．２，１１．５，１２．
５，１４．５，１６，１８，２０，２１，２２．５およ
び２９％のｎ−プロパノールにおいてピークとして溶離
される；均質なタンパク質であり、（ｄ）ブロックされたアミノ末端；（ｅ）ＭＤＢＫ（ウシの細胞）について約２．６×１０
＾８単位／ｍｇの比活性；（ｆ）Ａｇ１７３２〔ヒト細胞系〕細胞について約２．
６×１０＾８単位／ｍｇの比活性；（ｇ）ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による約１６
，５００±１，０００の分子量；（ｈ）１分子当り１残基以下のアミノ糖分；（ｉ）陽性の発育阻害活性；および（ｊ）次のアミノ酸組成（±１５％、分子量１６，５０
０に基づく）；＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿Ａｓｘ　１３．８　Ａｌａ　　８．４　Ｐｈｅ　　６．
９Ｔｈｒ　　７．７　Ｖａｌ　　７．４　Ｈｉｓ　　３．
０Ｓｅｒ　　９．２　Ｍｅｔ　　３．７　Ｌｙｓ　１０．
５Ｇｌｘ　２０．３　Ｉｌｅ　　７．４　Ａｒｇ　　６．
２Ｐｒｏ　　６．１　Ｌｅｕ　１８．０　Ｃｙｓ　　３．
９Ｇｌｙ　　５．１　Ｔｙｒ　　４．０＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿を特徴とするα＿１と標示されるヒト白血球インタフエ
ロンの１種である特許請求の範囲第１項のインタフエロ
ン。
（４）（ａ）１Ｍのピリジン／２Ｍのギ酸緩衝水溶液中
の３２％のｎ−プロパノール（０〜４０％の勾配）の濃
度においてオクチル結合シリカマトリッスＨＰＬＣ４．
６×２５０ｍｍのカラムから室温および０．２ｍｌ／分
の流速で単一のピークとして溶離され；（ｂ）ロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノペプチ
ダーゼＭを用いる処理による不活性化に対して抵抗性で
あり；（ｃ）トリプシンを用いて処理したときにペプチド・フ
ラグメントを与え、該フラグメントは反応媒体をオクチ
ル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ４．６×２５０ｍｍカラム（１０μの粒度）に
室温において、０．０３Ｍのピリジン／０．１Ｍのギ酸
緩衝水溶液（ｐＨ３）を用い０．５ｍｌ／分の流速にて
０〜４０％のｎ−プロパノールの勾配で通過させたとき
、３，４，４．２，１１．５，１２．５，１４．５，１
６，１８，２７および２９％のｎ−プロパノールにおい
てピークとして溶離され；（ｄ）０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝水溶液中の６８％
のｎ−プロパノール（７２．５〜５０％の勾配）の濃度
においてグリセロール結合シリカマトリックスＨＰＬＣ
４．６×２５０ｍｍのカラムから室温および０．２５ｍ
ｌ／分の流速で単一のピークとして溶離される；均質なタンパク質であり、（ｅ）ブロックされたアミノ末端；（ｆ）ＭＤＢＫ（ウシの細胞）について約４．０×１０
＾８単位／ｍｇの比活性；（ｇ）Ａｇ１７３２（ヒト細胞系）細胞について約３×
１０＾８単位／ｍｇの比活性；（ｈ）ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による約１６
，２００±１，０００の分子量；（ｉ）１分子当り１残基以下のアミノ糖分；（ｊ）陽性の発育阻害活性；および（ｋ）次のアミノ酸組成（±１５％、分子量１６，２０
０に基づく）；＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿Ａｓｘ　１１．７　Ａｌａ　　８．３　Ｐｈｅ　８．０Ｔｈｒ　　８．３　Ｖａｌ　　６．２　Ｈｉｓ　２．８Ｓｅｒ　１０．０　Ｍｅｔ　　３．８　Ｌｙｓ　９．０Ｇｌｘ　２０．５　Ｉｌｅ　　７．０　Ａｒｇ　７．１Ｐｒｏ　　４．９　Ｌｅｕ　１８．０　Ｃｙｓ　４．０Ｇｌｙ　　４．５　Ｔｙｒ　４．４＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿を特徴とするα＿２と標示されるヒト白血球インタフエ
ロンの１種である特許請求の範囲第１項のインタフエロ
ン。
（５）（ａ）１Ｍのピリジン／２Ｍのギ酸緩衝水溶液中
の３２％のｎ−プロパノール（０〜４０％の勾配）の濃
度においてオクチル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ４
．６×２５０ｍｍのカラムから室温および０．２ｍｌ／
分の流速で単一のピークとして溶離され；（ｂ）ロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノペプチ
ダーゼＭを用いる処理による不活性化に対して抵抗性で
あり；（ｃ）トリプシンを用いて処理したときにペプチド・フ
ラグメントを与え、該フラグメントは反応媒体をオクチ
ル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ４．６×２５０ｍｍカラム（１０μの粒度）に
室温において、０．０３Ｍのピリジン／０．１Ｍのギ酸
緩衝水溶液（ｐＨ３）を用い０．５ｍｌ／分の流速にて
０〜４０％のｎ−プロパノールの勾配で通過させたとき
、３，４，４．２，１１．５，１２．５，１４．５，１
６，１７．５，１８および２９％のｎ−プロパノールに
おいてピークとして溶離され；（ｄ）０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝水溶液中の６６．
５％のｎ−プロパノール（７２．５〜５０％の勾配）の
濃度においてグリセロール結合シリカマトリックスＨＰ
ＬＣ４．６×２５０ｍｍのカラムから室温および０．２
５ｍｌ／分の流速で単一のピークとして溶離される；均質なタンパク質であり、（ｅ）ブロックされたアミノ末端；（ｆ）ＭＤＢＫ（ウシの細胞）についての約４．０×１
０＾８単位／ｍｇの比活性；（ｇ）Ａｇ１７３２（ヒト細胞系）細胞についての約２
×１０＾８単位／時の比活性；（ｈ）ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による約１６
，５００±１，０００分子量；（ｉ）１分子当り１残基以下のアミノ糖分；（ｊ）陽性の発育阻害活性；および（ｋ）次のアミノ酸組成（±１５％、分子量１６，５０
０に基づく）；＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿Ａｓｘ　１１．５　Ａｌａ　　７．９　Ｐｈｅ　８．７Ｔｈｒ　　９．０　Ｖａｌ　　６．７　Ｈｉｓ　３．０Ｓｅｒ　１０．０　Ｍｅｔ　　４．４　Ｌｙｓ　８．５Ｇｌｘ　２１．９　Ｉｌｅ　　７．４　Ａｒｇ　８．０Ｐｒｏ　　５．０　Ｌｅｕ　１８．９　Ｃｙｓ　１．８Ｇｌｙ　　５．０　Ｔｙｒ　４．６＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿を特徴とするβ＿２と標示されるヒト白血球インタフエ
ロンの１種である特許請求の範囲第１項のインタフエロ
ン。
（６）（ａ）１Ｍのピリジン／２Ｍのギ酸緩衝水溶液中
の３４％のｎ−プロパノール（０〜４０％の勾配）の濃
度においてオクチル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ４
．６×２５０ｍｍのカラムから室温および０．２ｍｌ／
分の流速で単一のピークとして溶離され；（ｂ）ロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノペプチ
ダーゼＭを用いる処理による不活性化に対して抵抗性で
あり；（ｃ）トリプシンを用いて処理したときにペプチド・フ
ラグメントを与え、該フラグメントは反応媒体をオクチ
ル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ４．６×２５０ｍｍカラム（１０μの粒度）に
室温において、０．０３Ｍのピリジン／０．１Ｍのギ酸
緩衝水溶液（ｐＨ３）を用い０．５ｍｌ／分の流速にて
０〜４０％のｎ−プロパノールの勾配で通過させたとき
、３，４，４．２、４．５，１０，１２．５，１４，１
４．５，１６，１８，１９．５，２７および３２％のｎ
−プロパノールにおいてピークとして溶離される；均質なタンパク質であり、（ｄ）ブロックされたアミノ末端；（ｅ）ＭＤＢＫ（ウシの細胞）についての約４．０×１
０＾８単位／ｍｇの比活性；（ｆ）Ａｇ１７３２（ヒト細胞系）細胞についての約３
×１０＾８単位／ｍｇの比活性；（ｇ）ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による約２１
，０００±１，０００の分子量（主要バンド）；（ｈ）１分子当り１残基以下のアミノ糖分；（ｉ）陽性の発育阻害活性；および（ｊ）次のアミノ酸組成；＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿Ａｓｘ　１８．２　Ａｌａ　１１．５　Ｐｈｅ　　９．
９Ｔｈｒ　　９．９　Ｖａｌ　　７．５　Ｈｉｓ　　３．
８Ｓｅｒ　１４．５　Ｍｅｔ　　６．０　Ｌｙｓ　　９．
３Ｇｌｘ　２８．５　Ｉｌｅ　　９．５　Ａｒｇ　１０．
８Ｐｒｏ　　５．９　Ｌｅｕ　２４．４　Ｃｙｃ　　２．
３Ｔｌｙ　　３．６　Ｔｙｒ　　５．０＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿を特徴とするβ＿３と標示されるヒト白血球インターフ
エロンの１種である特許請求の範囲第１項のインタフエ
ロン。
（７）（ａ）１Ｍのピリジン／２Ｍのギ酸緩衝水溶液中
の３１％のｎ−プロパノール（０〜４０％の勾配）の濃
度においてオクチル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ４
．６×２５０ｍｍのカラムから室温および０．２ｍｌ／
分の流速で単一のピークとして溶離され；（ｂ）ロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノペプチ
ダーゼＭを用いる処理による不活性化に対して抵抗性で
あり；（ｃ）トリプシンを用いて処理したときにペプチド・フ
ラグメントを与え、該フラグメントは反応媒体をオクチ
ル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ４．６×２５０ｍｍカラム（１０μの粒度）に
室温において、０．０３Ｍのピリジン／０．１Ｍのギ酸
緩衝水溶液（ｐＨ３）を用い０．５ｍｌ／分の流速にて
０〜４０％のｎ−プロパノールの勾配で通過させたとき
、３，４，４．２，４．５，５，６．５，１１．５，１
２．５，１４．５，１６，１７．５，１８および２９％
のｎ−プロパノールにおいてピークとして溶離される；均質なタンパク質であり、（ｄ）ブロックされたアミノ末端；（ｅ）ＭＤＢＫ（ウシの細胞）についての約２．６×１
０＾８単位／ｍｇの比活性；（ｆ）Ａｇ１７３２（ヒト細胞系）細胞についての約２
×１０＾８単位／ｍｇの比活性；（ｇ）ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による約１７
，７００±１，０００の分子量；（ｈ）１分子当り１残基以下のアミノ糖分；（ｉ）陽性の発育阻害活性；および（ｊ）次のアミノ酸組成物（±１５％、分子量１７，７
００に基づく）；＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿＿Ａｓｘ　１３．１　Ａｌａ　　８．７　　Ｐｈｅ　　８
．６Ｔｈｒ　　８．４　Ｖａｌ　　７．３　　Ｈｉｓ　　３
．７Ｓｅｒ　１０．２　Ｍｅｔ　　４．３　　Ｌｙｓ　１０
．１Ｇｌｘ　２３．９　Ｉｌｅ　　７．９　　Ａｒｇ　　８
．０Ｐｒｏ　　４．５　Ｌｅｕ　２０．３　Ｃｙｓ　　　３
．３Ｇｌｙ　　５．７　Ｔｙｒ　　４．８＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿＿を特徴とするγ＿１と標示されるヒト白血球インタフエ
ロンの１種である特許請求の範囲第１項のインタフエロ
ン。
（８）（ａ）１Ｍのピリジン／２Ｍのギ酸緩衝水溶液中
の３２％のｎ−プロパノール（０〜４０％の勾配）の濃
度においてオクチル結合シリカマトリックス４．６×２
５０ｍｍのカラムから室温および０．２ｍｌ／分の流速
で単一のピークとして溶離され；（ｂ）ロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノペプチ
ダーゼＭを用いる処理による不活性化に対して抵抗性で
あり；（ｃ）トリプシンを用いて処理したときにペプチド・フ
ラグメントを与え、該フラグメントは反応媒体をオクチ
ル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ４．６×２５０ｍｍカラム（１０μの粒度）に
室温において、０．０３Ｍのピリジン／０．１Ｍのギ酸
緩衝水溶液（ｐＨ３）を用い０．５ｍｌ／分の流速にて
０〜４０％のｎ−プロパノールの勾配で通過させたとき
、３，４，４．２，４．５，５，１１．５，１２．５，
１４．５，１６，１８および２９％のｎ−プロパノール
においてピークとして溶離される；均質なタンパク質であり、（ｄ）ブロックされたアミノ未満；（ｅ）ＭＤＢＫ（ウシ細胞）についての約４．０×１０
＾８単位／ｍｇの比活性；（ｆ）Ａｇ１７３２（ヒト細胞系）細胞についての約１
．５×１０＾８単位／ｍｇの比活性；（ｇ）ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による約１７
，７００±１，０００の分子量；（ｈ）１分子当り１残基以下のアミノ糖分；（ｉ）陽性の発育阻害活性；および（ｊ）次のアミノ酸組成（±１５％、分子量１７，７０
０に基づく）；＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿Ａｓｘ　１３．３　Ａｌａ　　８．１　Ｐｈｅ　　９．
０Ｔｈｒ　　９．６　Ｖａｌ　　７．０　Ｈｉｓ　　３．
３Ｓｅｒ　　７．８　Ｍｅｔ　　３．９　Ｌｙｓ　１０．
０Ｇｌｘ　２５．０　Ｉｌｅ　　８．０　Ａｒｇ　　８．
５Ｐｒｏ　　４．８　Ｌｅｕ　２０．１　Ｃｙｓ　　２．
９Ｇｌｙ　　５．０　Ｔｙｒ　　４．８＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿を特徴とするγ＿２と標示されるヒト白血球インタフエ
ロンの１種である特許請求の範囲第１項のインタフエロ
ン。
（９）（ａ）１Ｍのピリジン／２Ｍのギ酸緩衝水溶液中
の３４％のｎ−プロパノール（０〜４０％の勾配）の濃
度においてオクチル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ４
．６×２５０ｍｍのカラムから室温および０．２ｍｌ／
分の流速で単一のピークとして溶離され；（ｂ）ロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノペプチ
ダーゼＭを用いる処理による不活性化に対して抵抗性で
あり；（ｃ）トリプシンを用いて処理したときにペプチド・フ
ラグメントを与え、該フラグメントは反応媒体をオクチ
ル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ４．６×２５０ｍｍカラム（１０μの粒度）に
室温において、０．０３Ｍのピリジン／０．１Ｍのギ酸
緩衝水溶液（ｐＨ３）を用い０．５ｍｌ／分の流速にて
０〜４０％のｎ−プロパノールの勾配で通過させたとき
、３，４，４．２、１１．５、１２．５，１３．５，１
４．５，１６，１８，２０および３２％のｎ−プロパノ
ールにおいてピークとして溶離される；均質なタンパク
質であり、（ｄ）ブロックされたアミノ末端；（ｅ）ＭＤＢＫ（ウシの細胞）ついての約３．５×１０
＾８単位／ｍｇの比活性；（ｆ）Ａｇ１７３２（ヒト細胞系）細胞についての約１
．５×１０＾７単位／ｍｇの比活性；（ｇ）ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による約１７
，２００±１，０００の分子量（主要バンド）；（ｈ）１分子当り１残基以下のアミノ糖分；（ｉ）陽性の発育阻害活性；および（ｊ）次のアミノ酸組成＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿Ａｓｘ　１５．０　Ａｌａ　　９．３　Ｐｈｅ　　７．
２Ｔｈｒ　　８．６　Ｖａｌ　　５．５　Ｈｉｓ　　２．
９Ｓｅｒ　１０．１　Ｍｅｔ　　５．６　Ｌｙｓ　　７．
６Ｇｌｘ　２２．８　Ｉｌｅ　　６．８　Ａｒｇ　１０．
１Ｐｒｏ　　４．８　Ｌｅｕ　２０．５　Ｃｙｓ　　３．
１Ｇｌｙ　　３．２　Ｔｙｒ　　３．７＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿を特徴とするγ＿３と標示されるヒト白血球インタフエ
ロンの１種である特許請求の範囲第１項のインタフエロ
ン。
（１０）（ａ）１Ｍのピリジン／２Ｍのギ酸緩衝水溶液
中の３５％のｎ−プロパノール（０〜４０％の勾配）の
濃度においてオクチル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ
４．６×２５０ｍｍのカラムから室温および０．２ｍｌ
／分の流速で単一のピークとして溶離され；（ｂ）ロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノペプチ
ダーゼＭを用いる処理による不活性化に対して抵抗性で
ある；均質なタンパク質であり、（ｃ）ブロックされたアミノ末端；（ｄ）ＭＤＢＫ（ウシの細胞）についての約３．５×１
０＾８単位／ｍｇの比活性；（ｅ）Ａｇ１７３２（ヒト細胞系）細胞についての約４
．０×１０＾８単位／ｍｇの比活性；（ｆ）ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による約２１
，０００±１，０００の分子量；（ｇ）１分子当り１残基以下のアミノ糖分；（ｈ）陽性の発育阻害活性；および（ｉ）次のアミノ酸組成（±１５％、分子量２１，００
０に基づく）；＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿Ａｓｘ　１７．９　Ａｌａ　１０．４　Ｐｈｅ　　９．
１Ｔｈｒ　　７．３　Ｖａｌ　　７．９　Ｈｉｓ　　３．
８Ｓｅｒ　１３．５　Ｍｅｔ　　４．９　Ｌｙｓ　１２．
２Ｇｌｘ　２７．０　Ｉｌｅ　　９．７　Ａｒｇ　　８．
５Ｐｒｏ　　６．５　Ｌｅｕ　２４．１　Ｃｙｓ　　４．
１Ｇｌｙ　　４．８　Ｔｙｒ　　５．０＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿を特徴とするγ＿４と標示されるヒト白血球インタフエ
ロンの１種である特許請求の範囲第１項のインタフエロ
ン。
（１１）（ａ）１Ｍのピリジン／２Ｍのギ酸緩衝水溶液
中の３５．５％のｎ−プロパノール（０〜４０％の勾配
）の濃度においてオクチル結合シリカマトリックスＨＰ
ＬＣ４．６×２５０ｍｍのカラムから室温および０．２
ｍｌ／分の流速で単一のピークとして溶離され；（ｂ）ロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノペプチ
ダーゼＭを用いる処理による不活性化に対して抵抗性で
あり；（ｃ）トリプシンを用いて処理したときにペプチド・フ
ラグメントを与え、該フラグメントは反応媒体をオクチ
ル結合シリカマトリックスＨＰＬＣ４．６×２５０ｍｍカラム（１０μの粒度）に
室温において、０．０３Ｍのピリジン／０．１Ｍのギ酸
緩衝水溶液（ｐＨ３）を用い０．５ｍｌ／分の流速にて
０〜４０％のｎ−プロパノールの勾配で通過させたとき
、３，４，４．２，４．５，７，７．５，１０，１１．
５，１２．５，１４，１４．５，１６，１８，２４．５
，２５．５および３２％のｎ−プロパノールにおいてピ
ークとして溶離される；均質なタンパク質であり、（ｄ）ブロックされたアミノ末端；（ｅ）ＭＤＢＫ（ウシの細胞）についての約０．９×１
０＾８単位／ｍｇの比活性；（ｆ）Ａｇ１７３２（ヒト細胞系）細胞についての約２
×１０＾６単位／ｍｇの比活性；（ｇ）ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による約１６
，５００±１，０００の分子量（主要バンド）；（ｈ）１分子当り１残基以下のアミノ糖分；（ｉ）陽性の発育阻害活性；および（ｊ）次のアミノ酸組成＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿Ａｓｘ　１３．８　Ａｌａ　　９．３　Ｐｈｅ　　６．
４Ｔｈｒ　　７．６　Ｖａｌ　　５．１　Ｈｉｓ　　２．
８Ｓｅｒ　　９．０　Ｍｅｔ　　４．７　Ｌｙｓ　１２．
０Ｇｌｘ　２０．８　Ｉｌｅ　　６．６　Ａｒｇ　　９．
０Ｐｒｏ　　４．２　Ｌｅｕ　１９．６　Ｃｙｓ　　２．
３Ｇｌｙ　　４．０　Ｔｙｒ　　３．６＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿を特徴とするγ＿５と標示されるヒト白血球インタフエ
ロンの１種である特許請求の範囲第１項のインタフエロ
ン。