KR20090124204A - 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이인터페론-베타 단백질을 생산하는 재조합 대장균 및 이의제조방법 - Google Patents

아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이인터페론-베타 단백질을 생산하는 재조합 대장균 및 이의제조방법 Download PDF

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이정식
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Abstract

본 발명은 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 재조합 대장균 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 재조합 사람 변이 인터페론-베타(rHu IFN-βSer17, IFN-β 1b) 유전자를 pET21a(+) 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17를 제조하고, 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 pSTV29 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 제조한 후, 이 두 재조합 발현벡터를 하나의 대장균에 형질전환시켜 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 재조합 대장균 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 재조합 대장균 및 이의 제조방법{Recombinant E. Coli producing recombinant human variation interferon-β protein removed amino terminal methionine and preparation method thereof}
본 발명은 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 재조합 대장균 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
재조합 미생물을 이용하여 필요한 단백질을 제조하는 방법이 급속도로 발전하여 왔다. 그러나, 일반적으로 유전자 재조합 기술로 발현된 단백질 생산물은 아미노 말단에 그 단백질 생산물의 유전자가 지정하는 아미노산 서열 이외에 추가로 메티오닌(N-met)을 가지는 비천연형의 재조합 단백질이 만들어지며, 대장균의 경우도 예외는 아니다. 재조합 단백질은 인체 내의 단백질과 동일한 구조를 가지지 못하므로, 체내 투여를 목적으로 하는 치료제용 재조합 단백질을 대장균으로부터 발현하여 생산할 경우, N-met은 숙주로부터 예기치 못했던 면역반응을 유발시키거나, 단백질 자체가 불안정하여 기능을 완전히 수행하지 못하기도 한다.
따라서, 이러한 재조합 단백질의 문제를 해결하기 위하여 다양한 방법들이 개발되어 왔다. 예를 들면, 아미노 말단에 위치한 메티오닌을 제거하기 위해 재조합 단백질을 생산하여 절단하는 방법(참조: WO 89/12678, EP 20209, EP 321940) 또는 재조합 단백질이 숙주세포 밖으로 분비되는 과정에서 메티오닌이 절단되도록 하는 방법(참조: EP 008832, USP 4,755,464) 등이 제안된 바 있다.
지금까지의 사람 인터페론-베타 생산방법은 크게 세 가지로 나누어 볼 수 있다. 첫째, 사람의 섬유아세포를 대량으로 키우면서 폴리 I, 폴리 C 및 시클로헥사미드로 슈퍼인덕션(Super Induction)시켜 얻는 방법이다. 이 방법은 사람 인터페론-베타 발견 후 그에 대한 기초연구를 위한 필요한 양만큼의 사람 인터페론-베타를 얻기 위해 사용된 방법으로 다량의 사람 인터페론-베타 단백질 생산방법으로는 매우 비효율적이다.
둘째, 사람 인터페론-베타 유전자를 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포와 같은 포유동물 세포에 재조합시켜서 사람 인터페론-베타 단백질을 생산하는 방법이다(McCormick, F. et al(1984) Mol. Cell. Biol. 4, 166). 이 방법은 첫째 방법에 비해서는 효율적이나, 이 역시 대량 생산하는데 있어서 대장균을 이용한 생산방법에 비해 비효율적이다.
셋째, 사람 인터페론-베타 유전자를 대장균 발현벡터에 재조합시킨 뒤, 대장균에서 사람 인터페론-베타 유전자를 생산하는 방법이다. 이 방법은 상기 두 방법과 비교할 경우, 생산율, 시간 및 비용면에서 볼 때 다량의 사람 인터페론-베타 단백질을 얻기에는 가장 효율적이다. 그러나, 대장균에서 생성되어 나오는 사람 인터페론-베타 단백질은 아미노 말단에 메티오닌이 붙어서 나오기 때문에 정제과정에서 이를 제거하여야 한다. 이로 인해 정제 과정에서 수율의 감소 및 정제공정의 추가로 인한 시간의 증가를 초래한다.
따라서, 아미노 말단의 메티오닌을 효율적으로 제거하여 대장균으로부터 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 인터페론-베타 단백질을 간편하면서 신속하게 대량 생산할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명자들은 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 대량 생산할 수 있는 방법에 대해 연구하던 중, 재조합 사람 변이 인터페론-베타(rHu IFN-βSer17, IFN-β 1b) 유전자를 pET21a(+) 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17를 제조하고, 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 pSTV29 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 제조한 후, 이 두 재조합 발현벡터를 하나의 대장균에 형질전환시켜 재조합 대장균을 제조하였으며, 이 재조합 대장균을 배양한 후 발현된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질에서 아미노 말단의 메티오닌이 제거되었음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 재조합 대장균 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 대장균으로부터 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질의 생산방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 재조합 대장균(KACC 95075P)을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 재조합 사람 변이 인터페론-베타(rHu IFN-βSer17, IFN-β 1b) 유전자를 pET21a(+) 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17를 제조하는 단계,
2) 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 pSTV29 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 제조하는 단계, 및
3) 상기 1)단계에서 제조한 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17과 상기 2)단계에서 제조한 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 하나의 대장균에 형질전환시켜 재조합 대장균(E. coli BL21(DE3): pET21a(+)IFN-βSer17: pSTV29Map; KACC 95075P)을 제조하는 단계를 포함하는, 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 재조합 대장균의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 형질전환된 대장균(KACC 95075P)을 배양하여 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 발현시킨 후, 이를 수집 및 정제하여 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 재조합 대장균은 재조합 사람 변이 인터페론-베타(rHu IFN-βSer17, IFN-β 1b) 유전자를 pET21a(+) 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17를 제조하고, 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 pSTV29 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 제조한 후, 이 두 재조합 발현벡터를 하나의 대장균에 형 질전환시킨 것을 특징으로 한다.
본 발명의 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 재조합 대장균의 제조방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 재조합 대장균의 제조방법에서 상기 1)단계는 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17를 제조하는 단계이다. 먼저, 사람 T 림프구 cDNA library를 주형으로 하고 프라이머쌍(서열번호 1 및 2)을 이용하여 DNA 중합효소 연쇄반응을 수행하여 사람 인터페론-베타 유전자를 증폭시킨다. 증폭된 사람 인터페론-베타 유전자와 pUC118 벡터를 제한효소인 EcoRⅠ으로 절단하여 재분리 및 정제한 후 혼합한다. 이 혼합물에 T4 DNA 리가아제를 첨가하고, 16℃에서 4시간 동안 반응시킨다. 이 혼합물을 하나한(Hanahan)법에 서술된 열 충격(Heat shock) 방법으로 대장균 (DH5α)에 형질전환시켜 발현벡터 pUC118IFN-β를 제조한다. 이 증폭된 유전자의 아미노산 중 17번째 아미노산을 세린으로 변이시켜 발현벡터 pUC118IFN-βSer17를 제조한 후, 이를 pET21a(+) 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17를 제조한다.
상기 pET21a(+) 벡터는 T7 프로모터 직후에 lac 오퍼레이터 서열을 삽입하고 lacⅠ 유전자에 의해 목적 단백질의 발현을 제어함으로써 플라스미드의 안정성을 유지하고, 또한 lac 조절인자를 과잉 생산함으로써 lacUV 프로모터 조절하의 T7 RNA 합성효소의 발현을 억제하게 된다. 이 벡터의 복합 클로닝 부위(MCS)에 재조합 사람 변이 인터페론-베타 유전자를 삽입함으로써 손쉽게 단백질의 발현을 조절할 수 있다.
본 발명의 재조합 대장균의 제조방법에서 상기 2)단계는 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 제조하는 단계이다. 대장균 K12를 주형으로 하여 프라이머쌍(서열번호 7 및 8)을 이용하여 DNA 중합효소 연쇄반응을 수행하여 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 증폭시킨다. 증폭된 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 pSTV29 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 제조한다.
상기 pSTV29는 pACYC184의 복제기점을 갖고 있기 때문에 pUC, pBR 등의 플라스미드 벡터와 공존이 가능하고, Tn9의 클로람페니콜 내성 유전자를 가지고 있어, pET21a(+) 벡터와도 항생제 내성에 따른 구별을 할 수 있다. pSTV29 벡터의 복합 클로닝 부위(MCS)에 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 삽입함으로써 lac 프로모터를 이용한 발현을 조절할 수 있다.
본 발명의 재조합 대장균의 제조방법에서 상기 3)단계는 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17과 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 하나의 대장균에 형질전환시켜 재조합 대장균(E. coli BL21(DE3): pET21a(+)IFN-βSer17: pSTV29Map; KACC 95075P)을 제조하는 단계이다.
pET21a(+) 벡터 내에 있는 pBR322 오리진은 pUC, pBR 등의 플라스미드와 공존할 수 있는 pSTV29 벡터를 넣을 수 있어 하나의 대장균 내에 두 개의 플라스미드가 공존할 수 있는 둘 벡터 시스템(Two Vector System)을 구축할 수 있게 한다. 따 라서, pET21a(+) 벡터에 재조합 사람 변이 인터페론-베타 유전자를 삽입하고, pSTV29 벡터에 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 삽입함으로써 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질의 메티오닌 제거가 가능한 것으로 생각된다.
상기 방법에 의해 제조된 형질전환된 대장균(KACC 95075P)을 엠피실린과 클로람테니콜을 포함한 LB 배지에 접종하여 37℃에서 진탕배양한다. 배양액의 OD600 값이 0.4~0.6이 되었을 때, IPTG를 첨가하여 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 발현시킨다. 이를 수집 및 정제하여 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 대량 생산한다.
본 발명에 따른 재조합 대장균의 제조방법은, 세포 내에서 단백질이 합성되어 생산되는 과정 중에 아미노 말단의 메티오닌이 제거되도록 하여 정제 과정에서 메티오닌을 따로 제거해 주는 공정 없이 단백질을 정제할 수 있으므로 공정의 단계를 줄여 재조합 단백질을 간편하고 신속하게 대량생산할 수 있으며, 수율을 높일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질은 체내투여를 목적으로 하는 치료제용 재조합 단백질에 적합하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 재조합 사람 변이 인터페론-베타 발현벡터( pET21a (+)IFN-β Ser17 ) 의 제작
1-1. 재조합 발현벡터 pUC118IFN -β의 제조
사람 인터페론-베타 유전자를 확보하기 위하여, 표 1에 기재된 바와 같이 프라이머의 서열 내에 EcoR Ⅰ의 제한효소 자리가 존재하도록 제작하였다. 제작된 2개의 프라이머의 염기서열을 서열번호 1과 서열번호 2로 각각 기재하였다. 이때 각 프라이머는 제노텍사(한국)에 의뢰하여 합성하였다. 사람 인터페론-베타 유전자를 얻기 위하여 클론텍사의 사람 T-림프구 cDNA library를 주형으로 하여 DNA 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
염기서열
프라이머 1 (서열번호 1) 5'-GAA GAA TTC ATG AGC TAC-3' EcoRⅠ
프라이머 2 (서열번호 2) 5'-TTC GAA TTC TCA GTT TCG GAG-3' EcoRⅠ
DNA 중합효소 연쇄반응은 주형 DNA 100ng, 100pmole 프라이머 1 및 프라이머 2, 최종농도 각각 2mM의 dNTP 혼합물(TaKaRa), 10X Pfu 완충용액 10uL, Pfu 중합효소(Stratagene) 1uL를 포함하는 총 부피 100uL의 PCR 반응 혼합물을 이용하여 수행하였다. 중합효소 연쇄반응은 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 72℃에서 30초를 한 주기로 하여 25회 반복 수행하였다. 이후, 1% 아가로오스 겔 전기영동을 수행하여 증폭된 PCR 산물을 확인하였다. 결과는 도 4에 나타내었다. 이후, QIA퀵 겔 추출 킷(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)을 이용하여 겔로부터 사람 인터페론-베타 유전자를 분리하고, 정제하였다.
타카라사의 pUC118 벡터와 DNA 중합효소 연쇄반응으로 얻은 PCR 산물인 사람 인터페론-베타 유전자를 뉴잉글랜드 바이오랩사(NEB)의 제한효소인 EcoRⅠ으로 절단하여 재분리 및 정제하였다. 정제된 DNA 절편과 pUC118 벡터를 잘 혼합한 다음, T4 DNA 리가아제를 첨가하고, 16℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 이 혼합물을 하나한법에 서술된 열 충격 방법으로 대장균(DH5α)에 형질전환시켜 발현벡터 pUC118IFN-β를 제조하였다. 솔젠트사(한국)의 플라스미드 정제 키트를 이용하여 형질전환된 미생물로부터 재조합 발현벡터 pUC118IFN-β를 얻었다.
1-2. 재조합 발현벡터 pUC118IFN -β Ser17 의 제조
클로닝한 사람 인터페론-베타 유전자의 아미노산 중 17번째 시스테인을 세린으로 바꾸기 위하여 돌연변이생성(mutagenesis)을 실시하였다. 이를 위해 표 2에 기재된 바와 같이, 프라이머 서열의 N 말단에 인산기를 붙여 제작하였다. 제작된 2개의 프라이머의 염기서열을 서열번호 3과 서열번호 4로 각각 기재하였다. 이때 각 프라이머는 제노텍사(한국)에 의뢰하여 합성하였다. 사람 인터페론-베타 유전자를 함유하는 pUC118을 주형으로 하여 DNA 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
염기서열
프라이머 3 (서열번호 3) 5'-ⓟ-AGA AGC AGC AAT TTT CAG AGT CAG AAG-3'
프라이머 4 (서열번호 4) 5'-ⓟ-TTG CCA CAG GAG CTT CTG ACT CTG-3'
DNA 중합효소 연쇄반응은 주형 DNA 100ng, 100pmole 프라이머 3 및 프라이머 4, 최종농도 각각 2mM의 dNTP 혼합물(TaKaRa), 10X Pfu 완충용액 10uL, Pfu 중합효소(Stratagene) 1uL를 포함하는 총 부피 100uL의 PCR 반응 혼합물을 이용하여 수행하였다. 중합효소 연쇄반응은 94℃에서 30초; 55℃에서 1분; 68℃에서 8분을 한 주기로 하여 14회 반복 수행하였다. 이후, 뉴잉글랜드 바이오랩사(NEB)의 제한효소인 DpnⅠ으로 메틸기가 붙어있는 주형의 DNA들을 절단하여 재분리 및 정제하였다. 이 정제된 DNA를 하나한법에 서술된 열 충격 방법으로 대장균(DH5α)에 형질전환시켜 발현벡터 pUC118IFN-βSer17를 제조하였다. 솔젠트사(한국)의 플라스미드 정제 키트을 이용하여 형질전환된 미생물로부터 재조합 발현벡터 pUC118IFN-βSer17을 얻었다.
1-3. 재조합 발현벡터 pET21a (+)IFN-β Ser17 의 제조
사람 변이 인터페론-베타 유전자를 클로닝하기 위하여, 표 3에 기재된 바와 같이 프라이머의 서열 내에 NdeⅠ과 BamHⅠ의 제한효소 자리가 존재하도록 제작하였다. 제작된 2개의 프라이머의 염기서열을 서열번호 5와 서열번호 6으로 각각 기재하였다. 이때 각 프라이머는 제노텍사(한국)에 의뢰하여 합성하였다.
염기서열
프라이머 5 (서열번호 5) 5'-ATA TAC ATA TGA GCT ACA ACT TG-3' NdeⅠ
프라이머 6 (서열번호 6) 5'-TTC GGA TCC TCA GTT TCG GAG-3' BamHⅠ
DNA 중합효소 연쇄반응은 주형 DNA 100ng, 100pmole 프라이머 5 및 프라이머 6, 최종농도 각각 2mM의 dNTP 혼합물(TaKaRa), 10X Pfu 완충용액 10uL, Pfu 중합효소(Stratagene) 1uL를 포함하는 총 부피 100uL의 PCR 반응 혼합물을 이용하여 수행하였다. 중합효소 연쇄반응은 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 72℃에서 30초를 한 주기로 하여 25회 반복 수행하였다. 이후, 1% 아가로오스 겔 전기영동을 수행하여 증폭된 PCR 산물을 확인하였다. 결과는 도 5에 나타내었다. 이후, QIA퀵 겔 추출 킷(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)을 이용하여 겔로부터 사람 변이 인터페론-베타 유전자를 분리하고, 정제하였다.
노바젠사의 pET21a(+) 벡터와 DNA 중합효소 연쇄반응으로 얻은 PCR 산물인 사람 변이 인터페론-베타 유전자를 뉴잉글랜드 바이오랩사(NEB)의 제한효소인 NdeⅠ과 BamHⅠ으로 절단하여 재분리 및 정제하였다. 정제된 DNA 절편과 pET21a(+) 벡터를 잘 혼합한 다음, T4 DNA 리가아제를 첨가하고, 16℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 이 혼합물을 하나한법에 서술된 열 충격 방법으로 대장균(DH5α)에 형질전환시켜 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17를 제조하였다. QIAGEN사(독일)의 플라스미드 정제 킷을 이용하여 형질전환된 미생물로부터 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17를 얻었다. 재조합 발현 벡터 pET21a(+)IFN-βSer17의 제작 과정은 도 3에 나타내었다.
실시예 2 : 재조합 메티오닌 아미노펩티다제 발현벡터( pSTV29Map )의 제작
메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 클로닝하기 위하여, 표 4에 기재된 바와 같이 프라이머의 서열 내에 EcoRⅠ과 BamHⅠ의 제한효소 자리가 존재하도록 제작하였다. 제작된 2개의 프라이머의 염기서열을 서열번호 7과 서열번호 8로 각각 기재하였다. 이때 각 프라이머는 제노텍사(대전, 한국)에 의뢰하여 합성하였다. 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 얻기 위하여 대장균 K12를 주형으로 하여 DNA 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
염기서열
프라이머 7 (서열번호 7) 5'-GGA ATT CAC GTA TCC CAT ATT ACC GAC CCC AAA GG-3' EcoRⅠ
프라이머 8 (서열번호 8) 5'-CGG GAT CCA TCT TAT TCG TCG TGC GAG ATT ATC GC-3' BamHⅠ
DNA 중합효소 연쇄반응은 주형 DNA로 대장균 K12 콜로니, 100pmole 프라이머 7 및 프라이머 8, 최종농도 각각 2mM의 dNTP 혼합물(TaKaRa), 10X Taq 완충용액 10uL, Taq 중합효소(TaKaRa) 1uL를 포함하는 총 부피 100uL의 PCR 반응 혼합물을 이용하여 수행하였다. 중합효소 연쇄반응은 94℃에서 1분; 55℃에서 1분; 72℃에서 1분을 한 주기로 하여 25회 반복 수행하였다. 이후, 1% 아가로오스 겔 전기영동을 수행하여 증폭된 PCR 산물을 확인하였다. 결과는 도 7에 나타내었다. 이후, QIA퀵 겔 추출 킷(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)을 이용하여 겔로부터 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 분리하고, 정제하였다.
타카라사(일본)의 pSTV29 벡터와 DNA 중합효소 연쇄반응으로 얻은 PCR 산물인 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 뉴잉글랜드 바이오랩사(NEB)의 제한효소인 EcoRⅠ과 BamHⅠ으로 절단하여 재분리 및 정제하였다. 정제된 DNA 절편과 pSTV29 벡터를 잘 혼합한 다음, T4 DNA 리가아제를 첨가하고, 16℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 이 혼합물을 하나한법에 서술된 열 충격 방법으로 대장균(DH5α)에 형질전환시켜 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 제조하였다. QIAGEN사(독일)의 플라스미드 정제 킷을 이용하여 형질전환된 미생물로부터 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 얻었다.
재조합 발현벡터 pSTV29Map의 제작과정은 도 6에 나타내었다.
실시예 3 : 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 재조합 대장균의 제조
상기 실시예 1과 2에서 제작한 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17와 pSTV29Map을 하나한 방법에 서술된 열 충격 방법으로 대장균(BL21 (DE3))에 형질전환시켰다. 형질전환된 재조합 대장균(E. coli BL21(DE3): pET21a(+)IFN-βSer17: pSTV29Map)을 2008년 3월 12일자로 한국농업미생물자원센터에 기탁하였다(KACC 95075P).
재조합 발현 벡터인 pET21a(+)IFN-βSer17과 pSTV29Map을 하나의 대장균에 형질전환하여, 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 둘 벡터 시스템이 구축된 미생물의 제작과정은 도 8에 나타내었다.
상기 형질전환된 재조합 대장균을 100㎍/mL 엠피실린과 6.8㎍/mL 클로람페니콜을 포함한 LB배지 5mL에 접종하여 배양한 후, QIAGEN사(독일)의 플라스미드 정제 킷을 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 정제한 플라스미드를 뉴잉글랜드 바이오랩사(New England Biolabs Ins.)의 제한효소 BamHⅠ을 사용하여 37℃에서 한 시간 동안 절단한 후, 1% 아가로오스 겔에 전기영동 하였다. 전기영동 결과는 도 9에 나타내었다(레인 M: 1kb DNA ladder(인트론 바이오, 한국), 레인 1: 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 추출하여 BamHⅠ으로 절단한 벡터).
도 9에 나타난 바와 같이, 아가로오스 겔의 레인 1에 두 개의 플라스미드가 있음을 확인하였다. 따라서, 재조합 발현 벡터인 pET21a(+)IFN-βSer17와 pSTV29Map가 하나의 대장균에 형질전환 되었음을 확인하였다.
실시예 4 : 재조합 대장균을 이용한 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질의 발현
상기 실시예 3에서 제조한 재조합 대장균(E. coli BL21(DE3): pET21a(+)IFN-βS er 17: pSTV29Map; KACC 95075P)을 100㎍/mL 엠피실린과 6.8㎍/mL 클로람페니콜을 포함한 LB 배지 250 mL에 접종하여, 37℃ 진탕 배양기에서 배양하였다. 배양액의 OD600 값이 0.4~0.6이 되었을 때, IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질의 발현을 유도시켰다. 이후, 4시간 정도 더 배양하여 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질의 발현을 진행시켰다.
실시예 5 : 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질의 확인
재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질이 발현된 균체를 나트륨 세척 용액으로 현탁한 다음, 세포 파쇄기(압력 방식)을 이용하여 파쇄하였다. 파쇄액으로부터 불용성 응집체(Inclusion body) 형태의 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 수거하고, 세척하였다. 세척한 불용성 응집체는 단백질로서 활성을 갖지 못하기 때문에 생물학적 활성을 가진 수용성 단백질로 전환시키기 위해 용해 용액을 사용하여 불용성 응집체 형태의 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 녹이고, 환원과정 및 산화과정을 통해 재폴딩(refolding)을 거친다. 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 분석하기 위해, 분자량 크기에 따라 분리하는 세파크릴 S200 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
5-1. 웨스턴 블럿을 통한 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질의 확인
정제된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 인비트로젠사(Invitrogen)의 14% 트리스-글리신 겔에 전기영동을 실시하여 분자량을 확인하였다. 또한 R&D사의 사람 인터페론-베타 단일 항체(Monoclonal Anti-human IFN-β Antibody)를 이용하여 웨스턴 블럿을 실시하여 인터페론-베타 단백질의 유무를 확인하였다. 전기영동 및 웨스턴 블럿 결과는 도 10에 나타내었다.
5-2. 겔 이미지 분석 시스템을 통한 분자량 측정
정제된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질의 분자량을 좀더 세밀히 측정하기 위하여, 단백질 전기영동법에 의한 겔 결과를 코아바이오사(한국)의 겔 이미지 분석 시스템(i-MAXTM Gel Image Analysis System)으로 촬영 후, 알파 인노테크사(Alpha Innotech Corporation)의 알파이지 소프트웨어(AlphaEaseFCTM Software, version 4.0.0)를 이용하여 분자량을 계산하였다. 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 정제된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질의 분자량은 18.761 kDa 이었다. 이는 알려진 사람 인터페론-베타 단백질의 크기인 18.5(±1000) kDa과 비교하여 같음을 확인하였다.
5-3. 아미노 말단 염기서열 분석을 통한 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질에서 아미노 말단의 메티오닌 제거 확인
재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17과 pSTV29Map로 형질전환된 재조합 대장균으로부터 발현된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질에서 아미노 말단의 메티오닌이 제거되었는지를 확인하기 위하여, 정제된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 단백질 전기영동을 실시하고, 이를 PVDF 멤브레인에 옮겼다. 이 옮겨진 PVDF 멤브레인을 한국기초과학지원연구원 서울센터 메타볼롬분석 연구팀에 아미노 말단 염기서열분석(N-termianl Amino Acid Sequencing)을 의뢰하였다. 분석기기로는 Procise 491 HT protein sequencer(Applied Biosystems, USA)를 이용하였다.
결과는 도 12a 및 도 12b에 나타내었다.
도 12a 및 도 12b에 나타난 바와 같이, 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17과 pSTV29Map로 형질전환된 재조합 대장균으로부터 발현된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질에서 아미노 말단의 메티오닌이 제거되었음을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 재조합 대장균의 제조방법은, 세포 내에서 단백질이 합성되어 생산되는 과정 중에 아미노 말단의 메티오닌이 제거되도록 하여 정제 과정에서 메티오닌을 따로 제거해 주는 공정 없이 단백질을 정제할 수 있으므로 공정의 단계를 줄여 재조합 단백질을 간편하고 신속하게 대량생산할 수 있으며, 수율을 높일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질은 체내투여를 목적으로 하는 치료제용 재조합 단백질에 적합하다.
도 1은 사람 변이 인터페론-베타 유전자(rHu IFN-βSer17, IFN-β 1b)의 염기서열 및 아미노산 염기서열을 나타낸 도이다.
도 2는 메티오닌 아미노펩티다제 유전자의 염기서열 및 아미노산 염기서열을 나타낸 도이다.
도 3은 사람 T 림프구 cDNA library에서 PCR에 의해 증폭된 사람 인터페론-베타 유전자를 17번째 아미노산이 세린이 되도록 변이시킨 후, 발현 벡터인 pET21a(+)에 삽입시킨 재조합 발현 벡터 pET21a(+)IFN-βSer17의 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 PCR에 의해 증폭된 사람 인터페론-베타 유전자의 단편을 확인하기 위하여 1% 아가로오스 겔 전기영동을 수행한 결과를 나타낸 겔 사진이다(레인 M: 1kb Plus DNA ladder(인비트로젠사), 레인 1: 증폭된 사람 인터페론-베타 유전자).
도 5는 PCR에 의해 증폭된 사람 변이 인터페론-베타 유전자의 단편을 확인하기 위하여 1% 아가로오스 겔 전기영동을 수행한 결과를 나타내는 겔 사진이다(레인 M: 1kb Plus DNA ladder(인비트로젠사), 레인 1: 증폭된 사람 변이 인터페론-베타 유전자).
도 6는 PCR에 의해 증폭된 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 재조합 발현 벡터와 공존할 수 있는 pSTV29 벡터에 삽입시켜 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 제작하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 7은 PCR에 의해 증폭된 메티오닌 아미노펩티다제 유전자의 단편을 확인하기 위하여 1% 아가로오스 겔 전기영동을 수행한 결과를 나타낸 겔 사진이다(레인 M: 1kb Plus DNA ladder(인비트로젠사), 레인 1: 증폭된 메티오닌 아미노펩티다제 유전자).
도 8은 재조합 발현 벡터인 pET21a(+)IFN-βSer17과 pSTV29Map을 하나의 대장균에 형질전환시켜, 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 둘 벡터 시스템(Two Vector System)이 구축된 미생물의 제작과정을 나타낸 모식도이다.
도 9는 재조합 발현 벡터인 pET21a(+)IFN-βSer17와 pSTV29Map가 하나의 대장균에 형질전환 되었음을 확인하기 위해, 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 추출하여 제한효소 BamHⅠ으로 절단 후, 1% 아가로오스 겔에 전기영동한 결과를 나타낸 도이다(레인 M: 1kb DNA ladder(인트론 바이오, 한국), 레인 1: 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 추출하여 BamHⅠ으로 절단한 벡터).
도 10은 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질에 대한 전기영동(SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis) 및 웨스텐 블럿(Western blot) 결과를 나타낸 사진이다(레인 M: SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard(인비트로젠사), 레인 1: 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질).
도 11은 도 10의 단백질 전기영동법에 의한 겔 결과를 코아바이오사(한국)의 겔 이미지 분석 시스템(i-MAXTM Gel Image Analysis System)으로 촬영 후, 알파 인노테크사(Alpha Innotech Corporation)의 알파이지 소프트웨어(AlphaEaseFCTM Software, version 4.0.0)를 이용하여 분자량을 계산한 결과를 나타낸 도이다(레인 M: SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard(인비트로젠사), 레인 1: 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질).
도 12a 및 도 12b는 둘 벡터 시스템이 구축된 재조합 미생물로부터 발현된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질에서 아미노 말단의 메티오닌이 제거되었음을 확인하기 위해, 한국기초과학지원연구원에 N-말단 아미노산 염기서열 확인 시험(N-terminal Sequencing)을 의뢰한 결과를 나타낸 도이다.
<110> BiocurePharm Co., Ltd. <120> Recombinant E. Coli producing recombinant human variation interferon-b protein removed amino terminal methionine and preparation method thereof <130> P08-05625 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 : EcoRI restriction site <400> 1 gaagaattca tgagctac 18 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 : EcoRI restriction site <400> 2 ttcgaattct cagtttcgga g 21 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 : phosphoric acid attached N-terminal <400> 3 agaagcagca attttcagag tcagaag 27 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 : phosphoric acid attached N-terminal <400> 4 ttgccacagg agcttctgac tctg 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 : NdeI restriction site <400> 5 atatacatat gagctacaac ttg 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 : BamHI restriction site <400> 6 ttcggatcct cagtttcgga g 21 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 : EcoRI restriction site <400> 7 ggaattcacg tatcccatat taccgacccc aaagg 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 : BamHI restriction site <400> 8 cgggatccat cttattcgtc gtgcgagatt atcgc 35

Claims (3)

  1. 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 재조합 대장균(KACC 95075P).
  2. 1) 재조합 사람 변이 인터페론-베타(rHu IFN-βSer17, IFN-β 1b) 유전자를 pET21a(+) 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17를 제조하는 단계,
    2) 메티오닌 아미노펩티다제 유전자를 pSTV29 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 제조하는 단계, 및
    3) 상기 1)단계에서 제조한 재조합 발현벡터 pET21a(+)IFN-βSer17과 상기 2)단계에서 제조한 재조합 발현벡터 pSTV29Map을 하나의 대장균에 형질전환시켜 재조합 대장균(E. coli BL21(DE3): pET21a(+)IFN-βSer17: pSTV29Map; KACC 95075P)을 제조하는 단계를 포함하는, 제 1항의 재조합 대장균의 제조방법.
  3. 제 2항에 의해 제조된 재조합 대장균(KACC 95075P)을 배양하여 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 발현시킨 후, 이를 수집 및 정제하여 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 사람 변이 인터페론-베타 단백질을 생산하는 방법.
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