KR101702342B1 - 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열 및 이의 방법 - Google Patents
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Abstract
본 기재내용은 재조합체 DNA 치료제의 분야에 관한 것이다. 이는 생물정보 설계, 리더 펩타이드 암호화 서열을 포함하는 사람 인슐린 전구체에 대한 인공 유전자의 합성, 발현 벡터내 클로닝 및, 유기체, 바람직하게는 피키아 파스토리스내 발현에 관한 것이다. 본 기재내용은 또한 단백질 전구체 분자를 수득하기 위한 하부 프로세싱 및 전구체 분자의 기능성 단백질로의 전환 방법에 관한 것이다.
Description
본 기재내용은 재조합체 DNA 치료제에 관한 것이다. 이는 생물-정보학 설계, 리더 펩타이드(leader peptide) 암호화 서열을 포함하는 사람 인슐린 전구체에 대한 인공 유전자의 합성, 발현 벡터내 클로닝 및 유기체, 바람직하게는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 발현을 포함한다. 본 기재내용은 또한 단백질 전구체 분자를 수득하기 위하여 하부 프로세싱(downstream processing)하고 전구체 분자를 기능성 단백질로 후속적으로 전환시키는 방법에 관한 것이다.
사람 인슐린은 혈액 및 체액 속에서 당의 조절에 관여하는 폴리펩타이드 호르몬이다. 생산 결핍은 제1형 또는 제2형 당뇨병을 초래한다. 제1형은 특히 인슐린 의존성 당뇨병이다. 일지기, 인슐린은 동물 공급원(소 및 돼지)으로부터 보충되어 사용되었으며, 이는 종종 장 기간 동안 연속 투여시 바람직하지 않은 알레르기 면역 반응 또는 과민 반응을 초래한다. 다음 세대의 사람화된 인슐린이 재조합체 DNA 기술에 의해 이. 콜라이(E. coli)에서 생산되었으며 지난 수년동안 성공적으로 사용되고 있다. 비록 재조합체 사람 인슐린이 특허된 방법을 통해 상이한 숙주에서 발현되어 당뇨병 치료학적 요건을 충족시키고 있지만, 상업적으로 실행가능한 양을 생산하기 위한 새롭고 변형된 방법을 실현하기 위한 요구가 인류에게 커지고 강요되고 있다.
시장에서 현재 이용가능한 재조합체 사람 인슐린은 적어도 3개의 상이한 발현 시스템, 즉, 이. 콜라이, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)로부터 생산된다. 이. 콜라이내에서 과 발현은 불용성 봉입체로서 축적되는 단백질을 초래한다. 봉입체로부터 재조합체 인슐린의 가용화 및 리폴딩(refolding)은 구아닌 하이드로클로라이드, 우레아 등과 같은 무질서유발 화학물질의 사용을 필요로 하며, 심지어 과도하게 정제한 후에 최종 생성물 속에 미량의 이들 화학물질이 존재하는 것은 위험할 수 있다. 또한, 단백질은 효모 시스템에서 발현되어 가용성 형태로 훨씬 더 높은 수준에서 배지내로 분비될 수 있다. 그러나, 이러한 효모 시스템에서 수득된 발현 수준은 알려지지 않은 이유로 단백질마다 상이하였다.
사람 인슐린의 2개의 쇄는 또한 2개의 상이한 벡터를 사용하여 별도로 발현되며 정제후 시험관내에서 함께 조립된다. 2개의 쇄 사이의 이황화물 결합은 화학적 방법에 의해 촉진된다.
따라서, 본 기재내용은 서열 번호 2에 나타낸 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 폴리펩타이드 서열; a) 26개의 서열 번호 3 내지 28의 올리고뉴클레오타이드를 조립체 PCR에 의해 결합시키고, 합성된 서열을 벡터내에 삽입시킴으로써 서열 번호 2에 나타낸 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 합성하는 단계, b) 숙주 세포를 상기 벡터로 형질감염시킨 후 항생제 선별 숙주 선택하는 단계, 및 c) 선택된 형질전환된 숙주 세포를 발효시키고 인슐린 전구체 분자를 반응계내에서 포획하여 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 폴리펩타이드 서열을 갖는 상기 전구체를 수득하는 단계를 포함하는, 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 폴리펩타이드 서열을 갖는 재조합체 인슐린 전구체 분자를 수득하는 방법; a) 발효 동안에 수득된 발효 생산물을 중공 섬유(hollow fiber) 수거 시스템으로 동시 펌핑(pumping)하여 투과물(permeate) 및 농축물(retentate)을 수득하는 단계, b) 농축물을 발효기내로 재순환시키는 단계, 및 c) 투과물을 이온-교환 크로마토그래피 컬럼에 적용시킨 후 TRIS 용출 완충액으로 세척함으로서 상기 단백질 전구체 분자를 수득하는 단계를 포함하여, 발효 공정 동안 단백질 전구체 분자의 반응계내 포획을 위한 하부 프로세싱 방법; a) 전구체 분자를 TFF 카세트를 통해 농축시키고 농축물을 유기 용액과 혼합하여 농축물 반응 혼합물을 수득하는 단계, b) 반응 혼합물을 TPCK 트립신 고정화된 컬럼을 통해 항온처리에 적용시켜 단백질 에스테르를 수득하는 단계, 및 c) 에스테르를 탈차단 완충액에 적용시킨 후 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼에 적용시켜 상기 기능적 단백질 분자를 수득하는 단계를 포함하는, 단백질 전구체 분자를 기능적 단백질 분자로 반응계내 전환시키기 위한 하부 프로세싱 방법; a) 서열 3 내지 28의 26개의 올리고뉴클레오타이드를 조립체 PCR에 의해 합하여 서열 2에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열을 합성하는 단계, b) 합성된 서열을 벡터내로 삽입하고 숙주 세포를 당해 벡터로 형질감염시킨 후 항생제 선별 숙주 선택을 수행하는 단계, c) 선택된 형질전환된 숙주 세포를 발효시킨 후 인슐린 전구체 분자의 반응계내 포획을 위해 하부 프로세싱하는 단계, 및 d) 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 폴리펩타이드 서열을 갖는 인슐린 전구체 분자를 상기 재조합체 인슐린 분자로 반응계내 전환시키는 단계를 포함하는, 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 폴리펩타이드 서열을 갖는 전구체 분자로부터 재조합체 인슐린 분자를 수득하는 방법; 서열 번호 2에 나타낸 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합체 벡터; 및 서열 번호 2에 나타낸 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터의 도입으로 형질전환된 재조합체 숙주 세포에 관한 것이다.
[도면의 간단한 설명]
도 1: 클로닝 공정의 순서도 - 삽입체의 작제, 연결용 벡터의 제조, 삽입체와 벡터의 연결, 피키아 형질전환용 벡터의 제조.
도 2: 조립 PCR에 의한 올리고로부터 유전자 작제물의 아가로즈 겔 영상. 레인 1: 100개 염기 쌍 DNA 래더(ladder) 및 레인 2 내지 5: 증폭된 조립된 유전자[AOX1 영역과 함께 앰플리콘(Amplicon) 크기 640 bp].
도 2a : 겔 전기영동 - 제2 PCR의 생성물을 TAE 완충액 중 1% 아가로즈 겔 상에서 점검한다
1% 아가로즈 겔 캐스팅(casting)
로딩(loading) - 1.5 μl 슈크로즈 염료 + 5 μl 내지 lOμl PCR 생성물
마커 - 100 bp 마커 0.8 내지 1.0 μl + 2 μl 밀리Q + 1.5 염료
PCR 앰플리콘 크기는 483이고 500bp 주변의 겔에서 관측된다.
도 03: BamH1 및 Not1을 사용한 pPIC9K 벡터의 이중 효소 분해:
레인 1: 1 kb DNA 래더
레인 2: 분해 전 pPIC9K
레인 3: 분해 후 pPIC9K
도 04: BamH1 및 Not1을 사용한 표적 유전자의 이중 효소 분해
레인 1: 100 bpb DNA 래더
레인 2: 유전자 이중 분해
도 05: 설계되고 서열분석된 코돈 및 아미노산 세부사항을 사용한 DNA 서열분석 프로파일
도 06: 발효 배지내로 인슐린 전구체의 발현 및 분비의 연속적인 증가를 나타내는 상이한 유도 단계 동안 발효 시료의 SDS-PAGE(15 %) 영상.
레인 1 : 표준 PIP
레인 2: 단백질 분자 중량 마커
레인 3: 유도 0시간에서의 발효 시료;
레인 4: 유도 6시간에서의 발효 시료
레인 5: 유도 12시간에서의 발효 시료
레인 6: 유도 24시간에서의 발효 시료
레인 7: 유도 30시간에서의 발효 시료
레인 8: 유도 36시간에서의 발효 시료 및
레인 9: 유도 42시간에서의 발효 시료.
도 07: 상이한 유도 기간에서 발효 시료의 HPLC 프로파일[발효 유도 상의 시간 경과 대 인슐린 전구체의 양]. 유도 기간이 시간 대 시간의 전구체 양에 있어서 점진적인 증가가 있다. 이러한 양의 증가는 밀리 볼트로 표현된 피크의 크기와 관련된다.
도 08: 인슐린 전구체의 선택적인 포획을 나타내는, 발효(최종) 시료중 표준 전구체 및 전구체의 비교 HPLC 프로파일. 표준물에 상응하는 피크는 1mg/mL의 단백질 농도로부터 수득되었다. 발효 시료에 상응하는 피크는 브로쓰(broth)의 1:1 희석으로부터 수득된다. 50% 희석된 FMN 브로쓰 피크는 표준 전구체의 것 이상이다. 이는 >2g/lit에 상응한다.
도 09: 인슐린 전구체(PIP)의 사람 인슐린 부틸 에스테르로의 효소적 전환(펩타이드전이 생성물)의 HPLC 프로파일. 펩타이드전이 반응 전에, 상기 PIP를 로딩하였다. 트립신 분해 및 펩타이드전이 후에, 생성물(HI 에스테르)을 또한 HPLC 상에 로딩하여 반응의 완성을 확인한다. 질량 균형은 전구체와 이의 펩타이드 전이 생성물 사이에서 조화(match)된다.
도 10: TP 생성물을 탈차단하여 사람 인슐린을 수득하고 HPLC로 로딩하여 순도 및 프로파일을 안다. 질량 균형 측면에서, 이는 PIP(전구체)와 조화된다. 도 9에서 PIP 및 당해 도에서 HI 둘다는 동일한 농도(1mg/mL)로 로딩된다.(British Pharmacopeia 2007에 따른 정제된 사람 인슐린 HPLC 프로파일).
도 11: 발효, 반응계내 수거 및 0.2μM 카세트를 사용한 중공 섬유 수거 시스템에 의한 발효 브로쓰의 정화의 순서도를 나타내는 도표. 수거 후 남아있는 세포를 신선한 배지와 함께 발효기내로 다시 넣었다.
도 12: 도표는 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에서 사람 인슐린 전구체의 농축 및 반응계내 포획에 이은 반응계내 분해 및, 인슐린 부틸 에스테르로의 전환을 위한 TPCK 트립신 고정된 컬럼내에서 펩타이드전이의 순서도를 나타낸다.
도 13: 정제된 사람 인슐린의 SDS PAGE (15%) 및 시판되는 제형과의 비교;
레인 1 : 인슐린 전구체;
레인 2: 단백질 분자량 마커;
레인 3: 정제된 인슐린 전구체;
레인 4: 탈차단 후 사람 인슐린;
레인 5: 폴리싱(polishing) 후 사람 인슐린 및
레인 6: 시판되는 재조합체 사람 인슐린(Huminsulin R)
도 14: 인슐린 전구체 및 정제된 HI 및 시판되는 HI의 웨스턴 블롯 영상.
레인 1: 예비염색된 단백질 마커
레인 2: FMN 브로쓰로부터 포획된 인슐린 전구체
레인 3: 정제된 빅텍(bigtec) 사람 인슐린
레인 4: 시판되는 사람 인슐린
도 15: 코돈(codon) 쌍 최적화: 올리고 조립된 서열(조립-PCR의 생성물)
기재내용의 상세한 설명
본 기재내용은 서열 번호 2에 나타낸 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.
본 기재내용의 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 재조합체 사람 인슐린 전구체 및 시그날 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. 본 기재내용은 서열 번호 1의(서열 번호 1에 나타낸 바와 같은) 폴리펩타이드 서열에 관한 것이다. 본 기재내용의 양태에서, 폴리펩타이드는 재조합체 사람 인슐린 전구체 및 시그날 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드이다. 본 기재내용의 다른 양태에서, 폴리펩타이드 서열은 서열 번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열에 상응하며, 여기서, 폴리뉴클레오타이드는 전사 후 변형 및 코돈 최적화에 적용시켜 서열 번호 1의 상응하는 폴리펩타이드를 수득한다.
본 기재내용은
a) 서열 3 내지 28의 26개의 올리고뉴클레오타이드를 조립 PCR에 의해 결합하고 합성된 서열을 벡터내로 삽입함으로써 서열 번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 합성하는 단계,
b) 숙주 세포를 상기 벡터를 사용하여 형질전환한 후 항생제 선별 숙주 선택하는 단계, 및
c) 선택된 형질전환된 숙주 세포를 발효시키고 인슐린 전구체 분자를 반응계내 포획하여 서열 번호 1의 폴리펩타이드 서열을 갖는 전구체를 수득하는 단계를 포함하여, 서열 번호 1의 폴리펩타이드 서열을 갖는 재조합체 인슐린 전구체 분자를 수득하는 방법에 관한 것이다.
본 기재내용의 하나의 양태에서, 폴리펩타이드는 재조합체 사람 인슐린 전구체 및 시그날 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드이다.
본 기재내용의 다른 양태에서, 합성된 폴리뉴클레오타이드 및 벡터는 폴리뉴클레오타이드를 발현 벡터내로 삽입하기 위한 제한 효소 분해에 적용되며, 여기서, 제한 효소는 BamHI, Notl, SacI, BgIII 및 SacII 또는 이의 특정 조합을 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 벡터는 pPIC9K 및 pPICZα, 바람직하게는 pPIC9K를 포함하는 그룹 중에서 선택되고, 여기서, 숙주는 피키아 파스토리스, 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 길리에르몬디이(Pichia guilliermondii) 및 피키아 카리비카(Pichia caribbica), 바람직하게는 피키아 파스토리스를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 전구체 분자의 반응계내 포획은 중공 섬유 수거 시스템 및 이온-교환 크로마토그래피 컬럼에 의해 수행하여 상기 전구체를 수득한다.
본 기재내용은
a) 발효 동안 수득된 발효 생산물을 중공 섬유 수거 시스템으로 동시에 펌핑하여 투과물 및 농축물을 수득하는 단계,
b) 농축물을 발효기내로 재순환시키는 단계, 및
c) 투과물을 이온-교환 크로마토그래피 컬럼에 적용시킨 후 TRIS 용출 완충액으로 세척함으로서 상기 단백질 전구체 분자를 수득하는 단계를 포함하여, 발효 공정 동안 단백질 전구체 분자의 반응계내 포획을 위한 하류 프로세싱 방법에 관한 것이다.
본 기재내용의 하나의 양태에서, 투과물은 정화된 세포 비함유 브로쓰를 포함하고 농축물은 농축된 세포를 포함한다.
본 기재내용의 다른 양태에서, 농축물은 발효기 속에서 신선한 배지와 함께 발효 용기로 다시 재순환되며 농축물은 단백질 전구체의 포획을 위해 이온-교환 크로마토그래피 컬럼을 통해 통과된다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 단백질 전구체는 이온-교환 크로마토그래피 컬럼의 중합체 매트릭스에 선택적으로 결합하며 용출 완충액과 함께 용출된다.
본 기재내용은
a) 전구체 분자를 TFF 카세트를 통해 농축시키고 농출물을 유기 용액과 혼합하여 농축물 반응 혼합물을 수득하는 단계,
b) 반응 혼합물을 TPCK 트립신 고정화된 컬럼을 통해 항온처리에 적용시켜 단백질 에스테르를 수득하는 단계, 및
c) 에스테르를 탈차단 완충액에 적용시킨 후 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼에 적용시켜 상기 기능적 단백질 분자를 수득하는 단계를 포함하는, 단백질 전구체 분자를 기능적 단백질 분자로 반응계내 전환시키기 위한 하부 프로세싱 방법에 관한 것이다.
본 기재내용의 하나의 양태에서, 전구체 분자는 약 100 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 범위로 농축된다.
본 기재내용의 다른 양태에서, 유기 용액은 1:1 v/v 디메틸 설폭사이드(DMSO) : 메탄올에 용해된 O-3급-부틸-L-트레오닌 3급-부틸 에스테르 아세테이트를 포함하며, 탈차단 완충액은 트리토판 및 트리플루오로아세트산의 배합물을 포함한다.
본 기재내용의 다른 양태에서, TPCK 컬럼은 CaCl2 및 아세트산의 배합물로 평형화되며 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼은 아세트산 및 황산암모늄의 배합물로 평형화된다.
본 기재내용의 다른 양태에서, 항온처리 시간은 약 1.5 시간 내지 약 3.5 시간의 범위이며, 항온처리 온도는 약 1.5 시간 내지 약 3.5 시간의 범위이고, 항온처리 온도는 약 15℃ 내지 약 25℃의 범위이다.
본 기재내용은
a) 서열 3 내지 28의 26개의 올리고뉴클레오타이드를 조립 PCR에 의해 합하여 서열 2의 폴리뉴클레오타이드를 합성하는 단계,
b) 합성된 서열을 벡터내로 삽입하고 숙주 세포를 당해 벡터로 형질감염시킨 후 항생체 선별 숙주 선택을 수행하는 단계,
c) 선택된 형질전환된 숙주 세포를 발효시킨 후 인슐린 전구체 분자의 반응계내 포획을 위해 하부 프로세싱하는 단계, 및
d) 서열 번호 1의 폴리펩타이드 서열을 갖는 인슐린 전구체 분자를 상기 재조합체 인슐린 분자로 반응계내 전환시키는 단계를 포함하는, 서열 번호 1의 폴리펩타이드 서열을 갖는 전구체 분자로부터 재조합체 인슐린 분자를 수득하는 방법에 관한 것이다.
본 기재내용의 하나의 양태에서, 폴리펩타이드는 재조합체 사람 인슐린 전구체 및 시그날 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드이다.
본 기재내용의 다른 양태에서, 합성된 폴리뉴클레오타이드 및 벡터는 폴리뉴클레오타이드를 발현 벡터내로 삽입시키기 위한 제한 효소 분해에 적용되며, 여기서, 제한 효소는 BamHI, Notl, SacI, BgIII 및 SacII 또는 이의 특정 조합을 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 벡터는 pPIC9K 및 pPICZα, 바람직하게는 pPIC9K를 포함하는 그룹 중에서 선택되며, 여기서, 숙주는 피키아 파스토리스, 피키아 메타놀리카, 피키아 구일리에르몬디이 및 피키아 카리비카, 바람직하게는 피키아 파스토리스를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 전구체 분자의 반응계내 포획은 중공 섬유 수거 시스템 및 이온-교환 크로마토그래피 컬럼에 의해 수행되어 상기 전구체를 수득한다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 전구체 분자의 반응계내 전환은 전구체 분자를 TFF 카세트 및 TPCK 트립신 고정화된 컬럼에 적용시켜 단백질 에스테르를 수득함에 의해 수행된다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 단백질 에스테르는 탈차단 완충액에 이어 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼에 적용시켜 상기 재조합체 인슐린 분자를 수득한다.
본 기재내용은 서열 번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합체 벡터에 관한 것이다.
본 기재내용의 하나의 양태에서, 벡터는 pPIC9K 및 pPICZα, 바람직하게는 pPIC9K를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
본 기재내용은 서열 번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 도입시킴으로서 형질전환된 재조합체 숙주 세포에 관한 것이다.
본 기재내용의 하나의 양태에서, 숙주는 피키아 파스토리스, 피키아 메타놀리카, 피키아 구일리에르몬디이 및 피키아 카리비카, 바람직하게는 피키아 파스토리스를 포함하는 그룹 중에서 선택되며, 여기서, 벡터는 pPIC9K 및 pPICZα, 바람직하게는 pPIC9K를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
본 기재내용의 주요 목적은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 "분비 시그날 및 재조합체 인슐린 전구체 융합 단백질"을 암호화하는 유전자를 새로이 설계하고 발현하는 것이다.
본 기재내용은
a) 인슐린 전구체-시그날 펩타이드 융합 단백질 암호화 유전자를 설계하고 작제하는 단계;
b) 전구체-시그날 펩타이드 융합 단백질 암호화 유전자를 벡터로 연결하는 단계;
c) 숙주 내로의 형질전환[전기천공(electroporation)]에 의해 전구체-시그날 펩타이드 융합 단백질 암호화 유전자의 다중 카피를 수득하는 단계,
d) 형질전환된 숙주 세포주를 발효시켜 재조합체 사람 인슐린 전구체를 수득하는 단계, 및
e) 사람 인슐린 전구체의 효율적인 하부 프로세싱에 의해 재조합체 사람 인슐린을 수득하는 단계를 포함하여, 재조합체 사람 인슐린을 수득하는 방법에 관한 것이다.
본 기재내용에서, 뉴클레오타이드 서열의 최적화는 표적 단백질의 발효 배지로의 향상된 발현 및 분비를 위해 수행된다. 클론 작제, 클로닝, 형질전환, 발효, 하부 프로세싱동안 다수 단계에서의 최적화는 수율에 있어서의 총 증가, 확장성 및 생물학적 효능을 초래하였다. 하부 프로세싱은 전구체의 최종 생성물로의 반응계내 포획 및 반응계내 전환으로 처리하여 프로세싱 시간, 비용, 인력 및 보존 시약을 최소화시킨다.
본 기재내용의 다른 양태에서, 상기 서열 번호 2는 피키아 파스토리스내에서 고도로 발현된 단백질의 "코돈-쌍 빈도"를 기초로 한 뉴클레오타이드 서열의 다중 단계 가상환경(in-silico) 최적화에 의해 수득된다. 서열은 또한 mRNA 제2 구조 예측 및 고 용융 줄기 루프 구조의 제거에 의해 단백질 합성을 향상시키며, 이는 제한되지 않은 리보솜 운동 및 고속 단백질 합성이 가능하도록 한다.
코돈 쌍 최적화
코돈 최적화는 유전자 최적화 방법이며, 여기서, 합성 유전자 서열은 변형되어 특수 유기체용 "코돈 사용 패턴"과 일치한다. 여기서, 특수 아미노산 서열의 경우, 이러한 유기체에 의해 "대부분 흔히 사용된 코돈"(아미노산에 대한 축퇴된 코돈의 목록으로부터)을 선택한다. 따라서, 아미노산 서열은 동일하게 유지되지만 이러한 유기체와 조화되는 상이한 DNA 서열을 갖는다.
그러나, 이는, 코돈이 단백질 합성 동안 리보솜에 의해 "쌍"으로 판독된다는 사실을 고려하지 않는다. 리보솜내에는 인접하게 위치하는 2개의 코돈 결합 부위가 존재한다. 확장 분석(extensive analysis)을 수행하여 특수 패턴을 관측하였으며, 여기서 "코돈-쌍"은 피키아 파스토리스에 의해 사용된다. 따라서, 작제물 DNA 서열은 변형되어 이러한 "코돈-쌍 사용 빈도"와 조화되었다. 당해 방법은 신규하며 유전자 발현 최적화를 위해 전혀 보고되지 않은 것이다. 등록된 내부 개발된 소프트웨어를 이러한 시험에 사용하였다. 이러한 유전자 최적화를 수행함으로써(도 15), 발현 수준이 대략 30%까지 증가될 수 있음이 밝혀졌다.
본 기재내용의 다른 양태에서, 전체 유전자 서열, 즉, 인슐린 전구체 및 분비 시그날은, 발현 숙주내에서 일본쇄 단백질로서 발현되므로, 함께 최적화에 적용시켰다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 상기 전구체는 인슐린 전구체-시그날 펩타이드 융합 단백질에 대해 암호화하는 약 26개의 올리고뉴클레오타이드로 작제된다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 상기 벡터는 pPIC9K 및 pPICZα, 바람직하게는 pPIC9K를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 상기 클로닝은 pPIC9K 벡터내 AOX1 프로모터의 하부에서 수행된다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 상기 숙주는 피키아 파스토리스, 피키아 메타놀리카, 피키아 구일리에르몬디이 및 피키아 카리브비카, 바람직하게는 피키아 파스토리스를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 상기 클로닝은 동시 다수 유전자 삽입 및 항생제를 사용한 직접적인 선택으로 수행함으로써 높은 카피 수의 유전자를 숙주내로 도입하였다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 상기 발효는 변형된 저염 최소 배지 속에서 최적 온도 범위, 통기, 세포 밀도 및 배지 공급(feeding)에서 수행되며, 이는 고 수준 발현 및 용이한 하부 프로세싱을 가능하도록 한다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 발효 과정 및 수거 과정이 결합된다. 이는 수거 동안 브로쓰의 반응계내 여과를 위해 발효기에 연결된 중공 섬유 수거 모듈을 포함한다. 발효기로부터의 배양물을 중공 섬유 카세트로 펌핑하여 세포로부터 세포 비함유 브로쓰(cell free broth)를 분리한다. 여과 후 세포는 발효 용기로 다시 배지와 함께 재순환되어 배양 용적을 유지하고 배양물의 정상 성장을 촉진한다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 사람 인슐린 전구체의 포획은 고정된 트립신 컬럼 속에서 트립신 분해 및 펩타이드전이와 커플링된다. 이는 중공 섬유 여과 시스템으로부터 고 결합능 합성 수지로 충전된 크로마토그래피 컬럼으로의 세포 비함유 브로쓰내 인슐린 전구체의 결합을 포함한다. 미결합은 신선한 배지와 함께 발효기로 다시 채널링(channeling)된다.
결합된 단백질은 용출되어 매트릭스에 고정화된 TPCK 트립신으로 충전된 컬럼내로 채널링된다. 트립신 컬럼으로의 통로에서, 용출된 전구체는 필요한 완충액 및 바람직한 pH로 합해진다. 전구체는 컬럼내에서 트립신 분해 및 펩타이드전이에 의해 인슐린 에스테르로 전환된다. 이후에, 인슐린 에스테르는 컬럼으로부터 용출되어 탈차단됨으로써 사람 인슐린으로 전환되어 동결건조된다. 최종적으로, 사람 인슐린은 역상 크로마토그래피에 의해 최고 순도로 손질된다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 상기 발효 배지는, 발효의 초기 상 동안 pH가 약 4.0 내지 5.0, 바람직하게는 약 4.75이고; 글리세롤 상 동안 약 4.0 내지 5.0, 바람직하게는 약 4.80이며, 유도 상 동안 약 4.0 내지 5.0, 바람직하게는 약 4.95의 범위이다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 발효시 상기 온도는 배치 상 동안 약 29 내지 3O℃, 바람직하게는 약 30.0℃이고; 글리세롤 공급물 배지 동안 약 29 내지 30℃, 바람직하게는 약 29.5℃이며; 메탄올을 사용한 유도 상 동안 약 27 내지 29℃, 바람직하게는 약 28.0℃의 범위이다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 발효시 통기는 배치 상 동안 약 0.5 내지 1.5 VVM 순수한 공기, 바람직하게는 1VVM 순수한 공기이고; 글리세롤 배치 동안 약 0.5 내지 1.5 VVM 공기:산소, 바람직하게는 약 1.0 VVM 공기:산소(약 90:10)이며; 메탄올 배치(유도 상) 동안 약 1.5 VVM 공기:산소 비가 약 매 5시간 째에 약 5로 증가/감소하면서, 약 85:15에서 개시하여 약 40:60에서 종결된다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 발효 동안 글리세롤 공급은 유도 전에 고 세포 밀도 성장을 촉진하기 위해 수행되며, 세포 밀도(OD600)가 약 500에 이를때까지 지속된다. 이후에, 메탄올을 기하급수적으로 공급하여 표적 단백질의 증가된 발현을 촉진한다.
본 기재내용에서, 변형된 뉴클레오타이드 서열을 갖고 Mat-α 분비 시그날, 스페이서 및 인슐린 전구체를 포함하는 유전자에 대해 암호화하는 합성 유전자를 새로이 설계하였다. 확장 생물정보 분석을 사용하여 피키아 파스토리스에서 고도로 발현된 단백질로부터의 뉴클레오타이드 패턴을 기초로 한, 새로운 암호화 서열에 도달하였다. 합성 유전자(482bp)는 26개 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 이들을 조립 PCR로 합하여 작제하였다.
피키아 발현 시스템은 메탄올 유도성 프로모터를 사용한 매우 높은 수준의 발현으로 알려져 있다. 단백질은 분비 단백질로 발현될 수 있으므로, 이의 정제는 단순하다. 균주의 배가 시간, 취급 용이성, 최소 성장 요건, 통상의 벡터의 이용가능성, 숙주 시스템 및 선택 방법은 피키아 파스토리스를 연구를 위한 이상적이고 매력적인 시스템이 되도록 한다. 고 세포 밀도가 최소 광물 배지 속에서 달성될 수 있으며 단백질의 유도된 발현의 용이성이 재조합체 단백질 발현을 위해 당해 시스템을 사용하는 편리성에 가해진다.
조립 PCR에 의해 수득된 인슐린 전구체 융합 단백질 유전자는 DNA 서열분석으로 확인하였으며(도 5), 피키아 파스토리스 발현 벡터 pPIC9K내로 클로닝되었다. 선형화 후 벡터를 전기천공에 의해 피키아의 GS115 균주내로 형질감염시켰다. 발현 카세트는 동종 재조합에 의해 피키아 숙주 시스템내로 통합되었다. 높은 카피 수 삽입물을 갖는 클론을 항생제 선별에 의해 골랐다. 항생제 겐티신(G418)에 대한 최대 내성을 나타내는 클론을 골라서 인슐린 전구체를 발현하여 배양 배지내로 분비하는 이들의 능력을 선별하였다. 촉망되는 클론을 7 리터 용적의 발효기로 추가로 평가하였다. 인슐린 전구체의 발효 수율은 대략 1.5 gm/리터이다. 이는 또한 과정의 추가의 최적화를 통해 증가시킬 수 있다.
분비된 인슐린 전구체를 브로쓰로부터 포획하고, 정제하며, 효소적으로 변형시켜 사람 인슐린을 수득하였다. 혈당 조절 측면에서 최종 생성물의 생물학적 활성은 마우스 및 랫트에서 확립하며 시판되는 치료학적 재조합체 사람 인슐린 제형과 필적한 것으로 밝혀졌다.
따라서, 당해 공정은 다수 단계에서 최적화되며, 이는 누적 효과를 가지고 증가된 수율을 생성한다. 명명하기 위해 당해 시스템에서 최적화된 주요 매개변수 중 일부, 전체 암호화 영역의 "코돈-쌍 서열", mRNA의 안정성, 다중 카피 삽입, 최적화된 배지 성분 및 성장 및, 유도 매개변수를 최적화하였다.
발현 카세트의 숙주 게놈내로의 통합은 반복된 부-배양(sub-culturing) 후 재조합체 균주의 수행능 및 안정성을 보증한다. 피키아 시스템에서 다중-카피 유전자 발현의 가능성은 이것이 발현, 폴딩 및 세포의 최대로의 분비능의 발휘가 실현가능하도록 한다. 일본쇄 단백질로서 사람 인슐린의 발현은 생물학적으로 활성인 분자로 이끄는 적절한 폴딩(folding)을 생성하는 적절한 이황화물 브릿지 형성을 가능하도록 한다. 또한, 시험관내 프로세싱 및 유해한 화학물질의 사용이 최소로 유지되는 본 기재내용의 공정은 재조합체 사람 인슐린의 대규모 및 상업적 생산에 이상적으로 적합하다. 발효 수율은 보고된 문헌 및 보고되지 않는 거래 수치보다 상당히 더 우수하다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 발효 수율은 높다.
본 기재내용의 여전히 다른 양태에서, 포획 및 정제 공정을 위한 고 효능 합성 중합체 수지의 사용은 하기 제공된 실시예에 기술된 바와 같이, 최소 단위 작업으로 향상된 회수 및 순도를 생성한다. 합성 수지의 사용은 공정의 견고성, 엄격한 위생화 프로토콜, 및 공정의 규모 확대의 용이성 및 전체적인 기술-경제적 실현가능성을 향상시켰다.
본 기재내용을 다음 실시예의 도움으로 추가로 상술한다. 그러나, 이들 실시예는 기재내용의 영역을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 유전자 작제 및 클론 생성
융합 단백질 "Mat-α-인슐린 전구체" 융합 단백질을 암호화하는 26개의 올리고뉴클레오타이드[서열 번호 3으로 제공된 것으로서]를 설계하고 통상적으로 합성하였다. 이들 올리고뉴클레오타이드를 조립 PCR로 조립하였다. PCR 생성물은 제한 효소 BamHI 및 NotI으로 분해하고(도 04) T4 DNA 리가제를 사용하여 유사하게 프로세싱된 벡터 pPIC9K(도 03) 내로 연결시켰다.
조립 PCR
올리고의 마스터 스톡(master stock)을 물 속에 재현탁시키고 바이오서브(Bioreserve)의 원래의 바이알 속에 저장하며 -2O℃로 유지시켰다. 올리고의 재현탁은 각각의 올리고의 100pm/μl 농도를 생성한다(1 μM = 1 p mole/μl). 조립 PCR은 각각의 올리고의 0.1 μM 농도를 필요로 한다. 10μl의 각각의 올리고를 200 μl(20배)로 희석시켜 5μM 용액을 수득한다. 1μl의 각각의 희석된 올리고를 조립 PCR 전에 PCR 마스터 혼합물에 가한다.
| PCR 혼합물(50μl) | |
| 5X rxn 완충액(고 정확도) | 10.0μl |
| 10mM dNTP | 1.0μl |
| 올리고 | 26μl |
| 태크(Taq) | 0.5μl(1 단위/μl) |
| 밀리Q | 12.5μl |
| 총 용적 | 50μl |
| PCR 혼합물(50μl) | ||||
| 단계 1 | 초기 변성 | 98℃ | 30초 | 1주기 |
| 단계 2 | 변성 | 98℃ | 10초 | 30주기 |
| 단계 3 | 어닐링 | 57℃ | 30초 | |
| 단계 4 | 연장 | 72℃ | 30초 | |
| 단계 2, 3 및 4 반복 | 30회 | |||
| 단계 5 | 최종 연장 | 72℃ | 7분 | 1 주기 |
| 단계 6 | 최종 보유 | 4℃ | α | |
조립 PCR의 생성물을 제2 PCR의 주형으로 사용한다. 생성물 양은 기하급수적 방식으로 증가하지 않으므로, 겔 전기영동에서 점검하지 않는다. 조립 PCR로부터의 생성물을 제2 PCR용 주형으로 직접 사용하며 여기서, 조립된 유전자는 AOXl1 프라이머를 사용하여 증폭시킨다.
| PCR 혼합물(NEB) (20μl) | |
| 5X rxn 완충액(Hi Fidelity) | 4.0μl |
| 10mM dNTP 혼합물 | 0.4μl |
| AOX1 프라이머 F(100μM) | 0.2μl |
| AOX1 프라이머 R(100μM) | 0.2μl |
| 주형(조립 PCR 혼합물) | 1.2μl |
| 푸션 태크(Phusion Taq)(NEB) | 0.2μl |
| 밀리Q | 13.8μl |
| 총 용적 | 20μl |
| PCR 혼합물(50μl) | ||||
| 단계 1 | 초기 변성 | 95℃ | 30초 | 1주기 |
| 단계 2 | 변성 | 98℃ | 10초 | 30주기 |
| 단계 3 | 어닐링 | 57℃ | 30초 | |
| 단계 4 | 연장 | 72℃ | 30초 | |
| 단계 2, 3 및 4 반복 | 30회 | |||
| 단계 5 | 최종 연장 | 72℃ | 7분 | 1 주기 |
| 단계 6 | 최종 보유 | 4℃ | α | |
수득되는 서열
제2 PCR로부터 수득한 앰플리콘(amplicon) 및 앰플리콘의 크기는 약 500 bp(482 bp)의 크기와 조화된다. 제2 PCR의 생성물을 서열분석을 위해 아가로즈 겔로부터 추출한다.
연결 혼합물, 즉, 목적한 연결된 유전자(인슐린 전구체 + mat-α 분비 시그날)을 함유하는 pPIC9K 벡터를 화학적으로 적격세포(competent cell) TOP 10 이. 콜라이 균주내로 형질전환하기 위해 사용한다(도 01). CaCl2를 적격 세포 제조용으로 사용하였다. 형질전환은 열 충격 방법(heat shock method)으로 수행하였다. 형질전환 혼합물을 암피실린을 함유하는 LB 배지 상에 플레이팅하여 형질전환된 콜로니를 선택하였다. 플레이트를 37℃에서 12 내지 14시간 동안 항온처리한 후 콜로니를 수득하였다. 형질전환된 세포의 글리세롤 스톡을 제조하고 -70℃에서 저장하였다. 이. 콜라이로부터의 플라스미드를 프로메가 키트(Promega Kit)(Wizard plus SV minipreps DNA purification system)로부터의 프로토콜에 의해 제조하였다. 재조합체 pPIC9K 플라스미드 벡터를 제한 효소 SacI/BglII/salI로 선형화하고, 정제하며, 정량화하고 피키아 파스토리스내로 형질전환하기 위해 사용하였다. 대략 10μg의 선형화된 플라스미드 DNA와 삽입체를 전기적격 숙주 세포(electrocompetent host cell)의 전기천공을 위해 사용하였다. 전기천공에 사용된 명세는 2 mm 큐베트(cuvette)에서 760 볼트/5 밀리 초(millisecond)이다.
형질전환 혼합물을 1M 소르비톨 속에서 30분 동안 세포에 대해 항온처리하여 회수하고 액체 재생 배지 속에서 4시간 동안 30℃에서 진탕시키면서 항온처리하였다. 이후에, 세포를 히스티딘이 결여되고 항생제 G418을 함유하는 최소 배지 상에 플레이팅하였다. 당해 플레이트 상에 성장한 His+ 콜로니를 AOX1 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 선별하였다(도 02). PCR 양성 세포주를 고 카피 수 균주의 추가의 선별을 위해 신선한 RD 배지 플레이트에 플레이팅한다.
게놈내로 삽입된 다중 카피의 유전자를 함유하는 클론을 고 농도의 항생제 G418을 사용하여 추가로 선별하였다. 4mg 이상의 G418에 대해 내성인 콜로니를 12개 카피 이상의 유전자를 함유하는 것으로 고려한다. 이러한 콜로니를 선택하여, YPD 배지 상에서 성장시키고 글리세롤 스톡으로서 -70℃에서 유지시켰다.
실시예 2: 발현 선별
4mg의 G418이 들어있는 RD 플레이트에서 성장하는 형질전환된 콜로니를 Invitrogen의 피키아 발현 프로토콜에 따라 진탕 플라스크 배양으로 발현에 대해 선별하였다. 100개 이상의 이러한 콜로니를 선별하여 아주 적은 수의 촉망되는 클론을 선별하였다.
선별될 각각의 콜로니를 배양 튜브내 5 ml의 YPD 속에서 3O℃/230rpm/24hr으로 항온처리함으로써 성장시켰다. 종균(1ml)을 250ml의 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크내 50 ml의 BMG(완충된 최소 글리세롤 배지)로 접종하고 3O℃/220rpm/24hr에서 항온처리하였다. 세포를 200Og/5분에서 실온으로 원심분리하여 수거하였다. 상층액을 경사여과(decanting)하고 세포 펠릿(pellet)을 150ml의 배플링된 플라스크(baffled flask) 내 25ml의 BMM(완충된 최소 메탄올 배지) 속에 재현탁시킨 후 3O℃/200rpm에서 3일 동안 성장하도록 하였다. 배양을 메탄올로 유도하여 최종 농도가 매 24시간째에 1.0%로 되도록 하였다. 시료를 24시간 간격으로 취하여 HPLC 및 SDS-PAGE로 분석하였다.
우수한 발현을 나타내는 콜로니를 발효 수준에서 추가의 평가를 위해 글리세롤 스톡으로 제조하였다.
실시예 3: 저 염 최소 배지[LSMM] 속에서 고 세포 밀도 발효
발효를 7리터 용량의 반응계내 자가분해가능한 자동화된 용기(BioFlo 415, NBS) 속에서 수행하였다. 교반, 가스 유동 속도, 배지 공급, pH 조절, 소포제와 같은 모든 매개변수를 PID 조절기로 조절하였다.
사용된 발효 배지는 다음과 같은, 미량의 금속 염 용액(PTM4) 및 바이오틴(Biotin)이 보충된 저 염 최소 배지(LSMM)이다:
인산 = 26.7ml
CaSO4.2H20 = 0.465 gm
K2SO4 = 9.1gm
MgSO4.7H2O =7.45gm
KOH = 4.13gm
글리세롤 = 50ml
[배지 리터당 모든 양]
발효기내에서 신속한 성장 및 높은 세포 밀도 수율을 촉진하기 위해, 글리세롤 스톡을 접종하고 YPD 배지 속에서 플라스크 배양물을 18 내지 20시간 동안 220 rpm/30℃에서 OD600이 10 내지 12에 이를 때까지 성장시켰다. 처음 종균을 다시 YPG 배지에 접종하고 상기 언급한 조건에서 성장시켰다. 배양물이 대수상(log phase)(약 20시간)에 대략 25 내지 30의 OD600과 함께 도달하면, 세포를 1500g/5분에서 수거하고 오토클레이브(autoclave)된 밀리Q 물 속에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 발효기 내 기본 염 배지내로 5.0의 OD600까지 접종하였다.
배치 상: 발효기 배지 pH를 접종 전 4.75로 조절하여 경우에 따라, 배지의 침전을 방지하였다. 용존 산소(DO) 프로브를 또한 접종 전에 계측하였다. 8%의 미량 금속 용액을 고정 간격으로 접종하기 전 및 후에 용기에 가하였다. 배양물 온도를 30℃로 유지한다. 용기 통기를 1.0 VVM 순수한 공기로 유지하였다. 초기 배치 상을 DO 급증의 지시와 함께 OD6OO이 120 내지 150에 이를 때까지 18시간 동안 지속한다.
글리세롤 공급된 배치: 글리세롤 공급된 배치를 대수 공급 속도(exponential feed rate)로 12% 미량의 금속 용액을 함유하는 50% 글리세롤의 배지 공급 속도로 개시하여 유도 전에 고 세포 밀도를 달성하였다. 온도 및 pH를 29.5℃ 및 4.80으로 유지하였다. 용기 통기를 1.0 VVM 공기 및 산소로서 9:1의 비로 유지시켰다.
메탄올 배치: 인슐린 전구체(IP)의 유도를 12% PTM4 미량의 금속 용액을 함유하는 100% 메탄올을 공급하여 개시하였다. 초기 메탄올 공급물을 배양이 적절하게 될 때까지 스파이크(spike)로서 제공한 후, 대수기 공급까지 스위칭하였다. DO 스파이크 방법을 사용하여 메탄올 공급물의 램프(ramp)를 측정하였다. Mut+ 및 MutS 클론은 문헌(참조: Stratton et al., Pichia protocols, Methods in Molecular Biology, Vol.103)을 기초로 하였다. 용기내 잔류 메탄올을 내부 설계된 메탄올 프로브 및 용기에 연결된 센서를 사용하여 연속적으로 모니터링한다. 메탄올 시그날의 소모는 메탄올 공급 배치를 통해 28.5℃에서 유지시킨 용기 온도로 증가한다. 중간 pH를 4.95로 유지시켰다. 용기 통기는 매 5시간 마다 5의 증가/감소로 85:15에서 시작하여 40:60에서 종결하는 비로 공기 및 산소를 사용한 고 밀도로 인하여 1.5 VVM로서 유지시켰다. 유도 상 동안에 시료를 6시간 간격으로 분석하여 경우에 따라, 성장, 유도 및 오염을 점검하였다. 브로쓰내로 분비된 유도된 단백질을 C18 컬럼 속에서 0.1% TFA/아세토니트릴 용매를 사용하는 HPLC로 분석하였다. 6시간 간격에서 HPLC 시료는 단백질 수준에 있어 점진적인 증가를 나타내었다(도 07). 발효 시료를 또한 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석함으로써 유도 시간에 따른 인슐린 전구체의 발현 및 이의 증가를 평가하였다(도 06).
유도 상 동안 발효 시료를 주기적으로 점검하여 아조카제인 검정에 의한 특정의 프로테아제 활성을 인지한다. 발효 조건을 최종 시료 속에 존재하는 총 단백질의 65% 이상인 인슐린 전구체의 고 수준 발현에 대해 최적화하였다. 결과는, 최종 시료 속에 존재하는 총 단백질이 2.3 g/L으로부터의 범위이며 인슐린 전구체는 1.5g/L임을 나타내었다.
실시예 4: 배양물의 수거 및 인슐린 전구체의 반응계내 포획
유도된 배양이 36 시간 이상이 될 때, 이를 발효기로부터 0.2μ 카트리지가 장착된 중공 섬유 수거 시스템내로 연동 펌프를 통해 펌핑한다. 투과물은 정화된 세포 비함유 브로쓰를 함유하며 농축물은 농축된 세포를 함유한다. 농축물과 세포를 발효기 용기에 신선한 배지와 함께 다시 재순환시켜 정상의 성장 및 용적을 유지한다(도 11).
정화된 세포 비함유 브로쓰를 함유하는 침투물을 강력한 양이온 교환체 수지, SP 세파로즈(설포프로필 기능적 유도체화된 메타크릴산 중합체 - GigaCap S 650, Toyopearl)로 충전된 컬럼을 통해 pH 3.0에서 단백질 포획을 위해 통과시켰다.
단백질 결합 후 컬럼을 pH 3.0 트리스 완충액의 2개 컬럼 용적으로 세척한다. 인슐린 전구체는 중합체 매트릭스에 선택적으로 결합하며 pH 8.0에서 트리스 완충액으로 용출시킨다. 인슐린 전구체의 크로마토그래피 순도는 HPLC로 점검한 것으로서 대략 75%이며(도 08) 단계 수율은 대략 90 %w/w이다.
실시예 5: 인슐린 전구체의 사람 인슐린으로의 반응계내 전환:
실시예 4에서 수득한 PIP를 트립신 매개된 분해 및 펩타이드전이를 통해 사람 인슐린으로 전환한 후 탈차단하였다. 이온 교환 컬럼으로부터 용출된 인슐린 전구체를 1kda MWCO TFF 카세트를 통과시키고 100 내지 200mg/ml로 농축시키고 이의 pH를 1N HCl을 사용하여 7.3으로 조절한다. 농축된 PIP를 1:1 v/v 디메틸 설폭사이드(DMSO):메탄올 속에 용해된 O-3급-부틸-L-트레오닌 3급-부틸 에스테르 아세테이트와 혼합한다. 반응 혼합물을 50 mM CaCl2 및 0.5% 아세트산으로 평형화시킨 TPCK-처리된 트립신 고정된 컬럼(냉각 자켓(jacket)이 장착된 25ml의 XK 컬럼)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 컬럼내로 완전히 로딩하는 경우, 컬럼은 2 내지 3시간 동안 폐쇄하여 반응 성분의 항온처리를 허용하고 컬럼 온도를 20℃로 유지한다. 이후에, 인슐린 부틸 에스테르로 전환된 인슐린 전구체를 용출시키고 HPLC로 점검한다(도 09).
반응계내에서 반응의 완료 후, TPCK 트립신 컬럼으로부터의 용출물을 탈차단 완충액, 즉, 트리플루오로아세트산(TFA) 중 0.1% 트립토판과 혼합하고, 실온에서 20분 동안 항온처리하고 결합을 위해 0.8 M 암모늄 설페이트를 갖는 100 mM 아세트산으로 평형화시킨 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼(PPG 650 M Toyopearl)내로 통과시킨다. 이후에, 컬럼을 0.4 M 암모늄 설페이트가 들어있는 100 mM 아세트산으로 2개 컬럼 용적에 대해 세척한다. 최종적으로 결합된 인슐린을 10OmM 아세트산으로 용출시키고 동결건조시켰다.
단계 수율 = 75%
크로마토그래피 순도 = 85 %
실시예 6: 사람 인슐린의 최종 연마(polishing)
실시예 5에서 수득된 사람 인슐린을 소 분자량 불순물 및 염으로부터 세파덱스 G25 매트릭스가 충전된 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로 추가로 정제하고 HPLC로 점검하며 분말 형태로 동결건조시킨다.
단계 수율 = 85%
크로마토그래피 순도 = 98.5 %
정제된 사람 인슐린은 HPLC 분석(도 10), SDS PAGE(15%)(도 13) 및 정제된 사람 인슐린의 웨스턴 블롯(도 14), 및 시판 제형과의 비교에 의해 영국 약전(British Pharmacopoeia) 2007하에 재조합체 사람 인슐린의 논문에서와 같은 품질 표준을 충족한다.
서열 목록
<160> 서열 번호들의 수: 28
<210> 서열 번호 1
<211> 길이: 138
<212> 유형: PRT
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 인슐린 전구체-분비물 시그널 융합 단백질
<400> 서열: 1
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu
85 90 95
Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys
115 120 125
Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
130 135
<210> 서열 번호 2
<211> 길이: 417
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 인슐린 전구체-분비물 시그널 융합 단백질 유전자
<400> 서열: 2
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ccagttaaca ccactactga agatgaaact gctcagattc cagctgaagc tgttattggt 120
tactctgatt tggaaggtga ttttgatgtt gctgttttgc cattttctaa ctctaccaac 180
aatggtttgt tgtttatcaa cactactatt gcttctattg ctgctaagga agaaggtgtt 240
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tacttggttt gtggtgaaag aggttttttc tacactccaa aggctgccaa gggtattgtt 360
gaacaatgtt gcacttcaat ctgttctttg taccaattgg agaactactg taactaa 417
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<210> 서열 번호 4
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<212> 유형: DNA
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<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R0)
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gctttggctg ctccagttaa caccactact gaaga 35
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<213> 유기체: 인공 서열
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<212> 유형: DNA
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<210> 서열 번호 13
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<212> 유형: DNA
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ggtagagtta gaaaatggca aaacagcaac atcaaaatc 39
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<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F182)
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<212> 유형: DNA
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<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F261)
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<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R316)
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<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F335)
<400> 서열: 22
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<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R354)
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<210> 서열 번호 24
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<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F371)
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ccaagggtat tgttgaacaa tgttgcactt caatctgt 38
<210> 서열 번호 25
<211> 길이: 39
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<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R390)
<400> 서열: 25
ttctccaatt ggtacaaaga acagattgaa gtgcaacat 39
<210> 서열 번호 26
<211> 길이: 41
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F409)
<400> 서열: 26
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<210> 서열 번호 27
<211> 길이: 46
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R429)
<400> 서열: 27
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<210> 서열 번호 28
<211> 길이: 25
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R450)
<400> 서열: 28
ccgcggatgt cagaatgcca tttgc 25
서열 목록
<160> 서열 번호들의 수: 28
<210> 서열 번호 1
<211> 길이: 138
<212> 유형: PRT
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 인슐린 전구체-분비물 시그널 융합 단백질
<400> 서열: 1
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
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85 90 95
Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys
115 120 125
Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
130 135
<210> 서열 번호 2
<211> 길이: 417
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 인슐린 전구체-분비물 시그널 융합 단백질 유전자
<400> 서열: 2
atgagatttc catctatttt cactgctgtt ttgtttgctg cttcttctgc tttggctgct 60
ccagttaaca ccactactga agatgaaact gctcagattc cagctgaagc tgttattggt 120
tactctgatt tggaaggtga ttttgatgtt gctgttttgc cattttctaa ctctaccaac 180
aatggtttgt tgtttatcaa cactactatt gcttctattg ctgctaagga agaaggtgtt 240
tctttggaga agagatttgt taaccaacac ttgtgcggtt ctcacttggt tgaagctttg 300
tacttggttt gtggtgaaag aggttttttc tacactccaa aggctgccaa gggtattgtt 360
gaacaatgtt gcacttcaat ctgttctttg taccaattgg agaactactg taactaa 417
<210> 서열 번호 3
<211> 길이: 44
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F0)
<400> 서열: 3
gactggttcc aattgacaag cggatccaaa cgatgagatt tcca 44
<210> 서열 번호 4
<211> 길이: 26
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R0)
<400> 서열: 4
gatccgcttg tcaattggaa ccagtc 26
<210> 서열 번호 5
<211> 길이: 37
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R19)
<400> 서열: 5
aaacagcagt gaaaatagat ggaaatctca tcgtttg 37
<210> 서열 번호 6
<211> 길이: 36
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F37)
<400> 서열: 6
tctattttca ctgctgtttt gtttgctgct tcttct 36
<210> 서열 번호 7
<211> 길이: 33
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R56)
<400> 서열: 7
ctggagcagc caaagcagaa gaagcagcaa aca 33
<210> 서열 번호 8
<211> 길이: 35
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F73)
<400> 서열: 8
gctttggctg ctccagttaa caccactact gaaga 35
<210> 서열 번호 9
<211> 길이: 37
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R89)
<400> 서열: 9
ggaatctgag cagtttcatc ttcagtagtg gtgttaa 37
<210> 서열 번호 10
<211> 길이: 36
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F108)
<400> 서열: 10
tgaaactgct cagattccag ctgaagctgt tattgg 36
<210> 서열 번호 11
<211> 길이: 37
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R126)
<400> 서열: 11
accttccaaa tcagagtaac caataacagc ttcagct 37
<210> 서열 번호 12
<211> 길이: 38
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F144)
<400> 서열: 12
ttactctgat ttggaaggtg attttgatgt tgctgttt 38
<210> 서열 번호 13
<211> 길이: 39
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R163)
<400> 서열: 13
ggtagagtta gaaaatggca aaacagcaac atcaaaatc 39
<210> 서열 번호 14
<211> 길이: 41
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F182)
<400> 서열: 14
tgccattttc taactctacc aacaatggtt tgttgtttat c 41
<210> 서열 번호 15
<211> 길이: 42
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R202)
<400> 서열: 15
aatagaagca atagtagtgt tgataaacaa caaaccattg tt 42
<210> 서열 번호 16
<211> 길이: 38
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F223)
<400> 서열: 16
aacactacta ttgcttctat tgctgctaag gaagaagg 38
<210> 서열 번호 17
<211> 길이: 36
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R244)
<400> 서열: 17
tctcttctcc aaagaaacac cttcttcctt agcagc 36
<210> 서열 번호 18
<211> 길이: 38
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F261)
<400> 서열: 18
tgtttctttg gagaagagat ttgttaacca acacttgt 38
<210> 서열 번호 19
<211> 길이: 36
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R280)
<400> 서열: 19
aaccaagtga gaaccgcaca agtgttggtt aacaaa 36
<210> 서열 번호 20
<211> 길이: 36
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F299)
<400> 서열: 20
gcggttctca cttggttgaa gctttgtact tggttt 36
<210> 서열 번호 21
<211> 길이: 38
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R316)
<400> 서열: 21
aaaaaacctc tttcaccaca aaccaagtac aaagcttc 38
<210> 서열 번호 22
<211> 길이: 36
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F335)
<400> 서열: 22
gtggtgaaag aggttttttc tacactccaa aggctg 36
<210> 서열 번호 23
<211> 길이: 36
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R354)
<400> 서열: 23
tgttcaacaa tacccttggc agcctttgga gtgtag 36
<210> 서열 번호 24
<211> 길이: 38
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F371)
<400> 서열: 24
ccaagggtat tgttgaacaa tgttgcactt caatctgt 38
<210> 서열 번호 25
<211> 길이: 39
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R390)
<400> 서열: 25
ttctccaatt ggtacaaaga acagattgaa gtgcaacat 39
<210> 서열 번호 26
<211> 길이: 41
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (F409)
<400> 서열: 26
tctttgtacc aattggagaa ctactgtaac taatagggcg g 41
<210> 서열 번호 27
<211> 길이: 46
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R429)
<400> 서열: 27
gcaaatggca ttctgacatc cgcggccgcc ctattagtta cagtag 46
<210> 서열 번호 28
<211> 길이: 25
<212> 유형: DNA
<213> 유기체: 인공 서열
<220> 특성:
<223> 다른 정보: 합성 올리고뉴클레오타이드 (R450)
<400> 서열: 28
ccgcggatgt cagaatgcca tttgc 25
<110> BIGTEC PRIVATE LIMITED
<120> A POLYNUCLEOTIDE AND POLYPEPTIDE SEQUENCE AND METHODS THEREOF
<130> 11-P-212
<150> 567/CHE/2009
<151> 2009-03-12
<160> 28
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 138
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin precursor-secretion signal fusion protein
<400> 1
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu
85 90 95
Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys
115 120 125
Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
130 135
<210> 2
<211> 417
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin precursor-secretion signal fusion protein gene
<400> 2
atgagatttc catctatttt cactgctgtt ttgtttgctg cttcttctgc tttggctgct 60
ccagttaaca ccactactga agatgaaact gctcagattc cagctgaagc tgttattggt 120
tactctgatt tggaaggtga ttttgatgtt gctgttttgc cattttctaa ctctaccaac 180
aatggtttgt tgtttatcaa cactactatt gcttctattg ctgctaagga agaaggtgtt 240
tctttggaga agagatttgt taaccaacac ttgtgcggtt ctcacttggt tgaagctttg 300
tacttggttt gtggtgaaag aggttttttc tacactccaa aggctgccaa gggtattgtt 360
gaacaatgtt gcacttcaat ctgttctttg taccaattgg agaactactg taactaa 417
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 3
gactggttcc aattgacaag cggatccaaa cgatgagatt tcca 44
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 4
gatccgcttg tcaattggaa ccagtc 26
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 5
aaacagcagt gaaaatagat ggaaatctca tcgtttg 37
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 6
tctattttca ctgctgtttt gtttgctgct tcttct 36
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 7
ctggagcagc caaagcagaa gaagcagcaa aca 33
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 8
gctttggctg ctccagttaa caccactact gaaga 35
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 9
ggaatctgag cagtttcatc ttcagtagtg gtgttaa 37
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 10
tgaaactgct cagattccag ctgaagctgt tattgg 36
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 11
accttccaaa tcagagtaac caataacagc ttcagct 37
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 12
ttactctgat ttggaaggtg attttgatgt tgctgttt 38
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 13
ggtagagtta gaaaatggca aaacagcaac atcaaaatc 39
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 14
tgccattttc taactctacc aacaatggtt tgttgtttat c 41
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 15
aatagaagca atagtagtgt tgataaacaa caaaccattg tt 42
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 16
aacactacta ttgcttctat tgctgctaag gaagaagg 38
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 17
tctcttctcc aaagaaacac cttcttcctt agcagc 36
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 18
tgtttctttg gagaagagat ttgttaacca acacttgt 38
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 19
aaccaagtga gaaccgcaca agtgttggtt aacaaa 36
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 20
gcggttctca cttggttgaa gctttgtact tggttt 36
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 21
aaaaaacctc tttcaccaca aaccaagtac aaagcttc 38
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 22
gtggtgaaag aggttttttc tacactccaa aggctg 36
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 23
tgttcaacaa tacccttggc agcctttgga gtgtag 36
<210> 24
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 24
ccaagggtat tgttgaacaa tgttgcactt caatctgt 38
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 25
ttctccaatt ggtacaaaga acagattgaa gtgcaacat 39
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 26
tctttgtacc aattggagaa ctactgtaac taatagggcg g 41
<210> 27
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 27
gcaaatggca ttctgacatc cgcggccgcc ctattagtta cagtag 46
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotides for gene construction
<400> 28
ccgcggatgt cagaatgcca tttgc 25
Claims (30)
- 서열 번호 2로 제시된 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 재조합 인간 인슐린 전구체 및 시그날 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 것인 폴리뉴클레오타이드.
- 서열 번호 1로 제시된 폴리펩타이드 서열을 갖는 재조합 인슐린 전구체 분자를 수득하는 방법에 있어서,
a) 서열 번호 3 내지 서열 번호 28의 26개의 올리고뉴클레오타이드들을 조립 PCR에 의해 결합하여 서열 번호 2로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 합성하고, 합성된 서열을 벡터 내로 삽입하는 단계,
b) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환한 후 항생제 스크리닝 숙주를 선택하는 단계, 및
c) 선택된 형질전환된 숙주 세포를 발효시키고 인슐린 전구체 분자를 반응계내(in-situ) 포획하여, 서열 번호 1로 제시된 폴리펩타이드 서열을 갖는 전구체를 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 인슐린 전구체 분자 수득 방법. - 제3항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 재조합 인간 인슐린 전구체 및 시그날 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드인 것인, 재조합 인슐린 전구체 분자 수득 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 합성된 폴리뉴클레오타이드 및 상기 벡터는 폴리뉴클레오타이드의 발현 벡터내 삽입을 위해 제한 효소 분해를 수행하는 것이고, 제한 효소는 BamHI, NotI, SacI, BgIII 및 SacII 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것인, 재조합 인슐린 전구체 분자 수득 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 벡터는 pPIC9K 및 pPICZα를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것이고, 상기 숙주는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 길리에르몬디이(Pichia guilliermondii) 및 피키아 카리비카(Pichia caribbica)를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것인, 재조합 인슐린 전구체 분자 수득 방법.
- 제3항에 있어서, 전구체 분자의 반응계내(in-situ) 포획은 중공 섬유 수거 시스템(hollow fibre harvesting system) 및 이온-교환 크로마토그래피 컬럼에 의해 수행되어 상기 전구체를 수득하는 것인, 재조합 인슐린 전구체 분자 수득 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열 번호 1로 제시된 폴리펩타이드 서열을 갖는 전구체 분자로부터 재조합 인슐린 분자를 수득하는 방법에 있어서,
a) 서열 번호 3 내지 서열 번호 28의 26개의 올리고뉴클레오타이드들을 조립 PCR에 의해 결합하여 서열 번호 2로 제시된 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 합성하는 단계,
b) 합성된 서열을 벡터내로 삽입하고 숙주 세포를 당해 벡터로 형질감염시킨 후 항생체 선별 숙주 선택을 수행하는 단계,
c) 선택된 형질전환된 숙주 세포를 발효시킨 후 인슐린 전구체 분자의 반응계내 포획을 위해 후속 공정(downstream processing)하는 단계, 및
d) 서열 번호 1로 제시된 폴리펩타이드 서열을 갖는 인슐린 전구체 분자를 재조합 인슐린 분자로 반응계내 전환시키는 단계를 포함하는, 재조합 인슐린 분자 수득 방법. - 제17항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 재조합 인간 인슐린 전구체 및 시그날 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드인 것인, 재조합 인슐린 분자 수득 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 합성된 폴리뉴클레오타이드 및 상기 벡터는 폴리뉴클레오타이드를 발현 벡터내로 삽입시키기 위한 제한 효소 분해에 적용되며, 제한 효소는 BamHI, NotI, SacI, BgIII 및 SacII 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것인, 재조합 인슐린 분자 수득 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 벡터는 pPIC9K 및 pPICZα를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것이고, 상기 숙주는 피키아 파스토리스, 피키아 메타놀리카, 피키아 구일리에르몬디이 및 피키아 카리비카를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것인, 재조합 인슐린 분자 수득 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 전구체 분자의 반응계내 포획은 중공 섬유 수거 시스템 및 이온-교환 크로마토그래피 컬럼에 의해 수행되어 전구체를 수득하는 것인, 재조합 인슐린 분자 수득 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 전구체 분자의 반응계내 전환은 상기 전구체 분자를 TFF 카세트 및 TPCK 트립신 고정화된 컬럼에 적용시킴으로서 수행되어 단백질 에스테르를 수득하는 것인, 재조합 인슐린 분자 수득 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 단백질 에스테르를 탈차단 완충액에 이어 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼에 적용시켜 상기 재조합 인슐린 분자를 수득하는 것인, 재조합 인슐린 분자 수득 방법.
- 서열 번호 2로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합체 벡터.
- 제24항에 있어서, 상기 벡터는 pPIC9K 및 pPICZα를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것인, 재조합체 벡터.
- 서열 번호 2로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 도입시킴으로써 형질전환된 재조합체 숙주 세포.
- 제26항에 있어서, 상기 숙주는 피키아 파스토리스, 피키아 메타놀리카, 피키아 구일리에르몬디이 및 피키아 카리비카를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것이고, 상기 벡터는 pPIC9K 및 pPICZα를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것인, 재조합체 숙주 세포.
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