JP4314332B1 - 高発現分泌インスリン前駆体を含む融合タンパク質、それをコードするｄｎａおよびインスリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、遺伝子組み換えインスリンを製造するための高発現分泌インスリン前駆体を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡを用いたインスリンの製造方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、遺伝子組み換えインスリンを製造するための高発現分泌インスリン前駆体を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡを用いたインスリンの製造方法に関する。

インスリンは生体内の血糖値を低下させる唯一のホルモンである。何らかの原因でインスリンの分泌機能が低下すると、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）に至る可能性がある。インスリンは、インスリン分泌機能低下を有する患者の治療に必須の医薬である。

ヒトのインスリンは、２１個のアミノ酸からなるＡ鎖と、３０個のアミノ酸からなるＢ鎖とからなるポリペプチドであり、Ａ鎖内に１個、Ａ鎖とＢ鎖との間に２個のジスルフィド結合を有する。インスリンはまず、膵臓ランゲルハンス島のＢ細胞で、２４個のアミノ酸からなるシグナルペプチド（ＳＰ）、Ｂ鎖（Ｂ）、３１個のアミノ酸からなるＣペプチド（Ｃ）、Ａ鎖（Ａ）がこの順序で直列に並んだプレプロインスリン（ＳＰ−Ｂ−Ｃ−Ａ）として、細胞内のリボソームで合成される。プレプロインスリンは、小胞体内に入る際にシグナルペプチドが切り離されて、プロインスリン（Ｂ−Ｃ−Ａ）となる。小胞体内でプロインスリンの鎖内にジスルフィド結合が生じて、プロインスリンが立体構造をとるようになる。その後、プロホルモン変換酵素であるＰＣ１／３によってＢ−Ｃ結合が切断され、ＰＣ２によってＣ−Ａ結合が切断される。最後に、ＰＣ１／３の切断時にＢ鎖のＣ末端に残った２個の塩基性アミノ酸がカルボキシペプチダーゼＨにより切り取られて、機能的なインスリンとなる。

治療用インスリンは、当初はウシやブタなどの動物膵臓からの抽出品であったが、現在では、ほとんどが遺伝子組み換えインスリンである。

遺伝子組み換えインスリンは、従来から、プロインスリンをコードするＤＮＡを含むベクターで微生物を形質転換してプロインスリンを発現させ、ジスルフィド結合を形成させ、そしてインスリンへの変換操作を行うことにより生成されている。そのような製造方法はこれまでにいくつか開発されている。例えば、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社は大腸菌を用いてプロインスリンを発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでジスルフィド結合を形成させ、トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢでＣペプチドを切り出してインスリンを製造する方法（特許文献１および２）を開発している。

また、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社は、Ｂ鎖とＡ鎖とを塩基性のアミノ酸２個で連結したミニプロインスリンを酵母で発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでトリプシン処理を行うことにより、インスリンを製造する方法（特許文献３〜５）を開発している。この方法は、既にジスルフィド結合が形成されたインスリン前駆体が発現分泌されるためにｉｎ ｖｉｔｒｏでジスルフィド形成の操作を必要としないという点で優れている。さらに、インスリン前駆体が培地中に分泌されるために、分離精製が容易である。

遺伝子組み換えインスリンの新規な製造方法の開発はその後も積極的に進められ、ヘキスト社（特許文献６〜１２）やＢＩＯ−ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＧＥＮＥＲＡＬ ＣＯＲＰ．（特許文献１３）が大腸菌を用いた新規な製造方法を開発している。

このように、遺伝子組み換えインスリンの製造方法に関しては複数のアプローチがあるが、発現効率、ジスルフィド結合の形成効率、インスリンへの変換方法の点で、さらなる改良が行われている。

遺伝子組み換えタンパク質を生産する宿主としては、操作の容易性および工業的生産に向いていることから、とりわけ微生物が最もよく利用されている。特に、大腸菌および酵母はよく知られた宿主である。近年開発されたブレビバチルス属のブレビバチルス・ブレビス（Brevibacillus brevis）を用いた遺伝子組み換えタンパク質の発現系は、機能的な状態ではジスルフィド結合を有するポリペプチド（ヒト上皮細胞増殖因子）が、培地中に活性を有する状態で、即ちジスルフィド結合が形成された状態で大量に分泌発現されることから、遺伝子組み換えタンパク質の大量生産系として注目されている（特許文献１４および１５、非特許文献１〜４）。

インスリン前駆体の発現がブレビバチルス・ブレビスの遺伝子発現系において試みられ、プロインスリン（特許文献１６）および変異型プロインスリン（特許文献１７）の発現分泌法が開発された。これにより、ブレビバチルス・ブレビスを宿主とした遺伝子組換えインスリンの生産の可能性が示された。

その後、この発現系を用いたインスリン生産の工業化を可能にするために、プロテインジスルフィドイソメラーゼの共発現により発現量を増やすための工夫がなされている（特許文献１８）。
特公平１−４８２７８号公報 特許第２６３４１７６号公報 特公平７−１２１２２６号公報 特公平８−８８７１号公報 特許第２５５３３２６号公報 特開平２−１９５８９６号公報 特開平２−２２５４９８号公報 特開平２−２３３６９８号公報 特開平３−１６９８９５号公報 特開平４−２５８２９６号公報 特開平６−２２８１９１号公報 特開平７−２６５０９２号公報 国際公開第９６／２０７２４号パンフレット 特許第２０８２７２７号公報 特開昭６２−２０１５８３号公報 特許第３３１３０８３号公報 特許第３４０６２４４号公報 国際公開第０１／０６８８８４号パンフレット Yamagata, H.ら, J. Bacteriol. 169, 1239−1245 (1987) 鵜高重三、日本農芸化学会誌61, 669-676 (1987) Takao, M. ら, Appl. Microbiol. Biotechnol.30, 75-80 (1989) Yamagata, H.ら , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3589-3593 (1989)

本発明は、組み換えインスリンの工業的生産を可能にするために、特にバチルス属またはブレビバチルス属細菌を用いた遺伝子発現系でさらなる高発現分泌を可能にする、最適なインスリン前駆体の配列を提供することを目的とする。

そこで、本出願人は、試行錯誤を重ね、インスリン前駆体を含む融合タンパク質において、バチルス属またはブレビバチルス属細菌の細胞壁タンパク質（ＣＷＰ）のＮ末端から５、６、７または１２個のアミノ酸残基からなる配列（リーダーペプチド）の挿入、リーダーペプチドとインスリンＢ鎖との間のリンカーペプチドの挿入、インスリンＢ鎖（Ｃ末端Ｔｈｒの除去）とＡ鎖との融合体の使用、インスリンＢ鎖とＡ鎖との間へのリンカーペプチドの挿入などにより、バチルス属またはブレビバチルス属の発現系でインスリン前駆体の高発現分泌を可能にし、本発明を完成するに至った。さらに、その前駆体からインスリンが高収量で製造できることを確認した。

すなわち、本発明は以下のものを提供する。

（１）バチルス属またはブレビバチルス属細菌の細胞壁タンパク質（ＣＷＰ）の１つであるＭＷＰ由来のシグナルペプチド、バチルス属またはブレビバチルス属細菌のＣＷＰ由来の５〜７もしくは１２アミノ酸からなるリーダーペプチド、以下の一般式：
（Ａｓｐ、ＬｅｕまたはＧｌｙ）（Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＬｅｕ）（Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＰｒｏ）（ＡｒｇもしくはＡｌａまたはなし）Ａｒｇ（配列番号５１または５２）
により示されるアミノ酸配列を有するリンカーペプチド、およびインスリン前駆体のアミノ酸配列がこの順序で連結された融合タンパク質をコードするＤＮＡ。

（２）上記リンカーペプチドが配列番号１〜６のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する、上記（１）に記載のＤＮＡ。

（３）上記リーダーペプチドがＭＷＰ由来のものである、上記（１）または（２）に記載のＤＮＡ。

（４）前記インスリン前駆体が配列番号８または９により示されるアミノ酸配列を有する、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のＤＮＡ。

（５）前記融合タンパク質が、配列番号１０〜１８のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のＤＮＡ。

ここで、配列番号１０〜１８のアミノ酸配列は、以下の式の構造を有する。

式：
ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号１０）
ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号１１）
ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＡｌａＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号１２）
ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＧｌｙＳｅｒＰｒｏＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号１３）
ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号１４）
ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＬｅｕＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号１５）
ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＡｓｎＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号１６）
ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ１２−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号１７）
ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ−ＡｒｇＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇ−Ａｃｈａｉｎ（配列番号１８）
［式中、ＭＷＰｓｐはＭＷＰシグナルペプチド、ＭＷＰｍｐはＭＷＰ由来リーダーペプチド、ＢｃｈａｉｎはインスリンＢ鎖、Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）はＣ末端のＴｈｒを欠いたインスリンＢ鎖、ＡｃｈａｉｎはインスリンＡ鎖である。］
（６）配列番号１９〜２７のいずれか１つにより示される塩基配列を有する、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のＤＮＡ。

（７）上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含むベクター。

（８）前記ＤＮＡが、細菌由来のプロモーター配列の下流に機能的に連結されている、上記（７）に記載のベクター。

（９）上記プロモーターがバチルス属またはブレビバチルス属細菌由来である、上記（８）に記載のベクター。

（１０）プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）をコードするＤＮＡをさらに含む、上記（７）〜（９）のいずれか１つに記載のベクター。

（１１）上記（７）〜（１０）のいずれか１つに記載のベクターを含む宿主細胞。

（１２）前記宿主細胞がバチルス属またはブレビバチルス属細菌である、上記（１１）に記載の宿主細胞。

（１３）前記細菌がブレビバチルス・ブレビスである、上記（１２）に記載の宿主細胞。

（１４）上記（１１）〜（１３）のいずれか１つに記載の宿主細胞を培養するステップ、宿主細胞から所望の融合タンパク質を発現させるステップ、発現されたポリペプチドを細胞または培地中から回収するステップを含む、インスリンの製造方法。

（１５）回収されたポリペプチドを酵素的に処理するステップをさらに含む、上記（１４）に記載の方法。

（１６）前記酵素処理がトリプシンによる処理である、上記（１５）に記載の方法。

（１７）前記ポリペプチドを培地から回収する、上記（１４）〜（１６）のいずれか１つに記載の方法。

（１８）配列番号１０〜１８のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質。

定義
本明細書中で用いる「バチルス属またはブレビバチルス属細菌」との用語は、グラム陽性桿菌であるバチルス属またはブレビバチルス属に分類されるいかなる細菌をも指す。そのようなものとしてはブレビバチルス・ブレビス、バチルス・サブティリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・ポリミキサなどが挙げられ、好ましくはブレビバチルス・ブレビスである。

本明細書中で用いる「ＭＷＰ」との用語は、三層からなる細胞壁を有する細菌の細胞壁タンパク質（ＣＷＰ）に含まれる中央壁タンパク質（middle wall protein）を指す。

本明細書中で用いる「インスリン前駆体」との用語は、適切な処理（例えば酵素処理）により機能的なインスリンへと変換し得る、少なくともＢ鎖またはＣ末端のＴｈｒを欠いたＢ鎖およびＡ鎖を含むポリペプチドを指す。

本発明により、新規な融合タンパク質を用いることによって、従来のバチルス属でのインスリン前駆体の発現事例よりも１．５〜３倍高い発現分泌量での組み換えインスリンの製造を可能にした。該組み換えインスリン前駆体は、インスリンへの変換が可能であり、かつ発現分泌に際してインスリンの生物活性に必須であるジスルフィド結合が正確に形成される。

ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎの塩基配列（配列番号１９）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎのアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。 ＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎの塩基配列（配列番号２０）を示す。 ＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎのアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＡｌａＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎの塩基配列（配列番号２１）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＡｌａＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎのアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＧｌｙＳｅｒＰｒｏＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎの塩基配列（配列番号２２）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＧｌｙＳｅｒＰｒｏＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎのアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎの塩基配列（配列番号２３）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎのアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＬｅｕＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎの塩基配列（配列番号２４）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＬｅｕＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号１５）のアミノ酸配列を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＡｓｎＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎの塩基配列（配列番号２５）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＡｓｎＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎのアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ１２−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎの塩基配列（配列番号２６）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ１２−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎのアミノ酸配列（配列番号１７）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ−ＡｒｇＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇ−Ａｃｈａｉｎの塩基配列（配列番号２７）を示す。 ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ−ＡｒｇＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇ−Ａｃｈａｉｎのアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。 融合ＤＮＡをバチルス・ブレビスの発現ベクター（ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５）に組み込む方法の概略図を示す。 融合タンパク質の発現量を示す。 Ｄｅｓ−Ｔｈｒインスリンのペプチドマッピングを示すＨＰＬＣ溶出パターンである。 成熟インスリンのＨＰＬＣ溶出パターンを示す。

本発明によって、上記融合タンパク質（以下、場合により「ミニプロインスリン」または「ＭＩＮＩＰＩＮＳ」と記す。）をコードするＤＮＡをバチルス属またはブレビバチルス属細菌で発現させることにより、インスリン前駆体が培地中に高量分泌される。そして、これを分離精製して、トリプシンによる切断、およびＢｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を用いた場合にはＴｈｒ付加を行うことにより、天然型の所望の構造を有するインスリンを得ることができる。

インスリン前駆体を高発現分泌させるための第一の条件は、上記融合タンパク質において、分泌に必須なシグナルペプチドとインスリン前駆体との間に特定のアミノ酸配列からなるリーダーペプチドとリンカーペプチドを配置することである。

本発明の実施態様によれば、インスリン前駆体の高発現分泌に好適なリーダーペプチドはバチルス属またはブレビバチルス属細菌の細胞壁タンパク質（ＣＷＰ）のＮ末端のアミノ酸残基５、６、７または１２個である。ＣＷＰとしては、以下のものに限定されないが、たとえばブレビバチルス・ブレビス株、４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４：特開昭６０−５８０７４号公報、特許文献１５）、ＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７：特開平４−２７８０９１号公報）等に由来のものを用いることができる。リーダーペプチドとしては、具体的には、以下に例示する配列を用いることができる（該当する配列を引用した文献を括弧内に示す）：
ＭＷＰｍｐ１２：ＡｌａＧｌｕＧｌｕＡｌａＡｌａＴｈｒＴｈｒＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＭｅｔ（配列番号２８；Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 7: 278-311, 1989）
ＯＷＰｍｐ１２：ＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｓｐＧｌｙＩｌｅＴｙｒＩｌｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＩｌｅ（配列番号２９；J.Bacteriol., 170: 935-945, 1988）
ＨＷＰｍｐ１２：ＡｌａＧｌｕＡｓｐＴｈｒＴｈｒＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＭｅｔＡｓｐＡｌａ（配列番号３０；J.Bacteriol., 172: 1312-1320, 1990）。

Ｎ末端からのアミノ酸の残基数は、当該融合タンパク質が高発現される限り限定されないが、好適には５、６、７または１２個である。他の例は、８、１０または１１個である（特許文献１６）。

インスリン前駆体のＢ鎖、もしくはＣ末端のＴｈｒを欠いたＢ鎖（Ｂ鎖（ｄｅｓＴｈｒ））の直前および任意にＢ鎖とＡ鎖との間に配置されるリンカーペプチドは、２つの機能を有する。１つは、インスリン前駆体からインスリンへの変換時にトリプシンで切断される部位としての機能である。もう１つは、インスリン前駆体を高発現分泌させることである。トリプシンで切断される部位は塩基性アミノ酸のＡｒｇまたはＬｙｓである。したがって、好ましくはＢ鎖もしくはＢ鎖（ｄｅｓＴｈｒ）直前のリンカーペプチドのＣ末端、Ｂ鎖とＡ鎖との間のリンカーペプチドのＮ末端とＣ末端には、Ａｒｇが１個または２個含まれる。あるいは、Ｃ末端からＴｈｒを欠いたＢ鎖が直接Ａ鎖と連結されている状態では、Ｂ鎖のＣ末端から２番目のＬｙｓが切断部位となる。

１個以上のアミノ酸残基からなるリンカーペプチドは、一般的にはタンパク質の中で機能ドメインの間に存在しており、それぞれのドメインの機能に影響を及ぼすことなくドメインを連結する。本発明では、リンカーペプチドは、リーダーペプチドとＢ鎖またはＢ鎖（ｄｅｓＴｈｒ）との間、および任意にＢ鎖とＡ鎖との間にそれぞれトリプシン切断部位を介して配置され、かつＢ鎖とＡ鎖との間および／またはＡ鎖内のジスルフィド結合、トリプシンの切断、ならびに当該融合タンパク質の発現を容易にするのに役立っている。そのような機能を満たす限り、リンカーペプチドは１個以上のアミノ酸でよく、特定のアミノ酸配列である必要はない。好適には、そのようなリンカーペプチドは、（ｉ）リーダーペプチドとＢ鎖との間に位置するものとしては、一般式：（Ａｓｐ、ＬｅｕまたはＧｌｙ）（Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＬｅｕ）（Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＰｒｏ）（ＡｒｇもしくはＡｌａまたはなし）Ａｒｇ（配列番号５１または５２）により示されるアミノ酸配列、より好適には、ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ（配列番号１）、ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＡｌａＡｒｇ（配列番号２）、ＧｌｙＳｅｒＰｒｏＡｒｇ（配列番号３）、ＡｓｐＬｅｕＡｓｐＡｒｇＡｒｇ（配列番号４）、ＡｓｐＡｓｎＡｓｐＡｒｇＡｒｇ（配列番号５）、ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇ（配列番号６）であり、（ｉｉ）Ｂ鎖とＡ鎖の間に位置するものでは、ＡｒｇＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇ（配列番号７）である。また、好適には、Ｂ鎖とＡ鎖との間のリンカーペプチドは、Ｂ鎖（ｄｅｓＴｈｒ）の場合には存在しなくともよい。

本発明のＤＮＡは、当業界で公知の技術を組み合わせて作製することができる。たとえば、構成要素の各ＤＮＡ配列を化学的合成法またはクローニング法によって個々に調製し、これら構成要素をリガーゼを用いて順次連結し、ＰＣＲ増幅法を組み合わせて目的のＤＮＡを作製することができる。具体的には実施例を参照することによってその詳細が理解されるが、個々の技術として、Maniatis, T.ら、Molecular Cloning 第２版, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)、Innis, M.A.ら, PCR Protocols, A guide to methods and applications, Academic Press (1990)等に記載の一般的技術が使用可能である。

インスリンのＢ鎖、Ｃペプチド、Ａ鎖を含むヒトプロインスリンをコードするＤＮＡは、市販のヒト膵臓のｍＲＮＡから、市販のｃＤＮＡファーストストランド合成キット等を用いて取得することができる。さらに、既知のＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０００２０７）に基づいて、市販のＤＮＡ合成機を用いてプライマーとなる短鎖ＤＮＡを合成できれば、一般的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＢ鎖、Ａ鎖などをコードする所望のＤＮＡ断片を増幅することができる。この場合、好ましくは、ＤＮＡの変性（９４℃、３０秒〜２分）、プライマーとのアニーリング（５５℃、３０秒〜１分）、および伸長反応（７２℃、３０秒〜１分）を１サイクルとして２０サイクル以上繰り返す。

本発明はさらに、本発明の上記ＤＮＡを含むベクターを提供する。使用可能なベクターは、本発明のＤＮＡを組み込むことのできる適当な挿入部位（すなわち制限酵素部位）を有していること、該ＤＮＡを宿主細胞内で発現可能であること、さらに該宿主細胞内で自律的に複製可能であること、等の性質を少なくとも有している必要がある。ベクターは、プロモーター、複製開始点、ターミネーター配列を含むことができ、さらに薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子等の選択マーカーを含んでもよい。本発明の実施態様によれば、当該融合タンパク質をコードするＤＮＡはバチルス属またはブレビバチルス属由来のプロモーター領域を含有するＤＮＡ配列の３’末端に機能的に連結される。本発明において「機能的に連結される」とは、それぞれの機能的塩基配列（プロモーター等）がその機能を発揮し得るように連結されていることを意味する。使用し得るプロモーターとしては、解糖系プロモーター、組織特異的プロモーター、ウイルスプロモーター、誘導性プロモーターなどが挙げられる。プロモーターは、好ましくはブレビバチルス・ブレビス４７由来のＭＷＰプロモーター(特公平１−５８９５０号公報、特公平７−１０８２２４号公報）、ブレビバチルス・ブレビスＨＰＤ３１由来のＨＷＰプロモーター（特開平４−２７８０９１号公報、特開平６−１３３７８２号公報)等であるが、これらに限定されない。選択マーカーの例としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。

本発明のベクターとしては、適合性の原核細胞または真核細胞、例えば細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物および動物細胞などの宿主細胞中に維持され、そこから目的のタンパク質が発現されることが可能ないずれかのＤＮＡベクターが挙げられる。好ましくは、本発明のベクターはバチルス属またはブレビバチルス属細菌で複製可能なプラスミドである。以下のものに限定されないが、たとえば、ｐＮＵ２００、ｐＨＹ５００（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3589−3593, 1989）、ｐＨＹ４８３１（J. Bacteriol., 169: 1239-1245, 1987）、ｐＮＵ１００（Appl. Microbiol. Biotechnol., 30: 75-80, 1989）、ｐＮＵ２１１（J. Biochem., 112: 488-491, 1992）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７−１７０９８４号公報）、ｐＨＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＴ２１０（特開平６−１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５（Appl. Microbiol. Biotechnol., 42: 358-363, 1994）が使用可能である。本発明の具体例では、図１９に示すような構築法で発現ベクターｐＮＵ−ＭＩＮＩＰＩＮＳ〜ｈＰＤＩ＊を作製することができる。

本発明は、上記ＤＮＡに加えて、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）をコードするＤＮＡをさらに含むベクターを提供する。上記で具体例として挙げた発現ベクターｐＮＵ−ＭＩＮＩＰＩＮＳ〜ｈＰＤＩ＊は、ＰＤＩ遺伝子を担持しているため、そのようなベクターの構築に有用である。そのようなベクターからは、ＰＤＩ遺伝子と目的の融合タンパク質とが共発現される。

ＰＤＩを所望のタンパク質と共発現させることの利点は、以下のとおりである。例えば哺乳動物由来の機能的ポリペプチドを細菌発現系で発現させようとする場合、細菌発現系では、当該ポリペプチドが機能的なフォールディングを有するために必要なジスルフィド結合が正確に形成されないことが多くある。そのような、細菌発現系では正確にジスルフィド結合が形成されないか、または形成されにくいポリペプチドの発現に際して、ＰＤＩを共発現させることにより、目的とするポリペプチドとＰＤＩとが共存する環境が構築され、それにより、正確なジスルフィド結合を有し、したがって所望の機能を有するポリペプチドの生産効率を高めることができる。

そのような試みについては国際公開第ＷＯ０１／０６８８８４号に詳細に記載されている。

本発明において、ＰＤＩをコードするＤＮＡとしては、ヒトをはじめとする哺乳動物、昆虫、酵母などの真核生物由来のものを使用することができる。哺乳動物由来のＰＤＩ遺伝子の塩基配列は、例えばヒト（ＮＭ＿０００９１８）、マウス（ＮＭ＿０１１０３２）、ラット（ＮＭ＿０１２９９８）のものがデータベースに登録されている。また、酵母由来ＰＤＩは、例えば、ＷＯ９８／０３５０４９などに記載されている。

上記のようなＰＤＩの共発現系を用いるための好適な宿主は、バチルス属またはブレビバチルス属の細菌であり、最も好ましい宿主はブレビバチルス・ブレビスである。

本発明はさらにまた、上記定義のベクターで形質転換された、例えば細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物および動物細胞などの宿主細胞を提供する。好ましくは該宿主細胞はバチルス属またはブレビバチルス属細菌である。宿主としてのバチルス属またはブレビバチルス属細菌としては、以下のものに限定されないが、たとえばブレビバチルス・ブレビス株、４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４：特開昭６０−５８０７４号公報、特許文献１５）、４７Ｋ（特開平２−２５７８７６号公報）、３１−ＯＫ（特開平６−２９６４８５号公報）およびＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７；特開平４−２７８０９１号公報）等を挙げることができる。

上記のようにして得られた発現ベクターを、コンピテントな宿主細胞に導入し、発現可能な条件下で適切な培地中にて該細胞を培養して、目的の組換えポリペプチドを細胞外または細胞内、好ましくは細胞外に産生させる。続いて常法によりポリペプチドを回収し精製する。

ベクターの導入方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション（Methods in Enzymol., 217: 23-33, 1993）、スフェロプラスト融合法、プロトプラスト融合法、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等を例示することができる。

発現ベクターを有する前記細胞の培養については、当業者は細胞の種類に応じて公知の適切な培地および培養条件を選択しうる。例えば、宿主細胞がバチルス属またはブレビバチルス属細菌の場合、宿主細胞の培養は、Ｔ２培地中で３７℃にて１日間培養し、その後、Ｔ２培地中の菌懸濁液の一部をＭ−５ＹＣ培地に移し、該培地を３０℃にて４日間振とう培養することを含む。

細胞外からのポリペプチドの回収は、例えば、細胞を培養した培地から行うことができる。細胞内からのポリペプチドの回収は、例えば、遠心分離により細胞を回収し、該細胞を破壊して該ポリペプチドを回収することにより行うことができる。

また、得られたポリペプチドの精製は、たとえばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動等の方法を単独で、または組合わせて実施することができる。

上記で得られたポリペプチドは、次いで、トリプシン処理によりｄｅｓＴｈｒ−インスリンとし、さらにｔｅｒｔ−ブチル−Ｔｈｒ存在下でのトリプシン処理を施すことによりインスリンを得ることができる。従って、本発明はさらに、上記のように形質転換されたバチルス属またはブレビバチルス属細菌を培地に培養し、菌体外にインスリン配列を含むポリペプチドを蓄積させ、回収されたポリペプチドをトリプシン処理し、インスリンを得ることを含む、インスリンの製造方法を提供する。

このようにして得られた組換えインスリンは天然型のインスリンと全く同一のジスルフィド結合、ＨＰＬＣ溶出パターンを有しており、インスリン依存型糖尿病の治療用医薬品として有用である。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これら実施例により本発明が限定されるものではない。

融合タンパク質をコードするＤＮＡを作製するにあたっては、ＰＣＲ反応（polymerase chain reaction）で増幅したＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応で連結する手法を採用した。本文中、ＭＷＰｓｐはＭＷＰタンパク質のシグナルペプチドを意味し、ＭＷＰｍｐはＭＷＰ成熟タンパク質のＮ末端ペプチドを意味し、後に続く数字はＮ末端からのアミノ酸の数を表す。

実施例Ｉ
１．各種ＤＮＡ断片の取得
（１）ＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５の取得
ａ．鋳型ＤＮＡ
ブレビバチルス・ブレビス（４７−５Ｑ株）から、公知の方法（Molecular Cloning 第２版, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)）により抽出したゲノムＤＮＡ（８４０ｎｇ）
ｂ．プライマー
順方向プライマー：５’−ＡＣＡＣＧＣＧＣＴＴＧＣＡＧＧＡＴＴＣＧ−３’（配列番号３１）
逆方向プライマー：５’−ＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣ−３’（配列番号３２）
プライマーは、Yamagata, H.ら（J. Bacteriol.,169, 1239-1245, 1987）およびTsuboi, A.ら（J. Bacteriol.,170, 935-945, 1988）により決定されたＭＷＰタンパク質の塩基配列をもとに有機化学合成し、最終濃度０．１μｍｏｌ／Ｌとなるように加えた。

ｃ．Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
市販の製品（GIBCO BRL社製）を、反応あたり５Ｕ加えた。

ｄ．その他
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（最終濃度２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８）、ＭｇＣｌ_２（最終濃度２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ；それぞれ最終濃度５０μｍｏｌ／Ｌ）を加えた。

ａ〜ｄを反応液量１００μＬとして０．５ｍＬチューブに入れ、公知の方法（Innis, M. A.ら、PCR Protocols, A guide to methods and applications、Academic Press、(1990)）でＰＣＲ反応（変性：９４℃、１分間；アニーリング：５０℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、１分間を１サイクルとして３０サイクル）を行った。ＰＣＲ反応終了後、反応液をフェノールで濃縮してから０．８％のアガロースゲルにアプライして通常条件下で電気泳動を行い、ミリポア社のウルトラフリーＣ３ＨでアガロースゲルからＰＣＲ産物、即ち、ＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５を回収した。回収したＰＣＲ産物はフェノール抽出後、エタノール沈殿して真空乾燥し、適量の蒸留水に溶かした。ＤＮＡブランティングキット（宝酒造）を使用して、取り扱い説明書に準じて平滑末端化反応を行った。

（２）ＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６の取得
以下の点以外は（１）と同様な手順に従って、平滑末端化したＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６を取得した。

・逆方向プライマー、５’−ＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号３３）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性：９４℃、１分間；アニーリング：５０℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

（３）ＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７の取得
以下の点以外は（１）と同様な手順に従って平滑末端化したＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７を取得した。

・逆方向プライマー、５’−ＡＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号３４）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性温度：９４℃、１分間；アニーリング：５０℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

（４）ＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ１２の取得
以下の点以外は（１）と同様な手順に従って、平滑末端化したＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ１２を取得した。

・逆方向プライマー、５’−ＣＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＧＴ−３’（配列番号３５）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性温度：９４℃、１分間；アニーリング：５０℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

（５）ＤＮＡ断片プロインスリンの取得
以下の点以外は（１）と同様な手順に従って、平滑末端化したＤＮＡ断片プロインスリンを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、ヒトプレプロインスリンＤＮＡを組み込んだプラスミドベクター１０ｎｇを用いた。ヒトプレプロインスリンＤＮＡを組み込んだプラスミドベクターの取得は次のようにして行った。市販のヒト膵臓ｍＲＮＡ（CLONTECH社製）から、ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア社）を用い、取り扱い説明書に従ってヒト膵臓ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、Bell, G. I.ら（Nature, 282, 525-527, (1979)）により決定されたヒトプレプロインスリン遺伝子の塩基配列をもとに合成された順方向プライマー、５’−ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＣＧＣＣ−３’（配列番号３６）および逆方向プライマー、５’−ＣＴＡＧＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣ−３’（配列番号３７）を用いてＰＣＲ反応（条件：９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１分間を１サイクルとして３５サイクル繰り返す）を行い、得られたＰＣＲ産物、即ち、ヒトプレプロインスリンＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega社製）にクローニングした。

・プライマーとして、順方向プライマー、５’−ＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号３８）、逆方向プライマー、５’−ＣＴＡＧＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣ−３’（配列番号３７）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性：９４℃、１分間；アニーリング：４７℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

（６）ＤＮＡ断片ＤＧＤＲ−Ｂｃｈａｉｎ−Ｒの取得
以下の点以外は（１）と同様な手順に従って、平滑末端化したＤＮＡ断片ＤＧＤＲ−Ｂｃｈａｉｎ−Ｒを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、（５）より得られたプロインスリンＰＣＲ産物１０ｎｇを用いた。

・プライマーとして、順方向プライマー、５’−ＧＡＣＧＧＴＧＡＴＣＧＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号３９）および逆方向プライマー、５’−ＧＣＧＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡ−３’（配列番号４０）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性：９４℃、１分間；アニーリング：５２℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

（７）ＤＮＡ断片ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）の取得
以下の点以外は（１）と同様な手順に従って、平滑末端化したＤＮＡ断片ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得し、さらにリン酸化反応（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニッポンジーン）を使用し、方法は取り扱い説明書に準じた）を行い、リン酸化したＤＮＡ断片ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を得た。

・鋳型ＤＮＡとして、（５）より得られたプロインスリンＰＣＲ産物１０ｎｇを用いた。

・プライマーとして、順方向プライマー、５’−ＧＡＣＧＧＴＧＡＴＣＧＴＣＧＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号４１）および逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性温度：９４℃、１分間；アニーリング：５２℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

（８）ＤＮＡ断片ＤＬＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）の取得
以下の点以外は（１）と同様な手順に従って、平滑末端化したＤＮＡ断片ＤＬＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、（５）より得られたプロインスリンＰＣＲ産物１０ｎｇを用いた。

・プライマーとして、順方向プライマー、５’−ＧＡＣＴＴＧＧＡＴＣＧＴＣＧＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号４３）および逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性：９４℃、１分間；アニーリング：５２℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

（９）ＤＮＡ断片ＤＮＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）の取得
以下の点以外は（１）と同様な手順に従って、平滑末端化したＤＮＡ断片ＤＮＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、（５）より得られたプロインスリンＰＣＲ産物１０ｎｇを用いた。

・プライマーとして、順方向プライマー、５’−ＧＡＣＡＡＴＧＡＴＣＧＴＣＧＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号４４）および逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性温度：９４℃、１分間；アニーリング：５２℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

（１０）ＤＮＡ断片ＬＮＳＡＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）の取得
以下の点以外は（１）と同様な手順に従って、平滑末端化したＤＮＡ断片ＬＮＳＡＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、（５）より得られたプロインスリンＰＣＲ産物１０ｎｇを用いた。

・プライマーとして、順方向プライマー、５’−ＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＣＴＣＧＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号４５）および逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性：９４℃、１分間；アニーリング：５２℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

（１１）ＤＮＡ断片ＧＳＰＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）の取得
以下の点以外は（１）と同様な手順に従って、平滑末端化したＤＮＡ断片ＧＳＰＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、（５）より得られたプロインスリンＰＣＲ産物１０ｎｇを用いた。

・プライマーとして、順方向プライマー、５’−ＧＧＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号４６）および逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３（配列番号４２）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性：９４℃、１分間；アニーリング：５２℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

（１２）ＤＮＡ断片Ａｃｈａｉｎの取得
以下の点以外は（１）と同様な手順に従って、平滑末端化したＤＮＡ断片Ａｃｈａｉｎを取得し、さらにリン酸化反応（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニッポンジーン社製）を使用し、方法は取り扱い説明書に準じた）を行い、リン酸化したＤＮＡ断片Ａｃｈａｉｎを得た。

・鋳型ＤＮＡとして、（５）より得られたプロインスリンＰＣＲ産物１０ｎｇを用いた。

・プライマーとして、順方向プライマー、５’−ＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴ−３’（配列番号４７）および逆方向プライマー、５’−ＣＴＡＧＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡ−３’（配列番号４８）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性：９４℃、１分間；アニーリング：５５℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

（１３）ＤＮＡ断片ＤＧＤＲ−Ａｃｈａｉｎの取得
以下の点以外は（１）と同様な手順に従って、平滑末端化したＤＮＡ断片ＤＧＤＲ−Ａｃｈａｉｎを取得し、さらにリン酸化反応（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニッポンジーン社製）を使用し、方法は取り扱い説明書に準じた）を行い、リン酸化したＤＮＡ断片ＤＧＤＲ−Ａｃｈａｉｎを得た。

・鋳型ＤＮＡとして、（１２）より得られたＤＮＡ断片ＡｃｈａｉｎのＰＣＲ産物１０ｎｇを用いた。

・順方向プライマー、５’−ＧＡＴＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴ−３’（配列番号４９）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性：９４℃、１分間；アニーリング：５５℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

２．ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５、６、７または１２と各種ＢｃｈａｉｎのＤＮＡ断片との融合ＤＮＡの取得
（１）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＧＤＲ−Ｂｃｈａｉｎ−Ｒ融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＧＤＲ−Ｂｃｈａｉｎ−Ｒを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、１の（３）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７と１の（６）で得られたＤＮＡ断片ＤＧＤＲ−Ｂｃｈａｉｎ−Ｒを適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用い、１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

・逆方向プライマー、５’−ＧＣＧＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡ−３’（配列番号４０）を用いた。

次に、平滑末端化されたＰＣＲ産物のリン酸化反応（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニッポンジーン社製）を使用し、方法は取り扱い説明書に準じた）を行った。生成物をＨｉｎｃＩＩ切断したＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔプラスミドベクター（Stratagene）に組み込んでからＤＮＡ塩基配列を決定して、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（２）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、１の（１）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５と１の（７）で得られたＤＮＡ断片ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

・逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（３）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、１の（２）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６と１の（７）で得られたＤＮＡ断片ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

・逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（４）ＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、１の（３）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７と１の（７）で得られたＤＮＡ断片ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

・逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（５）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ１２−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ１２−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、１の（４）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ１２と１の（７）で得られたＤＮＡ断片ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

・逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（６）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＬＮＳＡＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＬＮＳＡＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、１の（２）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６と１の（１０）で得られたＤＮＡ断片ＬＮＳＡＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

・逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（７）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＧＳＰＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＧＳＰＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、１の（２）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６と１の（１１）で得られたＤＮＡ断片ＧＳＰＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

・逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（８）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＬＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＬＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、１の（３）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７と１の（８）で得られたＤＮＡ断片ＤＬＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

・逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（９）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＮＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＮＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、１の（３）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７と１の（９）で得られたＤＮＡ断片ＤＮＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）を適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

・逆方向プライマー、５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

３．ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５、６、７または１２と各種ＢｃｈａｉｎのＤＮＡ断片、各種ＡｃｈａｉｎのＤＮＡ断片との融合ＤＮＡ（ＭＩＮＩＰＩＮＳ）の取得
（１）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＧＤＲ−Ｂｃｈａｉｎ−ＲＤＧＤＲ−Ａｃｈａｉｎ融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＧＤＲ−Ｂｃｈａｉｎ−ＲＤＧＤＲ−Ａｃｈａｉｎを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、２の（１）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＧＤＲ−Ｂｃｈａｉｎ−Ｒと１の（１３）で得られたＤＮＡ断片ＤＧＤＲ−Ａｃｈａｉｎを適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（２）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、２の（２）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）と１の（１２）で得られたＤＮＡ断片Ａｃｈａｉｎを適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（３）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、２の（３）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）と１の（１２）で得られたＤＮＡ断片Ａｃｈａｉｎを適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（４）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、２の（４）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）と１の（１２）で得られたＤＮＡ断片Ａｃｈａｉｎを適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分反応させて得られた産物を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（５）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ１２−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ１２−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、２の（５）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ１２−ＤＧＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）と１の（１２）で得られたＤＮＡ断片Ａｃｈａｉｎを適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（６）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＬＮＳＡＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＬＮＳＡＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、２の（６）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＬＮＳＡＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）と１の（１２）で得られたＤＮＡ断片Ａｃｈａｉｎを適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（７）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＧＳＰＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＧＳＰＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、２の（７）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＧＳＰＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）と１の（１２）で得られたＤＮＡ断片Ａｃｈａｉｎを適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（８）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＬＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＬＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、２の（８）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＬＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）と１の（１２）で得られたＤＮＡ断片Ａｃｈａｉｎを適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

（９）ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＮＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、平滑末端化した融合ＤＮＡ、ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＮＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、２の（９）で得られたＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＤＮＤＲＲ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）と１の（１２）で得られたＤＮＡ断片Ａｃｈａｉｎを適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。それぞれの融合体のアミノ酸配列とＤＮＡ塩基配列を図１〜１８に示した。

４．上記３の融合ＤＮＡとＭＷＰｓｐ＊−ｈＰＤＩ＊との融合ＤＮＡの取得
以下の点以外は１の（１）と同様な手順に従って、下記融合ＤＮＡを組み込んだベクターを取得した。

・鋳型ＤＮＡとして、３の（１）〜（９）で得られた各ＤＮＡ断片と、特許文献１８に記載のものと同様のＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ＊−ｈＰＤＩ＊を適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させて得られた産物を用いた。

・逆方向プライマーとして、５’−ＴＴＡＣＡＧＴＴＣＡＴＣＴＴＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号５０）を用いた。

・ＰＣＲの反応条件は、変性：９４℃、１分間；アニーリング：５５℃、１分間；ＤＮＡ鎖伸長：７２℃、２分３０秒間を１サイクルとして２５サイクルとした。

また、２の（１）と同様にして、適切な融合ＤＮＡが形成されていることを確認した。

このようにして、種々の融合ＤＮＡが組み込まれたｐＭＩＮＩＰＩＮＳ〜ｈＰＤＩ＊得た。これらのベクターには、上記３で得られた融合ＤＮＡ（ＭＩＮＩＰＩＮＳ）に加えて、ＰＤＩをコードするＤＮＡも担持されている。上記ＤＮＡ断片ＭＷＰｓｐ＊−ｈＰＤＩ＊のＭＷＰｓｐの５’側には、ＳＤ（シャイン・ダルガノ）配列（リボソーム結合部位）が付加されている。これらのベクターｐＭＩＮＩＰＩＮＳ〜ｈＰＤＩ＊からＭＩＮＩＰＩＮＳおよびＰＤＩをそれぞれコードするＤＮＡの融合物を切り出し、これを適当な発現ベクターに組み込み、さらに当該発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。これらの発現ベクターを導入した宿主においては、該発現ベクター中の１つのプロモーターの下流に挿入された目的とする融合タンパク質とＰＤＩとの融合ＤＮＡが、１つのｍＲＮＡとして転写されることが予想される。続いて融合タンパク質とＰＤＩそれぞれの遺伝子の５’側に存在するＳＤ配列の機能により、２種類の遺伝子がそれぞれ翻訳され、結果として該宿主での目的とする融合タンパク質とＰＤＩとの共発現がもたらされる。

得られた融合ＤＮＡ（ＭＩＮＩＰＩＮＳ）がコードする融合タンパク質の構造を、以下に挙げる：
００１：ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ５−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号１９）
００２：ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号２０）
００３：ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＡｌａＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号２１）
００４：ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＧｌｙＳｅｒＰｒｏＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号２２）
００５：ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号２３）
００６：ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＬｅｕＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号２４）
００７：ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＡｓｎＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号２５）
００８：ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ１２−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ（配列番号２６）
００９：ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ−ＡｒｇＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇ−Ａｃｈａｉｎ（配列番号２７）。

以下の実施例ＩＩでは、これらＮｏ．００１〜００９に加え、比較例として他の構造を有する種々の融合タンパク質についても発現実験を行った。それらの他の融合タンパク質をコードする融合ＤＮＡは、上記と同様の手順により作製した。それらの他の融合タンパク質の例を、以下に挙げる：
０００：ＭＷＰｍｐ９−ＧｌｙＳｅｒＬｅｕＧｌｎＰｒｏＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ−ＡｒｇＧｌｙＨｉｓＡｒｇＰｒｏ−Ｃｐｅｐｔｉｄｅ−ＰｒｏＡｒｇ−Ａｃｈａｉｎ
０１０：ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ６−ＧｌｕＬｅｕＬｅｕＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ
０１１：ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ７−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ−ＡｒｇＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇ−Ａｃｈａｉｎ
０１２：ＭＷＰｓｐ−ＭＷＰｍｐ０−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎ。

実施例ＩＩ
融合ＤＮＡの発現分泌
１．融合タンパク質の発現量の測定
実施例Ｉで得られた融合ＤＮＡによってコードされる融合タンパク質の発現を行った。融合ＤＮＡを発現ベクターに組み込む様式を図１９に示した。

即ち、上記の融合ＤＮＡを組み込んだベクターｐＭＩＮＩＰＩＮＳ〜ｈＰＤＩ＊を制限酵素ＡｐａＬＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、０．８％アガロース電気泳動を行い、続いてそれぞれの融合ＤＮＡを含むＤＮＡ断片をゲルから切り出した。切り出した融合ＤＮＡと、ＡｐａＬＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したブレビバチルス・ブレビス用発現ベクターｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７−１７０９８４号公報）を適量ずつ混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃で３０分間反応させることにより、融合ＤＮＡを発現ベクターに組み込んだ。以上のようにして、それぞれの融合ＤＮＡを組み込んだ発現ベクター、ｐＮＵ−ＭＩＮＩＰＩＮＳ〜ｈＰＤＩ＊を取得した。これらの発現ベクターでブレビバチルス・ブレビスの４７−５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６６４）を公知の方法（Methods in Enzymol., 217： 23−33, 1993）に従って形質転換し、Ｔ２寒天培地［ポリペプトン（１％）、肉エキス（０．５％）、酵母エキス（０．２％）、ウラシル（０．１ｍｇ／ｍＬ）、グルコース（１％）、エリスロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）、寒天（１．５％）、ｐＨ７］上で平板培養し、形質転換体を取得した。

形質転換体をＴ２培地（組成は、寒天を含まないことを除いてＴ２寒天培地と同一）で３７℃にて１日間培養してから、公知の方法（Molecular Cloning 第２版, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)）を用いてプラスミドＤＮＡを精製し、当該プラスミドＤＮＡをＡｐａＬＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより目的の融合ＤＮＡが組み込まれていることを確認した。融合ＤＮＡの組み込みが確認された形質転換体については、組み込まれた融合ＤＮＡによりコードされる融合タンパク質の発現分泌を試みた。即ち、Ｔ２培地で３７℃で１日培養した菌懸濁液５０μＬを５０ｍＬのＭ−５ＹＣ培地［ポリペプトン（２．０５％）、酵母エキス（０．２７％）、グルコース（３％）、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（０．００９％）、ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ（０．０００９％）、ウラシル（２７μｇ／ｍＬ）、エリスロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）、ｐＨ８］に添加して５００ｍＬの三角フラスコで３０℃にて４日間振とう培養した。

培養後、培地１ｍＬを１．５ｍＬのマイクロチューブに入れ、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。得られた培養上清１９４μＬに６μＬの６Ｎ塩酸を加えてメンブレンフィルター（Millipore、pore size 0.22μm、Cat. No. SLGVR04NL）でろ過した。ろ液１００μＬをＨＰＬＣカラム（Waters、Symmetry300^TMC_18、５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）でのＨＰＬＣ（Waters LC-Module 1）に供し、それにより融合タンパク質の発現量を求めた。溶出並びに検出条件は、以下の通りである。

Ａ液：０．１％ＴＦＡ水溶液
Ｂ液：０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル
ＴＩＭＥ（ｍｉｎ） ＦＬＯＷ ％Ａ ％Ｂ
ＩＮＩＴＩＡＬ ０．８ ７２ ２８
５．００ ０．８ ７２ ２８
３０．００ ０．８ ６４ ３６
３２．００ ０．８ ６４ ３６
３３．００ ０．８ １０ ９０
ＴＥＭＰ： ３５℃
ＳＰＲＧ： ３０ ｍＬ／ｍｉｎ
ＷＡＶＥ ＬＥＮＧＴＨ： ２２０ｎｍ。

プロインスリン（Sigma、Cat. No. P-4672）を０．００１Ｎの塩酸に溶かした溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を同条件でＨＰＬＣにアプライして検量線を作成し、これに基づいて融合タンパク質の相対量を求めた。

図２０には各融合タンパク質の相対発現量を示した。ＷＯ０１／０６８８８４で開示された変異型プロインスリン配列を含む融合タンパク質、ＭＷＰｍｐ９−ＧｌｙＳｅｒＬｅｕＧｌｎＰｒｏＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ−ＡｒｇＧｌｙＨｉｓＡｒｇＰｒｏ−Ｃｐｅｐｔｉｄｅ−ＰｒｏＡｒｇ−Ａｃｈａｉｎ（Ｎｏ．０００）の発現量（１０２．８ｍｇ／Ｌ）に比べて、上記００１〜００９の構造を有するインスリン配列を含む各種の融合タンパク質の発現量は１．５〜３倍高く、また、他の構造を有する融合タンパク質（Ｎｏ．０１０〜０１２）と比較して顕著に高かった。

実施例ＩＩＩ
インスリンへの変換
（１）融合タンパク質、ＭＷＰｍｐ６−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎの分離精製
ｐＭＩＮＩＰＩＮＳで形質転換された細菌を３７℃で１日間培養し、その細菌懸濁液１．１ｍＬを１．１Ｌの培地［ポリペプトン（３％）、酵母エキス（０．４％）、グルコース（３％）、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（０．０１％）、ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ（０．００１％）、エリスロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）、ｐＨ８］に添加してジャーファメンターで３０℃、２００ｒｐｍ、１．１ｖｖｍエアレーションにて４日間培養した。培地を９，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、ＨＣｌで得られた上清のｐＨを３に調整し、４℃で１時間静置した。再度、９，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、得られた上清を５０ｍＭ酢酸で平衡化した陽イオン交換樹脂にアプライして、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で融合タンパク質を溶出した。溶出後、ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整した。その後、溶出液を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）でバッファー交換をしつつ、濃縮した。

（２）融合タンパク質からインスリンへの転換
濃縮された融合タンパク質を、トリプシンを含有する５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、１２℃で一晩処理することによりｄｅｓ−Ｔｈｒインスリンに転換した（１００ｍｇ融合タンパク質、２．４ｍｇ ＴＰＣＫトリプシン／４４０ｍＬ溶液）。１０％ＴＦＡを添加して反応を停止し、１８％アセトニトリル／０．０５％ギ酸で平衡化した樹脂（ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＨＰ２ＭＧＹ、Mitsubishi Chemicals Japan）にアプライし、２７％アセトニトリル／０．０５％ギ酸でｄｅｓ−Ｔｈｒインスリンを溶出した。その後、エバポレーターで乾固した。

次に、ｄｅｓ−Ｔｈｒインスリンを反応液中（１０ｍＭ ｄｅｓ−Ｔｈｒインスリン、０．８Ｍ Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ−ＨＣｌ、５０％ＤＭＦ／エタノール＜１：１＞、２０μＭトリプシン、アンモニア水でｐＨ６．１に調整）で１５℃、８時間処理することにより、ｄｅｓ−ＴｈｒインスリンにＴｈｒを付加してインスリンエステルとした。ＴＦＡにて反応を停止し、２２．５％アセトニトリル／０．０５％ギ酸で平衡化した樹脂（ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＨＰ５５Ｙ、Mitsubishi Chemicals Japan）にアプライし、２９．３％アセトニトリル／０．０５％ギ酸でインスリンエステルを溶出した。

最後に、溶出したインスリンエステルを乾固し、アニソール／ＴＦＡ＜１：９＞で処理してインスリンを取得した。

（３）ｄｅｓ−Ｔｈｒインスリンのペプチドマッピング
市販のインスリン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）をカルボキシペプチダーゼＡ処理（２５℃、１時間、０．２Ｎ ＮＨ_４ＨＣＯ_３、ｐＨ８．４、カルボキシペプチダーゼＡ＜０．３Ｕ／ｍｇインスリン＞）して、ｄｅｓ−Ｔｈｒインスリン（以下、ＳＴＤ ｄｅｓ−Ｔｈｒ ｉｎｓｕｌｉｎと記す）を得た。上記（２）で得られたｄｅｓ−Ｔｈｒインスリン（以下、ＩＴＯＨＡＭ ｄｅｓ−Ｔｈｒ ｉｎｓｕｌｉｎと記す）と、ＳＴＤ ｄｅｓ−Ｔｈｒ ｉｎｓｕｌｉｎの各５ｎｍｏｌｅを０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．８）５０μＬに溶かし、Ｖ８プロテアーゼ（和光純薬社製、２μｇ／ｍＬ）水溶液１．３５ｍＬを加えて２５℃で２４時間反応させた。続いて１％ＴＦＡを加えてｐＨ２とすることにより反応を停止した。次に、反応液をＶｙｄａｃ２１８ＴＰ５４（４．６×２５０ｍｍ、Ｃ_１８カラム）にアプライし、５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ溶液で平衡化させてから、３５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ溶液までの勾配により溶出した。溶出パターンを図２１に示す。ＩＴＯＨＡＭ ｄｅｓ−Ｔｈｒ ｉｎｓｕｌｉｎとＳＴＤ ｄｅｓ−Ｔｈｒ ｉｎｓｕｌｉｎは同様なパターンを示した。これにより、両者のｄｅｓ−Ｔｈｒインスリンのジスルフィド結合様式は同等であると結論された。

（４）インスリンのＨＰＬＣ溶出パターン
上記（３）で得られたインスリン（以下、ＩＴＯＨＡＭ ｉｎｓｕｌｉｎと記す）と市販のインスリン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ、以下ＳＴＤ ｉｎｓｕｌｉｎと記す）をＹＭＣのＣ_４カラム（４．６×２５０ｍｍ）にアプライし、２５−３５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡで溶出した。図２２に示されるように、両者とも同一の溶出パターンであった。

即ち、ブレビバチルス・ブレビスの発現系で高発現がみられた融合タンパク質の１つであるＭＷＰｍｐ６−ＡｓｐＧｌｙＡｓｐＡｒｇＡｒｇ−Ｂｃｈａｉｎ（ｄｅｓＴｈｒ）−Ａｃｈａｉｎから、適正なジスルフィド結合を有するインスリンが形成されることが示された。

本発明により、糖尿病等の疾患の治療において用いることができる機能的なインスリンを工業的に許容される効率で得ることができる方法が実現される。

配列番号１〜７：リンカー
配列番号８、９：インスリン前駆体
配列番号１０〜２７：融合タンパク質
配列番号２８〜３０：リーダーペプチド
配列番号３１〜５０：プライマー
配列番号５１、５２：リンカー

Claims (18)

1. バチルス属またはブレビバチルス属細菌の細胞壁タンパク質（ＣＷＰ）の１つであるＭＷＰ由来のシグナルペプチド、バチルス属またはブレビバチルス属細菌のＣＷＰのＮ末端から５〜７もしくは１２アミノ酸からなるリーダーペプチド、以下の一般式：
   （Ａｓｐ、ＬｅｕまたはＧｌｙ）（Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＬｅｕ）（Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＰｒｏ）（ＡｒｇもしくはＡｌａまたはなし）Ａｒｇ（配列番号５１または５２）
   により示されるアミノ酸配列からなるリンカーペプチド、およびインスリン前駆体のアミノ酸配列がこの順序で連結された融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
2. 上記リンカーペプチドが配列番号１〜６のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のＤＮＡ。
3. 上記リーダーペプチドがＭＷＰ由来のものである、請求項１または２に記載のＤＮＡ。
4. 前記インスリン前駆体が配列番号８または９により示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
5. 前記融合タンパク質が、配列番号１０〜１８のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
6. 配列番号１９〜２７のいずれか１つにより示される塩基配列を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むベクター。
8. 前記ＤＮＡが、細菌由来のプロモーター配列の下流に機能的に連結されている、請求項７に記載のベクター。
9. 上記プロモーターがバチルス属またはブレビバチルス属細菌由来である、請求項８に記載のベクター。
10. プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載のベクター。
11. 請求項７〜１０のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
12. 前記宿主細胞がバチルス属またはブレビバチルス属細菌である、請求項１１に記載の宿主細胞。
13. 前記細菌がブレビバチルス・ブレビスである、請求項１２に記載の宿主細胞。
14. 請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養するステップ、宿主細胞から所望の融合タンパク質を発現させるステップ、発現されたポリペプチドを細胞または培地中から回収するステップを含む、インスリンの製造方法。
15. 回収されたポリペプチドを酵素的に処理するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記酵素処理がトリプシンによる処理である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ポリペプチドを培地から回収する、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 配列番号１０〜１８のいずれか１つにより示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質。

Images