JP2798351B2 - 正確に連結されたシスチン橋を有するプロインスリンの取得方法 - Google Patents
正確に連結されたシスチン橋を有するプロインスリンの取得方法Info
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Description
残基の二本のアミノ酸鎖を有するタンパク質である。そ
れら二本のアミノ酸鎖には6個のシステイン残基が存在
しそして各2個のシステイン残基がジスルフィド橋を介
して相互に連結している。生物学的に活性なヒトインス
リンにおいては、AおよびB鎖が2個のシスチン橋を介
して相互に連結しており、またA鎖にはもう一つのシス
チン橋が存在している。統計的観点からは、ヒトインス
リン1分子内で15通りのジスルフィド橋形成の可能性
がある。それら15通りの可能性のうちの一つだけが生
物学的に活性なヒトインスリン中に存在する。ヒトイン
スリン中では次のシステイン残基が相互に連結してい
る: A6−A11 A7−B7 A20−B19
鎖を表わし、そして数値は各アミノ酸鎖のアミノ末端か
らカルボキシル末端の方向に数えたアミノ酸残基の位置
を表わす。ジスルフィド橋はヒトインスリン2分子間で
も形成され得るため、多くの様々なジスルフィド橋が予
測できない程に容易に生じ得る。
ロインスリンの使用に基づいている。ヒトプロインスリ
ンは86個のアミノ酸残基で構成された一本の直鎖状ア
ミノ酸鎖を有するタンパク質であり、そしてヒトインス
リンのAおよびB鎖が35個のアミノ酸残基を有するC
ペプチドを介して相互に連結している。ヒトインスリン
中に存在するジスルフィド橋の形成は、中間体を経て行
われ、ヒトインスリンのシスチン残基には硫黄保護基、
例えばS−スルホネート(−S−SO3 -)基が付与され
る(EP 0 037 255)。さらに、ブタプロイン
スリンが出発物質として用いられそしてシスチン残基が
チオ残基(−SH)として存在する、正確に連結された
シスチン橋を有するプロインスリンの取得方法が知られ
ている(Biochemistry, 60, (1968), pp. 622-629)。
「正確に連結されたシスチン橋」という用語は哺乳動物
由来の生物学的に活性なインスリンにみられるジスルフ
ィド橋を意味する。
リン、またはヒトインスリンのそれからは逸脱したアミ
ノ酸配列および/またはアミノ酸鎖長を有するプロイン
スリンを製造することが可能となっている。組換えによ
り変えられた大腸菌(Escherichia coli)細胞から製造
されたプロインスリン類は正確に連結されたシスチン橋
を全く有していない。大腸菌を用いたヒトインスリンの
取得方法(EP 0 055 945)は次の手順段階に
基づいている:
の単離─臭化シアンによる融合タンパク質の切断─プロ
インスリン配列を有する切断生成物の単離─S−スルホ
ネート基によるプロインスリンのシステイン残基の保護
─正確に連結されたシスチン橋の形成─亜硫酸分解─プ
ロインスリンの脱塩─正確に連結されたシスチン橋を有
するプロインスリンのクロマトグラフィー精製─プロイ
ンスリン溶液の濃縮─濃縮プロインスリン溶液のクロマ
トグラフィー精製─プロインスリンの酵素切断によるヒ
トインスリンの取得─生成ヒトインスリンのクロマトグ
ラフィー精製。
製段階での損失であり、それらの損失はインスリン収率
の低下につながる。多段階手順経路のため、この手順を
用いる場合には実質的な損失を受け入れなければならな
い。臭化シアン切断、亜硫酸分解およびプロインスリン
精製を介しての単離融合タンパク質の段階から、40%
にのぼるプロインスリン損失が予測される(EP 0 0
55 945)。それ以後の最終生成物に到る精製段階
の過程でも同様の高損失が生じ得る。
体の、組換えによる製造に関連した収率増加は、必要な
手順段階数を顕著に低下できれば達成することができ
る。
くそして総精製損失がより低い、プロインスリンアミノ
酸鎖中に正確に連結されたシスチン橋を有するプロイン
スリンの取得方法にある。
システイン残基1個あたり2〜10個のメルカプタン由
来−SHラジカルを生成する量のメルカプタンと、カオ
トロピック助剤の存在下に水性媒質中10〜11のpH
で、水性媒質1リットルあたり式IIで示されるタンパク
質濃度を0.05〜0.3gとして反応させ、そして得ら
れた式Iで示されるプロインスリンを B) 4〜7のpHで水性媒質1リットルあたり3〜50
gの疎水性吸着剤樹脂と混合し、 C) 式Iで示される、プロインスリンを吸着した吸着
剤樹脂を単離し、そして D) 式Iで示されるプロインスリンを吸着剤樹脂から
脱着することより成る、式I
り、Yは遺伝コード化し得るアミノ酸残基であり、R1
はフェニルアラニン残基または共有結合であり、 R2はa)水素原子、 b)遺伝コード化し得るアミノ酸残基または c)2〜45個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、R3は遺伝コード化し得るアミノ酸残基であり、そ
して残基A2−A20はヒトインスリン、動物インスリ
ンまたはインスリン誘導体のA鎖のアミノ酸配列に相当
し、また残基B2−B29はヒトインスリン、動物イン
スリンまたはインスリン誘導体のB鎖のアミノ酸配列に
相当する、が見出された。
酸配列を有するペプチドであり、YがAla、Thrま
たはSerより成る群より選択されるアミノ酸残基であ
り、R1がアミノ酸残基Pheであり、 R2がa)水素原子、または b)2〜25個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、R3がAsn、SerまたはGlyより成る群より
選択されるアミノ酸残基であり、そして残基A2−A2
0およびB2−B29がヒトインスリンのAおよびB鎖
のアミノ酸配列に相当する、式IIで示されるタンパク質
が好ましい。
するペプチド(該ペプチドの最初と最後に2個の塩基性
アミノ酸、特にArgおよび/またはLys、が位置し
ている)であり、Yがアミノ酸残基Thrであり、R1
がアミノ酸残基Pheであり、 R2がa)水素原子、または b)そのカルボキシル末端にアミノ酸残基Metまたは
Argが位置している、2〜15個のアミノ酸残基を有
するペプチドであり、R3がアミノ酸残基Asnであ
り、そして残基A2−A20およびB2−B29はヒト
インスリンのAおよびB鎖のアミノ酸配列に相当する、
式IIで示されるタンパク質が特に好ましい。
立って行われる反応段階(R. Jaenicke, R. Rudolph, 1
989, Folding Proteins, in Protein Structure a prac
tical Approach;ed. Creighton, T.E. pp. 191-224, J
RL Press Oxford;EP 0 219874)において式IIで示され
るタンパク質を完全に還元する必要がないこと、およ
び、記載された手順において高割合の異タンパク質(7
0〜90%)であるにもかかわらず、−SH保護基を有
する相応に精製されたプロインスリンを折りたたんだ際
に得られるものと同等の大きさの折りたたみ収率が得ら
れることが見出された。
より迅速でかつより高い収率の得られる製造が可能にな
る。この理由は、亜硫酸分解および場合によっては臭化
シアン切断という手順段階が回避され、また式(I)に
相当するプロインスリンを限定量のカオトロピック塩の
存在下にその変性状態から直接高収率で生物学的に活性
な構造に折りたたむというこれまでに知られていない選
択が可能になったためである。これによって生成プロイ
ンスリンを折りたたみ溶液から吸着により分取すること
ができる。すなわち、それらプロインスリンは、吸着剤
から脱着した後、予め中間単離または精製を行うことな
く、インスリンへの酵素転化に用いることができる。本
発明方法により、放置時間の短縮および損失の回避のた
めに、既知の方法に比べ25〜100%程度の収率増加
が可能な実質的に製造手順が短縮される。
はアミノ酸鎖のN−末端から示される。式Iの括弧に示
したデータ、例えばA6、A20、B1、B7またはB
19はインスリンのAおよびB鎖におけるアミノ酸残基
の位置に相当する。
Ile、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Arg、Lys、His、
Tyr、Phe、Trp、Proおよびセレノシステインは「遺伝コ
ード化し得るアミノ酸残基」を表わす。
残基B2−B29という用語は、例えば、ウシ、ブタま
たは家禽由来のインスリンのアミノ酸配列を意味する。
びB2−B29は、アミノ酸を他の遺伝コード化し得る
アミノ酸と交換することにより形成される相当するヒト
インスリンのアミノ酸配列を表わす。
(配列番号:1):Gly,Ile,Val,Glu,Gln,Cys,Cy
s,Thr,Ser,Ile,Cys,Ser,Leu,Tyr,Gln,Leu,Gl
u,Asn,Tyr,Cys,Asn
(配列番号:2):Phe,Val,Asn,Gln,His,Leu,Cy
s,Gly,Ser,His,Leu,Val,Glu,Ala,Leu,Tyr,Le
u,Val,Cys,Gly,Glu,Arg,Gly,Phe,Phe,Tyr,Th
r,Pro,Lys,Thr
(配列番号:3):Arg,Arg,Glu,Ala,Glu,Asp,Le
u,Gln,Val,Gly,Gln,Val,Glu,Leu,Gly,Gly,Gl
y,Pro,Gly,Ala,Gly,Ser,Leu,Gln,Pro,Leu,Al
a,Leu,Glu,Gly,Ser,Leu,Gln,Lys,Arg
合を切断する化合物、例えば硫酸アンモニウム、グアニ
ジン塩酸塩、エチレンカーボネート、チオシアネート、
ジメチルスルホキシドおよび尿素などである。
性、疎水性、架橋ポリマーおよび/またはコポリマー、
例えばポリスチレンまたはスチレンとジビニルベンゼン
とより成るコポリマー、特に大きな表面と多くの大きな
細孔を有するポリマーの吸着剤樹脂、例えばRohm and H
aas社またはMitsubishi Chemical Industries Ltd.社
からの市販調製物、例えばXAD16、XAD1600
またはHP20などを表わす。
り、そして少なくとも一つの−SH基を含む化合物を意
味する。これら化合物の例は、ジチオトレイトール、ジ
チオエリトロール、2−メルカプトエタノール、システ
イン、メチルチオグリコレート、3−メルカプト−1,
2−プロパンジオールおよび3−メルカプトプロピオン
酸である。
様々な組換え構築物を用いて形成することができる(E
P 0 489 780、EP 0 347 781、EP
0 453 969)。
イシス類(streptomycetes)などの微生物中で発酵中に
発現される。形成されたタンパク質は微生物の内部に貯
蔵される(EP 0 489 780)か、または発酵溶
液中に分泌される。
溶液または微生物由来の様々なタンパク質で依然として
汚染されている式IIで示されるタンパク質を用いること
ができる。しかしながら、式IIで示されるタンパク質
は、例えば沈殿またはクロマトグラフィー精製後、予め
精製された形で用いることもできる。
おりである:タンパク質をカオトロピック助剤に、また
は様々なカオトロピック助剤の混合物に溶解する。好ま
しくは、グアニジン塩酸塩を溶媒としての水に基づき6
〜10M、好ましくは8M、の濃度で用いる。反応混合
物のpHは8.5から10.8である。使用できる緩衝剤の
例は、ホスフェート、トリ(ヒドロキシメチル)アミノ
メタン(Tris)、ボレートまたはグリシン緩衝剤などで
ある。水性媒質中の緩衝物質濃度は0.5Mまで、好ま
しくは0.005M〜0.5M、特に好ましくは0.05
M〜0.1Mである。次に、タンパク質混合物をメルカ
プタンの水性溶液と混合する。これによって反応溶液中
に次の(水に基づく)濃度が得られる:
05〜0.3g/リットル、好ましくは0.1〜0.2g
/リットル、である。
パク質のシステイン残基1個あたり、メルカプタンの−
SHラジカル2〜10個、好ましくは3〜6個、であ
る。
8である。前述の緩衝成分が用いられる。精密なpHは、
水酸化ナトリウム溶液を添加することにより設定され
る。緩衝成分の濃度は0.005〜0.5M、好ましくは
0.05〜0.1M、である。
ピック助剤の濃度は、1M以下、好ましくは0.1〜0.
8M、特に0.3〜0.6M、である。システインまたは
2−メルカプトエタノールいずれか単独、またはそれら
両者の混合物をメルカプタンとして用いるのが好まし
い。
度は0℃〜50℃、好ましくは2℃〜30℃、特に4℃
〜10℃、である。反応時間は3〜12時間、好ましく
は4〜8時間、特に5時間、である。
されたシスチン橋を含む式Iで示されるプロインスリン
である。
らの反応溶液は、酸、例えば塩酸または硫酸を用いて4
〜7のpHに調節される。溶液に濁りが生じたら、これら
を濾過または遠心分離により除去する。次に、残留溶液
に疎水性吸着剤樹脂を添加する。XADまたはHP20
型の樹脂が適切であることがわかっている。樹脂の量は
反応溶液1リットルあたり3〜50g、好ましくは10
〜25gである。
Iで示されるプロインスリンの樹脂への吸着は、サンプ
リングにより、また高圧液体クロマトグラフィー分析
(HPLC分析)により点検する。溶液中にプロインス
リンがもはや検出し得なくなったらただちに、吸着剤樹
脂を水性反応溶液から分取する(手順段階C)。これ
は、例えば既知方法に従って濾過または遠心分離などに
より行われる。プロインスリンを吸着した樹脂は、純粋
に水性の溶液で、または緩衝剤含有水性溶液で洗浄され
る。
順段階D)は、使用した疎水性吸着剤樹脂に依存する既
知方法に従って行われる。例えばXADまたはHP20
吸着剤樹脂の場合には、脱着は、10〜50%の、水と
混和し得る非イオン性有機溶媒、例えば(C1〜C6)−
アルカノール、を含有する水性溶液を用いて行われる。
好ましくは、50%イソプロパノールを溶媒としての水
中で用いる。式Iで示されるプロインスリンの脱着は、
例えばそのイソプロパノール溶液で洗浄することにより
行われる。その洗浄は、撹拌機付き容器内でイソプロパ
ノール溶液と混合することにより、あるいはカラムでの
クロマトグラフィーにより行うことができる。樹脂容量
対イソプロパノール溶液容量の比は1:1〜1:10、
好ましくは1:1.1〜1:2である。洗浄段階は1〜
5回、好ましくは2回、反復することができる。合一し
たイソプロパノール画分は、直接、あるいは水で希釈し
た後、さらなるクロマトグラフィー精製、またはプロイ
ンスリンのインスリンへの酵素切断に用いることができ
る(Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246(1971), p.
6786;EP 0 305 760)。
ている。パーセント値は特に断らない限り重量に関する
ものである。
に修飾された大腸菌細胞を発酵させることにより製造さ
れる(EP 0 489 780)。 プロインスリン1(配列番号:4): Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
リンのCペプチドであり、YがThr(B30)であ
り、R1がPhe(B1)であり、R2が11個のアミノ
酸残基を有するペプチドであり、R3がAsn(A2
1)であり、そしてA2−A20がヒトインスリンのA
鎖のアミノ酸配列(アミノ酸残基2〜20)でありまた
B2−B29がヒトインスリンのB鎖のアミノ酸配列
(アミノ酸残基2〜29)である式IIに相当する。
中に蓄積しそして封入体を形成する。発酵が完了した
ら、細胞を遠心分離により分取し、そして慣用の高圧ホ
モジナイゼーションにより破砕する。遊離した融合タン
パク質封入体は遠心分離により単離される。
質封入体1000g(凍結乾燥後の水分不含重量に基づ
く)をpH10.8で8Mグアニジン塩酸塩溶液100リ
ットルに溶解する。遠心分離により少量の濁り源固体を
除去した後、その澄明溶液を、10.8のpHおよび4℃
の温度で、システイン(125gのシステイン塩酸塩水
和物)の水性溶液900リットル中に撹拌しながら添加
する。融合タンパク質のインスリン含量は、SDS電気
泳動走査により測定する(U.K. Laemmli, Nature, Volu
me227, pp. 680-685, 1970)。それは15%である。折
りたたみ反応の完了後、反応混合物中のプロインスリン
は分析的HPLCにより105gと測定される。
に調節し、そしてわずかな濁りを遠心分離により除去す
る。30kgのHP20(Mitsubishi Chemical Industri
es Ltd製)をその澄明な溶液に添加する。その懸濁液を
上清中にプロインスリン1がもはや検出し得なくなるま
で約4時間、ゆっくり撹拌する。その樹脂を吸引フイル
ターを通して濾過することにより分取しそして水洗す
る。生成物の脱着は、イソプロパノールの50%強度水
性溶液50リットル中で樹脂をスラリー化することによ
り行われる。前記濾過およびイソプロパノール溶液との
インキュベーションを2回繰り返す。式Iで示されるプ
ロインスリンの収量は103gである。
Tris、pH8.5、5mMエチレンジアミンテトラアセテー
ト(EDTA)、1%2−メルカプトエタノールおよび
10mMジチオトレイトールより成る溶液40mlに95℃
で2分間溶解し、次いで14000gで20分間遠心分
離する。0.02mlの澄明な上清を高圧液体クロマトグ
ラフィーカラムにかける。
erey & Nagel社製) 勾 配:緩衝剤A:0.1%トリフルオロ酢酸(TF
A) 緩衝剤B:アセトニトリル中0.09%TFA 温 度:55℃ 総ランニング時間:15分 前記勾配は相当するランニング時間後の次の緩衝剤B量
によって特徴付けられる:10分 25%、12分 60
%、13分 90%、15分 100%。 流 速:1ml/分 検 出:215nm プロインスリンの保持時間:9分間
に修飾された大腸菌を発酵させることにより製造される
(EP 0 347 781)。 プロインスリン2(配列番号:5): Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Ile Glu Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
中に蓄積しそしてしばしば封入体を形成する。実施例1
と同様に細胞の破砕を行う。このようにして得られたプ
ロインスリンを臭化シアンによる切断に付すとプロイン
スリン3(配列番号:7)が形成される。
り、YがThr(B30)であり、R1がPhe(B
1)であり、R2が4個のアミノ酸残基を有するペプチ
ドであり、R3がAsn(A21)であり、そしてA2
−A20およびB2−B29がヒトインスリンのそれぞ
れAおよびB鎖のアミノ酸配列に相当する、式IIに相当
する。
ン含有タンパク質を含有する凍結乾燥試料中のプロイン
スリン3含量をSDS電気泳動により定量的に測定す
る。
と同様にシステイン塩酸塩水和物と共にインキュベート
する。その後で、全反応混合物中の式Iで示されるプロ
インスリンの含量は分析的HPLCを用いて63gと測
定される。実施例1と同様、生成物を35kgのXAD−
1600樹脂(Rohm and Haas Company製)で吸着し、
そして反応溶液から取出す。その樹脂を洗浄しそして生
成物を脱着した後、式Iで示されるプロインスリンの含
量は56gと測定される。
より修飾された大腸菌を発酵させることにより製造され
る(EP 0 489 780): プロインスリン4(配列番号:6) Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
り、YがThr(B30)であり、R1がPhe(B
1)であり、R2が11個のアミノ酸を有するペプチド
であり、R3がAsn(A21)であり、そしてA2−
A20およびB2−B29がヒトインスリンのそれぞれ
AおよびB鎖のアミノ酸配列に相当する、式IIに相当す
る。
ートから遠心分離により単離する。実施例1と同様、生
成物含量(15%)を測定した後、1000gの融合タ
ンパク質を折りたたみ反応に用いる。反応終了時の折り
たたみ収率を実施例1と同様測定したところ60%と測
定される。プロインスリン収量は108gである。
Claims (6)
- 【請求項1】 A) 式II R2−R1−B2−B29−Y−X−Gly−A2−A
20−R3 (II) で示されるタンパク質を、式IIで示されるタンパク質
のシステイン残基1個あたり2〜10個のメルカプタン
由来−SHラジカルを生成する量のメルカプタンと、カ
オトロピック助剤の存在下に水性媒質中10〜11のp
Hで、水性媒質1リットルあたり式IIで示されるタン
パク質濃度を0.05〜0.3gとして反応させ、そし
て得られた式Iで示されるプロインスリンを B) 4〜7のpHで水性媒質1リットルあたり3〜5
0gの疎水性吸着剤樹脂と混合し、 C) 式Iで示される、プロインスリンを吸着した吸着
剤樹脂を単離し、そして D) 式Iで示されるプロインスリンを吸着剤樹脂から
脱着する ことより成る、式I 【化1】 で示されるプロインスリンの取得方法。(前記式Iおよ
びIIにおいて、 Xはa)遺伝コード化し得るアミノ酸残基または b)2〜35個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、 Yは遺伝コード化し得るアミノ酸残基であり、 R1はフェニルアラニン残基または共有結合であり、 R2はa)水素原子、 b)遺伝コード化し得るアミノ酸残基または c)2〜45個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、 R3は遺伝コード化し得るアミノ酸残基であり、そして
残基A2−A20はヒトインスリン、動物インスリンま
たはインスリン誘導体のA鎖のアミノ酸配列に相当し、
また残基B2−B29はヒトインスリン、動物インスリ
ンまたはインスリン誘導体のB鎖のアミノ酸配列に相当
する)。 - 【請求項2】 式中、 XがヒトインスリンのC鎖のアミノ酸配列を有するペプ
チドであり、 YがAla、ThrまたはSerより成る群より選択さ
れるアミノ酸残基であり、 R1がアミノ酸残基Pheであり、 R2がa)水素原子、または b)2〜25個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、 R3がAsn、SerまたはGlyより成る群より選択
されるアミノ酸残基であり、そして残基A2−A20お
よびB2−B29がヒトインスリンのAおよびB鎖のア
ミノ酸配列に相当する、式IIで示されるタンパク質を
用いる請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 式中、 Xが2〜35個のアミノ酸残基を有するペプチド(該ペ
プチドの最初と最後に2個の塩基性アミノ酸、特にAr
gおよび/またはLys、が位置している)であり、 Yがアミノ酸残基Thrであり、 R1がアミノ酸残基Pheであり、 R2がa)水素原子、または b)そのカルボキシル末端にアミノ酸残基Metまたは
Argが位置している、2〜15個のアミノ酸残基を有
するペプチドであり、 R3がアミノ酸残基Asnであり、そして 残基A2−A20およびB2−B29はヒトインスリン
のAおよびB鎖のアミノ酸配列に相当する、式IIで示
されるタンパク質を用いる請求項1または2記載の方
法。 - 【請求項4】 システインまたはシステイン塩酸塩水和
物をメルカプタンとして用いる請求項1〜3のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項5】 架橋ポリスチレンまたはスチレンとジビ
ニルベンゼンとで構成されるコポリマーが疎水性吸着剤
樹脂として用いられる請求項1〜4のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項6】 式Iで示されるプロインスリンをイソプ
ロパノールを用いて吸着剤樹脂から脱着する請求項1〜
5のいずれかに記載の方法。
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