NO173194B - Fremgangsmaate for fremstilling av proinsulin - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av proinsulin Download PDFInfo
- Publication number
- NO173194B NO173194B NO885154A NO885154A NO173194B NO 173194 B NO173194 B NO 173194B NO 885154 A NO885154 A NO 885154A NO 885154 A NO885154 A NO 885154A NO 173194 B NO173194 B NO 173194B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- proinsulin
- fusion protein
- protein
- cleavage
- sequence
- Prior art date
Links
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 title claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108090000988 Lysostaphin Proteins 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 claims description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 9
- 229920000232 polyglycine polymer Polymers 0.000 abstract description 8
- 108010094020 polyglycine Proteins 0.000 abstract description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 7
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 abstract description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000191978 Staphylococcus simulans Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] Chemical compound [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 aluminum silicates Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000002734 metacrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000008684 selective degradation Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940037648 staphylococcus simulans Drugs 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Welding Or Cutting Using Electron Beams (AREA)
- Exhaust Gas After Treatment (AREA)
- Machines For Manufacturing Corrugated Board In Mechanical Paper-Making Processes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Techniques For Improving Reliability Of Storages (AREA)
- Fuses (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av proinsulin ved enzymatisk spalting.
Den økende betydning av rekombinant DNA-teknologi til fremstilling av polypeptider og proteiner krever utvikling av nye fremgangsmåter for anriking og rensing av produktene, som er tilpasset de endrede utgangsmaterialer.
For tiden syntetiseres et stort antall proteiner i mikroorga-nismer som fusjonsprotein, det vil si at man før aminosyrese-kvensen av det ønskede polypeptid setter sekvensen av et fremmedprotein (F.A.O. Harston, "Biochem. J." 240 (1986) 1-12). Fusjonsproteinene faller vanligvis ut i cellen på grunn av deres lave eller sogar fullstendige uoppløselighet som såkalte innslutningslegemer og er således beskyttet mot proteolytisk nedbygging. Høye utbytter og lett isolerbarhet av dette primære genprodukt er således sikret.
For å fremstille det ønskede polypeptid må det imidlertid separeres fra fusjonsproteinet ved enzymatisk eller kjemisk spalting. Ofte spalter man med kjemiske metoder, da disse enklest lar seg tilpasse fusjonsproteiners tungtoppløselige karakter av fusjonsproteinet. Ufullstendig spalting eller dannelse av biprodukter ved irreversibel derivatisering av aminosyresidekjeder iakttas imidlertid praktisk talt ved alle kjemiske metoder. Det består stadig en fare for uspesifikk nedbygging av polypeptidkjeder (K.-K. Han et al., "Int. J. Biochem." 15, (1983) 875-884). Anvendelsen av de kjemiske fremgangsmåter er dessuten begrenset, da spaltingens spesifisitet overveiende bestemmes ved en enkel aminosyre, som ofte naturlig også er tilstede i det ønskede polypeptid.
Enzymatiske fragmenteringer kan gjennomføres under vesentlig mer skånende betingelser. Generelle vanskeligheter opptrer her imidlertid ved at det tungtoppløselige fusjonsprotein må bringes og holdes i oppløsning med detergenter, urinstoff eller guanidinhydroklorid, altså betingelser hvorunder enzymene ofte inaktiveres. Proteaser, som bare erkjenner en eneste spesifikk aminosyre, kan ofte ikke anvendes fordi denne aminosyre også er tilstede i det ønskede protein. På den annen side er disponerbarheten av proteaser, som bare erkjenner og spalter helt bestemte sjeldne sekvenser av flere aminosyrer, liten. For hvert produkt må det altså søkes en egen spaltingsfremgangsmåte. Ønskelig er altså videre en universell anvendbar spaltingsmetode, som bare spalter ved helt bestemte sjeldne aminosyresekvenser uten å beskadige proteinet og som også er anvendbar på tungtoppløselige fusjonsproteiner.
Fra litteraturen er lysostafin kjent som celleveggnedbyggende enzym, og som sekreteres fra Staphylococcus simulans (NRRL B-2628, Sloan et al., "Int. J. of Systematic Bacteriology", vol. 32, nr. 2 (1982) 170-174) til mediet. Dette enzym lyserer praktisk talt alle kjente stafylokokktyper, men ingen andre bakteriearter. Hittil ble det antatt at Lysostaphin-Endoprotease bare meget selektivt spalter polyglycinbroene i Mureinsacculus av stafylokokker (Iversen og Grov, "Eur. J. Biochem. 38" (1973) 293-300). Dertil er det kjent transpep-tideringsforsøk under lysostafinkatalyse med korte syntetiske glycylpeptider (G.L. Sloan et al., "Biochem. J." 167 (1977) 293-296). Overraskende ble det nå funnet at lysostafin-endoprotease også spalter fusjonsproteiner med en oligo-henholdsvis polyglycinsekvens. Innbinding av denne sekvens i de spesifikke steriske forhold av en bakteriell cellevegg er tydeligvis ikke nødvendig for selektiviteten av spaltingen.
Dette muliggjør den skånende målrettede avspalting av det ønskede protein fra et fusjonsprotein.
I henhold til dette angår foreliggene oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av proinsulin ved enzymatisk spalting og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at man
a) fremstiller et fusjonsprotein inneholdende proinsulin, bundet som vist ved et peptid:
der
(Yi.... Ym)-(Gly)p betyr sekvensen som skal spaltes av og (Gly)q-X betyr proinsulinet,
X og Y uavhengig av hverandre er genetisk kodbare aminosyrer,
m er større enn 1,
p er større enn 0 og
p + q sammen betyr et naturlig tall mellom 2 og 100, idet hvis Ym betyr Gly kan p og q også være mindre enn 2 og p = 0, og
b) spalter fusjonsproteinet med lysostafin.
I avhengighet av størrelsen av indeksene p henholdsvis q
underligger sekvensen som skal avspaltes eventuelt ytter-ligere enzymatiske spaltinger.
(Yi ....Ym) er en naturlig eller artifisiell proteinsekvens, slik den vanligvis anvendes til fremstilling av fusjonsproteiner. På tale kommer eksempelvis p-galaktosidase, enzymer av tryptofanstoffskiftet eller deler av disse proteinmolekyler, som vanligvis fører til uoppløselige produkter, men også polypeptidsekvenser som letter en hurtig anrikning av et oppløselig fermentasjonsprodukt (for eksempel antistoffer).
Resten X og Y betyr uavhengig av hverandre naturlig forekom-mende aminosyrer (se for eksempel Schroder, Liibke "The Peptides", vol. I, New York 1965, s. 137-270 og Houben-Weyl "Methoden der organischen Chemie", bd. 15/1 og 2 ("Synthese von Peptiden"), Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974, bilag). Spesielt skal nevnes: Gøly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit, Tyr, Phe, Trp, His, Pro og Hyp.
Med en for oligo- henholdsvis polyglycinsekvenser spesifikk endoprotease menes spesielt lysostafin (produsent: "Sigma" Chemie GmbH., Deisenhofen, se også Recsei et al., "Proe. Nati. Acad. Sei.", USA, bind. 84, (1987), 1127-1131).
Det ønskede sluttprodukt X forbindes med et protein (Y^ ....Ym) ved hjelp av en ønskelig glycinsekvens (Gly)p+q. Foretrukket er fusjonsproteiner hvori p + q sammen betyr et naturlig tall mellom 2 og 30. Et større antall på hverandre følgende glycinrester kan derved på grunn av den bedre tilgjengelighet av spaltingsstedene påvirke positivt reaksjonshastigheten. Den samme effekt oppnås imidlertid også når korte oligoglycinsekvenser flankeres av en eller flere andre aminosyrer, som ikke hindrer enzymet sterisk ved spaltingen. Lengden av forbindelsesstykket er følgelig å tilpasse de strukturelle egenskaper av fusjonspartneren.
Spaltingsbetingelsene lar seg variere innen meget vide rammer og dermed tilpasse egenskapene av fusjonsproteinet. Således kan enzym/substratforholdet for eksempel ligge mellom 1:1 og 1:1 000 000 og reaksjonen gjennomføres i et pH-område fra 6 til 9, fortrinnsvis i området fra 7 til 8, fortrinnsvis ved en temperatur på 20-60°C, spesielt 32-42°C. Eventuelt kan det også alt efter graden av fusjonsproteinets tungt-oppløselighet tilsettes et hjelpestoff, for eksempel urinstoff, detergenter eller guanidinhydroklord, som holder fusjonsproteinet i oppløsning. Hurtigst forløper spaltingen riktignok når det uten tilsetning av denatureringsmidler er mulig med en omtrent fullstendig oppløsning av fusjonsproteinet, imidlertid inaktiveres ikke lysostafin-endoproteasen ved nærvær av urinstoff, men bare gjør den enzymatiske reaksjon langsom. Dette faktum kan benyttes til spalting av spesielt tungtoppløselige fusjonsproteiner. På den annen side er det ved tilsvarende forlengelse av reaksjonstiden prinsipielt mulig med hell å fragmentere de kun suspenderte innesluttelseslegemer. Ved oppløsninger av fusjonsproteinet, med eller uten denatureringsmiddel, kan lysostafin-endoproteasen også fordelaktig anvendes i bærerbundet form (immobilisert enzym) og gjenvinnes for gjentatt anvendelse. Som enzymbærere kommer for eksempel uorganiske bærere som aluminiumsilikater eller også polymere organiske bærere som agarose, for eksempel "Affi-Gel 10"
(firma Bio Rad), celluloser, modifiserte polyacrylamidgeler som har amino- eller hydroksylgrupper, eller også organiske kopolymerisater av acrylamid, metacrylater eller metacrylamid og maleinsyreanhydrid på tale. Fremstillingen av tilsvarende bærerbundne enzymer er for eksempel omtalt i Halwachs et al., "Biotechnology and Bioengineering" XIX (1977) 1667-1677 (fiksering på aluminiumsilikat) eller DE-OS 29 27 534 (fiksering på cellulose).
Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler. Derved skal eksemplene 3 og 4 belegge at de i eksemplene 1 og 2 dannede fusjonsproteinsspaltinger er å tilbakeføre på innbygging av en polyglycinsekvens og ikke på en nedbygging av (....Ym).
Eksempel 1
Spalting av et polyglycinholdig fusjonsprotein.
Det anvendes en konstruksjon, hvori et segment av p<->galaktosidase over et (Gly)ig-peptid og et syntetisk heksapeptid er sammenknyttet med proinsulin. Proinsulinet danner fusjonsproteinets karboksylende. Proteinet er anriket til ca. 40$.
Dette protein oppløses med 20 mg/ml buffer (8 M urinsstoff, 50 mM tris/HCl, pH 7,5) og bringes ved langsom fortynning med
50 mM tris/HCl, pH 7,5 og 8 M urinstoff, pH 7,5 til forskjel-lige urinstoffkonsentrasjoner (se tabell 1) og en proteinkon-sentrasjon på 2 mg/ml henholdsvis 10 mg/ml. De respektivt svakt uklare oppløsninger blandes med lysostafin ("Sigma") i enzym:substrat-forhold 1:100 henholdsvis 1:1000 og holdes ved 37° C. Til bestemte tider tas det ut prøver som analyseres ved hjelp av SDS-elektroforese. Den selektive nedbygging av
fusjonsproteinet på polyglycinsekvensen sees ved nedgang av fus j onsproteinbåndet og dannelsen av et nytt bånd for galaktosidasefragmentet med en rundt 10000 Dalton lavere molekylvekt.
I tabell 1 er det de tider, hvorefter ved densitometrisk vurdering av SDS-elektroforesen flaten for de opprinnelig fusjonsbånd er sunket til under 5$ oppført. De oppnådde verdier ligger mellom 1 og 20 timer, alt efter urinstoff-konsentrasjon og enzym:substrat-forhold. Nærværet av et reduksjonsmiddel, for eksempel ditioerytritol (DTE, Cleland's reagens), som er fordelaktig til oppløsning av fusjonsproteinet, har ingen signifikant innvirkning på enzymets ak-tivitet .
Eksempel 2
Spalting av et fusjonsprotein i suspensjon.
Den samme konstruksjon som i eksempel 1 kommer til anvendelse, og ikke i isolert, tørket form. Det anvendes heller en suspensjon, slik den vanligvis fremkommer ved utvinning av innslutningslegemer og som ved ca. 200 g/l tørrstoff (90$ protein) inneholder ca. 50 g/l fusjonsprotein. 10 ml av denne suspensjon fortynnes med 50 mM tris/HCl, pH 7,5 til 200 ml og blandes med 20 mg lysostaf in ("Sigma"). Ef ter 20 timer ved 37 °C viser SDS-gelektrof oresen enda kun små spor av ikke fragmenterte fusjonsproteiner.
Eksempel 3
Inkubasjon av proinsulin med lysostrafin.
Proinsulin (human) oppløses med 1 mg/ml i 50 mM tris/HCl, pH 7,5 og blandes med lysostafin i enzym:substrat-forhold 1:100. Oppløsningen holdes ved 37° C. Efter 1, 3, 5 og 20 timer tas det ut prøver som analyseres ved hjelp av Reversed Phase-HPLC. Derved kan det ikke sees noen antydning til en nedbygging av proinsulinet ved hjelp av lysostafin.
Eksempel 4
Forsøk på spalting av et fusjonsprotein uten polyglycinsekvens.
Det anvendes en konstruksjon, hvor et segment av p<->galaktosidase over et syntetisk heksapeptid er knyttet sammen med proinsulin. Proinsulin danner fusjonsproteinets karboksylende. Fusjonsproteinet er anriket til ca. 80$. Dette protein oppløses med 20 mg/ml buffer (8 M urinstoff, 50 mM tris/HCl, pH 7,5) og bringes ved langsom fortynning med 50 mM tris/HCl, pH til en proteinkonsentrasj on på 2 mg/ml. Den svakt uklare oppløsning blandes med lysostafin ("Sigma") i enzym:substrat-forhold 1:100 og holdes ved 37°C. Analysen av prøver ved hjelp av SDS-elektroforese viser selv efter 20 timer ingen nedbygging av fusjonsproteinet.
Claims (5)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av proinsulin ved enzymatisk spalting, karakterisert ved at man a) fremstiller et fusjonsprotein inneholdende proinsulin, bundet som vist ved et peptid:
der
(Y^....Ym)-(Gly)p betyr sekvensen som skal spaltes av og (Gly)q-X betyr proinsulinet,
X og Y uavhengig av hverandre er genetisk kodbare aminosyrer,
m er større enn 1,
p er større enn 0 og
p + q sammen betyr et naturlig tall mellom 2 og 100, idet hvis Ym betyr Gly kan p og q også være mindre enn 2 og p = 0, og b) spalter fusjonsproteinet med lysostafin.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at p + q betyr tallet 2 til 30.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at p + q sammen betyr tallet 2 til 18.
4 .
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at P-galaktosidase betyr sekvensen som skal spaltes av.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at p<->galaktosidase er forbundet med proinsulin via et (Gl<y>)18<->peptid.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873739347 DE3739347A1 (de) | 1987-11-20 | 1987-11-20 | Verfahren zur selektiven spaltung von fusionsproteinen |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO885154D0 NO885154D0 (no) | 1988-11-18 |
| NO885154L NO885154L (no) | 1989-05-22 |
| NO173194B true NO173194B (no) | 1993-08-02 |
| NO173194C NO173194C (no) | 1993-11-10 |
Family
ID=6340882
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO885154A NO173194C (no) | 1987-11-20 | 1988-11-18 | Fremgangsmaate for fremstilling av proinsulin |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0316748B1 (no) |
| JP (1) | JPH01160496A (no) |
| KR (1) | KR890008166A (no) |
| CN (1) | CN1033184A (no) |
| AT (1) | ATE78873T1 (no) |
| AU (1) | AU618035B2 (no) |
| CA (1) | CA1337283C (no) |
| DE (2) | DE3739347A1 (no) |
| DK (1) | DK645588A (no) |
| ES (1) | ES2051816T3 (no) |
| FI (1) | FI885328A (no) |
| GR (1) | GR3006045T3 (no) |
| HU (1) | HU204894B (no) |
| IE (1) | IE62228B1 (no) |
| IL (1) | IL88413A (no) |
| NO (1) | NO173194C (no) |
| NZ (1) | NZ226998A (no) |
| PT (1) | PT89019B (no) |
| ZA (1) | ZA888650B (no) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5837516A (en) * | 1995-03-03 | 1998-11-17 | Genentech, Inc. | Subtilisin variants capable of cleaving substrates containing basic residues |
| US5780285A (en) * | 1995-03-03 | 1998-07-14 | Genentech, Inc. | Subtilisin variants capable of cleaving substrates containing dibasic residues |
| ES2218622T3 (es) | 1996-07-26 | 2004-11-16 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada. |
| US6265204B1 (en) | 1997-01-17 | 2001-07-24 | Genencor International, Inc. | DNA sequences, vectors, and fusion polypeptides for secretion of polypeptides in filamentous fungi |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| WO2003082926A2 (en) * | 2002-03-26 | 2003-10-09 | Biosynexus Incorporated | Antimicrobial polymer conjugates |
| CN101717449B (zh) * | 2008-10-09 | 2013-06-19 | 重庆富进生物医药有限公司 | 重组TRAIL-Fc融合蛋白及其制备和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3523701A1 (de) * | 1985-07-03 | 1987-01-08 | Bayer Ag | Verfahren zur herstellung von proteinen und polypeptiden |
-
1987
- 1987-11-20 DE DE19873739347 patent/DE3739347A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-11-10 ES ES88118673T patent/ES2051816T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-10 EP EP88118673A patent/EP0316748B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-10 AT AT88118673T patent/ATE78873T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-11-10 DE DE8888118673T patent/DE3873273D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-17 FI FI885328A patent/FI885328A/fi not_active Application Discontinuation
- 1988-11-17 PT PT89019A patent/PT89019B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-11-18 HU HU885958A patent/HU204894B/hu unknown
- 1988-11-18 IE IE346288A patent/IE62228B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-11-18 KR KR1019880015202A patent/KR890008166A/ko not_active Application Discontinuation
- 1988-11-18 AU AU25695/88A patent/AU618035B2/en not_active Expired
- 1988-11-18 DK DK645588A patent/DK645588A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-11-18 JP JP63290349A patent/JPH01160496A/ja active Pending
- 1988-11-18 NZ NZ226998A patent/NZ226998A/en unknown
- 1988-11-18 IL IL88413A patent/IL88413A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-11-18 ZA ZA888650A patent/ZA888650B/xx unknown
- 1988-11-18 CA CA000583545A patent/CA1337283C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-18 NO NO885154A patent/NO173194C/no unknown
- 1988-11-19 CN CN88107955A patent/CN1033184A/zh active Pending
-
1992
- 1992-10-22 GR GR920402186T patent/GR3006045T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1337283C (en) | 1995-10-10 |
| NZ226998A (en) | 1991-06-25 |
| IL88413A (en) | 1993-07-08 |
| EP0316748A2 (de) | 1989-05-24 |
| CN1033184A (zh) | 1989-05-31 |
| FI885328A (fi) | 1989-05-21 |
| PT89019A (pt) | 1988-12-01 |
| ATE78873T1 (de) | 1992-08-15 |
| HU204894B (en) | 1992-02-28 |
| NO173194C (no) | 1993-11-10 |
| KR890008166A (ko) | 1989-07-10 |
| NO885154D0 (no) | 1988-11-18 |
| NO885154L (no) | 1989-05-22 |
| DK645588A (da) | 1989-05-21 |
| IL88413A0 (en) | 1989-06-30 |
| EP0316748B1 (de) | 1992-07-29 |
| IE62228B1 (en) | 1995-01-11 |
| DE3739347A1 (de) | 1989-06-01 |
| PT89019B (pt) | 1993-02-26 |
| DK645588D0 (da) | 1988-11-18 |
| GR3006045T3 (no) | 1993-06-21 |
| EP0316748A3 (en) | 1990-08-29 |
| ZA888650B (en) | 1989-07-26 |
| FI885328A0 (fi) | 1988-11-17 |
| IE883462L (en) | 1989-05-20 |
| JPH01160496A (ja) | 1989-06-23 |
| HUT50514A (en) | 1990-02-28 |
| AU618035B2 (en) | 1991-12-12 |
| DE3873273D1 (de) | 1992-09-03 |
| ES2051816T3 (es) | 1994-07-01 |
| AU2569588A (en) | 1989-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5270176A (en) | Method for the selective cleavage of fusion proteins with lysostaphin | |
| Weeks et al. | Subtiligase-catalyzed peptide ligation | |
| EP0112849A1 (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF CHYMOSINE. | |
| JPH06102034B2 (ja) | タンパク質の生産方法 | |
| JPH0822240B2 (ja) | 真核生物ポリペプチドアナログからｎ−末端アミノ酸残基を除去する方法とそれによつて生成されるポリペプチド | |
| Nagasawa et al. | Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli | |
| CN113025598A (zh) | 一种利用sumo融合表达系统制备重组肝素酶iii的方法及其所制备的sumo_肝素酶iii融合蛋白 | |
| JP2023502335A (ja) | スプリットインテインシステムを使用したタンパク質精製 | |
| NO173194B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av proinsulin | |
| CN111183220B (zh) | 用于聚糖分析的工具 | |
| Herr et al. | Purification and microsequencing of the intra-acrosomal protein SP-10. Evidence that SP-10 heterogeneity results from endoproteolytic processes | |
| US11697809B2 (en) | Biological synthesis of amino acid chains for preparation of peptides and proteins | |
| CN109136209B (zh) | 肠激酶轻链突变体及其应用 | |
| Muranova et al. | Structural investigations and identification of the extracellular bacteriolytic endopeptidase L1 from Lysobacter sp. XL1 | |
| Brömme et al. | Substrate specificity of Thermitase, a thermostable serine proteinase from Thermoactinomyces vulgaris | |
| WO1994026770A1 (en) | Electrosynthetic method of modifying biomolecules in particular enzymes | |
| CN113493780A (zh) | 一种利用sumo融合表达系统制备重组肝素酶ii的方法及其所制备的sumo_肝素酶ii融合蛋白 | |
| US6428997B1 (en) | Aminopeptidase derived from Bacillus licheniformis and process for preparation of natural type proteins | |
| Vorgias et al. | Efficient degradation in vitro of all intermediate filament subunit proteins by the Ca2+-activated neutral thiol proteinase from Ehrlich ascites tumor cells and porcine kidney | |
| CN110511951B (zh) | Plb蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用 | |
| CN110540601B (zh) | 重组PLB-hEGF融合蛋白及其应用 | |
| CN117801123B (zh) | 沃索利肽可溶性中间体、中间体制备方法及沃索利肽的制备方法 | |
| CN112522242A (zh) | 寨卡病毒丝氨酸蛋白酶在去除重组蛋白亲合标签中的应用 | |
| CN112980820A (zh) | 一种利用sumo融合表达系统制备重组肝素酶i的方法及其所制备的sumo_肝素酶i融合蛋白 | |
| EP0268743B1 (en) | A process for the production of a protein |