JPH0822240B2

JPH0822240B2 - 真核生物ポリペプチドアナログからｎ−末端アミノ酸残基を除去する方法とそれによつて生成されるポリペプチド

Info

Publication number: JPH0822240B2
Application number: JP60503686A
Authority: JP
Inventors: ブラムバーグ，シユマーヤフ; ベン・メイアー，ダニエラ
Original assignee: BAIO TEKUNOROJII JENERARU CORP
Current assignee: BAIO TEKUNOROJII JENERARU CORP
Priority date: 1984-08-16
Filing date: 1985-08-09
Publication date: 1996-03-06
Anticipated expiration: 2011-03-06
Also published as: EP0489711A3; EP0191827A1; DE3588249D1; IL76107A0; AU591464B2; WO1986001229A1; DE122004000009I2; DE3586773T2; ZA856194B; DE3588249T2; LU91064I2; EP0489711B1; DE3586773D1; EP0489711A2; IL76107A; AU4773985A; DE122004000009I1; EP0191827A4; HK143096A; JPS62500003A

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景組換えDNA技術によつて真核生物蛋白質を細菌中で大
規模に生産することが可能である。しかしこうして生産
された蛋白質はその特徴としてＮ−末端に余分なメチオ
ニン残基が付加されていることが多い。これは、翻訳が
開始されるのは必らずメチオニンをコードしているAUG
コドンからであるために起こる。原核細胞ではこのＮ−
末端メチオニンが酵素的に除去されることが多い。しか
しながらこれは、細菌中で産生された真核生物蛋白質に
ついては多くの場合当てはまらないようである。これは
恐らく、このような蛋白質が大量に過剰生産されるので
細菌のプロセシング能を上回つてしまうということに起
因するのであろう。別の可能な説明は、細菌のプロセシ
ング酵素が外来（異種）の真核生物蛋白質を自身の基質
として認識しないということである。

真核細胞では、蛋白質がその合成部位から最終局在部
位まで輸送される間にエンドペプチダーゼとエキソペプ
チダーゼの双方によるさまざまなプロセシングを受ける
ため、成熟蛋白質はＮ−末端メチオニンを欠いているこ
とが多い。

真核生物蛋白質のＮ−末端にメチオニンが存在すると
これを真核生物に投与したとき免疫応答を引き起こすか
もしれないので、細菌中で産生された真核生物蛋白質を
（プロセシング）処理してＮ−末端メチオニンを除去す
ることによつて成熟真核生物蛋白質を生成するのが望ま
しいであろう。最も入手し易いアミノペプチダーゼは亜
鉛金属酵素である。これらはいくつかのサブユニツトか
らなつており、非常に大きい分子量を有している。（概
論はDelangeおよびSmith,The Enzymes,3版,P.D.Boyer
編,1971年,3巻,81〜118頁を参照されたい）。たとえば
ブタ腎由来とウシ水晶体由来のロイシンアミノペプチダ
ーゼの分子量はそれぞれ255,000と320,000である。これ
らの酵素の正確な役割は知られていないがこのように大
きい分子量の酵素は主としてペプチドに作用すると思わ
れる。我々はこのような１つのロイシンアミノペプチダ
ーゼがメチオニル−ヒト成長ホルモン（Met−hGH）から
選択的にＮ−末端メチオニンを除去することはできない
ことを立証する。低分子量ペプチドに作用できる哺乳動
物の脳アミノペプチダーゼのあるものは膜に結合してい
るかまたは可溶性の酵素であり、後者の分子量は約100,
000である。これらの酵素は主要金属原子に加えてSH基
を含有していることが多く極めて不安定である。これら
の酵素はいずれも、メチオニル−ポリペプチド誘導体を
成熟ポリペプチドにするための「プロセシング」に対す
る実用価値がむしろ低いと思われる。

一方、文献に記載されている分子量が約30,000の２種
の微生物のアミノペプチダーゼがmet−ポリペプチドの
「プロセシング」用の候補として有望である。これら２
種の酵素はアルカリ性pHで安定でしかも至適活性である
上、熱に対してかなり安定である。Met−ポリペプチド
のプロセシングに最も適したアミノペプチダーゼはAero
monos proteolyticaアミノペプチダーゼとStreptomyces
griseusアミノペプチダーゼである。

AeromonosアミノペプチダーゼはPrescottおよびWilke
s〔Methods in Enzymology,46:530−543（1976）〕によ
つて、またWilkesら〔Eur.J.Biochem.,34:459−466（19
73）〕によつて精製されて特性決定されている。これら
はいくつかのポリペプチドと蛋白質のＮ−末端からのア
ミノ酸の遊離（liberation）を立証しているようではあ
るが、Ｎ−末端メチオニンを正確に蛋白質から除去する
ことについては何も示していない。Ｎ−末端メチオニン
の除去は残基11個のオリゴペプチドについて示されてい
る。しかしメチオニンに加えて他の多くの残基も共に除
去される。さらに、分子量が10,000より大きい未変性ホ
ルモンに対する酵素の活性は示されていない。また、Wi
lkesとPrescottが行なつた反応が定量的であるかどうか
に関する示唆もない。さらに、この論文ではアミノペプ
チダーゼに対するいくつかの「ストツプシグナル」が指
摘されているが、ストツプシグナルAspまたはＸ−Pro
（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）がこの酵素が蛋
白質と反応するときにもストツプシグナルとなるという
ことは何も示唆していない。さらにまた予備的な結果に
よつて、あらゆる蛋白質がAeromonas proteolyticaアミ
ノペプチダーゼによる攻撃を受けるわけではないことが
示される。真核生物の成熟蛋白質は、そのＮ−末端にア
ミノペプチダーゼが近付き難いように、あるコンホメー
シヨン中に「閉じ込められている（locked）」ようであ
る。しかし、真核生物蛋白質のメチオニル型はアミノペ
プチダーゼによつて除去され得るメチオニンをもつてい
る。同様に、真核生物蛋白質のＮ−末端にいくつかのア
ミノ酸が付加された誘導体も同じ酵素による除去を受け
得るであろう。我々は、Aeromonasアミノペプチダーゼ
がMet−ヒト成長ホルモン（Met−hGH）とメチオニン−A
sp−Gln−ウシ成長ホルモン（Met−Asp−Gln−bGH）か
らＮ−末端メチオニンを除去できるということを発見し
た。また我々は、AeromonasアミノペプチダーゼがMet−
Leu−hGHからＮ−末端メチオニンとその隣りのロイシン
を除去することができることも発見した。この反応は定
量的であり、しかも蛋白質は他の分解（減成）を受けな
い。

発明の概要外来（異種）宿主中で合成された真核生物ポリペプチ
ドのアナログからＮ−末端アミノ酸残基を順次除去する
方法は、この真核生物ポリペプチドアナログをＮ−末端
アミノ酸残基の連続的除去が可能になる適切な条件下で
アミノペプチダーゼと接触させることからなる。このポ
リペプチドアナログは、このポリペプチドアナログのＮ
−末端以外の位置にあつてアミノペプチダーゼの作用を
停止させる１個のアミノ酸残基または残基配列を含有し
ている。

本発明の好ましい態様では真核生物ポリペプチドアナ
ログを産生する外来宿主は細菌である。

使用する酵素アミノペプチダーゼは、ほぼ65℃までの
温度で安定であり、しかも中性pH（すなわち約7.0）と
アルカリ性pH（すなわちpH約8.0〜pH約10.0）で安定か
つ活性であるものが好ましい。このアミノペプチダーゼ
は、分子量が約100,000未満であり細菌起源のものが好
ましい。この酵素は細胞外アミノペプチダーゼであるこ
とができる。特定具体例では水に不溶のアミノペプチダ
ーゼが使用され得る。またこのアミノペプチダーゼは、
固体の担体（支持体）に固定（結合）して用いてもよい
し、あるいは反応終了時にアフイニテイー樹脂を用いて
除去してもよい。

本発明の好ましい態様ではアミノペプチダーゼがAero
monasアミノペプチダーゼである。Streptomyces griseu
sアミノペプチダーゼやBacillus stearothermophilusア
ミノペプチダーゼIIまたはIIIのような他のアミノペプ
チダーゼも使用し得る。

真核生物のポリペプチドアナログとしては、アポリポ
タンパク質E,インターフエロン特にガンマ−インターフ
エロン，またはソマトメジン特にソマトメジンＣのよう
な蛋白質やその他のあらゆるペプチド分子でよい。また
このポリペプチドはホルモン，リンホカイン，成長因子
またはこれらの誘導体であることもできる。

Ｎ−末端アミノ酸残基はいずれのアミノ酸でもよい。
本発明の特定具体例ではこのＮ−末端アミノ酸残基がメ
チオニンかまたはメチオニンとこれに続くロイシンであ
る。このＮ−末端アミノ酸残基またはアミノ酸残基の配
列は、停止信号（ストツプシグナル）として機能してア
ミノペプチダーゼの作用を停止させる１個のアミノ酸残
基また残基配列のＮ−末端に結合している。Aeromonas
アミノペプチダーゼを用いる態様ではこのアミノ酸停止
シグナルがアスパラギン酸残基かグルタミン酸残基かプ
ロリン残基のＮ−末端に結合したプロリン以外の１個の
残基を含む残基の配列かでよい。ある特定具体例ではア
ミノ酸停止シグナルがプロリン残基のＮ−末端に結合し
たフエニルアラニン残基からなる。

本発明の一特定具体例は細菌中で産生された成長ホル
モンアナログやその誘導体からＮ−末端のメチオニン残
基を除去することである。Met−hGH,Met−Asp−Gln−bG
H,Met−bGHおよびMet−pGHをそのＮ−末端のメチオニン
残基の除去が可能になる適切な条件下でアミノペプチダ
ーゼと接触させることによつて、これらの成長ホルモン
アナログからＮ−末端メチオニン残基が除去される。

本発明のもう一つ別の具体例は細菌中で産生された成
長ホルモンアナログやその誘導体のＮ−末端からメチオ
ニン残基とロイシン残基の双方を除去することである。
Ｎ−末端のメチオニン残基とその隣りのロイシン残基
は、これら２つの残基の除去が可能になる適切な条件下
でMet−Leu−hGHをアミノペプチダーゼに接触させるこ
とによつてこの成長ホルモンアナログから除去される。

本発明のもう一つ別の一面はポリペプチド分子にＮ−
末端アミノ酸残基を付加する方法に係り、この方法はこ
のポリペプチドのＮ−末端へのアミノ酸の付加が可能と
なる適切な条件下でポリペプチド分子をアミノペプチダ
ーゼおよび付加すべき充分過剰な遊離のＮ−末端アミノ
酸に接触させることからなる。Aeromonasアミノペプチ
ダーゼが本発明のこの態様で用いるのに好適なアミノペ
プチダーゼである。

本発明の特定実施態様では補酵素の金属置換によつい
てAeromonasアミノペプチダーゼを過活性化（hyperacti
vation）することができる。好ましい具体例ではZn（I
I）の一部をCu（II）で、一部をNi（II）で置換する。

本発明は、本発明の方法によつて生成したポリペプチ
ドアナログにも関する。ヒトやウシの成長ホルモンのよ
うな成長ホルモンや成長ホルモンアナログ、たとえばhG
H,Asp−Gln−bGHおよびbGHが本発明の方法に従つて生産
された。

本発明の別の一面は真核生物ポリペプチド分子のアナ
ログの製造方法に係り、この方法は真核生物ポリペプチ
ドのアナログをコードしている遺伝子の発現によつて細
菌中で最初のアナログを産生させ、アミノペプチダーゼ
を用いる本発明方法によつてＮ−末端のメチオニン残基
とそれに隣接するアミノ酸残基を除去し、得られたアナ
ログを回収することからなつている。アミノペプチダー
ゼによつて除去されるＮ−末端メチオニン残基とその隣
接アミノ酸残基を限外過か透析によつて除去すること
でアナログの回収を最適にすることができる。

図面の簡単な説明第１図は、実施例１に記載したAeromonas proteolyti
caアミノペプチダーゼによるMet−hGHからのＮ−末端メ
チオニンの放出（release）の時間経過を示す。比較の
ためロイシンの放出も示す。

第２図は、実施例IIに記載したAeromonas proteolyti
caアミノペプチダーゼによるMet−Asp−Gln−bGHからの
Ｎ−末端メチオニンの放出の時間経過を示す。比較のた
めロイシンの放出も示す。

発明の詳細な説明外来宿主中で合成された真核細胞ポリペプチドアナロ
グのＮ末端から１個以上のアミノ酸残基を順次除去する
方法は、Ｎ末端アミノ酸残基の連続的な除去を可能とす
る適当な条件下で、真核細胞ポリペプチドアナログを適
当なアミノペプチダーゼと接触させることから成り、該
ポリペプチドアナログは、ポリペプチドアナログのＮ末
端以外の位置にアミノペプチダーゼの作用を停止するア
ミノ酸残基あるいは残基配列を含有する。

真核細胞ポリペプチドのアナログを合成する外来宿主
は、組換えDNA法の使用によりアナログをコードする遺
伝子を発現し、その結果としてのポリペプチドを産生し
得るものであれば、どのようなバクテリア（細菌）、そ
の他の微生物あるいは生物でも良い。

アミノペプチダーゼは約65℃の温度まで安定である酵
素であることが好ましい。アミノペプチダーゼはまた、
約7.0の中性pH及び好ましくは約8.0〜約10.0のアルカリ
性pHにおいて安定かつ活性でなければならない。

本発明の好ましい実施態様の一つでは、該アミノペプ
チダーゼは分子量約100000以下でバクテリア由来のもの
である。アミノペプチダーゼはまた、細胞外のもの、水
に不溶のものであつてもよく、アガロースあるいはその
他のポリマー物質のような固体支持体（担体）に結合さ
れていてもよい。本発明の特定の実施態様では、親和性
（アフイニテイー）樹脂を使用して反応混合物から過剰
のアミノペプチダーゼを除去してもよい。

本発明の好ましい実施態様においては、該アミノペプ
チダーゼはアエロモナス（Aeromonas）アミノペプチダ
ーゼである。その他のタイプのアミノペプチダーゼを使
用することもでき、例えばストレプトマイセスグリセウ
ス（Streptomyces griseus）アミノペプチダーゼ、バチ
ルスステアロサーモフイラス（Bacillus stearothermop
hilus）アミノペプチダーゼIIあるいはIIIがある。

Ｎ末端アミノ酸残基の除去を可能とする適当な条件は
通常の知識を有する当業者には周知のものであつて、使
用するアミノペプチダーゼのタイプにより変化する。ア
エロモナスアミノペプチダーゼの場合、適当な条件は温
度約37℃でpHが約9.5のアルカリ性水溶液である。

真核細胞ポリペプチドアナログはどのようなポリペプ
チドあるいはポリペプチドアナログであつても良く、例
えばホルモン，リンフオカインあるいは成長因子等であ
る。適した真核細胞ポリペプチドは、アポリポプロテイ
ンE,インターフエロン，特にガンマ−インターフエロン
及びソマトメジン，特にソマトメジンＣである。本発明
の特定の実施態様は、ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリある
いはその他の動物の成長ホルモンのような真核細胞成長
ホルモンのアナログからのＮ末端アミノ酸の除去に係
る。これ等の実施態様において、成長ホルモンポリペプ
チドアナログは組み換えDNA技術によりバクテリア中で
産生されたものである時には、該アナログにＮ末端メチ
オニンが付加されている。本発明は、バクテリア中で産
生された後のヒト、ウシ、ブタ及びニワトリ成長ホルモ
ン分子あるいはそのアナログからＮ末端メチオニン及び
それに隣接するアミノ酸の除去法を提供する。

本発明のある実施態様では、アミノペプチダーゼの作
用を停止するアミノ酸残基あるいはＮ末端メチオニンの
隣りに位置するものである。この場合、アミノペプチダ
ーゼはＮ末端メチオニン残基のみを除去する。

別の本発明のある実施態様では、アミノペプチダーゼ
の作用を停止するアミノ酸残基あるいは残基配列は分子
Met−Leu−hGH中のロイシンの隣りに位置する。この場
合、アミノペプチダーゼはＮ末端メチオニン残基とロイ
シン残基の両方を除去する。

その他の本発明の実施態様では、アミノペプチダーゼ
の作用を停止する残基あるいは残基配列は、１つあるい
はそれ以上のアミノ酸残基でＮ末端メチオニンから隔て
られている。この実施態様においては、アミノペプチダ
ーゼはＮ末端メチオニンを除去した後、停止信号（スト
ツプシグナル）の前にあるこれ等のアミノ酸残基も除去
する。

アエロモナスアミノペプチダーゼの場合は、この酵素
の作用を停止させるアミノ酸残基は、アスパラギン酸あ
るいはグルタミン酸のどちらでも良い。さらに、プロリ
ンのＮ末端に結合したプロリン以外のアミノ酸から成る
残基配列もまた停止信号として機能する。ある実施態様
においては、この停止信号はプロリンのＮ末端に結合し
たアミノ酸フエニルアラニンから成る。このPhe−Pro配
列は多くの天然動物成長ホルモン分子のＮ末端に見られ
る。本発明のある特定の実施態様では、バクテリア中で
組換えDNA技術により酸生され、そのような産生方法の
結果Ｎ末端にMet−Phe−Pro配列を有する動物成長ホル
モン分子からＮ末端メチオニンを除去している。また別
の本発明の実施態様では、バクテリア中で組換えDNA技
術により産生され、そのような産生方法の結果Ｎ末端に
Met−Leu−Phe−Pro配列を有する動物成長ホルモン分子
からＮ末端メチオニンとそれに隣接するロイシン残基の
両方を除去している。また別の本発明の実施態様では、
バクテリア中で組換えDNA技術により産生され、そのよ
うな産生方法の結果Ｎ末端にMet−Leu−Phe−Pro配列を
有する動物成長ホルモン分子からＮ末端メチオニンとそ
れに隣接するロイシン残基の両方を除去している。

本発明の特定の実施態様では、真核細胞ポリペプチド
がウシ成長ホルモン（bGH）のアナログである。これ等
のアナログはMet−Asp−GlnあるいはMet−Phe配列をそ
のＮ末端配列として含んでいる。このメチオニンは、こ
れ等アナログをバクテリア中で組換えDNA法により産生
した場合は、これ等の成長ホルモンのＮ末端に付加され
ている。アミノペプチダーゼによりＮ末端メチオニンを
除去した後、Asp−Gln−bGH及びbGHをそれぞれ回収す
る。この実験に使用したbGHは天然状態でそのＮ末端に
フエニルアラニン残基を有するフエニルアラニン型のbG
Hであつた。しかしこれ等の方法は、天然形状でＮ末端
にアラニンを含有するアラニン型のbGHの末端からＮ末
端メチオニンを除去するのにも使用し得る。但しこの場
合はアラニン残基も除去される。

本発明の１つの好ましい実施態様は、ホルモンをコー
ドする遺伝子の発現によりバクテリア中で産生された、
例えば動物及びヒト成長ホルモンアナログのような真核
動物成長ホルモンアナログからのＮ末端メチオニン残基
の除去方法に係り、該方法は、Ｎ末端メチオニン残基あ
るいはＮ末端メチオニン残基及びそれに隣接するロイシ
ン残基を除去し得る適当な条件下で該成長ホルモンアナ
ログをアエロモナスアミノペプチダーゼと接触させるこ
とから成る。

本発明のある特異的な実施態様は、ヒト成長ホルモン
（hGH）アナログからのＮ末端メチオニン残基の除去方
法に係り、該ヒト成長ホルモンアナログは、該ホルモン
をコードする遺伝子の発現によりバクテリア中で産生さ
れたものであり、本来（真正）のヒト成長ホルモンのＮ
末端に付加されたメチオニン残基を有するものであつ
て、該方法はＮ末端メチオニン残基を除去し得る適当な
条件下で該アナログをアエロモナスアミノペプチダーゼ
と接触させることから成る。

本発明のまた別の特異的な実施態様は、ヒト成長ホル
モン（hGH）アナログからのＮ末端メチオニン残基とそ
れに隣接するロイシン残基の除去方法に係り、該ヒト成
長ホルモンアナログは該ホルモンをコードする遺伝子の
発現によりバクテリア中で産生されたものであり、本来
のヒト成長ホルモンのＮ末端にロイシン残基につながる
メチオニン残基を有するものであつて、該方法はＮ末端
メチオニン残基及びそれに隣接するロイシン残基を除去
し得る適当な条件下で該アナログをアエロモナスアミノ
ペプチダーゼと接触させることから成る。

本発明のまた別の特異的な実施態様は、ウシ成長ホル
モンアナログからのＮ末端メチオニン残基の除去方法に
係り、該ウシ成長ホルモンアナログはそれをコードする
遺伝子の発現によりバクテリア内で産生されたものであ
り、Ｎ末端に付加されたメチオニン残基を有しており、
該方法は、Ｎ末端メチオニン残基を除去し得る適当な条
件下で該アナログをアエロモナスアミノペプチダーゼと
接触させることから成る。

本発明のまた別の特異的な実施態様は、例えばガンマ
−インターフエロンのようなインターフエロンのアナロ
グからのＮ末端メチオニン残基の除去方法に係り、該イ
ンターフエロンアナログはそれをコードする遺伝子の発
現によりバクテリア内で産生されたものであり、該方法
は、Ｎ末端メチオニン残基を除去し得る適当な条件下で
該インターフエロンアナログをアエロモナスアミノペプ
チダーゼと接触させることから成る。

本発明のまた別の特異的な実施態様は、例えばソマト
メジンＣのようなソマトメジンのアナログからのＮ末端
メチオニン残基の除去方法に係り、該ソマトメジンアナ
ログはそれをコードする遺伝子の発現によりバクテリア
内で産生されたものであり、Ｎ末端に付加されたメチオ
ニン残基を有しており、該方法は、Ｎ末端メチオニン残
基を除去し得る適当な条件下で該アナログをアエロモナ
スアミノペプチダーゼと接触させることから成る。

本発明のまた別の特異的な実施態様は、アポリポプロ
テインＥアナログからのＮ末端メチオニン残基の除去方
法に係り、該アナログはそれをコードする遺伝子の発現
によりバクテリア内で産生されたものであり、Ｎ末端に
付加されたメチオニン残基を有しており、該方法は、Ｎ
末端メチオニン残基を除去し得る適当な条件下で該アナ
ログをアエロモナスアミノペプチダーゼと接触させるこ
とから成る。

本発明はまた、ポリペプチド分子にＮ末端残基を付加
する方法にも係り、該方法は、ポリペプチドのＮ末端に
アミノ酸を付加し得る適当な条件下で、ポリペプチド分
子をアミノペプチダーゼと付加を所望する遊離Ｎ末端ア
ミノ酸残基の充分に過剰な量とに接触させることから成
る。どのようなアミノペプチダーゼ酵素も使用し得る
が、アエロモナスアミノペプチダーゼが好ましい。該ア
ミノペプチダーゼを使用すると、該酵素の停止信号とし
て機能しないアミノ酸であればどのようなアミノ酸残基
でもポリペプチドのＮ末端に付加することができ、停止
信号として働くアミノ酸をＮ末端に付加するのが好まし
い。アミノペプチダーゼ反応は可逆反応であるので、付
加反応の条件は、付加所望遊離アミノ酸の濃度以外は開
裂反応のものと同じである。

アエロモナスアミノペプチダーゼの活性は金属置換に
よつて増加し得る。実質的にJ.M.プレスコツト（Presco
tt）等の方法（Biochemical and Biophysical Research
Communications,Vol.114,No.（pp.646−652）２（198
3））による部分的あるいは混合金属置換により最大の
活性増加が起る。部分的あるいは混合金属置換は、Zn
（II）に対するCn（II）あるいはZn（II）に対するNi
（II）とし得る。

本発明は、本発明の方法により産生された、例えばヒ
ト、ウシ、ブタ、ニワトリの成長ホルモンあるいはAsp
−Gln−bGHのような成長ホルモンアナログといつたポリ
ペプチドアナログにも係る。

本発明のもう１つの形態は、真核細胞ポリペプチドの
アナログの調製方法であり、該方法は該真核細胞ポリペ
プチドのアナログをコードする遺伝子の発現によりバク
テリア中で第１のアナログを産生することから成る。そ
の後このアナログのＮ末端メチオニン残基あるいはＮ末
端メチオニン残基及びそれに隣接するロイシン残基を、
本発明の方法により例えばアエロモナスアミノペプチダ
ーゼのようなアミノペプチダーゼで除去する。得られた
アナログを当業者に公知の方法で回収する。

アナログの回収は、アミノペプチダーゼによりポリペ
プチドアナログから開裂された遊離Ｎ末端メチオニン及
びロイシン残基を除去することにより最適化される。遊
離アミノ酸の除去により反応が完全なものとなる。該除
去は当業者に公知の方法、例えば限外過あるいは透析
により行ない得る。本発明はまた、本発明の方法により
調製した、例えばヒト、ウシ、ブタ成長ホルモンのよう
な成長ホルモンといつた真核細胞ポリペプチドのアナロ
グにも係る。

実験の詳細材料および方法 Met−hGHおよびMet−Asp−Gln−bGHを組換えDNA技法
により作成した。ドデシル硫酸ナトリウムおよび２−メ
ルカプトエタノールの存在下で電気泳動したタンパク質
のポリアクリルアミドゲル（15％ゲル）をクーマシーブ
ルー染色したところ、ａ） Met−Asp−Gln−bGHに対応するMw約22,000の主要
バンドとMet−Asp−Gln−bGH分子に対して僅かに高い
（ロツト108−）〔バイオ−テクノロジー・ジエネラル
（イスラエル）社〕もしくは低い（ロツト113D）〔バイ
オ−テクノロジー・ジエネラル（イスラエル）社〕分子
量を有する極めて弱いバンド；ｂ） Mw約22,000の主要バンドとMet−hGH（ロツト1/10
0）分子に対して僅かに低い分子量を有する極めて弱い
バンド（クーマシーブルー）が示された。S.D.S.ゲルを
走査したところ、88−93％の両タンパク質の純度が示さ
れる。95％以上の純度が他の製法で得られた。37℃で24
時間インキユベート後タンパク質をSDS−ポリアクリル
アミドゲルで電気泳動した結果、明らかな汚染性エンド
ペプチダーゼ活性は存在していなかつた。

アエロモナス（Aeromonas）アミノペプチダーゼを、
アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンから入
手したアエロモナスプロテオリテイカ（Aeromonas prot
eolytica）（ATCC 15338）の細胞外液から、本質的に
プレスコツトジエー．エム．（Prescott J.M.）およ
びウイルキスエス．エツチ．（Wilkes S.H.）、メソ
ツドエンザイモル．（Methods Enzymol.）46:530−54
3（1976）に従つて作成した。精製は次の工程で行つ
た。バクテリアの沈降および過、液の硫酸アンモニ
ウム沈殿（367g/）、アセトン分画（70％アセトンに
対して43.7％）、エンドペプチダーゼ活性を殺すための
70℃での加熱処理（８時間）、セフアデツクスＧ−75に
よるゲル過およびDEAE−セフアデツクスＡ−50による
イオン交換クロマトグラフイー。全ての実験で、10mMト
リス−HCl緩衝液（pH8.0）をプレスコツト（Prescott）
およびウイルキス（Wilkes）が使用した10mMトリシン緩
衝液（pH8.0）に代えて使用した。

Ｇ−75カラムの予備平衡化および溶離は、本来の方法
で使用した50μmole ZnCl₂に代えて５μmole ZnCl₂の存
在下で実施した。DEAE−セフアデツクスＡ−50カラムに
おける精製は、５μmole ZnCl₂を含む10mMトリス−HCl
（pH8.0）中の0.1M NaClでカラムを予備平衡化（preequ
ilibration）し、サンプルを導入し、（５μmole ZnCl₂
を含む）同一緩衝液中の0.6M NaClで勾配溶離させて実
施した。塩濃度を約0.5Mまで高めた後、カラムを同一緩
衝液中の0.7M NaClを用いて溶離させた。カラムから溶
出した主要ピークを集め、５μmole ZnCl₂を含む10mMト
リス−HCl,0.1M NaCl（pH8.0）を用いて透析し、−20℃
に凍結保持した。

成長ホルモンと反応させる前に酵素溶液を70℃で２時
間インキユベートし、調製物中に残存すると長期間の保
存後再び活性化される可能性のある痕跡量のエンドペプ
チダーゼ活性を不活化した。大規模実験では、ホルモン
との反応前に酵素を70℃で３時間インキユベートした。

アミノ酸は、デイオネツクス（Dionex）Ｄ−502アミ
ノ酸アナライザーを用いて分析した。アミノ酸配列の分
析は、アプライド・バイオシステムス・ガス・フエーズ
・シークエンサー（Applied Biosystems Gas Phase Seq
uencr）、次いでPTH−アミノ酸の高性能液体クロマトグ
ラフイーを用いて実施した。

実施例ＩアエロモナスアミノペプチダーゼによるMet−hGHから
の遊離メチオニンの放出の時間依存性 Met−hGHと反応させる前に、DEAE−セフアデツクスＡ
−50カラムから溶出されたアミノペプチダーゼのサンプ
ル、10mMトリス−HCl,0.1M NaCl（pH8.0）中の0.63mg/m
lを70℃で２時間インキユベートし、痕跡量のエンドペ
プチダーゼ活性を不活化した。次いで酵素を2Mトリス−
HCl（pH9.5）で3:1に希釈し、最終濃度0.4725mg/ml酵素
とした。

Met−hGHを10mMホウ酸Na（pH9.5）中で8mg/ml（重
量）に溶解させた。

900μのMet−hGH溶液と19μのアミノペプチダー
ゼ溶液を混合し、37℃でインキユベートした。２分,5
分,10分,15分,30分,60分,2時間,4時間および22時間後に
50μアリコートを採取し、等容量の３％スルホサリチ
ル酸水溶液を添加し、37℃で15分間インキユベート後エ
ペンドルフ（Eppendorf）ベンチ遠心機で遠心して沈殿
させた。上清50μサンプルを（酸加水分解せずに）直
接アミノ酸分析した。コントロール実験として、t₀間で
溶解直後あるいはMet−hGHのみを37℃で４時間もしくは
22時間インキユベート後Met−hGH溶液（8mg/ml）のみを
沈殿させた。各コントロールについても、ホルモン溶液
50μを等容量の３％スルホサリチル酸を用いて沈殿さ
せ、上清50μについてアミノ酸分析を行つた。分子量
が約21,800であり、秤量した物質の85％がホルモン（水
５％−10％、ホルモン純度90％−95％）であると仮定し
て、各分析はMet−hGH出発物質の7.63ナノモルに反応す
る。酵素により遊離したメチオニンおよび幾種かの他の
アミノ酸の量を表Ｉに示す。

メチオニンおよびロイシンの経時的放出変化を第１図
に示す。Met−hGHのＮ−末端配列を表IVに示す。生成物
にポリアクリルアミドゲル電気泳動を行つたところ、hG
Hの明らかな減成はみられない。

アミノペプチダーゼの中性プロテアーゼ汚染物質はむ
しろ疎水性アミノ酸のアミノサイド上の内部ペプチド結
合を開裂させる。これは、例えば次いでアミノペプチダ
ーゼにより遊離されるLeuやIle残基を示す。表示してい
ない他のアミノ酸の放出は無視できる程度である。

実施例II アエロモナスアミノペプチダーゼによるMet−Asp−Gl
n−bGHからの遊離メチオニンの放出の時間依存性 Met−Asp−Gln−bGHと反応させる前に、DEAE−セフア
デツクスＡ−50カラムから溶出されたアミノペプチダー
ゼのサンプルを70℃に加熱し、実施例Ｉに記載した如く
希釈した。

Met−Asp−Gln−bGHを10mMホウ酸Na（pH9.5）中で8mg
/ml（重量）に溶解させた。

750μのMet−Asp−Gln−bGH溶液と32μのアミノ
ペプチダーゼ溶液を混合し、37℃でインキユベートし
た。５分,10分,15分,30分,60分,2時間,4時間および22時
間後に50μアリコートを採取し、等容量の３％スルホ
サリチル酸水溶液を添加し、37℃で15分間インキユベー
ト後エペンドルフ（Eppendorf）ベンチ遠心機で遠心し
て沈殿させた。50μサンプルをアミノ酸分析用に再び
採取した。コントロール実験として、t₀間で溶解直後あ
るいは37℃で22時間インキユベート後Met−Asp−Gln−b
GH溶液（8mg/ml）のみを沈殿させた。タンパク質の沈殿
および上清のアミノ酸分析を実施例Ｉに記載された如く
行つた。分子量が約22,000であり、秤量した物質の85％
がホルモン（水５％−10％、ホルモン純度90％−95％）
であると仮定して、各分析はMet−Asp−Gln−bGH出発物
質の7.4ナノモルに対応する。遊離したメチオニンおよ
び幾種かの他のアミノ酸の量をIIに示す。

遊離メチオニンおよびロイシンの経時的放出変化を第
２図に示す。Met−Asp−Gln−bGHのＮ−末端配列を表IV
に示す。生成物にポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
つたところ、bGHアナログの明らかな減成はみられな
い。

アミノペプチダーゼの中性プロテアーゼ汚染質はむしろ
疎水性アミノ酸のアミノサイド上の内部ペプチド結合を
開裂させる。これは、例えば次いでアミノペプチダーゼ
により遊離されるLeuやIle残基を示す。表示していない
他のアミノ酸の放出は無視できる程度である。

実施例III アエロモナスアミノペプチダーゼとロイシンアミノペ
プチダーゼ（豚腎からのミクロソーマル，シグマL500
6）の比較アエロモナス（Aeromonas）アミノペプチダーゼ、10m
Mトリス−HCl,0.1M−NaCl（pH8.0）中の0.63mg/mlを70
℃で２時間インキユベートし、痕跡量のエンドペプチダ
ーゼ活性を不活性化させた。次いで酵素を2Mトリス−HC
l（pH9.5）で3:1に希釈し、最終濃度0.4725mg/mlとし
た。

3.5M（NH₄）₂SO₄,10mM MgCl₂（pH7.7）中の1mg/ml懸
濁液、ロイシンアミノペプチダーゼ（豚腎，ミクロソー
マル，シグマL5006）100μを、0.5MトリスHCl（pH9.
5）20μ、H₂O 150μおよび0.025M MnCl₂ 25μと
混合し、混合物を37℃で２時間インキユベートした。

Met−hGHを10mMホウ酸Na（pH9.5）中で11mg/mlに溶解
した。

１）Met−hGH溶液（11mg/ml）290μ＋10mMホウ酸Na
（pH9.5）110μ＋アエロモナスアミノペプチダーゼ溶
液（最終酵素濃度:19.3μg/ml）17μ、または２）Met−hGH溶液（11mg/ml）400μ＋ロイシンアミノ
ペプチダーゼ活性化酵素85μ＋0.125M MgCl₂（最終イ
ンキユベート酵素濃度49.9μg/ml）85μを、37℃でイ
ンキユベートした。５分,3時間および22時間後に75μ
アリコートを採取し、等容量の３％スルホサリチル酸を
用いて沈殿させた。37℃で15分間インキユベートし、混
合物を遠心分離し、上清50μを直接アミノ酸分析し
た。分子量が約21,800であり、秤量した物質の85％がホ
ルモンであると仮定して、各分析はアエロモナス酵素，
豚ロイシンアミノペプチダーゼとの反応用Met−hGH出発
物質の夫々7.46nmole,7.53nmoleに対応する。

コントロール実験として、溶解後あるいは37℃で22時
間インキユベート後Met−hGHを等容量の３％スルホサリ
チル酸を用いて沈殿させた。沈殿混合物を37℃で15分間
インキユベートし、遠心分離し、上清50μを直接アミ
ノ酸分析用に採取した。実験結果を表IIIに示す。これ
らの結果から、ロイシンアミノペプチダーゼはＮ−末端
メチオニンを除去せず、放出された少量のメチオニンは
恐らくエンドペプチダーゼ活性の汚染物質から形成され
る小ペプチドから放出されたものであろう。（Ileおよ
びLeuの量参照）ことが示される。この結論は、37℃で2
2時間インキユベート後ホルモンが酵素により幾分減成
されることを示すポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
つて確認される。

アミノペプチダーゼの中性プロテアーゼ汚染物質はむ
しろ疎水性アミノ酸のアミノサイド上の内部ペプチド結
合を開裂させる。これは、例えば次いでアミノペプチダ
ーゼにより遊離されるLeuやIle残基を示す。

実施例IV Met−Asp−Gln−bGHからのＮ−末端メチオニンの除去お
び配列分析用サンプルの調製 10mNホウ酸ナトリウム（pH9.5）中8mg/mlのMet−Asp
−Gln−bGH 2.5mlを、0.5Mトリス−HCl（pH9.5）中0.47
25mg/mlの酵素106μと一緒に37℃で22時間インキユベ
ートした。アミノ末端配列を決定するために、混合物2m
lを10mMホウ酸Na（pH9.5）を用いて1:1に希釈し、15％
スルホサリチル酸1mlを添加し、混合物を37℃で15分間
インキユベート後、遠心により沈降させた。ペレツトを
３％スルホサリチル酸5ml中で再懸濁させ、再び遠心し
た。ペレツトを10mMホウ酸Na（pH10.5）5ml中に懸濁さ
せ、夫々1ml、0.3mlおよび1mlの濃水酸化アンモニウム
を含む水２を用いて３回透析を行つた後、次いで水を
用いて透析を行つた。サンプルを（氷酢酸を用いて）20
％酢酸とし、これを配列分析に用いた。配列分析の結果
を第IV表に示す。この結果から、分子の95％より多くが
Ｎ−末端配列Asp−Gln−Phe−Proを有することが示され
る。

実施例Ｖ反応を進行させるための限外過または透析の使用酵素を用いて実施される反応は可逆性である。従つて
生成物の一方を除去すると、反応は更に完結するであろ
う。我々はこのことを、反応中遊離したメチオニン残基
を除去し、反応を進行させて（drive）更にhGHを生成さ
せることにより示した。遊離したメチオニン残基は限外
過により除去された。

10mMホウ酸Na（pH9.5）1500ml中のMet−hGH12gを、0.
5Mトリス−HCl（pH9.5）中の酵素0.4725mg/mlの12.4ml
と共に37℃で２時間インキユベートした。更に同じ酵素
溶液6.2mlを添加し、37℃で3.5時間インキユベートし
た。溶液を限外過用に用意し、遊離メチオニンを除去
し、酵素反応を完結させるべく材料に10mMホウ酸Na（pH
9.5）約50を４時間に亘つて通した。次いで37℃で12.
5時間インキユベートした。インキユベートおよび限外
過の総時間数は22時間であつた。材料をDEAE−セフア
セルに吸着させ、樹脂を10mMホウ酸Na（pH9.0）で洗浄
し、次いで25mM NaCl,50mM NaClおよび75mM NaCl含有の
10mMホウ酸ナトリウム（pH9.0）で洗浄した。ホルモン
を、100mM NaCl含有10mMホウ酸Na（pH9.0）を用いて溶
出させた。溶出したホルモンを濃縮し、限外過により
透析し、凍結乾燥させた。サンプルを20％酢酸に溶解
し、配列分析を行つた。分析の結果を表IVに示す。この
結果から、分子の99％より多くでＮ−末端メチオニンが
除去されタンパク質の更なる減成がないことが示され
る。

実施例VI アエロモナスアミノペプチダーゼによるMet−Leu−hG
Hからの遊離メチオニンおよび遊離ロイシの放出の時間
依存性 Met−Leu−hGHと反応させる前に、DEAE−セフアデツ
クスＡ−50カラムから溶出されたアミノペプチダーゼの
サンプルを70℃に加熱し、実施例Ｉに記載した如く希釈
した。

Met−Leu−hGHを10mMホウ酸Na緩衝液（pH9.5）中で8m
g/ml（重量）に溶解させた。pHを10.6に上げ、次いで8.
8に下げ、最後に混合物を遠心分離して少量の沈殿を除
去した。上清液を反応用に用いた。

1000μのMet−Leu−hGH溶液と21μのアエロモナ
スアミノペプチダーゼを混合し、37℃でインキユベート
した。２分,5分,10分,30分,60分,2時間および22時間後
に75μアリコートを採取し、等容量の３％スルホサリ
チル酸水溶液を添加し、37℃で15分間インキユベート後
エペンドルフ（Eppendorf）ベンチ遠心機で遠心して沈
殿させた。上清50μサンプルを（酸加水分解せずに）
直接アミノ酸分析した。コントロール実験として、t₀時
間であるいはMet−Leu−hGH溶液を37℃で22時間インキ
ユベート後等容量の３％スルホサリチル酸を用いてMet
−Leu−hGH溶液（8mg/ml）のみを沈殿させた。上清50μ
について直接アミノ酸分析を行つた。この実験結果を
表Ｖに示す。

メチオニンおよびロイシンの経時的放出変化を第３図
に示す。Met−hGHのＮ−末端配列を表IVに示す。生成物
にポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、hG
Hの明らかな減成はみられない。

表示していない他のアミノ酸の放出は無視できる程度
である。

実施例VII Metガンマ−インターフエロンの市販品からのMetの除去真正のリンフオカイン配列を含み１−５×10⁷単位/mg
の比活性を有するガンマ−インターフエロン〔アムジエ
ン（Amgen）；インターフエロン−ガンマ−4A;ARN3010,
バツチ１〕30μを、マイクロシークエンス分析にかけ
た。最初の３個のアミノ酸分析から、材料が（第３サイ
クルでは微量のArgがみられたが）Met−Gln−AspのＮ−
末端配列を有するMet−ガンマ−インターフエロンを含
むことが示された。

このガンマ−インターフエロン誘導体にアエロモナス
アミノペプチダーゼによる作用を加え、ピコモルの感度
とオルト−フタルアルデヒドポスト−カラム誘導（post
−column derivatization）を有する高感度アミノ酸ア
ナライザーを用いてアミノ酸分析した結果遊離メチオニ
ンが放出されたことが判明した。他の全てのアミノ酸分
析はDionex D−502アミノ酸アナライザーを用いてナノ
モル感度で実施したことに注目されたい。配列分析は全
て、Applied Biosysntems Model 470Aタンパク質シーク
エンサー、次いでPTH−アミノ酸のHPLCにより実施し
た。メチオニン除去方法は次の通りである。

メチオニル−ガンマ−インターフエロン：インターフエロン−ガンマ4A ARN 3010,バツチ1,0.04
Mトリス−HCl（pH7.0）中10⁷単位/ml（１−５×10⁷単位
/mg）アエロモナスアミノペプチダーゼ：（ロツト２）使用前に、0.1M−NaCl−10mMトリス−HCl,5μ・mole
ZnCl₂（pH8.0）中0.5mg/mlを70℃で２時間加熱した。次
いで0.1m NaCl,10mMトリス・HCl,5μmole ZnSO₄（pH8.
0）で1:9に希釈し、0.05mg/ml酵素とした。

手順：ガンマ−インターフエロン溶液12μおよび酵素溶液
（0.05mg/）３μを37℃で35分間インキユベート
し、混合物を氷冷した。30分後、混合物14μを凍結乾
燥し、更なる処理をせずにアミノ酸分析カラムに充填し
た。コントロール実験として、ガンマ−インターフエロ
ン12μのみおよび酵素３μのみを37℃で35分間イン
キユベートし、サンプルを上記の如く乾燥後アミノ酸分
析カラムに充填した。

放出されたメチオニン量は96ピコモルであり、他のア
ミノ酸の基底値（background）は殆んど正常であつた:A
sp−15ピコモル;Thr−24ピコモル:Ser−39ピコモル;Glu
−８ピコモル;Gly−53ピコモル;Ala−23−ピコモル;Val
−10ピコモル;Leu−８ピコモルおよびPhe−11ピコモ
ル。標準酵素もピークを示した位置に別の大きな汚染ピ
ークがみられた。ガンマ−インターフエロン標準物質で
も、SerおよびGlyの比較的大きな基底値ピークがみられ
た。サンプルの比活性が５×10⁷単位/mgでありガンマ−
インターフエロンの分子量が約17,000であると仮定する
と、放出されたメチオニン量は理論値の73％にあたる。
材料の比活性が上記仮定値よりも低いならば、Metの除
去率はより低くなるであろう。

この実験から、Ｎ−末端メチオニンがMet−ガンマ−
インターフエロンからアエロモナスアミノペプチダーゼ
により選択的かつ効率的に除去されることが示される。

実施例VIII インターフエロンからのＮ−末端Metの除去Ｎ−末端にMetを有する組換えインターフエロンアナ
ログを本発明方法に従つて処理した。Metは、分子のＮ
−末端からアエロモナスアミノペプチダーゼにより選択
的に除去された。

実施例IX ソマトメジンＣポリペプチドからのＮ−末端Metの除去Ｎ−末端にMetを有する組換えソマトメジンＣポリペ
プチドを本発明方法に従つて処理した。Metは、分子の
Ｎ−末端からアエロモナスアミノペプチダーゼにより選
択的に除去された。

実施例Ｘ Met−豚成長ホルモン（PGH）からのMet除去および成熟
組換えCu₂−Zn₂ヒトスーパーオキシドジスムターゼから
のＮ−末端Alaの非除去（0.1M−NaCl−10mMトリス−HCl,pH8.0中）アエロモ
ナスアミノペプチダーゼ（ロツト２）0.5mg/mlを使用前
に70℃で２時間加熱し、2Mトリス−HCl（pH9.5）で3:1
に希釈した。

Met−PGH（ロツト5/100）およびCu₂−Zn₂ヒトスーパ
ーオキシドジスムターゼ（SOD,ロツト１）を組換え技法
で作成した。後者は、Ｎ−末端AlaがＮ−アセチル化さ
れていない点を除き成熟タンパク質の真正な（authenti
c）Ｎ−末端配列を有する。

手順：タンパク質を10mMホウ酸ナトリウム（pH9.5）中に溶
解させた（8mg/ml）。タンパク質溶液600μに酵素溶
液34μを添加し、混合物を37℃でインキユベートし
た。サンプルを経時的に採取し、等容量の３％スルホサ
リチル酸を用いて沈殿させ、37℃で15分間インキユベー
ト後遠心した。上清溶液50μをアミノ酸分析用に採取
した。コントロール実験として、タンパク質のみを37℃
で22時間インキユベートし、上記と同様にアミノ酸分析
した。秤量したタンパク質の含量が85％およびMet−PG
H,Cu₂−Zn₂スーパーオキシドジスムターゼの分子量が
（サブユニツトあたり）夫々22,000,16,000であると仮
定すると、各分析においてＮ−末端残基の理論量は7.31
nmole,10.17nmoleである。放出されたMetおよびAla量を
表VIに示す。

（Met−hGHからMetが化学量論的に除去されるのに対
して）Met−PGHからはMetが化学量論的に除去されない
理由は幾つかある。１つの説明として、分子が非共有結
合で結合したダイマーとして存在し、ダイマー中の１方
の分子のＮ−末端メチオニンのみが酵素アタツクを受け
やすいのに対してダイマー中の他の分子のＮ−末端メチ
オニンは立体的に阻害されていることが挙げられる。こ
のため、Ｎ−末端メチオニン残基の約50％−60％のみが
除去される。これに対して、Met−hGHはモノマーであ
る。別の可能性として、Met−pGHでは分子のこの部分が
なおホルミル化されており、酵素はホルミル−メチオニ
ンを除去しないことが挙げられる。上記したあるいは他
の可能性を立証するには、更なる実験が必要であろう。

実施例XI アエロモナスアミノペプチダーゼによるアポリポプロテ
インＥからのMet,LysおよびValの除去 Met−Lys−Val−GluのＮ−末端配列を有するメチオニ
ル−アポリポプロテインＥ（ロツトCC 017）を大腸菌で
作成し、精製した。これを、5mM NH₄HCO₃中2.53mg/mlの
溶液として使用した。

アミノペプチダーゼ：実験ではアエロモナスアミノペプチダーゼ（ロツト
２）を使用した。0.1M NaCl−10mMトリス−HCl−５μmo
le ZnCl₂（pH8.0）中酵素（0.5mg/ml）を、タンパク質
との反応前に2.5時間加熱した。

手順：メチオニル−アポリポプロテインE60μおよび酵素1
2.25μを37℃インキユベートし、混合物の90μアリ
コートを経時的に採取し、15％スルホサリチル酸水溶液
10μを用いて沈殿させた。混合物を37℃で15分間イン
キユベートし、遠心した。上清50μ（酸加水分解せず
に）直接アミノ酸分析に使用した。コントロール実験と
して、酵素を用いずタンパク質のみを22時間インキユベ
ートし、上記と同様にして分析した。タンパク質から放
出されたメチオニン、リジンおよびバリンの量を表VII
に示す。

放出されたメチオニン，リジンおよびバリンの量は、
サンプルの特定の濃度に基いてタンパク質の分子量を約
35,000（即ち各3.19nmole）と仮定して予想された理論
量と一致する。第３のアミノ酸Valは他のアミノ酸に比
べてややゆつくり除去される。反応の最初の１時間以内
には、グルタミン酸の放出は認められず、このアミノ酸
のアミノペプチダーゼに対する停止特性（stopping cha
racter）が示される。22時間のインキユベート後、ドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）および２−メルカプトエタ
ノールの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行つたところタンパク質の少量が減成されていることが
認められた。このことは、基質もしくは酵素における痕
跡量のエンドペプチダーゼ活性を反映している。SDSゲ
ルから、３種のアミノ酸Met,LysおよびValを含まない新
しいApoE誘導体は親のタンパク質よりも僅かに速く移動
する（migrate）。興味深いことに、反応混合物中の酵
素は22時間のインキユベート後活性を失う。これは多
分、細胞毒性であり酵素を不活性にするであろうアポリ
ポプロテインＥに起因するのであろう。今までにテスト
した全ての基質で、反応混合物中の酵素活性は37℃で22
時間後も十分に保持されている。

実施例XII Met−bGHからのMetの除去本実施例では、bGHがbGHのフエニルアラニン形であり
Met−Phe−ProのＮ−末端配列を有するメチオニル−bGH
からのＮ−末端メチオニンの除去を示す。

Met−bGH（ロツト178）を、本実験用に大腸菌で作成し
た。

アミノペプチダーゼ： 0.1M NaCl−10mMトリス・HCl−５μmole ZnCl₂（pH8.
0）中の0.5mg/mlアエロモナスアミノペプチダーゼ（ロ
ツト２）を使用前に70℃で２時間予備加熱し、その後2M
トリスHCl（pH9.5）で3:1に希釈し、最終濃度0.375mg/m
lとした。

手順：ホルモンを10mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）中
に懸濁させ（8mg/ml）、pHを1N−NaOHで12に上げ、その
後1N−HClでpH9.4に下げ、遠心分離し僅少量の沈殿を除
去した。約7mg/mlの溶液を得た。

1000μのMet−bGH溶液と56.3μの酵素溶液を37℃
でインキユベートし、混合物の75μアリコートを経時
的に採取し、等容量の３％スルホサリチル酸溶液を用い
て沈殿させた。37℃で15分間インキユベート後沈殿を遠
心した。上清50μサンプルを（酸加水分解せずに）直
接アミノ酸分析した。コントロール実験として、ゼロ時
であるいは37℃で22時間インキユベート後ホルモンのみ
を沈殿させ、上記と同様にして分析した。実験結果を表
VIIIに示す。

実験結果から、20μg/mlの酵素で反応の殆んどが２分
以内に完結しているのでアエロモナスアミノペプチダー
ゼとMet−bGHとの反応は非常に迅速であることが示され
る。

２種のMet−hGHバツチ、Met−Asp−Gln−bGHとMet−
アポリポプロテインＥおよびMet−ガンマ−インターフ
エロンとMet−ソマトメジンの幾つかの反応における酵
素反応では90−100％の化学量論が認められたのに対し
て、上記反応の化学量論は約65％である。一方、Met−L
eu−hGHおよびMet−bGHとの反応では放出されたMet/モ
ル基質の約65％にすぎず、Met−pGHの反応では約50％−
60％にすぎない。我々が最近得た知見ではMet−Asp−Gl
n−bGHの或る種の新しいバツチでも化学量論は50−60％
の範囲である。我々は従来この部分化学量論（partial
stoichiometry）が次の理由に因るものと仮定してき
た。ａ）完全に純粋な物質でない;b）１種あるいはそれ
以上の大腸菌宿主脱ホルミル化酵素によるＮ−ホルミル
基の不完全な除去および／又は;c）幾つかのホルモンの
ダイマー形成とダイマー中の一方のモノマーに対しての
み酵素が接近しやすいこと。我々は不完全な化学量論に
対する別の可能性として宿主大腸菌プロセシング酵素系
がタンパク質の精製前に例えばMet−pGHやMet−bGH中の
Ｎ−末端メチオニンの幾つかを部分的に除去することも
あろうと考えた。

実施例XIII Met−hGHからアエロモナスアミノペプチダーゼによりMe
tを除去して得られた真正組換えhGHの生物学的活性遊離メチオニンを除去すべく限外過の使用を含めて
実施例１および２に記載の手順と本質的に同じ手順に従
つてアエロモナスアミノペプチダーゼとの反応によりMe
t−hGHから得られた真正な組換えhGHは、生物学的に活
性であり高活性を示す。従つて、Met−hGH（ロツト1/10
0）から誘導された実施例１および２（ロツト2/100）に
記載されたhGHのバツチ調製物はＮ−末端Pheを有する。
その免疫反応性は凍結（frozed）下垂体からの下垂体ホ
ルモンと同じであり、放射線受容体結合アツセイによる
その生物学的活性は2.1IU/mgである。また、Met−hGH
（ロツト4.1.1）を陰イオン交換樹脂カラムに通して脱
アミド形態のホルモンを除去し、アエロモナスアミノペ
プチダーゼを用いて処理し、反応を完結させるべく反応
中に放出される遊離メチオニンを除去させるために限外
過法を用い、次いで別の陰イオン交換樹脂カラムに通
し、凍結乾燥させた別のバツチ調製物をロツト4.2.1と
名付け、これを分析した。結果は次の通りであつた。

ａ）Ｎ−末端アミノ酸はPheであり、Ｎ−末端の最初の3
8個のアミノ酸は天然の下垂体由来の製品と同一であつ
た（少なくとも99％）。

ｂ）Ｃ−末端残基はPheであり、これも下垂体由来の製
品と同一であつた。

ｃ）免疫反応性は下垂体からの市販品より1.35倍高い。

ｄ）放射線受容体の結合アツセイによる活性は2.5単位/
mgタンパク質である。

考察上記の実験及び結果は、組換えDNA技術により調製さ
れたMet−hGH,Met−Asp−Gln−bGH,Met−ガンマインタ
ーフエロン,Met−ソマトメジンC,Met−pGH,Met−アポリ
ポプロテインＥ及びMet−bGH分子から、アエロモナスア
ミノペプチダーゼがＮ末端メチオニル残基を迅速に除去
することを明らかに示している。またこのアミノペプチ
ダーゼは、組換えDNA技術によつて調製されたMet−Leu
−hGHからＮ末端メチオニン残基及びそれに隣接するロ
イシン残基を除去することもできる。基質及びアミノペ
プチダーゼの両方からエンドペプチダーゼ活性を回避す
るように予め注意しておいたことは、ホルモンをアミノ
ペプチダーゼと22時間インキユベートした後でも酵素反
応中におけるエンドペプチダーゼ開裂は検知できたとし
ても極くわずかのものであつた（図１及び2,表Ｉ−VII
I）という点で成功したことが判明した。従つて、有意
なエンドペプチダーゼ活性なしに完全に酵素反応を生起
し得る条件を容易に利用できる。

更に、実施例VIの結果は、アエロモナスアミノペプチ
ダーゼは１個のメチオニン残基だけでなくいくつかのア
ミノ酸を真核細胞ポリペプチドアナログから迅速に除去
し得ることを示している。特に、Met−Leu−hGHからＮ
末端メチオニン及びロイシン残基を除去して本来の形
（真正）のヒト成長ホルモンを産生し得ることが示され
ている。

実施例VIの実験の最も注目すべき結果は、２分間だけ
の反応の後でも放出されたロイシンとメチオニンの量が
同じであることである。これはおそらくロイシン残基は
メチオニン残基よりも速い速度で除去されるという事実
によるものである。従つて、Metの次にLeuが続いている
Met−Leu−hGHデザインの組換えDNA生成物では、最終生
成物はLeu−hGH分子の存在が検出されないhGHとなるこ
とが保証される。

この実験は、メチオニル誘導体からだけでなくメチオ
ニル−ｘ−誘導体（ｘは他の１つのアミノ酸）からも本
来の形の分子が得られることを示している。同様に、ｎ
が２より大きい（ｘ）_ｎ−誘導体からも本来の形の分子
が得られる。

該酵素反応は特異的である。調査した２つの反応にお
いて、アミノペプチダーゼの明らかなAsp及びＸ−Pro停
止が認められ、これは小ペプチドに対する該酵素の特異
性と一致する。

測定した反応は定量的である。予備的な配列分析で
は、ヒト及びウシ成長ホルモン生成物で、アミノペプチ
ダーゼとホルモンの反応生成物のＮ末端残基の少なくと
も99％及び95％がそれぞれPhe及びAspであり、それによ
り前記の結論が部分的に確認された。この反応の定量的
側面が確認されたことは、配列法に明らかに存在するハ
ンデイキヤツプ（感度，ノイズ，副産物及び分離限界）
に対抗するものであり、実際の数字は上記のものよりも
さらに高いものであろう。

この点に関して、酵素反応Met−タンパク質Met＋タ
ンパク質は可逆的であり、原則的には過剰のメチオニン
を加えることによつて合成を生起し、アミノ酸を連続的
に除去することによつて加水分解を完全にすることがで
きるということに注意すべきである。hGHのバツチ生産
を例示している実施例の１つ（実施例Ｖ）では実際に、
反応の進行段階において数時間の限外過を使用して遊
離メチオニンを除去し、反応の完了を補助している。

反応したホルモンからのアミノペプチダーゼの除去
は、アニオン交換樹脂に対するホルモンの選択的吸着及
び脱着により達成される。ホルモンと反応した後のアミ
ノペプチダーゼのその他の除去方法としては、バツチ中
あるいはカラムにパツクされた水に不溶性の酵素誘導体
を使用するか、酵素に対して親和性（アフイニテイー）
を有する樹脂を使用して反応の終了時に酵素を吸着する
こともできる。

Met−hGH,Met−Asp−Gln−bGH,Met−Leu−hGH,Met−
ガンマインターフエロン,Met−ソマトメジンC,Met−pG
H,Met−アポリポプロテインＥ及びMet−bGHに使用した
方法は他の成長ホルモン及びポリペプチドに適用するこ
とができる。アミノペプチダーゼの入手方法を改良する
こともできる（例えば、より経済的な単離方法、酵素の
遺伝子工学的生産、アミノペプチダーゼを過剰に産生す
る微生物及び該微生物のエンドペプチダーゼを保有しな
い変異株の開発等）。その他のストレプトマイセグリセ
ウスアミノペプチダーゼのような低分子量（100,000以
下）のアミノペプチダーゼ及び耐熱性でアルカリpHにお
いて活性を有するアミノペプチダーゼも、アエロモナス
酵素を代替することができるであろう。

該アミノペプチダーゼは、成長ホルモンに対するその
作用に加えて、例えばソマトメジンインターロイキン3,
インターフエロン，アポリポプロテインＥのような、一
種以上の前記酵素の特異性に一致するＮ末端配列を有す
る酵素，ホルモン，成長因子といつた他の組換えDNA生
産物に対しても使用できる。さらに前記組換えDNA生産
物は、Ｎ末端からメチオニン残基に加えていくつかのア
ミノ酸を除去し得るように設計し得る。例えば、Met−L
ys−bGH,Met−Leu−Tyr−bGH及びMet−Phe−Asp−Gln−
bGHのような誘導体はアミノペプチダーゼの作用によ
り、それぞれhGH,bGH,bGH及びAsp−Gln−bGHを産生す
る。また、インキユベート混合物中のアミノ酸を過剰な
ものとし、該酵素を使用してアミノ酸を付加して合成反
応を生起することも可能であろう。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】真核生物のポリペプチドアナログをAeromo
nasアミノペプチダーゼに接触させることからなってお
り、前記ポリペプチドアナログがこのポリペプチドアナ
ログのＮ−末端メチオニンと隣接した又はアミノ酸残基
一つ以上離れた位置にアミノペプチダーゼの作用を停止
させるアミノ酸残基又は残基の配列を含有している、外
来宿主中で合成された真核生物ポリペプチドのアナログ
からＮ−末端のアミノ酸残基を順次除去する方法。
【請求項２】外来宿主が細菌である請求の範囲１の方
法。
【請求項３】アミノペプチダーゼがほぼ65℃までの温度
で安定である請求の範囲１の方法。
【請求項４】アミノペプチダーゼが約7.0のpHで安定か
つ活性である請求の範囲１の方法。
【請求項５】アミノペプチダーゼが約8.0〜約10.0のpH
で安定かつ活性である請求の範囲１の方法。
【請求項６】アミノペプチダーゼが約100,000未満の分
子量を有する請求の範囲１の方法。
【請求項７】アミノペプチダーゼが細菌由来である請求
の範囲６の方法。
【請求項８】アミノペプチダーゼが細菌外のものである
請求の範囲７の方法。
【請求項９】アミノペプチダーゼが水に不溶である請求
の範囲１の方法。
【請求項１０】アミノペプチダーゼが固体の支持体に結
合している請求の範囲１の方法。
【請求項１１】余分なアミノペプチダーゼを除去するた
めにアフィニティー樹脂を添加することを含む請求の範
囲１の方法。
【請求項１２】真核生物のポリペプチドアナログがホル
モンのアナログである請求の範囲１の方法。
【請求項１３】真核生物のポリペプチドがリンホカイン
のアナログである請求の範囲１の方法。
【請求項１４】真核生物のポリペプチドアナログが成長
因子のアナログである請求の範囲１の方法。
【請求項１５】真核生物のポリペプチドアナログがイン
ターフェロンのアナログである請求の範囲１の方法。
【請求項１６】真核生物のポリペプチドアナログがソマ
トメジンのアナログである請求の範囲１の方法。
【請求項１７】真核生物のポリペプチドアナログがアポ
リポタンパク質Ｅのアナログである請求の範囲１の方
法。
【請求項１８】ホルモンが成長ホルモンである請求の範
囲12の方法。
【請求項１９】成長ホルモンがヒト成長ホルモンである
請求の範囲18の方法。
【請求項２０】成長ホルモンがウシ成長ホルモンである
請求の範囲18の方法。
【請求項２１】成長ホルモンがブタ成長ホルモンである
請求の範囲18の方法。
【請求項２２】Ｎ−末端アミノ酸残基がメチオニンであ
る請求の範囲１の方法。
【請求項２３】アミノペプチダーゼの作用を停止させる
アミノ酸残基がアスパラギン酸である請求の範囲７の方
法。
【請求項２４】アミノペプチダーゼの作用を停止させる
アミノ酸残基がグルタミン酸である請求の範囲７の方
法。
【請求項２５】アミノペプチダーゼの作用を停止させる
アミノ酸残基配列がプロリン残基のＮ−末端に結合した
プロリン以外のアミノ酸残基を含む請求の範囲７の方
法。
【請求項２６】アミノ酸残基がフェニルアラニンである
請求の範囲18の方法。
【請求項２７】真核生物のポリペプチドアナログがその
Ｎ−末端に配列Met−Phe−Pro−を有している請求の範
囲１の方法。
【請求項２８】成長ホルモンアナログがそのＮ−末端と
してアミノ酸メチオニンを有している請求の範囲18の方
法。
【請求項２９】ウシ成長ホルモンアナログがそのＮ−末
端に配列Met−Asp−Gln−を有している請求の範囲20の
方法。
【請求項３０】ウシ成長ホルモンアナログがそのＮ−末
端としてアミノ酸メチオニンを有している請求の範囲20
の方法。
【請求項３１】動物成長ホルモンをコードしている遺伝
子の発現によって細菌中で産生されたこのホルモンのア
ナログからＮ−末端のメチオニン残基を除去するため
に、成長ホルモンアナログをAeromonasアミノペプチダ
ーゼに接触させることからなる請求の範囲１の方法。
【請求項３２】ヒト成長ホルモンをコードしている遺伝
子の発現によって細菌中で産生されたこのホルモンのア
ナログからＮ−末端のメチオニン残基を除去するための
方法であって、このヒト成長ホルモンアナログが真正ヒ
ト成長ホルモンのＮ−末端に付加されたメチオニン残基
を有しており、アナログをAeromonasアミノペプチダー
ゼに接触させることからなる請求の範囲１の方法。
【請求項３３】ウシ成長ホルモンアナログをコードして
いる遺伝子の発現によって細菌中で産生されたウシ成長
ホルモンアナログからＮ−末端のメチオニン残基を除去
するための方法であって、このウシ成長ホルモンアナロ
グがそのＮ−末端に付加されたメチオニン残基を有して
おり、アナログをAeromonasアミノペプチダーゼに接触
させることからなる請求の範囲１の方法。