CN1033184A - 一种选择性切割融合蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到一种采用蛋白质内切酶切割含有 寡甘氨酸或多甘氨酸顺序的融合蛋白，以制备多肽或 蛋白质的方法。

Description

本发明涉及一种通过酶切割融合蛋白质制备多肽或蛋白质的方法。

用于制备多肽和蛋白质的重组DNA技术正具有日益增长的重要性，这就要求研究出适用于不同的起始物质的新的浓缩和纯化产物的方法。

目前，大量蛋白质在微生物中以融合蛋白质形式合成。所谓融合蛋白系指，一个外源蛋白质序列置于所需多肽的氨基酸顺序之前（F.A.O.Harston，Biochem.J.240（1986）1-12）。通常，融合蛋白在细胞中沉淀，因为它们微溶或基本不溶，象某些包含体那样，因此避免了蛋白降解。这样就保证了高产率，此初级基因产物也易于分离。

然而，为得到所需要的多肽，必须用酶切或化学切割将其从融合蛋白质中分离出来。化学方法经常用于切割，因为化学方法很适合于融合蛋白质的微溶特性。然而，实际上无论采用任何一种化学方法，都能观察到由于产生氨基酸侧链而出现不完全切割或形成副产物。也常发生多肽链的非特异性降解（K.-K.Han    et    al，Int.J.Biochem.15（1983）875-884）。此外，由于切割特异性主要是由一个氨基酸确定，而这个氨基酸也常出现在所需的多肽中，这样，化学方法的采用就受到了限制。

酶切片段可在相当温和的条件下进行，然而，通常的困难在于，由于微溶的融合蛋白质必须溶解并保存在去污剂脲或盐酸胍溶液中，而在此条件下酶处于无活力状态。采用只识别单一的特定氨基酸的蛋白酶通常是不可能的，因为此氨基酸也出现在所需蛋白质中。另一方面，识别并切割几个氨基酸的非常特异性而少见的顺序的蛋白酶的有效性很低。因此，有必要找到一种各个产物特异的切割方法。所以，也需要有一种普遍适用的切割方法，只切割非常特定的少有的氨基酸顺序而不破坏蛋白质，且适用于微溶融合蛋白质。

文献中报道葡萄球菌溶解酶（lysostaphin）作为一种降解细胞壁的酶，由葡萄球菌类似物分泌至介质中（NRRL    B-2628;Sloan    et    al.，Int.J.of    Systematic    Bacreriology，Vol.32，No.2（1982）170-174）。此酶溶解基本上所有已知的葡萄球菌品系，但不溶解其它细菌品系。目前认为葡萄球菌溶解酶蛋白质内切酶只是非常选择性地切割位于葡萄球菌上的胞壁质球囊中的多甘氨酸桥（Iversen    and    Grov，Eur.J.Biochem.38（1973）293-300）。此外还有人用短的合成甘氨酸多肽在葡萄球菌溶解酶催化下进行过转肽实验（G.L.Sloan    et    al.，Biochem.J.167（1977）293-296）。我们现已意外地发现，葡萄球菌溶解酶蛋白内切酶还切割具有寡甘氨酸或多甘氨酸顺序的融合蛋白质。这种切割的选择性显然不需要这段顺序按特定的空间关系连接于细菌细胞壁上。这使得在温和条件下从一个融合蛋白质上特异性地排除所需要的蛋白质成为可能。

本发明涉及到一种用酶切制备多肽或蛋白质的方法，其包括切割一具有下列顺序的融合蛋白：

（Y₁……Ym）-（Gly）p+q-（X₁……Xn）

其中（Y₁……Ym）-（Gly）p代表要切除的顺序，（Gly）q-（X₁……Xn）代表多肽或蛋白质。

X和Y相互独立地表示天然氨基酸，

m和n表示大于1的数，

p和q各表示一个大于零的数，

p+q表示介于2和100之间的一个自然数，如果Ym代表Gly，则p+q有可能小于2，p有可能等于零，如果Xi代表Gly，则p+q有可能小于2，q有可能等于零。

方法中采用一特异针对-寡甘氨酸或多甘氨酸顺序的一种蛋白内切酶，并将切割后的多肽或蛋白质进行进一步的化学处理或酶处理（若需要的话），或者对它们进行适当的或直接的加工。

依脚标p和/或q的值的不同，可任意选择对要切除的顺序和/或多肽或蛋白质进行进一步的酶切。

（Y₁……Ym）是一种天然的或合成的蛋白质顺序，常用来制备融合蛋白质。适当的例子是β-半乳糖苷酶，参与色氨酸代谢的酶或这些蛋白质分子的一部分，其通常产生不溶产物，以及一些加速浓缩一种可溶发酵产物（例如抗体）的多肽顺序。

（X₁……Xn）代表一种药学活性多肽或蛋白质，或代表一种分子量较高的前体，从这个前体可通过进一步加工如折叠获得所需要的生物学活性形式，其产生正确的二硫键，和/或多肽链的特异性切割。例如前胰岛素原，从中可产生胰岛素。

残基X和Y相互独立地代表天然发生的氨基酸（例如见Schroder，Lubke“The    Peptides”Vol.I，New    York    1965，Pages    137-270    and    Houben-weyl“Methoden    der    organischen    Chemie”（Methods    of    Organic    Chemistry）Vol.15/1和2（Synthesis    of    Peptides），Georg    Thieme    Verlag    Stuttgart    1974，Annex）。下列氨基酸是特别值得提到的：甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，天冬氨酸，天冬氨酰氨，谷氨酸，谷氨酰氨，半胱氨酸，蛋氨酸，精氨酸，赖氨酸，羟赖氨酸，鸟氨酸，柠檬酸，酷氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸，脯氨酸和羟脯氨酸。

一种特异针对于寡甘氨酸和多甘氨酸顺序的蛋白质内切酶可理解为葡萄球菌溶解酶（厂家：SIGMA    Chemie    GmbH，Deisenhofen;of，also    Recsei    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.84，（1987），1127-1131）。

所需产物（X₁……Xn）通过任意所需的甘氨酸顺序（Gly）p+q与蛋白质（Y₁……Ym）连接。优选的融合蛋白为p+q值介于2和100之间的自然数。有相当多的连续甘氨酸残基在此情形中对于反应速度具有有利效果，因为切割位置更容易找到。然而当短的寡甘氨酸顺序两侧有1个或多个其它氨基酸出现，而这些氨基酸在酶切时并不阻碍酶的靠近，则也可达到同样效果。因而，就融合伙伴的结构性质来讲，连接部分的长度应该适当。

切割条件可在一个较宽的范围内变化，以便适合于融合蛋白质的各种性质。因此，有可能使酶与底物的比例介于1∶1到1∶1，000，000之间，反应PH值介于6～9，优选7～8，温度20～60℃，优选32°～42℃，基于微溶融合蛋白质的难溶程度，如果合适的话，可加入辅助物，如脲，去污剂或盐酸胍，其将融合蛋白保存在溶液中。尽管当融合蛋白质的完全溶液不加变性剂时切割进行得最快，葡萄球菌溶解酶蛋白质内切酶并不因脲的存在而失活，只是酶切反应减速。此事实可用来切割特别微溶的融合蛋白质。另一方面，理论上有可能在增加反应时间的前提下成功地进行悬浮液包含体的分裂。在融合蛋白溶液中-有或没有变性剂存在-也有可能有利地采用载体-连接形式（固定化酶）的葡萄球菌溶解酶蛋白质内切酶，并回收再用。适当的酶载体的例子如，无机载体，例如硅酸铝，以及聚合物有机载体如琼脂糖，例如

亲和胶10（Bio Rad公司出品），纤维素，修饰的聚丙烯酰胺凝胶，其具有氨基或羧基，或丙烯酰胺，异丁烯酸，异丁烯酰胺和马来酸酐的有机共聚物。合适的载体-连接酶的制备见（Halwachs et al.，Biotechnology and Bioengineering ⅩⅨ（1977）1667-1677（immobilization on aluminum silicate）or German Offenlegung-sschrift 2，927，534（immobilization on cellw loses）。

本发明的方法不仅适用于融合蛋白质的选择性切割，也通常适用于适当的多肽的选择性切割。

下面的例子描述了本发明的方法，但并不限于此。

其中例3和例4意在表明在例1和例2中得到的融合蛋白的切割片段是由于掺混了多甘氨酸顺序，而不是由于（X₁……Xn）或（Y₁……Ym）的降解。

实施例1

切割含有多甘氨酸的融合蛋白质

β-半乳糖苷酶的一个片段通过-（Gly）₁₈肽和一合成六肽与胰岛素原连接。胰岛素原形成融合蛋白的羧端。该蛋白质浓缩至40%。

此蛋白质以20mg/ml浓度溶于缓冲液（8M脲;50mM Tris/HCl;PH7.5），用50mM Tris/HCl，PH7.5及8M脲，PH7.5缓慢稀释至不同的脲浓度（见表1），蛋白质浓度为2mg/ml或10mg/ml。葡萄球菌溶解酶（ S IGMA）按酶与底物比例1∶100或1∶1000加至溶液中，每种情况都出现轻微混浊，并保持于37℃。按预定时间取样，用SDS电泳分析。融合蛋白在多甘氨酸顺序的选择性降解表现在融合蛋白质带的减少及半乳糖苷酶片段新带的形成，该片段的分子量降低了10，000道尔顿。

表1

蛋白质浓度    酶/底物比例    脲浓度    反应（＞95%的融合

（mg/ml）    （M）    蛋白带减少）（小时）

2    1∶100    4    ＞20

2    1∶100    3    20

2    1∶100    2    5

2    1∶100    1    2

10    1∶100    2    20

表1列出用SDS电泳光密度法测定的起始融合带降为原先的5%所需时间。所得到值依脲浓度和酶/底物比值不同介于1和20小时之间，还原剂的存在，例如二硫赤藓糖醇（DTE，Cleland′s试剂），其能有效地溶解融合蛋白，对于酶的活性没有显著效应。

例2

悬浮液中融合蛋白的切割

使用例1中同样的构造，但不是被分离的干燥形式。相反，是一悬浮液，其是在得到包含体时常常产生的，含约50g/l的融合蛋白，及200g/l干物质（90%蛋白质）。10ml悬浮液用50mM    Tris/HCl，PH7.5稀释至200ml，加入20mg葡萄球菌溶解酶（SIGMA）。37℃下过20小时后，SDS凝胶电泳显示只有很少量未切割的融合蛋白。

例3

用葡萄球菌溶解酶温浴胰岛素原

胰岛素原（人体）以1mg/ml浓度溶解于50mM    Tris/HCl    PH7.5，以酶/底物比1∶100加入葡萄球菌溶解酶。溶液保存在37℃，在1，3，5，20小时后取样，用反相HPLC分析。表明胰岛素原未被葡萄球菌溶解酶降解。

例4

试图切割没有多甘氨酸顺序的融合蛋白，采用这样一种构造，β-半乳糖苷酶一个片段通过一合成六肽与胰岛素原连接，胰岛素原形成融合蛋白的羧端。融合蛋白浓缩至80%。此蛋白以20mg/ml浓度溶于缓冲液（8M脲;50mM    Tris/HCl;PH7.5），用50mM    Tris/HCl    PH7.5缓慢稀释至蛋白质浓度2mg/ml。葡萄球菌溶解酶（SIGMA）以酶/底物比例1∶100加入轻微混浊的溶液，保持37℃。用SDS电泳分析样品表明，甚至在20小时后融合蛋白也没被降解。

Claims (4)

1、一种用酶切制备多肽或蛋白质的方法，其包括切割具有下列顺序的融合蛋白

(Y₁……Y_m)-(Gly)p+q-(X₁……X_n)

其中(Y₁……Y_m)-(Gly)p代表要切除的片段，(Gly)q-(X₁……X_n)代表多肽或蛋白质。

X和Y相互独立地代表天然氨基酸，

m和n代表大于1的数，

p和q分别代表大于零的数，

p+q代表介于2和100之间的自然数。如果Y_m代表Gly，p+q也有可能小于2，而p为零；如果X₁代表Gly，p+q也有可能小于2，而q为零，方法中采用特异针对于寡甘氨酸或多甘氨酸顺序的一种蛋白质内切酶来切割上述肽或蛋白质，并将所得产物进一步进行化学或酶处理(若需要的话)，或直接地进一步加工。

2、权利要求1所述方法，其中葡萄球菌溶解酶用作蛋白质内切酶。

3、权利要求1所述方法，其中p+q代表介于2和30之间的一个整数。

4、采用如权利要求1所述的融合蛋白制备一种药学活性多肽。