CN112063622A - I型ifnar功能缺失的细胞系的构建方法及其应用 - Google Patents

I型ifnar功能缺失的细胞系的构建方法及其应用 Download PDF

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黄梅
向程威
刘定祥
董楠
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Abstract

本发明公开了用于特异性靶向IFNAR1基因的sgRNA、用于CRISPR/Cas9敲除IFNAR1基因的质粒，以及I型IFNAR功能缺失的细胞系的构建方法，成功构建得到了I型IFNAR功能缺失的DF‑1细胞系，为干扰素及其调控基因的全功能研究；病原微生物复制、调控、致病机制的研究；抗病药物筛选等提供了研究工具。

Description

I型IFNAR功能缺失的细胞系的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及I型IFNAR功能缺失的细胞系的构建方法及其应用，更具体地，涉及利用CRISPR/Cas9技术构建I型IFNAR功能缺失的DF-1细胞系的方法，构建得到的DF-1细胞系，以及该细胞系的应用。
背景技术
干扰素(IFN)是指在特定诱导剂作用下，由细胞产生的一组具有高度生物学活性的糖蛋白。现已证明干扰素在生物体中普遍存在，是生物体内一种古老的保护因子，在免疫应答调控中处于中心地位。根据IFN与其结合受体的不同原则，将干扰素分为I型，Ⅱ型与III型。
I型IFN的细胞表面受体为I型IFNAR，IFNAR由两个亚基组成，分别称为低亲和力亚基IFNAR1和高亲和力亚基IFNAR2，其中IFNAR1是IFNAR的一个重要亚单位蛋白，与IFN结合及生物信号转导有关。一旦与I型IFN结合，IFNAR便激活JAK-STAT信号通路以及MAPK，PI3K和Akt信号通路并导致下游基因转录变化，可增加或抑制2000多种不同基因的转录。例如，I型IFN诱导干扰素刺激基因(ISG)的表达，ISG不仅可调控细胞的生物学功能更重要的是对入侵病原微生物的复制产生强烈的抑制效应。此外，IFN通过影响细胞的分化，增殖，凋亡和自噬，在很大程度上影响细胞的健康和生存能力。
目前大量有关病原微生物对IFN及其上下游调控因子的研究多采用瞬间过表达和siRNA介导的暂时性抑制来进行。这些方法虽具有较大的灵活性但缺乏稳定性，及效果严重受细胞的转染效率影响，限制了对IFN及其调控基因的全功能研究，如寻找与IFN调控机理相关的病原分子以及IFN下游因子。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于特异性靶向IFNAR1基因的sgRNA。
本发明的目的之二在于提供一种用于CRISPR/Cas9敲除IFNAR1基因的质粒。
本发明的目的之三在于提供一种I型IFNAR功能缺失的细胞系的构建方法。
本发明的目的之四在于提供一种I型IFNAR功能缺失的DF-1细胞系。
本发明的目的之五在于提供I型IFNAR功能缺失的DF-1细胞系的应用。
为达到上述目的之一，本发明提供如下技术方案一：
一种用于特异性靶向IFNAR1基因的sgRNA，所述IFNAR1基因含有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
为达到上述目的之二，本发明提供如下技术方案二：
一种用于CRISPR/Cas9敲除IFNAR1基因的质粒，所述IFNAR1基因含有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，所述质粒含有sgRNA，所述如sgRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
所述质粒由所述sgRNA和载体连接得到，任何可用载体均可以实现本发明的技术方案，优选地，所述载体为PX459载体。
为达到上述目的之三，本发明提供如下技术方案三：
一种I型IFNAR功能缺失的细胞系的构建方法，包括以下步骤：
构建用于敲除IFNAR1基因的质粒；
将用于敲除IFNAR1基因的质粒转染至宿主细胞，得到转染细胞；
将转染细胞培养筛选得到I型IFNAR功能缺失的细胞系；
其中，所述IFNAR1基因含有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，所述用于敲除IFNAR1基因的质粒中含有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的sgRNA。
需要说明的是：本发明的构建方法适用于任何鸡源细胞或基它物种，只要它们的干挠素I型受体基因序例含有与本专利应用的sgRNA靶位相同的序列都能通此专利应用的方法制备干挠素I型受体功能缺陷型细胞系。优选地，所述宿主细胞为DF-1细胞。
所述sgRNA与载体连接，得到所述用于敲除IFNAR1基因的质粒。任何可用载体均可以实现本发明的技术方案，优选地，所述载体为PX459载体。
任何转染方式均可实现本发明的技术方案，优选地，所述转染为阳离子脂质体介导的转染。
为达到上述目的之四，本发明提供如下技术方案四：
一种I型IFNAR功能缺失的DF-1细胞系，所述DF-1细胞系表达突变型IFNAR1，所述突变型IFNAR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
作为上述方案的进一步改进，所述DF-1细胞系含有编码所述突变型IFNAR1的核苷酸。
作为上述方案的进一步改进，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.4所示。
为达到上述目的之五，本发明提供如下技术方案五：
通过技术方案二中构建方法得到的细胞系或技术方案四所述的I型IFNAR功能缺失的DF-1细胞系在以下至少之一中的应用：
干扰素及其调控基因的全功能研究；
病原微生物复制、调控、致病机制研究；
抗病药物筛选。
本发明的有益效果是：
本发明提供了用于特异性靶向IFNAR1基因的sgRNA、用于CRISPR/Cas9敲除IFNAR1基因的质粒，以及I型IFNAR功能缺失的细胞系的构建方法，成功构建得到了I型IFNAR功能缺失的DF-1细胞系，为干扰素及其调控基因的全功能研究，如寻找与干扰素调控机理相关的病原分子以及干扰素下游因子；病原微生物，如病毒，复制、调控、致病机制的研究；抗病药物筛选等提供了不可多得的研究工具。
附图说明
图1DF1-WT和KO IFNAR1培养12-96h时的细胞表型；
图2DF1-WT和KO IFNAR1的细胞生长曲线；
图3DF1-WT和KO IFNAR1感染后IRF1的mRNA水平；
图4DF1-WT和KO IFNAR1感染后VIPERIN的mRNA水平。
具体实施方式
本部分将详细描述本发明的具体实施例，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的仪器，试剂如下：
CO2恒温培养箱Forma 371(Thermo公司，美国)；超净工作台SW-CJ-2FD(苏州安泰空气技术有限公司，中国江苏)；生物安全柜1300SERIES A2(Thermo公司，美国)；倒置光学显微镜(Nikon公司，日本)；高速离心机Centrifuge 5804R(Eppendorf公司，德国)；移液器Research plus(Eppendorf公司，德国)；PCR仪C1000 Touch(Bio-Rad公司，美国)；电泳仪Power Pac Basic(Bio-Rad公司，美国)；垂直电泳槽Mini Protean Tetra(Bio-Rad公司，美国)；凝胶成像系统2500(R)(Tanon公司，中国上海)。
TIAN prep Mini Plasmid Kit(DP103-03)购自天根生化科技(北京)有限公司；Gel Extraction Kit(D2500-02)购自OMEGA；M-MLVRT(2641A)购自TAKARA；RRI(2313A)购自TAKARA；Random 6primer(3801)购自TAKARA；Agarose(E0301)购自TSINGK；0.25％Trypsin-EDTA(25200-056)，DMEM basic(C11995500BT)购自Gibco；Lipofectamine LTX and PlusReagent(15338-100)购自Invitrogen；FBS(10099-141C)购自Gibco；Premix-Taq(RR902A)购自TAKARA；Pen Strep penicillin Streptomycin(15140-122)购自Gibco；Prime STARGXL(R050)购自TAKARA；T4 DNA连接酶及其他常用限制性内切酶均购自TAKARA；Trizol15596-026购自Invitrogen；氯仿，异丙醇，无水乙醇等生化试剂购自宁波萃英化学技术有限公司。CCK-8试剂盒购自赛默飞，抗DTMUV E蛋白抗体，抗VIPERIN抗体由武汉百意欣生物有限购公司制备。坦布苏病毒DTMUV QY17(GenBank Accession No.MT447092)由华农(肇庆)生物产业技术研究院提供。
本发明实施例中使用的PX459质粒来自于微旋基因公司。克隆载体pMD19T-Vector和大肠杆菌感受态细胞DH5α购自大连宝日医生物有限公司。
本发明实施例涉及的测序及引物合成均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例1构建用于敲除IFNAR1基因的sgRNA质粒pX459-sgIFNAR1
1.设计筛选得到下面两条sgRNA：
sgRNA-F：CTAATGTGGAACTACACTGG(SEQ ID NO：1)；
sgRNA-R：CCAGTGTAGTTCCACATTAG(SEQ ID NO：2)。
2.在sgRNA两端加上Bbsl酶切位点(斜体)
sgRNA-F：CACCgCTAATGTGGAACTACACTGG
sgRNA-R：AAACCCAGTGTAGTTCCACATTAGc
将上述引物送生物工程公司合成。
3.将引物磷酸化修饰和退火，具体操作如下：
用蒸馏水重悬sgRNA到终浓度100μM，按下述方法加磷酸基团和退火。
Figure BDA0002667567090000051
Figure BDA0002667567090000061
4.将PX459载体通过Bbsl酶切：
Figure BDA0002667567090000062
琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并用胶回收试剂盒回收线性化后的片段。
5.将按上述方法制备好的sgRNA与线性化的PX459连接
Figure BDA0002667567090000063
Figure BDA0002667567090000071
室温连接半小时。
6.将上述连接产物直接用于转化DH5a感受态细菌(大连宝日医生物有限公司),并按厂家说明书进行转化。
7.挑取单克隆细菌扩增培养，并用TIAN prep Mini Plasmid Kit提取质粒DNA提质粒，命名为PX459-IFNAR1并送生物公司测序验证。质粒DNA的提取完全按试剂盒的指导方法进行。
实施例2筛选IFNAR1功能缺失细胞系
1.将DF-1细胞培养于30mm瓶皿，24h之内用PX459-IFNAR1质粒进行转染。转染使用赛默飞Lipofectamine LTX DNA Transfection Reagents转染试剂盒，并严格按试剂盒指导方法进行转染。
2.待转染细胞培养36小时后在培养皿内加入嘌呤霉素使其终浓度为5μg/ml，并坚持每3天用含嘌呤霉素(5μg/ml)的细胞培养液更换一次。(如果细胞密度太大需将细胞稀释培养以利于筛选单个细胞系。)10天后改为用不含嘌呤霉素的细胞培养液每5天更换一次，直到有明显的细胞群落出现(约需2-3周)。我们挑选了4个细胞群落进行单群落细胞培养，并将这些细胞株命名为DF1-dIFNAR-1，DF-dIFNAR-2，DF1-dIFNAR-3，DF-dIFNAR-4。细胞培养液为含10％FBS的DMEM-F2培养基。
3.鉴定DF-dIFNAR1细胞株的突变IFNAR1基因。
分别从上述4个细胞株单独提取细胞全基因组DNA，并用Premix Taq(TAKARA)和引物F:GCTTACAATCACCCGTGGCA；R:ACCAGTTACACTCGTGCTGG进行PCR。将PCR产物纯化后分别用T4链接酶链接到pMD19-T载体。经细菌转化，质粒提取后分别用M13F/M3R引物检测这4个质粒的核苷酸序列。结果显示4个PCR产物中有3个出现缺失性突变。经测序显示，与野生型IFNAR1基因(SEQ ID NO：5)相比，突变型IFNAR1基因(SEQ ID NO：4)的第232(T)和第233(A)核苷酸丢失了，该碱基的丢失造成了氨基酸移码突变，突变造成第52个氨基酸(N)以后移码并提前终止，突变型IFNAR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
SEQ ID NO：3：
MAETACASGRLAAVLLCVLVVVSRCCAGQTNLKSPQDIQVYAVNTNFTLM
WNHWRWYQRDIFSTIPVL
斜体字部分为异常IFNAR1序列，其余为正常IFNAR1序列。
实施例3鉴定IFNAR1突变细胞株(KO IFNAR1)的生物学功能
1.细胞生长特性
图1示野生型DF-1(DF1-WT)和KO IFNAR1细胞培养12-96h时的细胞表型。结果示二者无明显差异。12-36h细胞生长良好，48h后由于接触性抑制细胞出现衰老甚至老死亡(空泡)。
用CCK法测定DF1-WT和KO IFNAR1细胞活力并绘制生长曲线。方法如下：
将细胞悬液接种于96孔板中，100μl/每孔，每个时间点设置3孔，置37℃，5％CO2培养。每隔12小时取出细胞每孔加入10μl CCK-8，轻轻混匀，避免产生气泡，再置回培养箱孵育4小时后用酶标仪测定450nm吸收值。计算3孔的平均值和标准误，作图。
结果(图2)显示二者无明显差异。二者完成1个复制周期(对倍增殖)的时间均在24h左右。后期受接触性抑制影响细胞逐渐死亡。
2.鉴定KO IFNAR1的I型IFNAR功能
坦布苏病毒(TDTMUV)感染鸡成纤维细胞DF-1会诱导I型干扰素产生并通过与I型IFNAR结合激活干扰素信号通路诱导大量ISG表达。其中一个重要的ISG基因就是IRF1。IRF1进一步作用于抗病毒基因VIPERIN的mRNA转录调控区，增强VIPERIN表达。如果细胞的I型IFNAR功能受损，这些调控过程将不能顺利进行，以至于病毒感染后不能诱导IRF1和VIPERIN表达。下面的实验结果证明了KO IFNAR1有严重的I型IFNAR功能缺失。
以1MOI的DTMUV分别感染DF1-WT以及KO IFNAR1细胞，并分别在感染后8h，16h，24h和48h搜集细胞，提取总RNA。然后进行RT-qPCR定量检测IRF1和VIPERIN的mRNA水平。
细胞培养与病毒感染操作方法如下：
细胞培养液：含10％FBS的DMEM-F12
细胞培养箱：37℃，5％CO2
病毒感染：将细胞培养于6-孔或30mm细胞培养皿内，待其95％-100％后弃去细胞培养液，用无菌PBS轻洗2次后加500ul含约1个MOI病毒量的含1％FBS的DMEM-F12培养基。将细胞置回细胞培养箱孵育2h后再弃去培养液，用无菌PBS轻洗2次后加1ml含1％FBS的DMEM-F12培养基，置回细胞培养箱继续培养。
上述涉及细胞，病毒的实验均在超净工作台进行。
RT-qPCR定量检测方法如下：
总RNA用TRIzol(Invitrogen)提取。RT(reverse-transcription)用PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara)试剂盒，qPCR(quantitative PCR)用
Figure BDA0002667567090000091
Premix Ex TaqTM II Kid试剂盒(Applied Biosystems公司)。所有反应完全按照厂家提供的方法进行。RT引物为随机引物(Random 6primer#3801)，PCR引物序列见下表。
Figure BDA0002667567090000092
qPCR用QuantStudio 3Real-Time PCR System(Applied Biosystems公司)方法进行分析。标准反应包括50℃ for 3min，95℃ for 3min,然后40个循环反应(95℃,5s，60℃,30s)。上述IRF 1和VIPERIN mRNA水平分别通过用IRF1和VIPERIN的q-PCR值除以同一样本中的GAPDH值所获的相对值来表示。通过这种标准化处理排除人为实验误差。
其结果如下：如图3所示，病毒感染DF1-WT细胞16h，24h和48h后，IRF1 mRNA水平分别增加了约11，110和90倍；而用同样方法感染KO IFNAR1细胞，在同一时间点IRF1 mRNA水平仅有微弱的上升，其值约为2，8和6倍上升。同样，如图4所示，病毒感染DF1-WT细胞16h，24h和48h后，VEIPERIN mRNA水平分别增加了约600，2500和2000倍；而用同样方法感染KOIFNAR1细胞，在同一时间点VIPERIN mRNA水平仅有微弱的上升，约为2，8和17倍上升。
序列表
<110> 华农（肇庆）生物产业技术研究院
<120> I型IFNAR功能缺失的细胞系的构建方法及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
ctaatgtgga actacactgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
ccagtgtagt tccacattag 20
<210> 3
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 3
Met Ala Glu Thr Ala Cys Ala Ser Gly Arg Leu Ala Ala Val Leu Leu
1 5 10 15
Cys Val Leu Val Val Val Ser Arg Cys Cys Ala Gly Gln Thr Asn Leu
20 25 30
Lys Ser Pro Gln Asp Ile Gln Val Tyr Ala Val Asn Thr Asn Phe Thr
35 40 45
Leu Met Trp Asn His Trp Arg Trp Tyr Gln Arg Asp Ile Phe Ser Thr
50 55 60
Ile Pro Val Leu
65
<210> 4
<211> 2425
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
catctttgca gccagagcag gccgcgtgcg cagtcgtcag aggcttccgg taagggtgag 60
cgcagccacg gactgatggc tgagacggcg tgtgcctctg ggcggctagc ggctgtgctg 120
ctttgtgtcc tggtcgtggt gtcccggtgc tgtgcaggcc agactaatct gaagagtcct 180
caggatattc aggtttatgc tgtaaataca aatttcaccc taatgtggaa ctacactgga 240
gatggtacca acgtgacatt ttcagcacaa taccagtgct ttgatgatct tcagacaagt 300
gaaccagaat ggaaggaatt atctggttgc cagaatgtca gtcacacaga atgtgacttt 360
tcttcagcaa taactgcata ctatgatacg catcacatcc gcataagggc tgaaagaagg 420
gaagccaagt ctccatggtc tagcattttc gaaatgattc cgtatgaaat agctcagatt 480
ggtccccctg aaatagcgtt gcagtccata aatggagcca ttaaaattaa catttctcct 540
ccagaagcaa atcaggttcg aaaaatgtgg ctaatttctg tgttttttaa atacaatgta 600
gttatctggg acaattcatc caatgtagaa aaggtcagaa gtattttacc cattgatgta 660
ataaatgatc ttgctccaga gactacctat tgtttgaaag ttcaagcaac tgttcctctg 720
gaggataaag gaggcctgtt cagtccaatt cattgcataa aaaccacccg taaagtaaat 780
gaccttcttt gcccaacaaa tgtgagagtt tttgctttga acatgaaatt ctatctgctt 840
tgggataatc actataacga acatgtgacc tataccgtac agtatctcac tgggtaccta 900
aagaaccttt atgatgatta ctcctcaaag tggcagaagg tatcaggatg tgagaacatc 960
actagcatga aatgcaattt gtcatctgtc atcaaaccta cttcggcatc ttattacttc 1020
cgtgtgcagg ctatgaatga atatagtaaa tcatgtttgt ctaaagacgt agaagtagat 1080
cctccggtaa caaatgaaat tggccctcct gatgtaaagg tggacatcag tgatgttttg 1140
ctccatatca agattactcc tccaggagga cctgggaata aaatcatgag tgacctttat 1200
gatttctctt accagattct gtattggaag aattcatcag ataatgagga ggaagtaaaa 1260
atgaaagaaa caaaacagac aatagcgaca gtctctgatc tggcaccctc gactttgtac 1320
tgtgtgaaag tacaagcgtt ctcagaagct tacaacaaaa gcagtgattt cagcagagag 1380
gaatgcatcg gaacagctgg cggtaaacac ttacctctga tcattttagc aacatttgca 1440
ggtgcgctga ctgttgtctt gattgtggca tcactggtca tttttttcct gtatcaagtc 1500
tataataaaa tcaagtacat gttctttcct tcatgccaga ctcctctgaa catagagggc 1560
ttcggagcac agctctttag cagtccattt gtgcctactg tagaagaacc ggtagaaatt 1620
tgttacataa ttgagagtag gatcacagaa gaagtaaatc aaattgactt taaagacaac 1680
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caaagcaaag ggtcagaaga aacactagga aatgacatac tataactttt atgggaataa 1800
aatccaaata tgggacttgt agtataataa acacttgaac ttttttttat tatgaaagtc 1860
tttggccaaa tgaagactgt atgactttgg gatcctcgtt ctgaagtttc caaatctgca 1920
ctttgttact ggagaattac ataccttctc tgctgccggc tgactgcagt taaagcacgc 1980
tggagtcctg gtagcttaca ccattctgac tgaatagtca tctcatgata aaaggaatac 2040
catctgaata cagagaagag atccgtatgc ttcgtatact tgaacctgat aaccttgatg 2100
aaagcctact gtgttgcaca agaaggattt ctctcttaca ggtttatttt gagtgccagt 2160
gtatactttg acagagtcct tagattatct ttacacaggc agaagaaagt tgatgccagg 2220
taccatttca agtacttctc tgacatcttc cagccccatt ggagacagtg ttttttgagt 2280
cagtaggtcc agagcaaagt atgcaaagaa gacgacagcc tcagtgaggc aactcctctg 2340
aacatccgtg tagaattcct tacagccgtg gctgccaggt actcccagtg cccacttcca 2400
tgtatgtgaa gttatgtatc ggggt 2425
<210> 5
<211> 2423
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
catctttgca gccagagcag gccgcgtgcg cagtcgtcag aggcttccgg taagggtgag 60
cgcagccacg gactgatggc tgagacggcg tgtgcctctg ggcggctagc ggctgtgctg 120
ctttgtgtcc tggtcgtggt gtcccggtgc tgtgcaggcc agactaatct gaagagtcct 180
caggatattc aggtttatgc tgtaaataca aatttcaccc taatgtggaa ccactggaga 240
tggtaccaac gtgacatttt cagcacaata ccagtgcttt gatgatcttc agacaagtga 300
accagaatgg aaggaattat ctggttgcca gaatgtcagt cacacagaat gtgacttttc 360
ttcagcaata actgcatact atgatacgca tcacatccgc ataagggctg aaagaaggga 420
agccaagtct ccatggtcta gcattttcga aatgattccg tatgaaatag ctcagattgg 480
tccccctgaa atagcgttgc agtccataaa tggagccatt aaaattaaca tttctcctcc 540
agaagcaaat caggttcgaa aaatgtggct aatttctgtg ttttttaaat acaatgtagt 600
tatctgggac aattcatcca atgtagaaaa ggtcagaagt attttaccca ttgatgtaat 660
aaatgatctt gctccagaga ctacctattg tttgaaagtt caagcaactg ttcctctgga 720
ggataaagga ggcctgttca gtccaattca ttgcataaaa accacccgta aagtaaatga 780
ccttctttgc ccaacaaatg tgagagtttt tgctttgaac atgaaattct atctgctttg 840
ggataatcac tataacgaac atgtgaccta taccgtacag tatctcactg ggtacctaaa 900
gaacctttat gatgattact cctcaaagtg gcagaaggta tcaggatgtg agaacatcac 960
tagcatgaaa tgcaatttgt catctgtcat caaacctact tcggcatctt attacttccg 1020
tgtgcaggct atgaatgaat atagtaaatc atgtttgtct aaagacgtag aagtagatcc 1080
tccggtaaca aatgaaattg gccctcctga tgtaaaggtg gacatcagtg atgttttgct 1140
ccatatcaag attactcctc caggaggacc tgggaataaa atcatgagtg acctttatga 1200
tttctcttac cagattctgt attggaagaa ttcatcagat aatgaggagg aagtaaaaat 1260
gaaagaaaca aaacagacaa tagcgacagt ctctgatctg gcaccctcga ctttgtactg 1320
tgtgaaagta caagcgttct cagaagctta caacaaaagc agtgatttca gcagagagga 1380
atgcatcgga acagctggcg gtaaacactt acctctgatc attttagcaa catttgcagg 1440
tgcgctgact gttgtcttga ttgtggcatc actggtcatt tttttcctgt atcaagtcta 1500
taataaaatc aagtacatgt tctttccttc atgccagact cctctgaaca tagagggctt 1560
cggagcacag ctctttagca gtccatttgt gcctactgta gaagaaccgg tagaaatttg 1620
ttacataatt gagagtagga tcacagaaga agtaaatcaa attgacttta aagacaacaa 1680
acattttaaa cagagcagtc gagattcagg gaattattct tacgacgata atacctcaca 1740
aagcaaaggg tcagaagaaa cactaggaaa tgacatacta taacttttat gggaataaaa 1800
tccaaatatg ggacttgtag tataataaac acttgaactt ttttttatta tgaaagtctt 1860
tggccaaatg aagactgtat gactttggga tcctcgttct gaagtttcca aatctgcact 1920
ttgttactgg agaattacat accttctctg ctgccggctg actgcagtta aagcacgctg 1980
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gtaggtccag agcaaagtat gcaaagaaga cgacagcctc agtgaggcaa ctcctctgaa 2340
catccgtgta gaattcctta cagccgtggc tgccaggtac tcccagtgcc cacttccatg 2400
tatgtgaagt tatgtatcgg ggt 2423

Claims (10)

1.用于特异性靶向IFNAR1基因的sgRNA，所述IFNAR1基因含有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，其特征在于，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.用于CRISPR/Cas9敲除IFNAR1基因的质粒，所述IFNAR1基因含有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，其特征在于，所述质粒含有sgRNA，所述如sgRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的质粒，其特征在于，所述质粒由所述sgRNA和PX459载体连接得到。
4.一种I型IFNAR功能缺失的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建用于敲除IFNAR1基因的质粒；
将用于敲除IFNAR1基因的质粒转染至宿主细胞，得到转染细胞；
将转染细胞培养筛选得到I型IFNAR功能缺失的细胞系；
其中，所述IFNAR1基因含有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，所述用于敲除IFNAR1基因的质粒中含有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的sgRNA。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA与PX459载体连接，得到所述用于敲除IFNAR1基因的质粒。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述转染为阳离子脂质体介导的转染。
7.I型IFNAR功能缺失的DF-1细胞系，其特征在于，所述DF-1细胞系表达突变型IFNAR1，所述突变型IFNAR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
8.根据权利要求7所述的DF-1细胞系，其特征在于，所述DF-1细胞系含有编码所述突变型IFNAR1的核苷酸。
9.根据权利要求8所述的DF-1细胞系，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.4所示。
10.权利要求7～9任一项所述的DF-1细胞系在以下至少之一中的应用：
干扰素及其调控基因的全功能研究；
病原微生物复制、调控、致病机制研究；
抗病药物筛选。
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