JPS63123393A - ヒトインタ−ロイキン−２の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒトインターロイキン−２の製造法に関する。

従来の技術　　　・ ヒトインターロイキン−２（以下ｒ■Ｌ−２Ｊと略称す
ることもある。）は、マイトーゲンや抗原によって活性
化されたＴ細胞の産生ずるリンホカインの１つである。

ヒトＩＬ−２は細胞傷害性Ｔ細胞やナチュラルキラー細
胞の増殖および分化に必須であり、これらの細胞を介し
た免疫防御系において重要な役割を果たしている。ヒト
ｒＬ−２は、その生物活性から考えて、各種の免疫不全
症。

感染症および悪性腫瘍などの治療薬として効果的に使用
し得ることが期待されている。

組換えＤＮＡ技術によりヒトＩＬ−２を大腸菌に産生さ
せ、組換え型ＩＬ−２を大量に精製取得することが可能
になった（特開昭６０−１１５５２８号公報参照）。

ヒトＩＬ−２を産生ずる組換え体の培養により得られた
ヒトＩＬ−２の大部分が、５８位および１０５位のシス
ティンが共に遊離のＳ１１基を有している（以下、この
ＩＬ−２をシスティン型ヒト！Ｌ−２と称することもあ
る）ことが見い出された。

このようなシスティン型ヒトＩＬ−２は、活性が失なわ
れており、活性を有するためには、天然型ＩＬ−２と同
じく５８位のシスティンと１０５位のシスティンとがジ
スルフィド結合を形成していることが必須であることが
報告されている［アナリティカル・バイオケミストリー
（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、
　１５５．１２３（１９８６）］［以下、５８位のシス
ティンと１０５位のシスティンとがジスルフィド結合を
形成しているものをシスチン型ヒトＩＬ−２と称するこ
ともある。］。

従来、５８位のシスティンと１０５位のシスティンとの
間にジスルフィド結合を形成させる方法として、特開昭
６０−１１５５２８号公報には、産生されたヒトＩＬ−
２の採取精製工程中に自然にシスヂン型に変換する方法
が示されている。

特開昭６０−２４３０２１号公報では、人為的に抑制さ
れた条件下にＯ−イオドソベンゾエートと反応せしめる
ことにより、シスチン型ヒトＩＬ−２を得ている。

昭和６１年４月７日発行の朝日新聞には、グルタチオン
でジスルフィド結合をつくることが記載されている。

また、特開昭６１−１４０６００号公報には、Ｃｕ”陽
イオンを含有する酸化促進剤を用いた反応が制御される
酸化方法により、ジスルフィド結合を形成させることが
示されている。

、８が解決しようとする問題、 しかしながら、上記した方法では、いずれもジスルフィ
ド結合の形成効率が低く、工業的生産において充分な方
法とはいえない。

また、上記特開昭６０−２４３０２１号公報および特開
昭６１−１４０６００号公報に記載の方法では、酸化反
応が過酷すぎる場合、蛋白質の分子間のポリメリゼーシ
ョン（ｐｏｌｙｒＡｅｒｉｚａｔ　１ｏｎ）が起り、活
性の低下を招くおそれがある。

問題１１、を解決するための手段 本発明者らは、天然ヒト！Ｌ−２と同じジスルフィド結
合を有しｒＬ−２活性を有するヒトＩＬ−２を製造する
方法につき鋭意研究を行なったところ、システィン型ヒ
トＩＬ−２を、ジスルフィド結合の形成を促進させる系
に用いられることが全く知られていなかった硫酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウムまたは（および）炭酸ナトリ
ウムを溶存する水溶液中で長時間熟成させることにより
、天然型ヒトＩＬ−２と同じジスルフィド結合を有する
ヒトＩＬ−２を効率良く製造できることを見い出し、さ
らに研究した結果、本発明を完成した。

本発明はヒトインターロイキン−２を産生ずる形質転換
体の培養によって得られたヒトインターロイキン−２な
らびに約１％以上の硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウ
ムまたは（および）炭酸ナトリウムを溶存する水溶液を
少なくとも１６時間熟成させることを特徴とする天然型
ヒトインターロイキン−２と同じジスルフィド結合を有
するヒトインターロイキン−２の製造法である。

本発明におけるヒトインターロイキン−２としては、第
１図で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｉ
）［特開昭６１−７８７９９号公報］。

その生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分のア
ミノ酸配列からなるフラグメントが挙げられる。上記フ
ラグメントとしては、例えばポリペプチド（１）のアミ
ノ末端から１個のアミノ酸（ＥＰＣ公開第９１５３９号
公報）または４個のアミノ酸を欠くフラグメント（特開
昭６０−１２６０８８号公報）やカルボキシル末端部の
数個のアミノ酸を欠くフラグメントなどが挙げられる。

さらに上記ポリペプチド（Ｉ）の構成アミノ酸の一部が
欠損しているか他のアミノ酸に置換されたもの、例えば
１２５位のシスティン残基がセリン残基に置換されたも
の（特開昭５９−９３０９３号公報）でもよい。

また、ポリペプチド（１）のアミノ末端にざらにＭｅｔ
を有していてもよく［特開昭６１−７８７９９号公報］
、またポリペプチド（１）とそのアミノ末端にさらにＭ
ｅｔを有するポリペプチド（１）との混合物でもよい［
特開昭６０−１１５５２８号公報］。

また、該ヒトＩＬ−２としては、糖鎖を有していてもよ
く、また有さなくてもよい。

ヒトＩＬ−２を産生ずる形質転換体は、自体公知の方法
により、当該ヒト［Ｌ−２を産生ずるように形質転換体
された微生物、動物細胞が挙げられる。

形質転換される微生物の宿主としては、たとえば、エシ
ェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌、酵母などが挙げられる。

上記エシェリヒア属菌の例としては、エシェリヒア・コ
リ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）が挙げられ、具体的にはエシェリ
ヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）Ｋ　
１２　Ｄ　Ｈｌ［プロシーディンゲス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・才ブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ）、　　６０．　１
６０（１９６ｇ）コ、Ｍ１０３［ヌクレイツク・アシッ
ズ・リサーチ、（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ）　９．　３０９（１９８１）］、　　Ｊ　Ａ
　２２１　［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　　１２０．　５１７（１９７
ｇ）コ、ＨＢｌｏｌ［ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー、社、　４５９（１９６９）］、　Ｃ６
００［ジエネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、　３９
．４４０（１９５４）］、　Ｎ４８３０［セル（Ｃｅｌ
ｌ）　２５．７１３（１９８１）］、　Ｋ　−１２ＭＭ
２９４［プロシーディンゲス・才ブ・ナショナル・アカ
デミ−・オプ・サイエンシズ７３．４１７４（１９７６
）］などが挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｔｓ）が挙げられ
、具体的にはバチルス・サチルスＭ１１１４（ジーン。

旦、　２５５（１９８３））、　２０７−２１　［ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｎｉ−ｓｔｒｙ）川、　８７（１９
８４）］などが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサツカロマイセス［相］セ
レビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）が挙げられ、具体的には、サツカロマイセ
ス・セレビシアｚＡＨ２２［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７５巻１９２９（１９７８）］、　Ｘ　Ｓ　Ｂ　５２−
２３　Ｃ［Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　
　７７巻　２１７３（１９８０）コ、ＢＨ−６４１Ａ（
ＡＴＣＣ２８３３９）、２０Ｂ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ　８５巻２３頁１９７６年）、ＧＭ３Ｃ−２［Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　
７８巻２２５ｇ（１９８１年）］などが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ５−７「セル
（Ｃｅｌｌ）　２３巻１７５頁１９８１年］、　Ｖｅｒ
ｏ（日本臨床　２１巻１２０９頁１９６３年）、チャイ
ニーズハムスター細胞ＣＨＯ［ジャーナル・オブ・エク
スペリメンタル・メデイシン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ
、）１０８巻９４５頁１９５８年コ、マウスＬ細胞［ジ
ャーナル・オブ・ナシゴナル・キャンサー・インスティ
チュート（Ｊ６Ｎａｔ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、）
４巻　１６５頁１９４３年コ、ヒトＰＬ細胞［プロシー
ディンゲス・オブ・ザ・ソサエティ・フォー・エキスペ
リメンタル・バイオロジー・アンド・メデイシン（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｔｐ。

Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、）　９４巻５３２頁１９５７年］
、ハムスターＣ細胞などが挙げられる。

上記ヒトインターロイキン−２を産生ずる形質転換体は
、従来公知の方法で製造することができる。

該製造法の具体的としては、たとえばＲＰＣ公開第９１
５３９号公報、特開昭６０−１１５５２８号公報、特開
昭６１−７８７９９号公報、特開昭６１−６３２８８号
公報、特開昭６０−１２６０８８号公報、特開昭５９−
９３０９３号公報に記載された方法が挙げられる。

本発明で用いられるヒトＩＬ−２を産生ずる形質転換体
としては、ヒトＩ　Ｌ−２を産生ずるものであればいず
れでもよい。その例としては、たとえばＣ０８−７／ｐ
ｃＥＩＬ−２，Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１／Ｉ）ＴＩＬ
２−２２（ＦＥＲＭ−１３Ｐ　　２４５）、Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ　ＨＢ　ｌ　０１／ｐＧ　Ｉ　Ｌ２−２２（ＰＥＲ
Ｍ−ＢＰ　　２４７）、Ｅ、ｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＴ
ＩＬ２−２１ａ（ＦＥＲＭ−ＢＰ　　２４８）、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＨＩ３１０１／ｐＴＩＬ２−２１ｂ（ＦＥＲ
Ｍ−ＢＰ　　２４９）（ＥＰＣ公開第９１５３９号公報
参照）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨＩ／ｐＴＦ４（Ｉ　ＦＯ
−１４２９９、ＦＥＲＭ−ＢＰ　６２８）（特開昭６０
−１１５５２８号公報、ＥＰＣ公開第１４５３９０号公
報参照）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｎ４８３０／ｐＴＢ　２８
５（［ＦＯ−１４４３７，ＦＥＲＭ−ＢＰ　　８５２Ｘ
特開昭６１−７８７９９号公報、ＥＰＣ公開第１７６２
９９号公報参照）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｃ−４／ｐＴＦ４
（Ｉ　ＦＯ−１４４２２，Ｆ’ＥＲＭ−ＢＰ　　９６７
）（特開昭６１−２０５４９７号公報、ＥＰＣ公開第１
９４８１８号公報参照）、マウスＬ−ＩＬ２＋３−３細
胞（ＩＦＯ５００４９）、マウスＬｉＬ３８５−６細胞
（ｔＦｏ　　５００５０）、ハムスタ−Ｃ−ＩＬ４８５
−１４細胞（ＩＦ’０　５００５１）（特開昭６１−６
３２８２号公報参照）、Ｅ。

ｃｏｌｔ　ＤＨＩ／ｐＹＴ２３（ＩＦＯ１４３００Ｘ特
開昭６０−１２６０８８号公報参照）、大腸菌に一１２
ＭＭ２９４／ｐＬＷ４６（ＡＴＣＣ３９４５２）（特開
昭５９−９３０９３号公報参照）などが挙げられる。

上記において、ＦＥＲＭ番号は通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所（ＦＲＩ）の受託番号を、ＩＰＯ番
号は財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）の受託番号を、ＡＴ
ＣＣ番号は、ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ＡＴ’ＣＣＸＴｈｅ　Ａｎ＋ｅｒｉｃａｎ
　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
　ＵＳＡ）の受託番号をそれぞれ示す。

ヒ）ＩＬ−２を産生ずる形質転換体を培養するには、形
質転換体の宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌の場
合には、培養に使用される培地としては液体培地が適当
であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源
、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源と
しては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱
粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウ
ム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン
。

カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの
無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カル
シウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムな
どがあげられる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因
子などを添加してもよい。

培地のｐＨは約６〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、さらに
例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地［Ｍｉｌ
ｌｅｒ、ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・
モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｒ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、　４３１−４３３．　Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２］が好ましい。ここに必要
によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえ
ば３β−インドリル　アクリル酸のような薬剤を加える
ことができる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常的１５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や攪拌を
加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常的３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や攪拌を加え
ることもできる。

形質転換体の宿主が酵母の場合には、培地としては、た
とえばパークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小
培地［Ｂｏｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、ら、Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７、４５０５（１９８０）］が
挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ま
しい。培養は通常的２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間
行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。

形質転換体の宿主が動物細胞の場合には、培地としては
、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地
［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１２２．５０１（１
９５２）］、ＤＭＥＭ培地［ヴイロロジー（Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ）。

随、　３９６（１９５９）］、ＲＰ　Ｍ　［１６４０培
地［ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・
アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔ
ｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉ
ａｔｉｏｎ）　１９９．５１９（１９６７）］、　ｌ　
９９培地［プロシーディンゲス・オブ・ザ・ソサエティ
・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ
　ｔｈｅ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ）　
７３．１（１９５０）］などが挙げられる。ｐＨは約６
〜８であるのが好ましい。培養は通常的３０〜４０℃、
培養時間は約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や
攪拌を加える。

産生されたヒトＩＬ−２が菌体内に蓄積される場合には
、培養物から菌体を集め、該菌体からたとえば、塩酸グ
アニジンや尿素等の変性剤、もしくはリゾチームあるい
は超音波、フレンチプレス等で菌体を破壊してヒトＩＬ
−２を抽出し、遠心分離機等で不溶物を除きヒ）ＩＬ−
２を含む水溶液を得る。ヒトＩＬ−２か菌体内で不溶性
の封入体を形成している場合、リゾデーム、超音波、フ
レンチプレス等による菌体破壊法を選択した際には、遠
心分離機等で不溶物を得、この不溶物を塩酸グアニジン
や尿素等の変性剤で可溶化して、ヒト■Ｌ−２を含む水
溶液を得る。

また、産生されたヒトｒＬ−２が培養液（菌体外）に蓄
積される場合には、培養物からろ過により菌体を除去し
培養液を集め、該培養液から、たとえば遠心分離機等で
不溶物を除き、ヒトＩＬ−２を含む水溶液を得る。

本発明方法における熟成させる水溶液に溶存しているヒ
トＩＬ−２としては、その濃度は約ｌＯ〜５０μｇ／−
が好ましく、約２０〜４０μｇ／ｄがさらに好ましい。

本発明方法においては、水溶液に約１％以上の硫酸アン
モニウム、炭酸アンモニウムまたは（および）炭酸ナト
リウムを溶存させるが、約１０％以下となるようにする
のが好ましい。なかでも、約３〜８％とするのが好まし
く、約３〜５％とするのがさらに好ましく、５％前後と
するのが特に好ましい。なお、％は、重量／容量％を表
わす。

本発明方法においては、硫酸アンモニウム、炭酸アンモ
ニウム、炭酸ナトリウムを単独で用いても良いし、２種
以上を混合して用いてもよい。混合して用いる場合の比
率は特に限定されず、混合物の全体量が上記した量とな
るようにすればよい。

混合して用いる場合の特に好ましい比率としては、等量
混合物が挙げられる。

本発明の熟成は、当該水溶液を当該時間、適切な温度で
放置することで達成できる。

本発明においては、当該水溶液を少なくとも約１６時間
熟成させる。また、約２４０時間未満とするのが好まし
い。さらに、約４８〜７２時間熟成させるのが好ましい
。

本発明の熟成の温度は、約θ〜１０℃が好ましくは、さ
らに好ましくは約３〜５℃である。

また、当該水溶液のｐＨは、約６〜８が好ましく、さら
に好ましくは、中性付近に調整される。

本発明方法において、システィン型ヒトＩＬ−２からシ
スチン型ヒトＩＬ−２への変換は、たとえばフェニル−
５ＰＷ　　ＲＰカラム（東洋遭達株式会社製）を用いる
逆相高速液体クロマトグラフィー法によって測定するこ
とができる。たとえば、試料をフェニル−５ＰＷ　　Ｒ
Ｐカラムにかけ、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系
を溶出溶媒としてクロマトグラフィーを行なう。ＩＬ−
２は疎水性が高いため、大腸菌由来のタンパク質から分
離して、遅く溶出される。システィン型ヒトＩＬ−２は
シスチン型ヒトＩＬ−２よりもさらに遅く溶出される。

したがって、これらのピーク面積を測定することにより
、システィン型ヒトＩＬ−２からシスチン型ヒトＩ　Ｌ
−２への変化が求められる。

反応生成物は、所望により抽出、塩析１分配、再結晶、
クロマトグラフィーなど公知の蛋白質やペプチドの分離
、精製手段に付し、分離、精製することができる。

反応生成物が、メチオニン残基が付加したものとそうで
ないものとの混合物である場合には、分離操作に付して
、これらを相互に分離してもよい。

該分離操作法としては、たとえば、特開昭６１−７８７
９９号公報に記載された等電点の差異に基づく分離手段
が挙げられる。

本発明方法によると、効率良く、天然型ヒトインターロ
イキン−２と同じジスルフィド結合を有するヒトインタ
ーロイキン−２を製造することができる。

本発明方法により製造されるヒトインターロイキン−２
は、天然型ヒトＩＬ−２と同様の活性を有し、低毒性で
あるので、安全に医薬品や診断用薬剤として使用できる
（特開昭６０−１１５５２８号公報、特開昭６１−７８
７９９号公報参照）。

本願明細書および図面において、アミノ酸を略号で表示
する場合、Ｉ　ＵＰＡＣ−Ｉ　ＵＢ　　Ｃｏｍｍ１−ｓ
ｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎ
ｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣
用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。また
、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に明
示しなければし一体を示すものとする。

Ｇｌｙ：　　グリシン Ａｌａ　　：　　アラニン Ｖａｔ　　：　　バリン　　　　 Ｌｅｕ　　：　　ロイシン ｌｉｅ：　　イソロイシン Ｓｅｒ　　：　　セリン　　　　　′ Ｔｈｒ　　：　　スレオニン Ｃｙｓ　　：　　システィン Ｍｅｔ　　：　　メチオニン Ｇｌｙ　　：　　グルタミン酸 Ａｓｐ　　：　　アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　：　　リジン Ａｒｇ　　：　　アルギニン Ｈｉｓ　　：　　ヒスチジン Ｐｈｅ　　；　　フェニールアラニン Ｔ、ｙｒ　　：　　チロシン Ｔｒｐ　：　トリプトファン ｐｒｏ：　　プロリン Ａｓｎ　　；　　アスパラギン Ｇｌｎ　　：　　グルタミン Ａｓｐ　　＆　　Ａｓｎ　　：　　アスパラギン酸およ
びアスパラギン Ｇｌｕ　　＆　　Ｇｉｎ　　：　　グルタミン酸および
グルタミン 実施例 以下の実施例により、本発明を具体的に説明するが、こ
れにより本発明が制限的に解釈されるものではない。

また、参考例１に開示した形質転換体、エシェリヒア・
コリＮ４８３０／ｐＴＢ２８５は昭和６０年４月２５日
からＩＦＯにＩＦＯ１４４３７として、また昭和６０年
４月３０日からＦＲＩにＦＥｒ（Ｍ　　Ｐ−８１９９と
して寄託され、該寄託はブタベスト条約に基づく寄託に
切換えられて受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８５２として
同研究所に保管されている。

参考例！ 特開昭６１−７８７９９号公報に記載の方法で得られた
組換え体大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｎ４８３０／ｐＴＢ２
８５（ＩＰＯ１４４３７，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８５２）
をＬ培地（バクトドリプトンｌｏｇ／ρ。

バクトイ−ストエキス５ｇ／Ｑ、食塩５ｇ／Ｇにアンピ
シリン５０ｍｇ／Ｑ、テトラサイクリン１５＋＋＋ｇ、
Ｑを添加した培地に接種し、３７℃−夜回転振盪培養し
た。この培養液をグルコースｌ　Ｏｇ／　１２．　Ｎ　
ａｔＨＰＯ４６ｇ／１２．ＫＨ２ＰＯ４３ｇ／Ｑ、Ｎａ
Ｃｌ０．５ｇ／＜！、、ＮＨ，ＣＩ　　１ｇ／１２．Ｍ
ｇ５Ｏ，−７Ｈ，００，３４ｇ／１２およびカザミノ酸
１０ｇ／１２からなる培地２．５１２に分注し、通気量
２　、５（２／分、攪拌１０００ｒｐｍ、温度３０℃で
培養を開始した。途中生育が１０００クレツト単位に達
した時、温度を４２℃へシフトアップし、さらに４時間
培養を続けたのち、集菌して凍結した。

実施例１ 参考例！で得られた組換え体大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ４８３
０／ｐＴＢ２８５（ＩＦＯ１１１４３７，ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−８５２）の凍結保存菌体１ｋｇを７Ｍ塩酸グアニ
ジン、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩからなる抽出バッフ
ァー（ｐＨ７，０）！ｌに懸濁し、４℃で１時間攪拌し
たのち、１０．００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離して上
清５ｇを得た。得られた上清を５　％（ｖ／Ｖ）硫酸ア
ンモニウム溶液（ｐＨ６，５）＋４５Ｑに加えて３０倍
に希釈しくＩＬ−２の濃度：約２０μｇ／１ｎ１）、４
℃でｌＯ日日間２４０時間）熟成した。熟成による還元
型ＩＬ−２のシスチン型ＩＬ−２への変換は逆相ＨＰＬ
Ｃにより測定した。

すなわち、０．２２μｍのフィルターを通した一定容量
の試料をフェニル−５ＰＷＲＰカラム（東洋曹達株式会
社製、４．６　ｘ　７５ｎ＋ｆｆ＋）にかけ、トリフル
オロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒としてクロマト
グラフィーを行なった。溶出条件は次の通り。溶出溶媒
Δ、０．１％トリフルオロ酢酸−９９，９％水；溶出溶
媒８．０．１％トリフルオロ酢酸−アセトニトリル９９
，９％；溶出プログラム。

０分（６８％Ａ＋３２％Ｂ）−２０分（５５％Ａ＋４５
％Ｂ）−３５分（４７，５％Ａ＋５２．５％Ｂ）−３８
分（１００％ｒ３）−３９分（６８％Ａ＋３２％Ｂ）溶
出速度、０．８滅／ｍｉｎ；検出波長、２８０ｎｍ。

本条件下では、シスチン型ヒトＩＬ−２は保持時間２６
分に、システィン型ヒトＩ　Ｌ−２は保持時間３０分に
溶出された。結果を第２図に示す。第２図において、番
はシスチン型ヒトＩＬ−２を、■はシスティン型ヒトＩ
Ｌ−２のピークを示す。

第２図に示されたように、熟成萌は大部分かシスティン
型ヒトｒＬ−２であるが、熟成するにしたがって、シス
チン型ヒトＩＬ−２が増加し、７日（１６８時間）後に
は約７０％がシスチン型ヒトＩＬ−２に相当した。第３
図はこれらの変化をまとめたものである。−〇−はシス
ティン型ヒト［Ｌ−２を、−・−はシスチン型ヒトＩＬ
−２を示す。

第３図の縦軸はピークの面積を示し、単位は任意である
。

実施例２ 実施例ｉと同様にして得られた菌体抽出液上清を、蒸留
水、硫酸アンモニウムを添加した溶液、炭酸アンモニウ
ムを添加した溶液または炭酸ナトリウムを添加した溶液
（各溶液のｐＨは６．５）で３０倍に希釈して（ＩＬ−
２の濃度：約２０μｇ／戒）４℃７日間（１６８時間）
熟成した。塩濃度はいずれも５％（Ｗ／Ｖ）である。

逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃで分析したシスティン型ＩＬ−２から
シスチン型ヒトＩＬ−２への変化の様子を第４図＝１な
いし４に示す。第４図−１は蒸留水の場合の、第４図−
２は硫酸アンモニウムを添加した場合の、第４図−３は
炭酸アンモニウムを添加した場合の、第４図−４は炭酸
ナトリウムを添加した場合の結果をそれぞれ示す。第４
図において、−・−はシスチン型ヒトＩＬ−２を、−〇
−はシスティン型ヒトＩＬ−２を示す。第４図の縦軸は
ピーク面積を示し、単位は任意である。横軸は熟成時間
（日）を示す。

第４図から明らかな如く、硫酸アンモニウム。

炭酸アンモニウムまたは炭酸ナトリウムを溶存する水溶
液中で熟成させると、高い変換率でシスチン型に変換さ
せることができる。

実施例３ 参考例１で得られた組換え体大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉＮ４８
３０／Ｉ）ＴＢ２８５（ＩＦＯ１４４３７゜ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−８５２）の凍結保存菌体１ｋｇを７Ｍ塩酸グア
ニジン、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩからなる抽出バッ
ファー（＋）Ｈ７，０）５１２に懸濁し、４℃で１時間
攪拌したのち、１０．ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心分離
して上清５Ｑを得た。得られた上清を５％（Ｗ／Ｖ）硫
酸アンモニウム溶液（ｐＨ６゜５）！４５Ｉ２に加えて
３０倍に希釈しくＩＬ−２の濃度：約２０μｇ／ｄ）、
４℃で６６時間熟成した。逆相ＨＰＬＣで分析したシス
ティン型ヒトＩＬ−２およびシスチン型ヒトＩＬ−２は
、熟成前の両者の総量を１００％として、それぞれ３０
％および５０％であった。

実施例４ 実施例１と同様にして得られた菌体抽出液上清を１．３
．５および１０％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム水溶液（
ｐＨ６、５）で３０倍に希釈して（Ｉｔ、−２の濃度：
約２０μｇ／Ｍｌ）４℃で５日間（２４０時間）熟成し
、逆相ＨＰＬＣでシスティン型ヒトＩＬ−２およびシス
チン型ヒトＩＬ−２のタンパク量を測定した。その結果
を第１表に示す。第１表から、システィン型ヒトｒＬ−
２からシスチン型ヒトＩＬ−２への変換には、硫酸アン
モニウムの濃度は３〜５％が最も適していることがわか
る。

第１表 （％（Ｗ／Ｖ））　　　　システィン型　　シスチン型
注：１熟成萌のシス、ティン型およびシスチン型ヒトＩ
Ｌ−２タンパク量（前者は８９％、後者は１１％）の総
量を１００％とした。表の数値の和か１００％とならな
いのは沈澱等による損失のためである。

実施例５ 実施例！と同様にして、菌体抽出液上清を硫酸アンモニ
ウム、炭酸アンモニウム、または（および）炭酸ナトリ
ウム（ｐｒ１６　、５　）で３０倍に希釈して（■Ｌ−
２の濃度：約２０μｇ／滅）４℃で５日間（２４０時間
）熟成し、逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃでシスティン型ヒトＩＬ−
２およびシスチン型ヒトＩＬ−２のタンバク量を測定し
た。その結果を第２表に示す。第２表から、システィン
型ヒトＩＬ−２からシステン型ヒト［Ｌ−２への変換に
は、２種あるいは３種の塩溶液を混合した場合ら、単独
の場合と同程度の効果のあることがわかる。

第２表 塩　溶　液　　　　　　シスチン型　　システィン型Ｈ
２０３５１９ ５％硫酸アンーモニウム　　　　　１３　　　　６９５
％炭酸アンモニウム　　　　　１１　　　　　７６５％
炭酸ナトリウム　　　　　　　９　　　　　７１注二〇
熟成前のシスティン型およびシスチン型ヒトＩＬ−２タ
ンパクｍ（前者は８９％、後者は１１％）の総量を１０
０％とした。表の数値の和が１００％とならないのは沈
澱等による損失のためである。

発明の効果 本発明方法を行なうと、天然型ヒトインターロイキン−
２と同じジスルフィド結合を有するヒトインターロイキ
ン−２を効率良く製造することができるので、本発明方
法は該ヒトＩＬ−２を工業的生産するにあたって有利な
方法である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アミノ末端が）（−Ａｌａ−Ｐｒｏであるヒ
トＩＬ−２のアミノ酸配列を示す。 第２図は、実施例１で得られた、逆相ＨＰＬＣでの分析
結果を示す。横軸は、保存時間（分）を示す。 第３図は、実施例１で得られた逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃでの分
析結果を、熟成時間を基準にしてまとめたものを示す。 第４図は、実施例２で得られた各種塩を用いた場合の逆
相ＨＰＬＣでの分析結果を、熟成時間をぺ　　−　　リ
　マー　　− ｈ−１ｉ、Ｌｉ　　　　門　　　口　　　−ＦｌＡｚａ
ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａ２ｓ。 Ａ　２１１０ Ａ２８０　　　　　　　　　　　　　　　　　八２８０
〜 Ａ　２ｇＯＡ　２１１０　　　　　　　　　　凹臭九ｊ
ｋｆｒ間　（日）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒトインターロイキン−２を産生する形質転換体の培養
   によって得られたヒトインターロイキン−２ならびに約
   １％以上の硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは
   （および）炭酸ナトリウムを溶存する水溶液を少なくと
   も１６時間熟成させることを特徴とする天然型ヒトイン
   ターロイキン−２と同じジスルフィド結合を有するヒト
   インターロイキン−２の製造法。