FI108727B - Menetelmä oikein sitoutuneet kystiinisillat omaavan proinsuliinin saamiseksi - Google Patents

Description

x 108727

Menetelmä oikein sitoutuneet kystiinisillat omaavan proin-suliinin saamiseksi

Ihmisen insuliini on proteiini, jossa on kaksi 5 aminohappoketjua, jotka sisältävät yhteensä 51 aminohappo-jäännöstä. Kummassakin aminohappoketjussa on 6 kysteiini-jäännöstä, jolloin aina kaksi kysteiinijäännöstä on sidoksissa toistensa kanssa disulfidisillan kautta. Biologisesti aktiivisessa ihmisen insuliinissa A- ja B-ketjut ovat 10 sidoksissa toitensa kanssa kahden kystiinisillan kautta ja A-ketjussa esiintyy ylimääräinen kystiinisilta. Ihmisen insuliinimolekyylissä on tilastollisesti katsottuna 15 mahdollisuutta disulfidisiltojen muodostamiseksi. Biologisesti tehokkaassa ihmisen insuliinissa ilmenee vain yksi 15 15 mahdollisuudesta. Seuraavat kysteiinijäännökset ihmisen insuliinissa ovat sidoksissa toistensa kanssa: A 6 - A 11 A 7 - B 7 A 20 - B 19.

20 Kirjaimet A tai B tarkoittavat kysymyksessä olevia insuliiniketjuja, luku tarkoittaa aminohappojäännöksen .. : asemaa j a se lasketaan kysymyksessä olevan aminohappoket- • jun aminopäätteestä karboksyylipäätteeseen. Disulfidisil- lat voivat muodostua myös kahden ihmisen insuliinimolekyy-25 Iin välille siten, että voi syntyä helposti mittaamattoman • | monia erilaisia disulfidisiltoja.

Tunnettu menetelmä ihmisen insuliinin valmistamiseksi perustuu ihmisen proinsuliinin käyttöön. Ihmisen proinsuliini on proteiini, jossa on 86 aminohappojäännök-

' r I

* 30 sestä koostuva lineaarinen aminohappoketju, jolloin ihmi- .· sen insuliinin A- ja B-ketjut ovat sidoksissa toistensa : kanssa 35 aminohappojäännöstä käsittävän C-peptidin kaut- ta. Ihmisen insuliinissa esiintyvien disulfidisiltojen muodostaminen tapahtuu välituotteen kautta, jolloin ihmi-35 sen insuliinin kysteiinijäännökset on varustettu rikkisuo- 2 108727 jaryhmällä, esimerkiksi S-sulfonaattiryhmällä (-S-S03") (EP 0 037 255). Lisäksi menetelmä oikein sitoutuneet kys-! tiinisillat omaavan proinsuliinin saamiseksi on tunnettu (Biochemistry, 60, (1968), sivut 622 - 629), jolloin läh-5 tökohtana on sian proinsuliini, jossa kysteiinijäännökset esiintyvät tiojäännöksinä (-SH). Käsitteellä "oikein sitoutuneet kystiinisillat" tarkoitetaan disulfidisiltoja, jotka esiintyvät nisäkkäiden biologisesti aktiivisessa insuliinissa.

10 Geeniteknologisen menetelmän avulla voidaan valmis taa mikro-organismeissa ihmisen proinsuliinia tai proinsu-liinia, jolla on ihmisen insuliinista poikkeava aminohapposekvenssi ja/tai aminohappoketjun pituus. Geeniteknologian avulla muunnettujen Escherichia coli -solujen valmis-15 tamilia proinsuliineilla ei ole oikein sitoutuneita kys-| tiinisiltoja. Menetelmä ihmisen insuliinin tuottamiseksi E. colin avulla (EP 0 055 945) perustuu seuraaviin mene-telmävaiheisiin:

Mikro-organismien ferraentointi - solujen liuottami-20 nen - fuusioproteiinin eristäminen - fuusioproteiinin bromi syaaniha jo tus - proinsuliinisekvenssin omaavien hajotus-• ‘ : tuotteiden eristäminen - prosinsuliinin kysteiinijäännös ten suojaaminen S-sulfonaattiryhmillä - oikein sitoutunei-; ; den kystiinisiltojen muodostaminen - sulfitolyysi - proin- . 25 suliinin suolan poistaminen - oikein sitoutuneet kystii nisillat omaavan proinsuliinin kromatografinen puhdistaminen - proinsuliiniliuoksen väkevöiminen - väkevöidyn proinsuliiniliuoksen kromatografinen puhdistaminen proinsuliinin entsymaattinen hajottaminen ihmisen insulii-30 nin saamiseksi - muodostuneen ihmisen insuliinin kromatografinen puhdistaminen.

Tämän menetelmän haittapuolia ovat menetelmän vaiheiden lukumäärä ja insuliinin vähäiseen saantoon johtavat häviöt puhdistusvaiheissa. Tässä menetelmätavassa täytyy 35 hyväksyä huomattavat häviöt monivaiheisen menetelmän vuok- 3 108727 si. Täytyy varautua proinsuliinin jopa 40 %:n häviöön eristetystä fuusioproteiinista bromisyaanihajottamiseen, sulfitolyysiin ja proinsuliinin puhdistamiseen mentäessä (EP 0 055 945). Vastaavia suuria häviöitä voi esiintyä 5 seuraavien puhdistusvaiheiden kuluessa lopputuotteeseen saakka.

Ihmisen insuliinin tai insuliinijohdannaisten geeniteknologisessa valmistuksessa saannon lisäyksiä voidaan sitten saada, kun välttämättömien menetelmävaiheiden mää-10 rää voidaan vähentää oleellisesti.

Tämän keksinnön tehtävänä oli kehittää menetelmä oikein sitoutuneet proinsuliiniaminohappoketjun kystiini-sillat omaavan prosinsuliinin tuottamiseksi, jolloin tarvitaan vähemmän menetelmävaiheita ja puhdistushäviöitä j 15 ilmenee yhteensä vähemmän.

I Nyt keksittiin menetelmä proinsuliinin tuottamisek

si, jolla on kaava I

-—----

20 S-S

( A6 ) | | (A20)

H H-G ly- Cy*- Cy * - Cy*- Cy *- R3-0H

(AI) | (A 7) (AI!) | :: s s :! I | s ,

- i I

R 2- r 1- C y t --- C y i- Y

(81) (87) (B19) 30 menetelmän ollessa tunnettu siitä, että A) saatetaan reagoimaan proteiini, jolla on kaava

: II

R2 - R1 - B2 - B29 - Y - X - Gly - A2 - A20 - R3 (II), . 108727 4 sellaisen määrän kanssa merkaptaania, että se tuottaa 2 -10 merkaptaanin -SH-jäännöstä kaavan II mukaisen proteiinin kysteiinijäännöstä kohden, kaotrooppisen apuaineen läsnä ollessa vesipitoisessa väliaineessa pH-arvon ollessa 5 10 - 11 ja kaavan II mukaisen proteiinin konsentraation ollessa 0,05 - 0,3 g/1 vesipitoista väliainetta, ja saatuun kaavan I mukaiseen proinsuliiniin B) sekoitetaan 3 - 50 g hydrofobista adsorbentti-hartsia/1 vesipitoista väliainetta pH-arvon ollessa 4-7, 10 C) eristetään adsorbenttihartsi adsorboituneen, kaavan I mukaisen proinsuliinin kanssa ja D) kaavan I mukainen proinsuliini desorboidaan ad-sorbenttihartsista;

jolloin kaavassa I ja II

15 X on a) geneettisesti koodattava aminohappojäännös tai b) peptidi, jolla on 2 - 35 aminohappojäännöstä, Y on geneettisesti koodattava aminohappojäännös, R1 on fenyylialaniinijäännös tai kovalenttinen sidos, 20 R2 on a) vetyatomi, b) geneettisesti koodattava aminohappojäännös tai c) peptidi, jolla on 2 - 45 amino-. : happoj äännöstä, R3 on geneettisesti koodattava aminohappojäännös ja jäännökset A2 - A20 vastaavat ihmisen tai eläimen insulii-: ·, 25 nin tai insuliinijohdannaisen A-ketjun aminohapposekvens- siä ja jäännökset B2 - B29 vastaavat ihmisen insuliinin tai eläimen insuliinin tai insuliinijohdannaisen B-ketjun aminohapposekvenssiä.

Edullisia ovat kaavan II mukaiset proteiinit, jol- 30 loin X on peptidi, jolla on ihmisen insuliinin C-ketjun : aminohapposekvenssi, Y on aminohappojäännös, joka on peräisin ryhmästä, joka käsittää jäännökset Ala, Thr tai Ser, : 35 R1 on aminohappojäännös Phe, 5 108727 R2 on a) vetyatomi tai b) peptidi, jolla on 2 - 25 aminohappoj äännöstä, R3 on aminohappojäännös, joka on peräisin ryhmästä, joka käsittää jäännökset Asn, Ser tai Gly, 5 ja jäännökset A2 - A20 ja B2 - B29 vastaavat ihmi sen insuliinin A- ja B-ketjujen aminohapposekvenssiä.

Erityisen edullisia ovat kaavan II mukaiset proteiinit, jolloin X on peptidi, jolla on 2 - 35 aminohappojäännöstä, 10 jolloin peptidin alussa ja lopussa on kaksi emäksistä aminohappo jäännöstä, erityisesti Arg ja/tai Lys, Y on aminohappojäännös Thr, R1 on aminohappojäännös Phe, R2 on a) vetyatomi tai b) peptidi, jolla on 2 - 15 15 aminohappojäännöstä, jolloin peptidin karboksyylipäässä on j aminohappojäännös Met tai Arg, R3 on aminohappojäännös Asn, ja jäännökset A2 - A20 ja B2 - B29 vastaavat ihmisen insuliinin A- ja B-ketjujen aminohapposekvenssiä.

20 Yllättäen havaittiin, että kaavan II mukaista pro teiinia ei tarvitse pelkistää täydellisesti tavanomaisesti : "refolding'ia" edeltävässä reaktiovaiheessa (R. Jaenicke, R. Rudolph, 1989, Folding Proteins, teoksessa Protein Structure a practical Approach; toimittanut Creighton, T.

: .·. 25 E., sivut 191 - 224, JRL Press Oxford; EP 0 219 874) ja että kuvatussa menetelmän toteuttamistavassa huolimatta suuresta vierasproteiinin määrästä (70 - 90 %) saadaan uudelleenkiertymisasteita, jotka ovat verrattavissa vastaavasti puhdistetun, -SH-suojaryhmät omaavan proinsulii-30 nin uudelleenkiertymisasteisiin.

,Keksinnön mukainen menetelmä tekee mahdolliseksi ;\j oleellisesti nopeamman valmistuksen saantojen ollessa suu- rempia verrattuna tähän mennessä tunnettuihin menetelmiin. Syynä siihen ovat menetelmän sulfitolyysi- ja mahdollises-35 ti bromisyaanihajotusvaiheiden välttäminen sekä tähän men- c 108727 nessä tuntematon mahdollisuus saattaa kaavaa (I) vastaava proinsuliini uudelleenkiertymään suoraan sen denaturoidusta tilasta suurina saantoina biologisesti aktiiviseksi rakenteeksi rajoitettujen määrien kaotrooppisia suoloja 5 läsnä ollessa. Tällä tavalla tulee mahdolliseksi muodostuvan proinsuliinin erottaminen adsorboimalla liuoksesta, jossa uudelleenkiertyminen tapahtuu. Siten proinsuliinit voidaan saattaa ilman välillä tapahtuvaa eristämistä tai puhdistusta adsorptioaineesta tapahtuvan desorption jäl-10 keen entsymaattiseen konversioon, jolloin saadaan insuliini. Keksinnön mukainen menetelmä johtaa huomattavasti lyhyempään valmistusmenetelmään, joka tekee mahdolliseksi lyhyempien seisonta-aikojen ja häviöiden välttämisen vuoksi saantojen lisäykset, jotka ovat 25 - 100 % tunnettuun 15 menetelmään verrattuna.

Peptidien ja proteiinien aminohapposekvenssi nimetään lähtien aminohappoketjun N-terminaalisesta päästä. Kaavassa I suluissa annetut tiedot, esimerkiksi A6, A20, Bl, B7 tai B19 vastaavat aminohappojäännösten asemaa insu-20 liinin A- tai B-ketjuissa.

Käsitteellä "geneettisesti koodattava aminohappo-.V: jäännös" tarkoitetaan aminohappoja Gly, Ala, Ser, Thr,

Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, ·.·. His, Tyr, Phe, Trp, Pro ja selenokysteiini.

25 Käsitteellä eläimen insuliinin "jäännökset A2 - V A20" ja "jäännökset B2 - B29” ymmärretään esimerkiksi nau- .! takarjasta, sioista tai kanoista peräisin olevan insulii nin aminohappojäännöksiä. Käsite insuliinijohdannaisten jäännökset A2 - A20 ja B2 - B29 tarkoittaa ihmisen insu-* 30 liinin vastaavia aminohapposekvenssejä, jotka muodostetaan vaihtamalla aminohapot muilla geneettisesti koodattavilla ,·, : aminohapoilla.

t » ·

Ihmisen insuliinin A-ketjulla on seuraava sekvenssi (Seq Id no 1): 7 108727

Gly, He, Val, Glu, Gin, Cys, Cys, Thr, Ser, lie, Cys, Ser, Leu,

Tyr, Gin, Leu, Glu, Asn, Tyr, Cys, Asn

Ihmisen insuliinin B-ketJulia on seuraava sekvenssi 5 (Seq Id no 2):

Phe, Val, Asn, Gin, His, Leu, Cys, Gly, Ser, His, Leu, Val, Glu,

Ala, Leu, Tyr, Leu, Val, Cys, Gly, Glu, Arg, Gly, Phe, Phe, Tyr,

Thr, Pro, Lys, Thr 10 Ihmisen insuliinin C-ketjulla on seuraava sekvenssi (Seq Id no 3):

Arg, Arg, Glu, Ala, Glu, Asp, Leu, Gin, Val, Gly, Gin, Val, Glu, Leu, Gly, Gly, Gly, Pro, Gly, Ala, Gly, Ser, Leu, Gin, Pro, Leu , Ala, Leu, Glu, Gly, Ser, Leu, 15 Gin, Lys, Arg.

Kaotrooppiset apuaineet ovat yhdisteitä, jotka katkovat vesipitoisessa liuoksessa vetysiltasidoksia, esimerkkejä niistä ovat ammoniumsulfaatti, guanidiinihydro-kloridi, etyleenikarbonaatti, tiosyanaatti, dimetyylisul-20 foksidi ja urea. Käsite hydrofobinen adsorbenttihartsi tarkoittaa ei-ioniaktiivisia, hydrofobisia, silloittuneita polymeerejä ja/tai sekapolymeereja, esimerkiksi polystyro-; .·. lia tai styrolista ja divinyylibentseenistä muodostettuja - V sekapolymeereja, erityisesti polymeerisiä adsorbenttihart- 25 seja, joilla on suuri pinta ja paljon suuria huokosia, ,* esimerkiksi yhtiöiden Rohm and Haas tai Mitsubishi

Chemical Industries Ltd. kauppavalmisteet, kuten XAD16, • ‘ ' XAD1600 tai HP20. Käsite merkaptaani tarkoittaa yhdis teitä, jotka ovat vesiliuokoisia ja sisältävät vähintään 30 yhden -SH-ryhmän. Esimerkkejä näistä yhdisteistä ovat di-tioreitoli, ditioerytroli, 2-merkaptoetanoli, kysteiini, ’ : metyylitioglykolaatti, 3-merkapto-l,2-propaanidioli ja » ♦ 3-merkaptopropionihappo.

Kaavan II mukainen proteiini voidaan muodostaa rao-'·’*·' 35 nenlaisten geeniteknisten rakennelmien avulla mikro-orga- 8 108727 nismeissa (EP O 489 780, EP O 347 781, EP O 453 969). Geeniteknologiset rakennelmat ekspressoltuvat mikro-organismeissa, kuten Escherichia colissa tai Streptomycetes-bak-teereissa, fermentoinnin aikana. Muodostuneet proteiinit 5 varastoituvat mikro-organismien sisälle (EP 0 489 780) tai ne erittyvät fermentointiliuokseen.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää kaavan II mukaisia proteiineja, joissa on epäpuhtautena solujen liuottamisen jälkeen vielä erilaisia proteiineja, 10 jotka ovat peräisin fermentointiliuoksesta ja mikro-organismeista. Kaavan II mukaisia proteiineja voidaan kuitenkin käyttää myös esipuhdistetussa muodossa esimerkiksi saostamisen tai kromatografisen puhdistamisen jälkeen. Menetelmävaiheessa A) toimitaan seuraavasti: 15 Proteiinit liuotetaan kaotrooppiseen apuaineeseen tai erilaisten kaotrooppisten apuaineiden seoksiin. Edullisesti käytetään guanidiinihydrokloridia, jonka konsen-traatio on 6 - 10 M, edullisesti 8 M, suhteessa liuottimena olevaan veteen. Reaktioseoksen pH-arvo on 8,5 - 10,8. 20 Esimerkkejä käyttökelpoisista puskureista ovat fosfaatti-, tri(hydroksimetyyli)aminometaani(tris)-, boraatti- tai · ·' : glysiinipuskurit. Puskuriaineiden konsentraatio vesipitoi- • sessa väliaineessa on enintään 0,5 M, edullisesti 0,005 - ·’: 0,5 M, erityisen edullisesti 0,05 - 0,1 M. Sen jälkeen 25 proteiiniseos sekoitetaan vesipitoiseen merkaptaaniliuok- .·. seen. Siten reaktioseokseen asetetaan seuraavat konsen- .! traatiot (suhteessa veteen):

Kaavan II mukaisen proteiinin konsentraatio on 0,05 - 0,3 g/1, edullisesti 0,1 - 0,2 g/1.

30 Merkaptaanin määrä käsittää 2-10, edullisesti 3 - 6, merkaptaanin -SH-jäännöstä kaavan II mukaisen proteii-·,· nin kysteiinijäännöstä kohden. Liuoksen pH-arvo on 10 - 11, edullisesti 10,8. Käytetään edellä mainittuja pusku-• riaineita. Tarkka pH-arvo säädetään lisäämällä natriumhyd- 9 108727 roksidia. Puskuriaineiden konsentraatio on 0,005 - 0,5 M, edullisesti 0,05 - 0,1 M.

Merkaptaanin käsittävässä reaktioseoksessa kao-trooppisen apuaineen konsentraatio on vähemmän kuin 1 M, 5 edullisesti se on 0,1 - 0,8 M, erityisesti 0,3 - 0,6 M. Merkaptaanina käytetään edullisesti kysteiiniä tai 2-mer-kaptoetanolia yksin tai seoksena.

Menetelmävaiheessa A) lämpötila uudelleenkiertyrni-sen aikana on 0-50 °C, edullisesti 2-30 °C, erityises-10 ti 4 - 10 °C. Reaktioaika on 3 - 12 tuntia, edullisesti 4-8 tuntia, erityisesti 5 tuntia.

Menetelmävaiheen A) lopputulos on kaavan I mukainen proinsuliini, joka sisältää oikein sitoutuneet kystiini-sillat.

15 Menetelmävaiheessa B) menetelmävaiheesta A) saadun reaktioliuoksen pH säädetään arvoon 4-7 hapon, kuten suolahapon tai rikkihapon, avulla. Jos liuokseen tulee sameutta, se poistetaan suodattamalla tai sentrifugoimal-la. Jäljelle jääneeseen liuokseen sekoitetaan hydrofobista 20 adsorbenttihartsia. Suotuisiksi ovat osoittautuneet hartsit, jotka ovat tyyppiä XAD tai HP20. Hartsin määrä on 3 -V 50 g/1 reaktioliuosta, edullisesti 10 - 25 g/1.

: j Saatua suspensiota sekoitetaan 3-4 tuntia. Kaavan ·': I mukaisen proinsuliinin adsorptiota hartsiin valvotaan 25 ottamalla näytteitä ja korkeapainenestekromatografia-ana- ,·. lyysien (HPLC-analyysien) avulla. Kun proinsuliinia ei enää ole havaittavissa liuoksesta, adsorbenttihartsi erotetaan heti vesipitoisesta reaktioliuoksesta (menetelmä-vaihe C). Tämä tapahtuu esimerkiksi suodattamalla tai ' * · 30 sentrifugoimalla tunnettujen menetelmien mukaisesti. Hart- * si siihen adsorboituneen proinsuliinin kanssa pestään puh-taasti vesiliuoksella tai puskuripitoisella vesiliuoksel-.la.

• t Kaavan I mukaisen proinsuliinin desorptio (menetel- ‘ ‘ 35 mävaihe D) tapahtuu tunnettujen menetelmien mukaan, jotka » t 10 108727 riippuvat käytetystä hydrofobisesta adsorbenttihartsista. Kun kysymyksessä ovat XAD- tai HP20-adsorbenttihartsit, desorptio tapahtuu esimerkiksi vesipitoisen liuoksen avulla, joka sisältää 10 - 50 % veden kanssa sekoittuvaa, ei-5 ioniaktiivista orgaanista liuotinta, esimerkiksi (C^J-al-kanolia. Edullisesti käytetään 50 % isopropanolia vesi-liuottimessa. Kaavan I mukaisen proinsuliinin desorptio tapahtuu esimerkiksi pesemällä isopropanoliliuoksella. Peseminen voi tapahtua sekoitusastiassa sekoittamalla iso-10 propanoliliuoksen kanssa tai kromatografian avulla pyl väässä. Hartsin ja isopropanoliliuoksen välinen tilavuus-suhde on 1:1 - 1:10, edullisesti 1:1,1 - 1:2. Pesuvaiheet voidaan toistaa 1-5 kertaa, edullisesti kaksi kertaa. Puhdistettuja isopropanolifraktioita voidaan käyttää suo-15 raan tai laimennettuna vedellä muihin kromatografiapuhdis-tuksiin tai proinsuliinin entsymaattiseen hajottamiseen insuliiniksi (Kemmler et ai., J. Biol. Chem., 246 (1971), sivu 6786; EP 0 305 760).

Seuraavissa esimerkeissä keksinnön mukainen mene-20 telmä kuvataan yksityiskohtaisesti. Prosenttiluvut perustuvat painoon, mikäli ei ilmoiteta toisin.

Esimerkki 1

Fermentoimalla geneettisesti muunnettuja Esche-richia coli -soluja (EP 0 489 780) valmistetaan proinsu-25 liini 1, jolla on seuraava aminohapposekvenssi.

,* Proinsuliini 1 (Seq Id no 4):

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu 30 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu

Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ile Vai Glu s '

Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys 35 Asn 108727 11

Proinsuliini 1 vastaa kaavaa II, jossa X on Ihmisen insuliinin C-peptidi, Y on Thr (B30), R1 on Phe(Bl), 5 R2 on peptidi, jossa on 11 aminohappojäännöstä, R3 on Asn(A21) ja A2 - A20 on ihmisen insuliinin A-ketjun aminohapposekvenssi (aminohappojäännökset 2 - 20) ja B2 - B29 on ihmisen insuliinin B-ketjun aminohapposekvenssi (aminohappo pojäännökset 2 - 29).

Ekspressoitunut proinsuliini 1 kerääntyy E. coli -soluihin ja muodostaa kappaleita. Fermentoinnin päätyttyä solut erotetaan sentrifugoimalla ja liuotetaan tavanomaisen korkeapainehomogenoinnin avulla. Vapautuneet fuusio-15 proteiinihiukkaset eristetään sentrifugoimalla.

Liuotetaan 1 000 g proinsuliinin eristettyjä fuu-sioproteiinikappaleita (perustuen kuivaan massaan pakaste-kuivauksen jälkeen) 100 l:aan 8 M guanidiinihydrokloridi-liuosta, jonka pH-arvo on 10,8. Kun pieniä määrä sameutta 20 aiheuttavaa ainetta on sentrifugoitu pois, kirkas liuos sekoitetaan 900 l:aan vesipitoista kysteiiniliuosta (125 g kysteiinihydrokloridihydraattia) pH-arvon ollessa 10,8 ja : lämpötilan ollessa 4 °C. Insuliinipitoisen fuusioproteii- ·': nin osuus määritetään SDS-elektroforeesipyyhkäisyn avulla 25 (U. K. Lämli, Nature, osa 227, sivut 680 - 685, 1970). Se .·. on 15 %. Uudelleenkiertymisreaktion päätyttyä proinsulii- • nipitoisuus määritetään 105 g:sta reaktioseosta analyyttisen HPLC-analyysin avulla. Liuoksen pH säädetään arvoon 4,5 6 N HCl:n avulla ja vähäinen sameus poistetaan sentri- • * 30 fugoimalla. Kirkkaaseen liuokseen lisätään 30 kg HP-20-hartsia (Mitsubishi Chemical Industries Ltd., DUsseldorf, ,; Saksa). Suspensiota sekoitetaan hitaasti noin 4 tunnin ajan, kunnes proinsuliini l:tä ei ole havaittavissa jäljellä olevasta liuoksesta. Hartsi erotetaan suodattamalla 35 imun avulla ja pestään vedellä. Tuotteen desorptio tapah- j · 108727 I 12 i tuu liettämällä hartsi 50 Iraan 50-%:ista isopropanolin vesiliuosta. Suodattaminen ja inkuboiminen isopropanoli-liuoksen kanssa toistetaan kaksi kertaa. Kaavan 1 mukaisen proinsuliinin saanto on 103 g.

5 HPLC-analyysi

Liuotetaan 0,5 g proteiinia 40 mlraan liuosta, joka on 6 M guanidiinihydrokloridin suhteen, 50 mM tris-pusku-rin suhteen, pH-arvo 8,5, 5 mM etyleenidiamiinitetraetik-kahapon (EDTA) suhteen, l-%:inen 2-merkaptoetanolin suh- 10 teen, 10 mM ditioreitolin suhteen, 95 °C:n lämpötilassa 2 minuutin ajaksi ja sitten liuosta sentrifugoidaan 20 minuutin ajan kierrosnopeudella 14 000 g. Kirkkaasta jäännöksestä 0,02 ml lisätään korkeapainenestekromatografia-pylvääseen.

15 Pylväs: ®Nucleogel RP 300-5/46 (Macheray & Nagel,

Aachen, Saksa).

Gradientti: Puskuri A: 0,l-%:inen trifluorietikka-happo (TFA). Puskuri B: 0,09-%:inen TFA asetonitriilissä.

Lämpötila: 55 °C.

20 Kokonaisajoaika: 15 min.

Gradientille ovat tunnusomaista seuraavat puskurin . ί B määrät vastaavien ajoaikojen mukaan: ; 10 min 25 %, 12 min 60 %, 13 min 90 %, 15 min ; : 100 %.

·. 25 Virtaus: 1 ml/min.

Detektio: 215 nm.

Proinsuliinin retentioaika: 9 min.

Esimerkki 2

Fermentoimalla geneettisesti muunnettuja E. coli · 30 -soluja (E 0 347 781) valmistetaan proinsuliini 2, jolla > on seuraava aminohapposekvenssi: » f 1 - »

* I

1 1 1 1 I

I I

! ‘ I

I » 13 1 08727

Proinsuliini 2 (Seq Id no 5):

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr 5 Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Ile Glu Gly Arg Phe Val Asn Gin

His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly lie Val Glu Gin ' Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 10 Ekspressoitunut proinsuliini 2 kerääntyy E. coli -soluihin ja muodostaa usein kappaleita. Solujen liuottaminen tapahtuu kuten esimerkissä 1. Näin saadut proinsu-liinit saatetaan bromisyaanihajotuksen kohteeksi ja syntyy proinsuliini 3 (Seq Id no 7).

15 Prosinsuliini 3 vastaa kaavaa II, jossa X on Arg, I Y on Thr(B30), R1 on Phe(Bl), R2 on peptidi, jolla on 4 aminohappojäännöstä, 20 R3 on Asn(A21) ja A2 - A20 ja B2 - B29 vastaavat ihmisen insuliinin ' . A- ja B-ketjujen aminohapposekvenssiä.

Bromisyaanihajotuksen jälkeen proinsuliini 3:n pitoisuus määritetään SDS-elektroforeesin avulla kvantita- 25 tiivisesti pakastekuivatusta näytteestä, jossa on 9,2 % , ,' insuliinipitoista proteiinia. Kuten esimerkissä 1, ;* 1 000 g:aa proinsuliini 3:a inkuboidaan kysteiinihydroklo- ridihydraatin kanssa. Sen jälkeen määritetään 63 g:sta kaavan I mukaisen proinsuliinin pitoisuus kokonaisreak- » 30 tioannoksesta. Kuten esimerkissä 1, tuote adsorboidaan 35 kg:aan XAD-1600-hartsia (Rohm and Haas Company, Phila-. delphia, USA) ja erotetaan reaktioliuoksesta. Hartsin pe semisen ja tuotteen desorption jälkeen kaavan I mukaisen proinsuliinin pitoisuus määritetään käyttäen 56 g:aa.

> t 14 1 08727

Esimerkki 3

Fermentoimalla geneettisesti muunnettuja E. coli -soluja (E 0 489 780) valmistetaan proinsuliini 4, jolla on seuraava aminohapposekvenssi: 5 Proinsuliini 4 (Seq Id no 6):

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu ' Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Vai Glu Gin Cys 10 Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

Proinsuliini 4 vastaa kaavaa II, jossa X on Arg, Y on Thr, (B30), R1 on Phe(Bl), 15 r2 on peptidi, jossa on 11 aminohappoa, ! R3 on Asn (A21) ja A2 - A20 ja B2 - B29 vastaavat ihmisen insuliinin A- ja B-ketjujen aminohapposekvenssiä.

Solujen liuottamisen jälkeen homogenoidusta tuot-20 teestä saadaan fuusioproteiini sentrifugoimalla. Siitä käytetäään tuotteen pitoisuuden määrittämisen (15 %) jälkeen 1 000 g uudelleenkiertyrnisreaktioon, kuten esimerkissä 1. Uudelleenkiertymisaste reaktion lopussa määritetään, kuten esimerkissä 1 käyttäen 60 %:ia. Proinsuliinin saanto 25 on 108 g.

Sekvenssipöytäkirja Seq Id no 1

Sekvenssin laji: aminohappo (AS)

Sekvenssin pituus: 21 aminohappoa 30 Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn 20 35 15 1 08727

Seq Id no 2

Sekvenssin laji: aminohappo Sekvenssin pituus: 30 aminohappoa

Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 5 15 10 15

Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 {

Seq Id no 3 10 Sekvenssin laji: aminohappo

Sekvenssin pituus: 35 aminohappoa

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly 1 5 10 15

Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu 15 20 25 30 I Gin Lys Arg 35

Seq Id no 4 20 Sekvenssin laji: aminohappo

Sekvenssin pituus: 97 aminohappoa Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Vai Asn Gin His 15 10 15

Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu ; . 25 20 25 30

Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu 35 40 45

Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu 30 50 55 60

Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ile Vai Glu 65 70 75 80

Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys 35 85 90 95

Asn 16 1 08727

Seq Id no 5

Sekvenssin laji: aminohappo Sekvenssin pituus: 96 aminohappoa 5 Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu 15 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr , 20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Ile Glu Gly Arg Phe Vai Asn Gin 10 35 40 45

His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly 50 55 60

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Vai Glu Gin 15 65 70 75 80 j Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 90 95

Seq Id no 6 20 Sekvenssin laji: aminohappo

Sekvenssin pituus: 63 aminohappoa

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Vai Asn Gin His 1 5 10 15 25 Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu 20 25 30

Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Vai Glu Gin Cys 35 40 45

Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60

Seq Id no 7

Sekvenssin laji: aminohappo Sekvenssin pituus: 56 aminohappoa 17 1 08727

Ile Glu Gly Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai 15 10 15

Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro c 20 25 30

D

Lys Thr Arg Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu 35 40 45 ,Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 10

Claims (8)

1. Menetelmä proinsuliinin saamiseksi, jolla on kaava I 5 -=- X S-S ( A 6 ) | | (A20) HN-Gly- Cy*- Cy*- Cy*- Cy*- RS-0H (AI) I (A7) (All) I 10 1 ' | j r2-r'-Cys - Cy*- Y 15 (B1 ) (87) (B19) tunnettu siitä, että A) saatetaan reagoimaan proteiini, jolla on kaava II

20 R2 - R1 - B2 - B29 - Y - X - Gly - A2 - A20 - R3 (II), sellaisen määrän kanssa merkaptaania, että se tuottaa 2 -| 10 merkaptaanin -SH-jäännöstä kaavan II mukaisen proteii- . : nin kysteiinijäännöstä kohden, vähintään yhden kaotrooppi- : 25 sen apuaineen läsnä ollessa vesipitoisessa väliaineessa pH-arvon ollessa 10 - 11 ja kaavan II mukaisen proteiinin < » konsentraation ollessa 0,05 - 0,3 g/1 vesipitoista väliainetta, ja saatuun kaavan I mukaiseen prosinsuliiniin . B) sekoitetaan 3 - 50 g hydrofobista adsorbentti- 30 hartsia/1 vesipitoista väliainetta pH-arvon ollessa 4-7, > C) eristetään adsorbenttihartsi adsorboituneen, : kaavan I mukaisen proinsuliinin kanssa ja ,· D) kaavan I mukainen prosinsuliini desorboidaan ad- sorbenttihartsista; 35 jolloin kaavassa I ja II 108727 X on a) geneettisesti koodattava aminohappojäännös tai b) peptidi, jolla on 2 - 35 aminohappojäännöstä, Y on geneettisesti koodattava aminohappojäännös, R1 on fenyylialaniinijäännös tai kovalenttinen si- 5 dos, R2 on a) vetyatomi, b) geneettisesti koodattava aminohappojäännös tai c) peptidi, jolla on 2 - 45 aminohappo jäännöstä, R3 on geneettisesti koodattava aminohappojäännös ja 10 jäännökset A2 - A20 vastaavat ihmisen tai eläimen insuliinin tai insuliinijohdannaisen A-ketjun aminohapposekvenssiä ja jäännökset B2 - B29 vastaavat ihmisen insuliinin tai eläimen insuliinin tai insuliinijohdannaisen B-ketjun aminohapposekvenssiä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään proteiinia, jolla on kaava II, jossa X on peptidi, jolla on ihmisen insuliinin C-ketjun aminohapposekvenssi, 20. on aminohappojäännös, joka on peräisin ryhmästä, joka käsittää jäännökset Ala, Thr tai Ser, ' R1 on aminohappojäännös Phe, : : R2 on a) vetyatomi tai b) peptidi, jolla on 2 - 25 : : aminohappojäännöstä, ! : 25 R3 on aminohappojäännös, joka on peräisin ryhmästä, ; joka käsittää jäännökset Asn, Ser tai Gly, ja jäännökset A2 - A20 ja B2 - B29 vastaavat ihmisen insuliinin A- ja B-ketjujen aminohapposekvenssiä.

, 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että käytetään proteiinia, jolla on kaava II, jossa X on peptidi, jolla on 2 - 35 aminohappojäännöstä, jolloin peptidin alussa ja lopussa on kaksi emäksistä ami-. nohappojäännöstä, erityisesti Arg ja/tai Lys, 35. on aminohappojäännös Thr, 108727 R1 on aminohappojäännös Phe, R2 on a) vetyatomi tai. b) peptidi, jolla on 2 - 15 aminohappojäännöstä, jolloin peptidin karboksyylipäässä on aminohappojäännös Met tai Arg,

4. Yhden tai useamman patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että merkap- 10 taanina käytetään kysteiiniä tai kysteiinihydrokloridihyd- raattia.

5. Yhden tai useamman patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetemä, tunnettu siitä, että hydrofobisena adsorbenttihartsina käytetään silloitettua polysty- 15 rolia tai polystyrolista ja divinyylibentsyylistä koostu vaa sekapolymeeria.

5 R3 on aminohappojäännös Asn, ja jäännökset A2 - A20 ja B2 - B29 vastaavat ihmisen insuliinin A- ja B-ketjujen aminohapposekvenssiä.

6. Yhden tai useamman patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan I mukainen proinsuliini desorboidaan adsorbenttihartsista 20 isopropanolin avulla. t t » 108727