KR100371824B1 - 정확하게연결된시스틴브릿지를갖는인슐린의수득방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 pH 10 내지 11에서 머캅탄 및 무질서화 보조제의 존재하에, 상응하는 프로인슐린 아미노산 쇄로부터 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린을 수득하는 방법 및 효소의 보조하에 프로인슐린의 인슐린으로의 직접적인 전환 및 소수성 흡착제 수지를 사용하여 반응 혼합물로부터의 인슐린의 직접적인 분리에 관한 것이다.

Description

정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린의 수득방법
사람 인슐린은 전부 51개의 아미노산 잔기를 함유하는 2개의 아미노산 쇄를 갖는 단백질이다. 2개의 아미노산 쇄내에는 I6개의 시스테인 잔기가 존재하며 각각 2개의 시스테인 잔기는 서로 디설파이드 결합을 통해 연결되어 있다. 생물학적으로 활성인 사람 인슐린에 있어, A 및 B쇄는 서로 2개의 시스틴 브릿지를 통해 연결되어 있고 추가의 시스틴 브릿지가 A쇄내에 발생한다. 통계적으로 볼때, 사람 인슐린 분자 내에서는 15가지의 디설파이드 브릿지 형성 가능성이 있다. 이 15가지 가능성중 단지 하나만이 생물학적으로 활성인 사람 인슐린내에서 일어난다. 다음의 시스테인 잔기가 사람 인슐린 내에서 서로 연결되어 있다:
A6-A11
A7-B7
A20-B19
문자 A와 B는 특정한 인슐린 아미노산 쇄를 나타내고, 숫자는 아미노산 잔기의 위치를 나타내며, 이 숫자는 특정 아미노산 쇄의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 카운트된다. 디설파이드 브릿지는 또한 2개의 사람 인슐린 분자 사이에서형성될 수 있으므로, 수없이 많은 상이한 디설파이드 브릿지가 용이하게 형성될 수 있다.
사람 인슐린을 제조하는 공지된 방법은 사람 프로인슐린(proinsulin)을 이용하는 것이다. 사람 프로인슐린은 86개 아미노산 잔기의 선형 아미노산 쇄를 갖는 단백질이면, 이러한 사람 인슐린의 B 및 A쇄는 서로 35개 아미노산 잔기를 갖는 C펩타이드를 통해 연결되어 있다. 사람 인슐린내에서 발생하는 디설파이드 브릿지의 형성은 매개체를 통해 일어나며, 사람 인슐린의 시스테인 잔기는 황보호 그룹 즉, S-설포네이트(-S-SO3 -) 그룹으로 제공된다(참조: EP 0 037 255). 정확하게 연결된 시스테인 브릿지를 갖는 프로인슐린을 수득하는 방법은 또한 공지되어 있으며[참조: Biochemistry, 60 (1968), pp 622-629], 이 방법에서는 돼지 췌장으로부터 수득한 프로인슐린으로부터 출발하는데, 여기에서 시스테인 잔기는 티올 잔기(-SH)로서 주어진다. "정확하게 연결된 시스틴 브릿지"란 용어는 포유동물로부터의 생물학적으로 활성인 인슐린에 존재하는 디설파이드 브릿지를 의미한다.
유전 공학적 방법은, 사람 프로인슐린 또는 사람 인슐린과는 아미노산 서열및/또는 아미노산 쇄 길이가 상이한 프로인슐린이 미생물에서 생성될 수 있도록 해준다. 유전 공학으로 변형시킨 에스케리키아 콜라이로부터 생성된 프로인슐린은 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 전혀 갖고 있지 않다. 이. 콜라이를 사용하여 사람 인슐린을 수득하는 방법(참조: EP 0 055 945)은 다음의 방법 단계에 근거하고 있다: 미생물의 발효 - 세포 파괴 - 융합 단백질의 분리 - 융합 단백질의 시아노겐브로마이드 분해 - 프로인슐린 서열을 함유하는 분해 생성물의 분리 - S-설포네이트 그룹에 의한 프로인슐린의 시스테인 잔기 보호 - 정확하게 연결된 시스틴 브릿지의 형성 - 설파이트분해(sulfitolysis) - 프로인슐린의 탈염 - 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 함유하는 프로인슐린의 크로마토그래프적 정제 - 프로인슐린 용액의 농축 - 농축된 프로인슐린 용액의 크로마토그래피적 정제 - 사람 인슐린을 수득하기 위한 프로인슐린의 효소적 분해 - 생성된 사람 인슐린의 크로마토그래피적 정제.
이 방법의 단점은 인슐린의 수율을 저하시키게 되는, 처리 단계의 수와 정제 단계중에서의 손실이다. 다단계 공정 경로 때문에 심각한 손실이 예상될 수 밖에 없다. 분리된 융합 단백질의 단계로부터 시아노겐 브로마이드 분해, 설파이트분해 및 프로인슐린의 정제를 통해 40% 이하의 프로인슐린이 손실되는 것으로 예측된다(참조: EP 0 055 945). 유사하게, 고도의 손실이 최종 생성물에 대한 추후의 정제 단계 과정에서도 발생할 수 있다.
유전 공학에 의한 사람 인슐린 또는 인슐린 유도체의 제조에서의 수율 증가는, 필요한 처리 단계의 수를 실질적으로 감소시킬 수 있다면 가능하다.
본 발명의 목적은, 보다 적은 처리 단계가 필요하고, 무엇보다도 정제 손실이 낮은, 인슐린 아미노산 쇄중에 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린을 수득하는 방법을 개발하는 것이다.
본 발명에 의해 일반식(I)의 인슐린을 수득하기 위한 방법이 개발되었으며, 이는
A) 일반식(II)의 단백질을, 하나 이상의 카오트로픽 보조제(chaotropic auxiliary)의 존재하에, pH가 10 내지 11이고 1ℓ 당 일반식(II) 단백질의 농도가 0.05 내지 0.3g인 수성 매질 속에서, 일반식(II)의 단백질의 시스테인 잔기당 2 내지 10개의 -SH 라디칼을 생성시키는 양의 머캅탄과 반응시키는 단계;
B) 단계 A)에서 생성된, 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 프로인슐린을 트립신, 트립신형 효소(trypsin-like enzyme) 및 임의로 부가적으로 카복시펩티다제 B 또는 언급된 효소의 혼합물과 반응시켜 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 일반식(I)의 인슐린을 수득하는 단계;
C) 단계 B)에서 수득된 반응 생성물을 pH 4 내지 7에서 수성 매질 ℓ 당 3 내지 50g의 소수성 흡착제 수지로 처리하는 단계;
D) 단계 C)의 흡착된 일반식(I)의 인슐린을 함유하는 흡착제 수지를 분리시키는 단계 및
E) 단계 D)에서 분리한 흡착제 수지로부터 일반식(I)의 인슐린을탈착(desorbing)시키는 단계들을 포함한다.
상기 일반식(I) 및 (II)에서,
X는 a) Lys 및 Arg로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기 또는 b) 펩타이드의 N-말단 및 카복실 말단에 아미노산 잔기 Arg 또는 Lys를 함유하는, 2개 내지 35개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이고,
Y는 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기이며,
Z는 a) Arg 및 Lys로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기, b) 펩타이드의 카복실 말단에 아미노산 잔기 Arg 또는 Lys를 함유하는, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 또는 c) OH이고,
Rl은 페닐알라닌 잔기 또는 공유 결합이며,
R2는 a) 수소 원자, b) Lys 및 Arg로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기 또는 c) 펩타이드의 카복실 말단에 아미노산 잔기 Lys 또는 Arg를 함유하는, 2개 내지 45개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이고,
R3는 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기이며,
잔기 A2-A20은 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 A쇄의 아미노산 서열에 상응하며,
잔기 B2-B29는 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 B쇄의 아미노산 서열에 상응한다.
바람직하게는,
X가 아미노산 잔기 Arg이거나 사람 인슐린의 C쇄의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드이고,
Y가 Ala, Thr 및 Ser로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며,
R1이 아미노산 잔기 Phe이고,
R2가 a) 수소 원자 또는 b) 펩타이드의 카복실 말단에 Arg를 함유하는, 2 내지 25개 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이며,
R3이 Asn, Ser 및 Gly로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며,
잔기 A2-A20 및 B2-B29가 사람 인슐린의 B와 A쇄의 아미노산 서열에 상응하는, 일반식(II)의 단백질을 사용하여,
Y, R1, R2, R3, A2-A20 및 B2-B29가 상기 정의한 의미를 가지며,
Z가 아미노산 잔기 Arg, 펩타이드 잔기 Arg-Arg 또는 OH인, 정확하게 연결된시스틴 브릿지를 갖는 일반식(I)의 인슐린을 수득한다.
특히 바람직하게는,
X가 아미노산 잔기 Arg 또는 2개 내지 35개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드인데, 이때 2개의 염기성 아미노산 잔기, 특히 Arg 및/또는 Lys이 펩타이드의 출발부 및 말단에 존재하며,
Y가 아미노산 잔기 Thr이며,
R1이 아미노산 잔기 Phe이고,
R2가 a) 수소 원자 또는 b) 카복실 말단에 아미노산 잔기 Arg이 존재하는, 2 내지 15개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이며,
R3가 아미노산 잔기 Gly또는 Asn이고,
잔기 A2-A20과 B2-B29가 사람 인슐린의 A와 B쇄의 아미노산 서열에 상응하는 일반식(II)의 단백질을 사용하여,
Y, R1, R2, R3, A2-A20 및 B2-B29가 상기 언급한 정의와 같고,
Z가 아미노산 잔기 Arg, 펩타이드 잔기 Arg-Arg 또는 Lys-Lys, 또는 OH인, 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 일반식(I)의 인슐린을 형성한다.
놀랍게도, 일반식(II)의 단백질은 통상적으로 "리폴딩(refolding)"에 선행되는 반응 단계에서 완전하게 환원시킬 필요가 없으며[참조: R Jaenicke, R. Rudolph, 1989, Folding Proteins, in Protein Structure, a practical Approach;Ed. Creighton, T.E., pp. 191-224, JRL Press Oxford; EP 0 219 874], 외부 단백질의 높은 비율(50-90%)에도 불구하고, 기술된 방법에서는, 폴딩 수율이 -SH 보호 그룹을 함유하는 적절하게 정제된 프로인슐린의 폴딩과 견줄만한 수준으로 성취된다는 것이 밝혀졌다.
또한, 놀랍게도, 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 일반식(I)의 인슐린을 수득하기 위한 정확하게 폴딩된 프로인슐린의 효소 반응은 또한 50 내지 90%의 외부 단백질 및 소수성 흡착제 수지에 대해 우수한 선택성으로 결합하는 인슐린의 존재하에 고수율로 가능하다는 것이 밝혀졌다.
선행의 공지된 방법과 비교하여, 본 발명에 따른 방법은 고수율로 실질적으로 보다 신속한 제조를 가능케 한다. 이에 대한 이유는 설파이트분해와 임의로 시아노겐 브로마이드 분해 처리 단계의 제거 및 제한된 양의 카오트로픽 염의 존재하에 프로인슐린을 이의 변형된 상태에서 정확하게 결합된 시스턴 브릿지를 갖는 프로인슐린으로 고수율로 직접 전환시킨 후 이를 추가의 정제없이 일반식(I)의 인슐린으로 효소적으로 전환시키는, 기존에 공지되어 있지 않았던 가능성에 있다. 즉, 생성된 일반식(I)의 인슐린은 흡착에 의해 폴딩 용액으로부터 분리시키는 것이 가능하다. 따라서, 일반식(I)의 인슐린은 매개체 분리 또는 탈착 후 정제과정 없이 흡착제로부터 수득할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 제조방법을 실질적으로 단축시키는데, 이는 보다 짧은 정치시간 및 손실의 배제로 인해 공지된 방법에 배해 25 내지 100%의 수율 증가를 가능케한다.
펩타이드와 단백질의 아미노산 서열은 아미노산 쇄의 N-말단으로부터 명시한다. 일반식(I)중의 괄호안에 나타낸 정보, 예를 들어 A6, A20, B1, B7 또는 B19는 인슐린의 A 또는 B쇄에서의 아미노산 잔기 위치에 상응한다.
아미노산 Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro 및 셀레노시스테인은 "유전적으로 암호화가능한 아미노산 라디칼"을 나타낸다.
동물 인슐린에서의 용어 "잔기 A2-A20" 및 "잔기 B2-B29"는, 예를 들면, 소, 돼지 또는 닭으로부터의 인슐린의 아미노산 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 인슐린 유도체의 라디칼 A2-A20 및 B2-B29라는 용어는, 다른 유전적으로 암호화가능한 아미노산에 의한 아미노산 치환으로 형성된 사람 인슬린의 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다.
잔기 Z는 항상 아미노산 서열 X의 일부를 나타내며 트립신, 트립신형 효소 또는 카복시펩티다제 B와 같은 프로테아제의 활성에 의해 형성된다. 잔기 R3은 인슐린의 A쇄의 A21 위치에 있는 아미노산 잔기이다. 이 잔기 Y는 인슐린의 B쇄의 B30 위치에 있는 아미노산 잔기이다.
트립신 또는 트립신형 효소는 아르기닌 또는 라이신 잔기에서 아미노산 쇄를 분해시키는 프로테아제이다.
카복시펩티다제 B는, 아미노산 쇄의 카복시 말단에 있는 Arg 또는 Lys와 같은 염기성 아미노산 잔기를 절단해내는 엑소프로테아제(exoprotease)이다[참조: Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246, pp. 6786-6791].
사람 인슐린의 A쇄는 다음의 서열(서열 확인 번호 1)을 갖는다: Gly, Ile, Val, Glu, Gln, Cys, Cys, Thr, Ser, Ile, Cys, Ser, Leu, Tyr, Gln, Leu, Glu, Asn, Tyr, Cys, Asn.
사람 인슐린의 B쇄는 다음의 서열(서열 확인 번호 2)을 갖는다: Phe, Val, Asn, Gln, His, Leu, Cys, Gly, Ser, His, Leu, Val, Glu, Ala, Leu, Tyr, Leu, Val, Cys, Gly, Glu, Arg, Gly, Phe, Phe, Tyr, Thr, Pro, Lys, Thr.
사람 인슐린의 C쇄는 다음의 서열(서열 확인 번호 3)을 갖는다: Arg, Arg, Glu, Ala, Glu, Asp, Leu, Gln, Val, Gly, Gln, Val, Glu, Leu, Gly, Gly, Gly, Pro, Gly, Ala, Gly, Ser, Leu, Gln, Pro, Leu, Ala, Leu, Glu, Gly, Ser, Leu, Gln, Lys, Arg.
카오트로픽 보조제는, 수성 용액 중에서, 수소 결합을 끊어버리는 화합물, 예를 들어, 암모늄 설페이트, 구아니딘 하이드로클로라이드, 에틸렌 카보네이트, 티오시아네이트, 디메틸 설폭사이드 및 우레아이다.
소수성 흡착제 수지란 용어는 비이온성, 소수성, 가교결합된 중합체 및/또는 공중합체, 예를 들어 폴리아크릴레이트 또는 폴리스티렌 또는 스티렌과 디비닐벤젠의 공중합체, 특히 큰 표면적과 많은 커다란 공극을 지닌 중합체성 흡착제 수지, 즉, Rohm and Haas 또는 Mitsubishi Chemical lndustries Ltd. 같은 회사의 시판제품, 예를 들어, XAD16, XAD1600 또는 HP20을 나타낸다.
용어 머캅탄이란 하나 이상의 -SH 그룹을 함유하는 화합물을 나타낸다. 수용성 머캅탄이 바람직하다. 이들 화합물의 예로는 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 2-머캅토에탄올, 시스테인, 글루타티온, 메틸 티오글리콜레이트, 3-머캅토-1,2-프로판디올 및 3-머캅토프로피온산이 있다.
일반식(II)의 단백질은 다수의 유전 공학 작제물의 보조하에 미생물에서 형성시킬 수 있다[참조: EP 0 489 780, EP 0 347 781, EP 0 453 969]. 이러한 유전공학 작제물은 에스케리키아 콜라이 또는 스트렙토마이세테스(Streptomycetes)와 같은 미생물내에서 발효 동안에 발현된다. 형성된 단백질은 미생물의 내부에 저장되거나(참조: EP 0 489 780) 또는 발효액내로 배출된다.
본 발명에 따른 방법을 위해 일반식(II)의 단백질이 사용될 수 있는데, 이는 발효액 및 미생물로부터 기원한 다수의 단백질에 의해 세포 파괴 후에 직접적으로 오염되어 있다. 그러나, 일반식(II)의 단백질은 또한, 예를 들면, 침전 또는 크로마토그래피적 정제 후에 예비 정제된 형태로 사용될 수도 있다.
처리 단계 A)에서의 방법은 다음과 같다: 단백질을 카오트로픽 보조제 또는 각종의 카오트로픽 보조제의 혼합물 중에 용해시킨다. 바람직하게는, 용매로서 물을 기준으로 하여 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드가 6 내지 9M, 바람직하게는 8M 농도로 사용된다. 반응 혼합물의 PH는 8.5 내지 10.8이다. 사용될 수 있는 완충액의 예는 포스페이트, 트리(하이드록시메틸)아미노메탄 (트리스), 보레이트 또는 글리신 완충액이다. 수성 매질중에서 완충 물질의 농도는 0.5M 이하, 바람직하게는 0.005M 내지 0.5M, 특히 바람직하게는 0.05 내지 0.1M이다. 그후 단백질 혼합물을 머캅탄 수용액과 혼합시킨다. 이 같은 방법으로, 반응 용액중(물 기준)에 다음의 농도가 확립된다:
일반식(II)의 단백질 농도는 0.05 내지 0.6g/ℓ , 바람직하게는 0.1 내지 0.3g/ℓ 이다. 머캅탄의 양은 일반식(II)의 단백질의 시스테인 잔기당 머캅탄의 -SH 잔기 2 내지 10개, 바람직하게는 6 내지 9개이다. 용액의 pH는 10 내지 11, 바람직하게는 10.8이다, 상기 언급한 완충 성분이 사용된다. 정확한 pH는 수산화나트륨용액을 첨가하여 달성한다. 완충 성분의 농도는 0.005 내지 0.5M, 바람직하게는 0.05 내지 0.1M이다.
머캅탄을 함유하는 반응 혼합물중 카오트르픽 보조제의 농도는 1M 미만, 바람직하게는 0.1 내지 0.8M, 특히 0.3 내지 0.6M이다, 사용된 머캅탄은 바람직하게는 단독 또는 혼합물로서의 시스테인 또는 2-머캅토에탄올이다.
처리 단계 A)의 폴딩 동안의 온도는 0℃ 내지 50℃, 바람직하게는 2℃ 내지 30℃, 특히 4℃ 내지 10℃이다. 반응 시간은 3 내지 12시간, 바람직하게는 4 내지 8시간, 특히 5시간이다.
처리 단계 A)의 생성물은 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 프로인슐린이다.
처리 단계 B)에서, 처리 단계 A)로부터의 반응 용액을 pH 6.5 내지 9, 바람직하게는 8 내지 9로 조정한다. 트립신 또는 트립신형 효소를 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 프로인슐린 3g을 기준으로 하여 1 내지 3㎎의 양으로 가한다. 임의로, 카복시펩티다제 B를 1g의 일반식(I)의 인슐린을 기준으로 3 내지 8단위의 양으로 가한다. 트립신 및 카복시펩티다제 B의 혼합물을 또한 가할 수 있다. 그후 수득된 용액을 4℃ 내지 15℃의 온도에서 4 내지 16시간 동안 교반한다. 처리단계B)의 생성물은 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 함유하는 일반식(I)의 인슐린이다.
처리 단계 C)에서, 처리 단계 B)로부터의 반응 용액을 염산 또는 황산과 같은 산을 사용하여 pH 2.5 내지 4.5로 조정한다. 용액의 혼탁이 발생한다면, 이는 임의로 여과 또는 원심분리에 의해 제거한다. 잔류 용액을 소수성 흡착제 수지로 처리한다. XAD 또는 HP20 타입의 수지가 적합한 것으로 입증되었다. 수지의 양은 반응 용액 ℓ 당 3 내지 50g, 바람직하게는 20 내지 40g/ℓ 이다.
수득한 현탁액은 0.1M 이하의 농도의 NaCl과 같은 염으로 처리한 후 3 내지 4시간 동안 교반시킬 수 있다. 수지 상에의 일반식(I)의 인슐린의 흡착은 샘플링 및 고압 액체 크로마토그래피 분석(HPLC 분석)으로 체크한다. 용액내에 더 이상의 인슐린이 검출되지 않게 되면, 흡착제 수지를 반응 수용액으로부터 분리제거한다(처리 단계 D). 이는, 예를 들면, 공지된 방법으로 여과 또는 원심분리하여 수행한다. 일반식(I)의 흡착된 인슐린을 함유하는 수지를 순수한 수용액 또는 완충액-함유 수용액으로 세척한다. 특히, 세척액중의 전도율이 0.4mS/㎝ 미만일 때까지 세척한다.
일반식(I)의 인슐린의 탈착(처리 단계 E)은 공지된 방법에 따라 수행하며, 이 방법은 사용되는 소수성 흡착제 수지에 따라 결정된다. 탈착은 XAD 또는 HP20 흡착제 수지의 경우, 예를 들어, 20 내지 65%의 수-혼화성, 비이온성 유기 용매, 예를 들어 (C1-C6)-알칸올을 함유하는 수용액으로 수행한다. 바람직하게는, 용매수중에 35%의 이소프로판올 또는 n-프로판올이 사용된다. 일반식(I)의 인슐린의 탈착은, 예를 들어, 이소프로판올 용액으르 세척하여 수행한다. 이 세척은 또한 이소프로판올 용액과 혼합하거나 또는 컬럼내에서 크로마토그래피시켜 교반압 여과(stirred pressure filter)로 수행할 수 있다. 수지 대 이소프로판을 용액의 용적비는 1.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:1.1 내지 1:2이다. 세척 단계는 1 내지 5회, 바람직하게는 2회 반복할 수 있다. 혼합된 이소프로판올 분획은 직접 사용하거나 또는 추가의 크로마토그래피적 정제를 위해 물로 희석시킨 후 사용할 수 있다.
다음의 실시예에서 본 발명에 따른 방법이 상세히 기술될 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 백분율 데이터는 중량과 관계된다.
실시예 1
다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 유전적으로 변형시킨 에스케리키아 콜라이 세포의 발효에 의해 제조한다(참조: EP 0 489 780).
프로인슐린 서열 1 (서열 확인 번호 4):
프로인슐린 서열 1은 일반식(II)에 상응하며, 이때
X는 사람 인슐린으로부터의 C 펩타이드이고,
Y는 Thr (B30)이며,
R1은 Phe (B1)이고,
R2는 11개 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이며,
R3는 Gly (A21)이고,
A2-A20은 사람 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내의 20)이고, B2-B29는 사람 인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.
프로인슐린 서열 1을 갖는 발현된 융합 단백질은 이. 콜라이 세포내에 모여져서 봉입체(inclusion body)를 형성한다. 발효 완료 후, 세포를 원심분리시켜 제거하고 통상적인 고압 균질화로 파괴한다. 방출된 융합 단백질 봉입체를 원심분리하여 분리한다.
프로인슐린 서열 1을 갖는 2600g의 분리된 융합 단백질 봉입체(동결건조시킨 후 건중량에 기준하여)를 pH 10.8에서 200ℓ 의 8M 구아니딘 하이드로클로라이드 용액에 용해시킨다. 임의로, 소량의 현탁시킨 물질을 원심분리한 후, pH 10.8 및 4℃의 온도에서 선명한 용액을 1800ℓ 의 시스테인 수용액(250g의 시스테인 하이드로클로라이드 수화물)에 유입하여 교반시킨다. 인슐린-함유 융합 단백질의 비율을 SDS 전기영동 스갠(SDS electrophoresis scan)[참조: U.K., Nature, Volume 227, pp. 680-685, 1970]으로 측정한다. 결과는 45%였다. 폴딩 반응 종료 후, 반응 혼합물 중에서 정확하게 연결된 시스테인 브릿지를 갖는 프로인슐린 서열 1의 함량은 분석용 HPLC로 측정시 760g인 것으로 측정되었다.
6N HCl을 사용하여 2000ℓ 의 용액을 pH 8.5로 조정한다. 그후 500㎎의 트립신을 가한다. HPLC 측정에 따르면 305g의 인슐린 2가 형성된다. 인슐린 2는 일반식(I)에 상응하며, 이 경우
Y는 Thr (B30)이고,
Z는 Arg-Arg이며,
R1은 Phe (B1)이고,
R3는 Gly (A21)이며,
A2-A20은 사람 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이며, B2-B29)는 사람 인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.
인슐린 2는 서열 확인 번호 6 및 9로 이루어져 있으며, 이는 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 통해 서로 연결되어 있다.
6N HCl을 사용하여 용액의 pH를 3.5로 조정하고, NaCl 포화 용액을 사용하여 전도율 값을 약 10mS/㎝으로 조정한다. 원심분리시켜 약한 혼탁물을 제거한다. 75kg의 HP20(독일연방공화국 뒤쎌도르프의 미쓰비시 케미칼 인더스트리즈 리미티드 제조원)를 선명한 용액에 가한다. 이 현탁액을 4℃에서 16시간 동안 상등액에서 인슐린 2가 더 이상 검출되지 않을 때까지 서서히 교반한다. 흡인 필터를 통해 여과시켜 수지를 제거하고 세척액의 전도율이 0.4mS/㎝ 미만이 될 때까지 물로 세척한다. 생성물을 50% 농도의 이소프로판올 수용액 75ℓ 중의 수지 현탁액으로 탈착시킨다. 여과 및 이소프로판올 용액과의 배양을 2회 반복한다. 60분 후, 수지를 여과한 다음, 35% 농도의 이소프로판올 용액중에서 수회 배양하고 여과한다. 인슐린 2의 수율은 288g이다.
인슐린 2를 함유하는 용출물은 물로 희석시키고 pH를 조정한 후 크로마토그래피 컬럼상에서 즉시 추가로 정제할 수 있다.
HPLC 분석
0.5g의 단백질을 40㎖의 6M 구아니딘 하이드로클로라이드, 50mM 트리스 pH 8.5, 5mM 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 1% 2-메캅토에탄올 및 10mM 디티오트레이톨 용액중에 95℃에서 2분간 용해시킨 후, 14000g에서 20분간 원심분리시킨다. 0.02ml의 투명한 상등액을 고압 액체 크로마토그래피 컬럼에 적용시킨다.
컬럼: 뉴클레오겔(?Nucleogel) RP 300-5/46 (독일연방공화국 아헨 마헤레이 & 나겔)
구배: 완충액 A: 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)
완충액 B: 아세토니트릴중의 0.09% TFA
온도: 55℃
총 전개 시간: 40분
구배는 상응하는 전개 시간 후의 다음의 완충액 B의 양을 특징으로 한다:
10분 25%, 12분 60%, 13분 90%, 15분 100%,
유속: 1ml/분
검출: 215nm
인슐린 보유 시간: 약 19분
실시예 2
다음 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 유전적으로 변형시킨 이. 콜라이를 발효시켜 제조한다(참조: EP 0 347 781):
융합 단백질 3(서열 확인 번호 5)
이 융합 단백질은 프로인슐린 3의 아미노산 서열을 함유한다. 발현된 융합 단백질 3은 이. 콜라이 세포내에 모여져서 봉입체를 형성한다. 세포의 파괴는 실시예 1에서와 같이 수행한다. 이렇게 수득된 융합 단백질 3을 시아노겐 브로마이드 분해시켜, 프로인슐린 3을 형성시킨다(서열 확인 번호 8).
프로인슐린 3은 일반식(II)에 상응하면, 여기에서
X는 Arg이고,
Y는 Thr (B30)이며,
R1은 Phe (B1)이고,
R2는 4개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이며,
R3는 Asn (A21)이고,
A2-A20 및 B2-B29는 사람 인슐린의 A 및 B쇄의 아미노산 서열에 상응한다.
시아노겐 브로마이드 분해 후, 프로인슐린 3의 함량을 9.2%의 인슐린-함유 단백질을 함유하는 동결건조시킨 샘플 중에서 SDS 전기영동에 의해 정량적으로 측정한다.
2000g의 프로인슐린 3을 실시예 1에서와 같이 시스테인 하이드로클로라이드 수화물과 함께 배양한다. 그후 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 1260g의 프로인슐린 3의 함량을 분석용 HPLC에 의해 전체 반응 혼합물 중에서 측정한다. 실시예 1에서와 같이 생성물을 500㎎의 트립신으로 처리한다.
인슐린 4가 형성된다. 인슐린 4는 일반식(I)에 상응하며, 이때,
Y는 Thr (B30)이며,
Z는 Arg이며,
R1은 Phe (B1)이고,
R3는 Asn (A21)이며,
A2-A20 및 B2-B29는 사람 인슐린의 A 및 B쇄의 아미노산 서열에 상응한다.
인슐린 4는 서열 확인 번호 1 및 7로 이루어져 있으며, 이는 정확하게 결합된 시스틴 브릿지로 서로 연결되어 있다.
생성된 용액(2m3)은 800g의 인슐린 유도체를 함유하며, 실시예 1과 같이 75kg의 HP20으로 처리한다. 흡착 및 탈착 후, 혼합된 용출물은 703g의 인슐린 4를 함유한다(88%의 수율).
서열 리스트
(1) 일반 정보:
(i) 출원인
(A) 명칭: 훽스트 아크티엔게젤샤프트
(B) 가: -
(C) 시: 프랑크푸르트 암 마인
(D) 국가: 독일연방공화국
(E) 우편번호: 65926
(F) 전화: 069-305-6047
(G) 팩시밀리: 069-35-7175
(H) 텔렉스: 041234-700 hod
(ii) 발명의 명칭: 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린의 수득방법
(iii) 서열 수: 9
(iV) 컴퓨터 판독형
(A) 매체 타입: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운용 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리즈 #1.0, 버젼 #1.25(EPA)
(2) 서열 확인 번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 21개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄형 : 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(Vi) 공급원:
(A) 생물체: 에스케리키아 콜라이
(iX) 특성
(A) 성명/키: 단백질
(B)위치: 1..21
(Xi) 서열기술: 서열 확인 번호 1:
(2) 서열 확인 번호 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 30개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(Vi) 공급원:
(A) 생물체: 에스케리키아 콜라이
(iX) 특성
(A) 성명/키: 단백질
(B) 위치: 1..30
(Xi) 서열기술: 서열 확인 번호 2:
(2) 서열 확인 번호 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 35개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(Vi) 공급원:
(A) 생물체: 에스케리키아 콜라이
(iX) 특성
(A) 성명/키: 단백질
(B) 위치: 1..35
(Xi) 서열기술: 서열 확인 번호 3:
(2) 서열 확인 번호 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 97개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(Vi) 공급원:
(A) 생물체: 에스케리키아 콜라이
(iX) 특성
(A) 성명/키: 단백질
(B) 위치: 1..97
(Xi) 서열 기술: 서열 확인 번호 4:
(2) 서열 확인 번호 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 96개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(Vi) 공급원:
(A) 생물체: 에스케리키아 콜라이
(iX) 특성
(A) 성명/키: 단백질
(B) 위치: 1..96
(Xi) 서열 기술: 서열 확인 번호 5:
(2) 서열 확인 번호 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 32개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(Vi) 공급원 :
(A) 생물체: 에스케리키아 콜라이
(iX) 특성
(A) 성명/키: 단백질
(B) 위치: 1..32
(Xi) 서열 기술: 서열 확인 번호 6:
(2) 서열 확인 번호 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 31개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(Vi) 공급원:
(A) 생물체: 에스케리키아 콜라이
(iX) 특성
(A) 성명/키: 단백질
(B) 위치: 1..31
(Xi) 서열기술: 서열 확인 번호 7:
(2) 서열 확인 번호 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 56개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(Vi) 공급원 :
(A) 생물체: 에스케리키아 콜라이
(iX) 특성
(A) 성명/키: 단백질
(B) 위치: ]..56
(Xi) 서열 기술: 서열 확인 번호 8:
(2) 서열 확인 번호 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 21개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 타입: 단백질
(Vi) 공급원:
(A) 생물체: 에스케리키아 콜라이
(iX) 특성
(A) 성명/키: 단백질
(B) 위치: 1..21
(Xi) 서열 기술: 서열 확인 번호 9:

Claims (18)

  1. A) 일반식(II)의 단백질을, 하나 이상의 카오트로픽 보조제(chaotropic auxiliary)의 존재하에, pH가 10 내지 11이고 1ℓ 당 일반식(II)의 단백질의 농도가 0.05 내지 0.3g인 수성 매질속에서, 일반식(II)의 단백질의 시스테인 잔기당 2 내지 10개의 -SH 라디칼을 생성시키는 양의 머캅탄과 반응시키는 단계;
    B) 단계 A)에서 생성된, 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 프로인슐린을 트립신, 트립신형 효소(trypsin-like enzyme) 및 임의로 부가적으로 카복시펩티다제 B 또는 언급된 효소의 혼합물과 반응시켜 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 일반식(I)의 인슐린을 수득하는 단계;
    C) 단계 B)에서 수득된 반응 생성물을 pH 4 내지 7에서 수성 매질 1ℓ 당 3 내지 50g의 소수성 흡착제 수지로 처리하는 단계;
    D) 단계 C)의 흡착된 일반식(I)의 인슐린을 함유하는 흡착제 수지를 분리시키는 단계 및
    E) 단계 D)에서 분리한 흡착제 수지로부터 일반식(I)의 인슐린을탈착(desorbing)시키는 단계들을 포함하여, 일반식(I)의 인슐린을 수득하는 방법.
    상기식에서,
    X는 a) Lys 및 Arg로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기 또는 b) 펩타이드의 N-말단 및 카복실 말단에 아미노산 잔기 Arg 또는 Lys를 함유하는, 2개 내지 35개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이고,
    Y는 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기이며,
    Z는 a) Lys 및 Arg로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기, b) 펩타이드의 카복실 말단에 아미노산 잔기 Arg 또는 Lys를 함유하는, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 또는 c) OH이고,
    R1은 페닐알라닌 잔기 또는 공유 결합이며,
    R2는 a) 수소 원자, b) Lys 및 Arg로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기 또는 c) 펩타이드의 카복실 말단에 아미노산 잔기 Arg 또는 Lys를 함유하는, 2개 내지 45개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이고,
    R3는 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기이며,
    잔기 A2-A20은 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 A쇄의 아미노산 서열에 상응하며,
    잔기 B2-B29는 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 B쇄의 아미노산 서열에 상응한다.
  2. 제1항에 있어서, X가 아미노산 잔기 Arg이거나 사람 인슐린의 C쇄의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드이고, Y가 Ala, Thr 및 Ser로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며, R1이 아미노산 잔기 Phe이고, R2가 a) 수소 원자 또는 b) 펩타이드의 카복실 말단에 Arg를 함유하는, 2개 내지 25개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이며, R3가 Asn, Ser 및 Gly로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며, 잔기 A2-A20과 B2-B29가 사람 인슐린의 A쇄와 B쇄의 아미노산 서열에 상응하는 일반식(II)의 단백질을 사용하여, Y, R1, R2, R3, A2-A20 및 B2-B29가 상기 언급한 정의와 같고, Z가 아미노산 잔기 Arg, 펩타이드 잔기 Arg-Arg 또는 OH인, 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 일반식(I)의 인슐린을 수득하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, X가 아미노산 잔기 Arg이거나 2개 내지 35개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드인데, 이때 2개의 염기성 아미노산 잔기가 펩타이드의 출발부 및 말단에 존재하며, Y가 아미노산 잔기 Thr이며, R1이 아미노산 잔기 Phe이고, R2가 a) 수소 원자 또는 b) 카복실 말단에 아미노산 잔기 Arg이 존재하는, 2개 내지 15개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이며, R3가 아미노산 잔기 Gly 또는 Asn이고, 잔기 A2-A20과 B2-B29가 사람 인슐린의 A쇄와 B쇄의 아미노산 서열에 상응하는 일반식(II)의 단백질을 사용하여, Y, R1, R2, R3, A2-A20 및 B2-B29가 상기 언급한 정의와 같고, Z가 (아미노산 잔기 Arg, 펩타이드 잔기 Arg-Arg 또는 Lys-Lys, 또는 OH인, 정확하게 연결된 시스틴 브릿지를 갖는 일반식(I)의 인슐린을 수득하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 머캅탄으로서 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드 수화물이 사용되는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 소수성 흡착제 수지로서 가교결합된 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트 또는 폴리스티렌과 디비닐벤젠의 공중합체가 사용되는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 일반식(I)의 인슐린을 이소프로판올 또는 n-프로판올을 이용하여 흡착제 수지로부터 탈착시키는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 C)에서, 0.01 내지 0.1M의 염이 가해지는 방법.
  8. 제4항에 있어서, 소수성 흡착제 수지로서 가교결합된 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트 또는 폴리스티렌과 디비닐벤젠의 공중합체가 사용되는 방법.
  9. 제4항에 있어서, 일반식(I)의 인슐린을 이소프로판올 또는 n-프로판올을 이용하여 흡착제 수지로부터 탈착시키는 방법.
  10. 제5항에 있어서, 일반식(I)의 인슐린을 이소프로판올 또는 n-프로판올을 이용하여 흡착제 수지로부터 탈착시키는 방법.
  11. 제4항에 있어서, 단계 C)에서, 0.01 내지 0.1M의 염이 가해지는 방법.
  12. 제5항에 있어서, 단계 C)에서, 0.01 내지 0.1M의 염이 가해지는 방법.
  13. 제6항에 있어서, 단계 C)에서, 0.01 내지 0.1M의 염이 가해지는 방법.
  14. 제8항에 있어서, 일반식(I)의 인슐린을 이소프로판올 또는 n-프로판올을 이용하여 흡착제 수지로부터 탈착시키는 방법.
  15. 제8항에 있어서, 단계 C)에서, 0.01 내지 0.1M의 염이 가해지는 방법.
  16. 제9항에 있어서, 단계 C)에서, 0.01 내지 0.1M의 염이 가해지는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 단계 C)에서, 0.01 내지 0.1M의 염이 가해지는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 단계 C)에서, 0.01 내지 0.1M의 염이 가해지는 방법.
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