JP2024515300A

JP2024515300A - ユニバーサルクローニングアダプターを含むアルファウイルスベクター

Info

Publication number: JP2024515300A
Application number: JP2023563825A
Authority: JP
Inventors: スティーブンワンナサニエル; ジョセフミヤケ－ストナーシゲキ; チーアー－ツォンチョウアニー
Original assignee: リプリケイトバイオサイエンス，インコーポレイティド
Priority date: 2021-04-21
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2024-04-08
Also published as: KR20230172527A; CA3213502A1; EP4326746A1; WO2022226019A1; AU2022262341A1

Abstract

本開示は、分子ウイルス学の分野に関し、改変ウイルスゲノム又はレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を含む核酸分子、それを含む医薬組成物、及び細胞培養物中又は生体内で所望の産物を産生するためのそのような核酸分子および組成物の使用を含む。また、それを必要とする対象において免疫応答を調節するための方法と様々な健康状態を予防および／又は治療するための方法も提供される。【選択図】図９

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年４月２１日に出願された米国仮特許出願シリアル番号第６３／１７７，６５６号の優先権の利益を主張する。上記出願の開示は、図面を含め、援用によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

本開示は、分子ウイルス学および免疫学の分野に関するものであり、そして、特に、改変ウイルスゲノムおよびレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）をコードする核酸分子、それを含む医薬組成物、及び細胞培養物中又は生体内で所望の産物を産生するためのそのような核酸分子および組成物の使用に関する。また、それを必要とする対象において免疫応答を調節するための方法と様々な健康状態を予防および／又は治療するための方法も提供される。

シーケンスリストの組み込み
添付のシーケンスリストの資料は、援用により本出願に組み込まれる。添付のシーケンスリストのテキストファイルは、０５８４６２－５０３００１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられ、２０２２年４月１２日に作成され、２２７ＫＢである。

近年、いくつかの異なる動物ウイルス群が、相同組換え又はゲノムの直接工学的操作によって遺伝子操作の対象となっている。ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスの逆遺伝学システムの利用可能性は、例えば、ワクチン、発現ベクター、抗腫瘍剤、遺伝子治療ベクター、および薬物送達ビヒクルとしての組換えウイルスの使用に新たな展望を生み出している。

例えば、培養組換え細胞における異種タンパク質の発現のために、多くのウイルスベースの発現ベクターが配備されてきた。例えば、宿主細胞における遺伝子発現のための改変ウイルスベクターの応用は拡大し続けている。この点に関する最近の進歩は、マルチサブユニットタンパク質複合体の生産のための技術やシステムのさらなる開発、及び異種タンパク質生産を改善するためのタンパク質修飾酵素の共発現を含む。ウイルス発現ベクター技術に関するその他の最近の進歩は、遺伝子発現を制御するための多くの高度なゲノム工学的応用、ウイルスベクターの調製、インビボ遺伝子治療応用、及びワクチンデリバリーベクターの作成を含む。

しかし、ＲＮＡレプリコンベースの発現プラットフォームで目的の産物を発現させるための、より効率的な方法およびシステムが依然として必要とされている。

本開示は、一般に、増殖障害および微生物感染のような様々な健康状態の予防および管理に使用するための組換え核酸構築物およびそれを含む医薬組成物のような免疫治療薬の開発に関する。特に、以下により詳細に記載するように、本開示のいくつかの実施形態は、改変アルファウイルスのゲノム又はレプリコンをコードする配列を含む核酸構築物であって、改変アルファウイルスのゲノム又はレプリコンＲＮＡのウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分が、改変アルファウイルスのゲノム又はレプリコンＲＮＡをコードする配列への異種配列の挿入を容易にするように構成された合成アダプター分子によって置換されている、核酸構築物を提供する。また、レプリコンＲＮＡの３’末端がアデニル酸残基のみを含むＤＮＡ鋳型を作製するためのポリ（Ａ）配列の後に制限酵素部位が挿入されている、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡをコードする配列を含む核酸構築物も開示する。特定の理論に束縛されることなく、アデニル酸残基のみを含むアルファウイルスレプリコンＲＮＡは、レプリコンＲＮＡの生物学的活性を増強すると考えられている。また、本明細書に開示される核酸構築物の１又は複数を含むように操作された組換え細胞およびトランスジェニック動物、目的の分子を産生するための方法、ならびに医薬組成物も開示される。本開示の特定の態様では、それを必要とする対象における免疫応答を調節するため、および／又は増殖性障害（例えば、がん）および慢性感染症を含む種々の健康状態の予防および／又は治療のための組成物および方法が、さらに提供される。

本開示の１つの態様では、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む核酸構築物が本明細書において提供され、ここで、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡのウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分が、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡへの異種配列の挿入を容易にするように構成された合成アダプター分子によって置換されており、そして、合成アダプター分子は、以下の式Ｉを有する：

ここで、ｎは１～６の整数であり；

前記制限部位が制限エンドヌクレアーゼにより切断可能であり；そして、

前記５’フランキングドメインおよび３’フランキングドメインはそれぞれ、最小限の二次構造を有すると予測される核酸配列を含む。

本開示の核酸構築物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１又は複数を含んでもよい。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、ステムループ構造を形成することができるＲＮＡ配列をコードする配列を含まない。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインの配列は、予め定義された閾値よりも高い最小自由エネルギー（ＭＦＥ）構造のフォールディングΔＧ値を有する。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、自己タンパク質分解ペプチドのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、自己タンパク質分解ペプチドのコード配列は、制限部位の上流に組み込まれる。いくつかの実施形態では、自己タンパク質分解ペプチドは、カルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼ（ｆｕｒｉｎ）、豚テシオウイルス－１２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質ポリヘドロシスウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、Ｆｌａｃｈｅｒｉｅウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、又はそれらの組み合わせに由来する１又は複数の自己タンパク質分解切断配列を含む。いくつかの実施形態では、自己タンパク質分解ペプチドのコード配列は、制限部位の上流に組み込まれる。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。

いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、いずれのリーディングフレームにも翻訳開始部位を含まない。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、５’アダプター配列の最後のヌクレオチドとして翻訳開始部位又はその一部を含む。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、５’アダプター配列の最後の３ヌクレオチドとしてメチオニンコドンを含む。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、約１５ヌクレオチド～約３５ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、約３０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、配列番号１の配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインの配列は、予め定義された閾値よりも高い最小自由エネルギー（ＭＦＥ）構造のフォールディングΔＧ値を有する。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、ステムループ構造を形成することができるＲＮＡ配列をコードする配列を含まない。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、３’アダプター配列の最初の３ヌクレオチドとして翻訳終止コドンを含む。いくつかの実施形態では、終止コドンは、ＴＡＧ、ＴＡＡ、又はＴＧＡから選択される。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、合成アダプター分子の５’フランキングドメインは、そのすぐ上流に位置する配列（例えば、ｓｇＲＮＡの５’ＵＴＲ内）又はそのすぐ下流に位置する配列（例えば、ＧＯＩのコード配列内）とステムループ構造を形成することができるＲＮＡ配列をコードしない。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、そのすぐ上流に位置する配列（例えば、ＧＯＩのコード配列内）又はすぐ下流に位置する配列（例えば、３’ＵＴＲ内）とステムループ構造を形成することができるＲＮＡ配列をコードしない。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインおよび／又は３’フランキングドメインは、３’ＵＴＲ内に位置する配列と相補性を有する配列を含まない。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインおよび／又は３’フランキングドメインは、３’ＵＴＲの３’末端と相補性を有する配列を含まない。

いくつかの実施形態では、合成アダプター分子は、配列番号２０に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、制限部位は、Ｉ型制限酵素、ＩＩ型制限酵素、ＩＩＩ型制限酵素、ＩＶ型制限酵素、およびＶ型制限酵素から選択される制限酵素により切断可能である。いくつかの実施形態では、制限部位は、ＩＩ型制限酵素により切断可能である。いくつかの実施形態では、制限部位は、ＳｐｅＩ又はそのアイソシゾマーにより切断可能である。いくつかの実施形態では、ＳｐｅＩのアイソシゾマーは、ＡｈＩＩ、ＢｃｕＩ、又はＳｐｅＩ－ＨＦである。

いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡのポリ（Ａ）テールをコードする配列に組み込まれた追加の制限部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の制限部位は、アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡのポリ（Ａ）テールをコードする配列の末端に組み込まれる。いくつかの実施形態では、追加の制限部位は、ＩＩＳ型制限酵素又はホーミングエンドヌクレアーゼによって切断可能である。いくつかの実施形態では、ＩＩＳ型制限酵素は、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｅＩ、ＢｂｉＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｓＩ－ＨＦ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＩ－ＨＦ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ－ｖ２、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ－ｖ２、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｐｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ，又はＳｆａＮＩである。いくつかの実施形態では、追加の制限部位は、ＳａｐＩ又はそのアイソシゾマーによって切断可能である。いくつかの実施形態では、ＳａｐＩのアイソシゾマーは、ＬｇｕＩ、ＰｃｉＳＩ、又はＢｓｐＱＩである。いくつかの実施形態では、追加の制限部位は、ホーミングエンドヌクレアーゼによって切断可能である。いくつかの実施形では、ホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩである。

いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、効率的なマイナス鎖合成に十分であると以前に考えられていた１１残基よりも長いポリ（Ａ）テールをコードする延長された配列を含む。いくつかの実施形態では、延長されたポリ（Ａ）テールは３４残基より長く、２５残基のポリ（Ａ）テールと比較して複製をさらに増強することはこれまで観察されていない。いくつかの実施形態では、延長されたポリ（Ａ）テールは、約３０～約１２０アデニル酸残基の範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、延長されたポリ（Ａ）テールは、約１２０アデニル酸残基の長さを有する。いくつかの実施形態では、延長されたポリ（Ａ）テールは、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、および約１００アデニル酸残基の長さを有する。

いくつかの実施形態では、改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡは、トガウイルス科アルファウイルス属に属するウイルスのものである。いくつかの実施形態では、改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶグループ、又はＳＦＶグループ、又はＳＩＮＶグループに属するアルファウイルスのものである。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドルバーグウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ホワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキーウイルス（ＢＡＢＶ）キジラガッチェウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウイルス（ＦＭＶ）、ヌドゥムウイルス（ＮＤＵＶ）、又はバギークリークウイルスである。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、又はシンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）である。

いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、１又は複数の発現カセットをさらに含み、発現カセットの各々は、異種核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットの少なくとも１つは、異種核酸配列に作動可能に連結されたサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇプロモーターは、２６Ｓサブゲノムプロモーターである。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、１又は複数の非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＵＴＲの少なくとも１つは、異種ＵＴＲである。

いくつかの実施形態では、発現カセットの少なくとも１つは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩコード配列は、合成アダプター分子の３’フランキングドメインの上流に位置する終止コドンを含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、抗体、抗原、免疫モジュレーター、酵素、シグナルタンパク質、およびサイトカインからなる群より選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルで発現するように最適化される。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡをコードする核酸構築物を直鎖化するために使用される制限酵素部位を含まない。いくつかの実施形態では、核酸構築物はベクター内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ベクターは自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターである。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号：３～２７からなる群より選択される核酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。

一態様では、本明細書に記載の核酸構築物を含む組換え細胞が、本明細書で提供される。関連する態様では、本明細書に記載される少なくとも１つの組換え細胞および培養培地を含む細胞培養物が本明細書で提供される。本開示の組換え細胞の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１又は複数を含んでもよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、原核細胞又は真核細胞である。いくつかの実施形態では、組換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、組換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は脊椎動物細胞又は無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、組換え細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、アフリカミドリザル腎臓細胞（Ｖｅｒｏ細胞）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒトＡ５４９細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒトＣＨＭＥ５細胞、ヒト表皮喉頭細胞、ヒト線維芽細胞、ヒトＨＥＫ－２９３細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、ヒトＨｅｐＧ２細胞、ヒトＨＵＨ－７細胞、ヒトＭＲＣ－５細胞、ヒト筋肉細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウス結合組織細胞、マウス筋肉細胞、及びウサギ腎臓細胞からなる群より選択される。

別の態様では、本明細書に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック動物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック哺乳動物は非ヒト哺乳動物である。

別の態様では、組換えＲＮＡ分子を産生するための方法が、本明細書において提供され、前記方法は、組換えＲＮＡ分子がトランスジェニック動物によって、又は組換え細胞において産生されるような条件下で、（ｉ）本明細書に記載のトランスジェニック動物を飼育すること、又は（ｉｉ）本明細書に記載の組換え細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック動物又は組換え細胞であって、そして、組換えＲＮＡ分子をコードする配列が、ポリ（Ａ）テールをコードする配列の末端の後に設計された制限部位を切断することができる制限酵素によって任意に分解され、ポリ（Ａ）テールおよび３’末端にアデニル酸残基のみを有するＲＮＡをコードする鋳型を生成する。従って、本明細書に記載の方法に従って産生される組換えＲＮＡ分子もまた、本開示によって提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子は、増強された生物学的活性を示す。

別の態様では、目的のポリペプチドを産生するための方法が、本明細書において提供され、前記方法は、ＧＯＩによってコードされるポリペプチドがトランスジェニック動物によって、又は組換え細胞において産生される条件下で、（ｉ）本明細書に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック動物を飼育すること、又は（ｉｉ）本明細書に記載の核酸構築物を含む組換え細胞を培養することを含む。別の態様では、目的のポリペプチドを産生するための方法が本明細書で提供され、前記方法は、本明細書に記載の核酸構築物を対象に投与することを含む。本開示の方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１又は複数を含み得る。いくつかの実施形態では、対象は、脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物対象である。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象はヒト対象である。従って、本明細書に記載の方法に従って産生される組換えポリペプチドもまた、本開示によって提供される。

一態様では、薬学的に許容される賦形剤および以下の：（ａ）本明細書に記載の核酸構築物；（ｂ）本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子；（ｃ）本明細書に記載の組換え細胞；および（ｄ）本明細書に記載の組換えポリペプチドを１又は複数含む医薬組成物が、本明細書において提供される。

本開示の医薬組成物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１又は複数を含んでもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される核酸構築物、および薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の組換え細胞、および薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子、および薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の組換えポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、リポソーム、脂質ベースのナノ粒子（ＬＮＰ）、又はポリマーナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物はワクチンとして製剤化される。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、バイオ治療薬、例えば、生物活性を有する異なる分子の遺伝子送達のためのビヒクルとして製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象に対して実質的に非免疫原性である。いくつかの実施形態では、非免疫原性組成物は、ワクチンとして製剤化される。いくつかの実施形態では、非免疫原性組成物は、バイオ治療薬として製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとして製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経鼻投与、経皮投与、腹腔内投与、筋肉内投与、結節内投与、腫瘍内投与、関節内投与、静脈内投与、皮下投与、膣内投与、および経口投与のうちの１又は複数のために製剤化される。

別の態様では、それを必要とする対象において免疫応答を調節するための方法が、本明細書において提供され、前記方法は、以下：（ａ）本明細書に記載の核酸構築物；（ｂ）本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子；（ｃ）本明細書に記載の組換え細胞；（ｄ）本明細書に記載の組換えポリペプチド；および（ｅ）本明細書に記載の医薬組成物のうちの１又は複数を含む組成物を対象に投与することを含む。

別の態様では、それを必要とする対象において健康状態を予防および／又は治療するための方法が、本明細書において提供され、前記方法は、以下：（ａ）本明細書に記載の核酸構築物；（ｂ）本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子；（ｃ）本明細書に記載の組換え細胞；（ｄ）本明細書に記載の組換えポリペプチド；および（ｅ）本明細書に記載の医薬組成物のうちの１又は複数を含む組成物を、前記対象に予防的又は治療的に投与することを含む。

本開示による健康状態を予防、および／又は改善、および／又は治療する方法の実施形態の実施は、以下の特徴のうちの１又は複数を含んでもよい。いくつかの実施形態では、健康状態は、増殖性障害、炎症性障害、自己免疫障害、又は微生物感染である。いくつかの実施形態では、対象は、増殖性障害、炎症性障害、自己免疫障害、又は微生物感染に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。いくつかの実施形態では、対象は、希少疾患に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。いくつかの実施形態では、組成物は、単一療法（単剤療法）として、又は少なくとも１つの追加の療法と組み合わせた第１の療法として、対象に個別に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、および手術からなる群より選択される。

さらに別の態様では、免疫応答を調節するため、健康状態又は微生物感染の予防のため、および／又は治療のためのキットが、本明細書において提供され、前記キットは、以下：（ａ）本明細書に記載の核酸構築物；（ｂ）本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子；（ｃ）本明細書に記載の組換え細胞；（ｄ）本明細書に記載の組換えポリペプチド；および（ｅ）本明細書に記載の医薬組成物のもののうちの１又は複数を含む。

本明細書に記載される各態様および実施形態は、実施形態又は態様の文脈から明示的に又は明確に除外されない限り、共に使用されることが可能である。

前述の要約は例示的なものに過ぎず、いかなる意味においても限定的であることを意図するものではない。本明細書に記載された例示的な実施形態および特徴に加えて、本開示のさらなる態様、実施形態、目的および特徴は、図面および詳細な説明ならびに特許請求の範囲から十分に明らかになるであろう。

図１Ａ～１Ｂは、元のアルファウイルスのウイルス構造タンパク質のコード配列が欠失され、かつ、合成アダプター分子が３’ＵＴＲの上流に挿入された、本開示のいくつかの実施形態に従ったアルファウイルスベクター設計の非限定的な例の概略図である。図１Ａは、本開示のいくつかの実施形態に従った、例示的な改変アルファウイルスベクター設計の非限定的な例を示す。この例では、合成アダプター分子は、５’→３’方向に、５’フランキングドメイン、ＳｐｅＩ認識制限部位、および３’フランキングドメインを含む。この改変アルファウイルスベクターデザイン（空ベクター）は、２６Ｓサブゲノムプロモーター（２６Ｓ）と、５’ＵＴＲ配列と、３’ＵＴＲ配列と、ポリ（Ａ）テールとを含んでいる。非構造タンパク質ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、およびＮＳＰ４も示されている。図１Ｂは、図１Ａに記載のベクターに由来する別のアルファウイルス設計の構造を示す。このデザインでは、異種の目的の遺伝子（ＧＯＩ）が、その発現が２６Ｓサブゲノムプロモーターの制御下に置かれるように、ＳｐｅＩ制限部位にクローニングされる。図２Ａ～２Ｉは、本開示のいくつかの実施形態に従った、４つの非限定的な例示的アルファウイルスＲＮＡレプリコン設計（空ベクター）の図解であり、この設計では、改変ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ゲノム、改変チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）株２７、改変ＣＨＩＫＶ株ＤＲＤＥ、改変東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、改変ＳＩＮＶ株Ｇｉｒｄｗｏｏｄ、又は改変ＳＩＮＶ株ＡＲ８６／Ｇｉｒｄｗｏｏｄをコードする配列が、それぞれ、発現ベクターに取り込まれ、それは、それぞれの３’ＵＴＲ配列の上流に挿入された合成アダプター分子も含む。図２Ａ～２Ｉは、本開示のいくつかの実施形態に従った、４つの非限定的な例示的アルファウイルスＲＮＡレプリコン設計（空ベクター）の図解であり、この設計では、改変ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ゲノム、改変チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）株２７、改変ＣＨＩＫＶ株ＤＲＤＥ、改変東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、改変ＳＩＮＶ株Ｇｉｒｄｗｏｏｄ、又は改変ＳＩＮＶ株ＡＲ８６／Ｇｉｒｄｗｏｏｄをコードする配列が、それぞれ、発現ベクターに取り込まれ、それは、それぞれの３’ＵＴＲ配列の上流に挿入された合成アダプター分子も含む。図２Ａ～２Ｉは、本開示のいくつかの実施形態に従った、４つの非限定的な例示的アルファウイルスＲＮＡレプリコン設計（空ベクター）の図解であり、この設計では、改変ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ゲノム、改変チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）株２７、改変ＣＨＩＫＶ株ＤＲＤＥ、改変東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、改変ＳＩＮＶ株Ｇｉｒｄｗｏｏｄ、又は改変ＳＩＮＶ株ＡＲ８６／Ｇｉｒｄｗｏｏｄをコードする配列が、それぞれ、発現ベクターに取り込まれ、それは、それぞれの３’ＵＴＲ配列の上流に挿入された合成アダプター分子も含む。図２Ａ～２Ｉは、本開示のいくつかの実施形態に従った、４つの非限定的な例示的アルファウイルスＲＮＡレプリコン設計（空ベクター）の図解であり、この設計では、改変ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ゲノム、改変チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）株２７、改変ＣＨＩＫＶ株ＤＲＤＥ、改変東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、改変ＳＩＮＶ株Ｇｉｒｄｗｏｏｄ、又は改変ＳＩＮＶ株ＡＲ８６／Ｇｉｒｄｗｏｏｄをコードする配列が、それぞれ、発現ベクターに取り込まれ、それは、それぞれの３’ＵＴＲ配列の上流に挿入された合成アダプター分子も含む。図２Ａ～２Ｉは、本開示のいくつかの実施形態に従った、４つの非限定的な例示的アルファウイルスＲＮＡレプリコン設計（空ベクター）の図解であり、この設計では、改変ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ゲノム、改変チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）株２７、改変ＣＨＩＫＶ株ＤＲＤＥ、改変東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、改変ＳＩＮＶ株Ｇｉｒｄｗｏｏｄ、又は改変ＳＩＮＶ株ＡＲ８６／Ｇｉｒｄｗｏｏｄをコードする配列が、それぞれ、発現ベクターに取り込まれ、それは、それぞれの３’ＵＴＲ配列の上流に挿入された合成アダプター分子も含む。図３Ａ～３Ｆは、本開示のいくつかの実施形態に従った、５つの非限定的な例示的アルファウイルスＲＮＡレプリコン設計の図解である。図３Ａにおいて、本開示のいくつかの実施形態に従う改変された東部馬脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）ゲノムは、合成アダプター分子に挿入された例示的な目的の遺伝子（ＧＯＩ）、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のヘマグルチニン前駆体（ＨＡ）のコード配列も含む発現ベクターに組み込まれる。図３Ｂ～３Ｆにおいて、Ｈ５Ｎ１ＨＡに対するコード配列は、本開示のいくつかの実施形態に従って、改変ＳＩＮＶＡＲ８６－Ｇｉｒｄｗｏｏｄキメラ設計を含む発現ベクターに挿入される。図３Ａ～３Ｆは、本開示のいくつかの実施形態に従った、５つの非限定的な例示的アルファウイルスＲＮＡレプリコン設計の図解である。図３Ａにおいて、本開示のいくつかの実施形態に従う改変された東部馬脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）ゲノムは、合成アダプター分子に挿入された例示的な目的の遺伝子（ＧＯＩ）、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のヘマグルチニン前駆体（ＨＡ）のコード配列も含む発現ベクターに組み込まれる。図３Ｂ～３Ｆにおいて、Ｈ５Ｎ１ＨＡに対するコード配列は、本開示のいくつかの実施形態に従って、改変ＳＩＮＶＡＲ８６－Ｇｉｒｄｗｏｏｄキメラ設計を含む発現ベクターに挿入される。図３Ａ～３Ｆは、本開示のいくつかの実施形態に従った、５つの非限定的な例示的アルファウイルスＲＮＡレプリコン設計の図解である。図３Ａにおいて、本開示のいくつかの実施形態に従う改変された東部馬脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）ゲノムは、合成アダプター分子に挿入された例示的な目的の遺伝子（ＧＯＩ）、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のヘマグルチニン前駆体（ＨＡ）のコード配列も含む発現ベクターに組み込まれる。図３Ｂ～３Ｆにおいて、Ｈ５Ｎ１ＨＡに対するコード配列は、本開示のいくつかの実施形態に従って、改変ＳＩＮＶＡＲ８６－Ｇｉｒｄｗｏｏｄキメラ設計を含む発現ベクターに挿入される。図３Ａ～３Ｆは、本開示のいくつかの実施形態に従った、５つの非限定的な例示的アルファウイルスＲＮＡレプリコン設計の図解である。図３Ａにおいて、本開示のいくつかの実施形態に従う改変された東部馬脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）ゲノムは、合成アダプター分子に挿入された例示的な目的の遺伝子（ＧＯＩ）、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のヘマグルチニン前駆体（ＨＡ）のコード配列も含む発現ベクターに組み込まれる。図３Ｂ～３Ｆにおいて、Ｈ５Ｎ１ＨＡに対するコード配列は、本開示のいくつかの実施形態に従って、改変ＳＩＮＶＡＲ８６－Ｇｉｒｄｗｏｏｄキメラ設計を含む発現ベクターに挿入される。図４は、本開示のいくつかの実施形態に従った、アルファウイルスベクターＤＮＡ鋳型設計の非限定的な例の概略図であり、それは、ポリ（Ａ）の下流にタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼ認識部位が付加されている。図４Ａは、アルファウイルスベクターＲＮＡのインビトロ転写に使用される最新のＤＮＡ鋳型の配列を示し、この鋳型では、ＲＮＡ転写が５’Ｔ７プロモーター（Ｔ７ｐｒｏｍ）の部位で開始され、Ｔ７ターミネーター（Ｔ７ｔｅｒｍ）への転写によって終結する。図４Ｂは、本開示のいくつかの実施形態に従った、例示的な改変アルファウイルスベクター設計の非限定的な例を示す。この例では、ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位がポリ（Ａ）配列のすぐ下流に挿入されている。ＳａｐＩはその認識部位（枠内に示した配列）の外側でＤＮＡを切断するＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼであり、分解産物はＲＮＡ産物中のアデノシル残基をコードするＤＮＡ鋳型配列上の５’末端にあるデオキシチミジン残基のみを残す。この例では、ＤＮＡがＳａｐＩ分解によって直鎖化され、インビトロ転写の鋳型として使用されると、ＲＮＡ転写は５’Ｔ７プロモーター（Ｔ７ｐｒｏｍ）の部位で開始され、ポリ（Ａ）の末端でのランオフ転写によって終結し、ＲＮＡの３’末端にはアデニル酸残基のみが残る。Ｔ７プロモーターによる終結では、ＲＮＡ産物の３’末端に非アデニル酸残基が転写されるのとは対照的である。図５は、（ｉ）３０アデニル酸残基からなる（Ａ）又は（ｉｉ）３０アデニル酸残基の後に転写ターミネーター（Ｔ７）配列が続く３’末端を有するレプリコンＲＮＡの違いを表す棒グラフである。異なる量のレプリコンＲＮＡをトリプルケートでＢＨＫ－２１細胞にエレクトロポレーションし、そして、１７．５時間後にレプリコン複製又はコードされた目的の導入遺伝子（ＨＡ）の発現の結果としてｄｓＲＮＡを含む細胞の頻度を蛍光フローサイトメトリーで定量した。この時点で、飽和量以下（＜２５０ｎｇ）のトランスフェクトされたレプリコンＲＮＡでは、アデニル酸残基で終わる３’末端を持つレプリコンＲＮＡ対Ｔ７ターミネーター配列で終わるレプリコンＲＮＡでは、有意に高い複製と導入遺伝子の発現という形で、増強された生物学的活性の証拠がある。図６は、３’末端が３０アデニル酸残基からなり、その後に転写ターミネーター（３０；Ｔ７）配列が続くレプリコンＲＮＡ、又は３’末端が３０アデニル酸残基（３０；Ｃｌｅａｎ）からなるレプリコンＲＮＡ、又は３’末端が約１２０アデニル酸残基（～１２０；Ｃｌｅａｎ）からなるレプリコンＲＮＡの違いを表す棒グラフである。２５又は１００ｎｇのレプリコンＲＮＡをＢＨＫ－２１細胞にデュプリケートでエレクトロポレーションし、そして、２０時間後にレプリコン複製又はコードされた目的の導入遺伝子（ＨＡ）の発現の結果としてｄｓＲＮＡを含む細胞の頻度を蛍光フローサイトメトリーで定量した。この例では、ポリ（Ａ）テールが延長されたレプリコンＲＮＡは、より高い複製と導入遺伝子の発現という形で、増強された生物学的活性を示している。図７は、ＩＩ型制限酵素対ＩＩＳ型制限酵素の認識配列と切断部位を模式的に比較している。図８は、酵素分解により直鎖化されたプラスミドＤＮＡ鋳型を用いてインビトロ転写（ＩＶＴ）により調製したｓｒＲＮＡ分子の完全性を評価するために行った電気泳動分析実験の結果を図にまとめたものである。この例では、ポリ（Ａ）配列の末端で切断する（例えば、ポリ（Ａ）配列のすぐ下流で切断する）ＳａｐＩでＤＮＡが直線化された。図９は、ポリ（Ａ）テールの長さに相関するｓｒＲＮＡのＲＮＡ複製活性の特異的な違いを説明するために行った実験の結果を模式的にまとめたものである。様々な用量のｓｒＲＮＡ構築物を細胞にエレクトロポレーション（ＥＰ）し、フローサイトメトリーを用いて二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を検出することにより、ＲＮＡ複製の頻度を定量した。図１０は、ポリ（Ａ）テールの長さと相関するｓｒＲＮＡのＲＮＡ複製活性の量的差異を模式的にまとめたものである。図９に示したデータを４ＰＬ曲線に当てはめ、ＥＣ５０（活性が半減するＲＮＡ量）の逆数を算出し、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計検定を行って、Ｌｏｇ（ＥＣ５０）値間の有意性を判定した。

（発明の詳細な説明）
特に、例えばワクチンや治療用ポリペプチドなどの異種分子を組換え細胞で発現させるのに適した、優れた発現能を有するウイルス発現系が、本明細書で提供される。例えば、本開示のいくつかの実施形態は、構造タンパク質をコードする元のウイルス配列の実質的な部分が欠失したアルファウイルスの改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む、例えば発現構築物およびベクターなどの核酸構築物に関する。また、本開示のいくつかの実施形態では、異種ポリペプチドをコードする１又は複数の発現カセットを含むウイルスベースの発現ベクターが提供される。さらに、本開示のいくつかの実施形態では、構造タンパク質をコードするその元のウイルス配列の少なくとも一部が欠失した、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）又はシンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）の改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む、例えば発現構築物およびベクターなどの核酸構築物が提供される。さらに、本明細書に開示される核酸分子の１又は複数を含むように遺伝子操作された組換え細胞が提供される。このような組換え細胞に由来する生体材料および組換え産物もまた、本出願の範囲内である。また、それを必要とする対象において免疫応答を調節するのに有用な組成物および方法、ならびに種々の健康状態を予防および／又は治療する方法も提供される。

ＲＮＡウイルス（例えばアルファウイルス）に基づく自己増幅ＲＮＡ（レプリコン）は、強力な発現系として使用されることができる。例えば、ＥＥＥＶおよびＳＩＮＶのようなアルファウイルスをウイルス発現ベクターとして使用する非限定的な利点は、組換え宿主細胞において大量の異種タンパク質の合成を指示できることであると報告されている。特に、本明細書で開示されるアルファウイルスレプリコンプラットフォーム系は、目的の異種ポリペプチドを高レベルで発現することができる。他の利点の中でも、治療用一本鎖抗体のようなポリペプチドは、インビボで高レベルで発現すれば最も効果的であろう。さらに、培養細胞から精製した組換え抗体を生産する場合（エクスビボ）、レプリコンＲＮＡから高タンパク質を発現させると、抗体産物全体の収量が増加する可能性がある。さらに、発現されるタンパク質がワクチン抗原である場合、高レベルの発現がインビトロで最も強固な免疫応答を誘導する可能性がある。

アルファウイルスは、ＵＴＲ、構造領域、および非構造領域に含まれるモチーフを利用して、宿主細胞における複製に影響を与える。これらの領域には、宿主細胞の自然免疫を回避するメカニズムも含まれている。アルファウイルス間にはしばしば大きな違いがあり得る。ゲノムのどの部分にこれらの機能的構成要素が含まれているかもアルファウイルスによって異なる。個々のアルファウイルス間の差異だけでなく、アルファウイルスの株内でもしばしば差異があり、病原性などの特性の変化を説明することができる。例えば、ＥＥＥＶの北米株と南米株との間の配列変異は、ＳＴＡＴ１経路を調節する能力を変化させ、Ｉ型インターフェロンの誘導に差異をもたらし、結果として病原性に変化をもたらす。以下に記載するように、本開示のいくつかの実施形態は、ＥＥＥＶに基づく改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡに関する。さらなる例として、ＳＩＮＶ株Ｓ．Ａ．ＡＲ８６（ＡＲ８６）は、ＩＦＮ－γおよび／又はＩＦＮ－βに応答して、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のチロシンリン酸化を迅速かつ強固に阻害するが、関連するＳＩＮＶ株Ｇｉｒｄｗｏｏｄは、ＳＴＡＴ１／２活性化の非効率的な阻害剤である。ＡＲ８６の非構造タンパク質における５３８位のユニークなスレオニンは、関連するＳＩＮＶ株Ｇｉｒｄｗｏｏｄよりも非構造タンパク質のプロセシングを遅くし、サブゲノムＲＮＡ合成を遅延させる。このことは、成体マウスの神経毒性の表現型に寄与し、異種タンパク質発現の速度論と収率に有利であり、ＡＲ８６ベースのレプリコンベクターから発現されるワクチン抗原に対するより強固な免疫応答に寄与する可能性がある。Ｔ５３８を含む真のＡＲ８６レプリコンは記載されていない。詳細は後述するが、報告されたゲノム配列（ＧｅｎｂａｎｋＵ３８３０５）を用いた機能的ＡＲ８６レプリコンは作製できなかったため、既存のＡＲ８６ベースのレプリコンがＴ５３８Ｉ変異を減弱させているものと思われる。しかしながら、Ｇｉｒｄｗｏｏｄ由来のｎｓＰ遺伝子と特定のキメラを作製することにより、Ｔ５３８を保持したまま機能的なＡＲ８６レプリコンを作製できることが判明した。以下にさらに記載するように、本開示のいくつかの実施形態は、ＳＩＮＶ株ＡＲ８６に基づく改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡに関する。

以下により詳細に記載されるように、本開示のいくつかの実施形態は、複製、発現、および／又は翻訳のレベルの増加のような増強された生物学的活性を提供するために、ポリ（Ａ）テールをコードする配列の末端に制限部位を組み込むように操作された改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡに関する。

また、以下により詳細に記載されるが、本開示のいくつかの実施形態は、複製、発現、および／又は翻訳のレベルの増加のような増強された生物学的活性を提供するために、延長されたポリ（Ａ）テールを有するように操作された改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡに関する。

（定義）
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての術語、表記、および他の科学用語又は専門用語は、本出願が関係する当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語は、明確化のため、および／又は、すぐに参照できるように、本明細書において定義され、そのような定義を本明細書に含めることは、必ずしも、当該技術分野において一般に理解されていることとの実質的な相違を表すと解釈されるべきではない。本明細書において記載又は参照される技術および手順の多くは、当業者によって従来の方法論を用いてよく理解され、一般的に採用されている。

単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数形の参照を含む。例えば、「細胞」という用語は、それらの混合物を含む、１又は複数の細胞を含む。本明細書において、「Ａ及び／又はＢ」は、以下の全ての選択肢を含む意味で使用される：「Ａ」、「Ｂ」、「Ａ又はＢ」、及び「Ａ及びＢ」。

本明細書で使用される「投与」および「投与する」という用語は、経鼻投与、経皮投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、結節内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、膣内投与、および局所投与、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない投与経路による生物活性組成物又は製剤の送達を指す。この用語には、医療従事者による投与、自己投与が含まれるが、これらに限定されない。

「細胞」、「細胞培養物」、及び「細胞株」という用語は、特定の対象細胞、細胞培養物、又は細胞株のみならず、培養における移植又は継代の回数に関係なく、そのような細胞、細胞培養物、又は細胞株の子孫又は潜在的子孫をも指す。すべての子孫が親細胞と完全に同一であるわけではないことを理解すべきである。というのも、突然変異（例えば、故意又は不注意による突然変異）又は環境的影響（例えば、メチル化又は他のエピジェネティック修飾）のいずれかにより、後代にある種の変化が起こる可能性があるからであり、その結果、子孫は実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、子孫が元の細胞、細胞培養物、又は細胞株と同じ機能性を保持する限り、本明細書で使用する用語の範囲内に含まれてもよい。

「構築物」という用語は、異種由来の１又は複数の単離された核酸配列を含む組換え分子を指す。例えば、核酸構築物は、異なる起源の２又は２超の核酸配列が単一の核酸分子に構築されたキメラ核酸分子であり得る。従って、代表的な核酸構築物には、（１）自然界で互いに隣接して見出されない（例えば、ヌクレオチド配列の少なくとも１つが、その他のヌクレオチド配列の少なくとも１つに関して異種である）調節配列およびコード配列を含む核酸配列、又は（２）自然界で隣接していない機能的ＲＮＡ分子もしくはタンパク質の部分をコードする配列、又は（３）自然界で隣接していないプロモーターの部分を含む構築物が含まれる。代表的な核酸構築物には、直鎖状又は環状の、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ核酸分子で、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製ポリヌクレオチド分子、ファージなどの任意の供給源に由来し、ゲノムの組み込み又は自己複製可能で、１又は複数の核酸配列が作動可能に連結された核酸分子を含む、任意の組換え核酸分子が含まれ得る。本開示の構築物は、構築物にも含まれる目的の核酸配列の発現を指示するために必要な要素を含み得る。そのような要素は、目的の核酸配列に作動可能に連結される（転写を指示するように）、かつ、任意選択でポリアデニル化（ａｐｏｌｙ（Ａ）ｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）配列を含む、プロモーターなどの制御要素を含んでもよい。

本開示のいくつかの実施形態では、核酸構築物は、ベクター内に組み込まれてもよい。ベクター」という用語は、本明細書において、別の核酸分子を移送又は輸送することができる核酸分子又は配列を指すために使用される。従って、「ベクター」という用語は、ＤＮＡベースのベクターおよびＲＮＡベースのベクターの両方を包含する。「ベクター」という用語は、クローニングベクターおよび発現ベクター、ならびにウイルスベクターおよび組み込みベクターを含む。「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターであり、それによって、インビトロ、エクスビボ、および／又はインビボでＤＮＡ配列および断片を発現することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えばプラスミド（ＤＮＡベースのベクター）又は自己複製ＲＮＡベクターのような細胞内での自律複製を指示する配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。有用なベクターは、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド又はＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、一本鎖ベクター（例えば、ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）であってもよい。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、二本鎖ベクター（例えば、ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ）であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、遺伝子送達ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、遺伝子を細胞に導入するための遺伝子送達ビヒクルとして使用される。

構築物の構成要素に加えて、ベクターは、例えば、１又は複数の選択可能マーカー、原核生物および真核生物の起源のような１又は複数の複製起点、少なくとも１つの多重クローニング部位、および／又は細胞のゲノムへの構築物の安定な組み込みを促進するためのエレメントを含み得る。２又は２超の構築物は、単一のベクターのような単一の核酸分子内に組み込まれてもよく、又は２又は２超の別々のベクターのような２又は２超の別々の核酸分子内に組み込まれてもよい。「発現構築物」は一般に、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたコントロール配列を少なくとも含む。このようにして、例えば、発現されるヌクレオチド配列と作動可能に連結したプロモーターが、細胞内での発現のために発現構築物中に提供される。本開示を実施するために、構築物および細胞を調製および使用するための組成物および方法は、当業者に公知である。

本開示の組成物、例えば、核酸構築物（例えば、ポリ（Ａ）ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、および／又は薬学的組成物の「有効量」、「治療上有効な量」、又は「薬学上の有効量」という用語は、一般に、組成物が存在しない場合に比較して、組成物が記載された目的（例えば、投与される効果を達成する、免疫応答を刺激する、疾患を予防又は治療する、又は疾患、障害、感染、もしくは健康状態の１つもしくは複数の症状を軽減する）を達成するのに十分な量を指す。「有効量」の例は、疾患の症状又は症状の治療、予防、又は軽減に寄与するのに十分な量が挙げられ、これは「治療有効な量」とも呼ばれ得る。症状の「軽減」とは、症状の重篤度もしくは頻度の減少、又は症状の消失を意味する。「治療上有効な量」を含む組成物の正確な量は、治療の目的によって異なり、当業者であれば公知の技術を用いて確認可能であろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，ＴｈｅＡｒｔ，ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ，ＤｏｓａｇｅＣａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）。

細胞、核酸、タンパク質、又はベクターに関して使用される場合、「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、例えば、実験室的方法によって改変された、又は実験室的方法の結果であるなど、人為的介入によって改変された、又は産生されたことを示す。したがって、例えば、組換えタンパク質および核酸には、実験室的方法によって産生されたタンパク質および核酸が含まれる。組換えタンパク質は、タンパク質のネイティブ（非組換え又は野生型）形態内に見出されないアミノ酸残基を含んでもよい、又は修飾された、例えば標識されたアミノ酸残基を含んでもよい。この用語は、ペプチド、タンパク質、又は核酸配列に対する任意の修飾を含み得る。このような修飾には、以下のものが含まれ得る：１又は複数のアミノ酸、デオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドを含む、ペプチド、タンパク質、又は核酸配列の任意の化学修飾；ペプチド又はタンパク質中の１又は複数のアミノ酸の付加、欠失、および／又は置換；融合タンパク質、例えば抗体フラグメントを含む融合タンパク質の作製；ならびに核酸配列中の１又は複数の核酸の付加、欠失、および／又は置換。細胞に関して使用される場合、「組換え」という用語は、天然に存在する細胞を含むことを意図するものではなく、操作／改変されなければ細胞中に存在しないポリペプチド又は核酸を含むか発現するように操作／改変された細胞を包含する。

本明細書で使用する場合、「レプリコンＲＮＡ」という用語は、許容細胞内でそれ自体の増幅又は自己複製を指示するのに必要な遺伝情報の全てを含むＲＮＡを指す。したがって、レプリコンＲＮＡは「自己増幅ＲＮＡ」（ｓａＲＮＡ）又は「自己複製ＲＮＡ」（ｓｒＲＮＡ）とも呼ばれることがある。ＲＮＡ分子は、それ自身の複製を指示するために、１）ポリメラーゼ、レプリカーゼ、あるいはウイルスや宿主細胞由来のタンパク質、核酸、リボ核タンパク質と相互作用してＲＮＡ増幅プロセスを触媒する他のタンパク質をコードし、かつ、２）サブゲノムレプリコンコードＲＮＡの複製と転写に必要なシス作用性ＲＮＡ配列を含む。これらの配列は、複製の過程で、その自己コードタンパク質、又は非自己コード細胞由来タンパク質、核酸もしくはリボ核タンパク質、又はこれらの成分のいずれかの間の複合体に結合され得る。本開示のいくつかの実施形態では、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ分子（例えば、ｓｒＲＮＡ又はｓａＲＮＡ分子）は、一般に、以下の順序付けられたエレメントを含む：複製のためにシスで必要な５′ウイルス又は欠陥干渉ＲＮＡ配列、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４）をコードする配列、サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）用プロモーター、複製のためにシスで必要な３′ウイルス配列、およびポリアデニル酸トラクト（ポリ（Ａ））。ある実施態様では、異種配列の発現を指示するサブゲノムプロモーター（ｓｇ）が、本開示のｓｒＲＮＡ構築物に含まれ得る。さらに、レプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ又はｓａＲＮＡ）という用語は、一般に、正の極性、又は「メッセージ」センスの分子を指し、レプリコンＲＮＡは、公知の、天然に存在するアルファウイルスの長さとは異なる長さであり得る。本開示のいくつかの実施形態では、レプリコンＲＮＡは、構造ウイルスタンパク質の少なくとも１つの配列を含まない；構造遺伝子をコードする配列は、異種配列で置換され得る。レプリコンＲＮＡが組換えアルファウイルス粒子にパッケージされる場合、レプリコンＲＮＡは、粒子形成につながるアルファウイルス構造タンパク質との相互作用を開始する役割を果たす１又は複数の配列、いわゆるパッケージングシグナルを含み得る。

本明細書で使用される場合、「対象」又は「個体」は、ヒト（例えば、ヒト対象）及びヒト以外の動物などの動物を含む。いくつかの実施形態では、「対象」又は「個体」は、医師の管理下にある患者である。従って、対象は、ヒト患者、又は対象とする疾患（例えば、がん）および／又はその疾患の1又は複数の症状を有する、有する危険性がある、又は有する疑いがある対象であり得る。対象はまた、診断時又はそれ以降に対象疾患のリスクを有すると診断された対象であり得る。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳類、例えばげっ歯類、例えばマウス、非ヒト霊長類、および例えばヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリなどの他の哺乳類、および両生類、爬虫類などの非哺乳類を含む。

値の範囲が提供される場合、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の10分の1までの各介在する値と、その記載された範囲内の他の記載された値又は介在する値とは、本開示内に包含されると理解される。これらの小さい範囲の上限値及び下限値は、独立して小さい範囲に含まれることがあり、また、記載された範囲内の特に除外された限界値に従い、本開示内に包含される。記載された範囲が境界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる境界の一方又は両方を除いた範囲も本開示に含まれる。

本明細書では、数値の前に「約（ａｂｏｕｔ）」という用語が付された特定の範囲が示されているが、この用語は、本明細書で使用される場合、おおよそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）という通常の意味を有する。「約」という用語は、その用語が先行する正確な数値、およびその用語が先行する数値に近い、又はその数値にほぼ近い数値の文字通りの裏付けを提供するために使用される。ある数字が具体的に言及された数字に近いか、近似しているかどうかを判断する際、具体的に言及されていない数字に近いか、近似している数字とは、その数字が提示された文脈において、具体的に言及された数字と実質的に等価である数字とすることができる。近似の程度が文脈から明らかでない場合、「約」は、提供された値のプラスマイナス１０％以内、又は提供された値を含むすべての場合において最も近い有効数字に四捨五入された値のいずれかを意味する。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、指定値±１０％まで、±５％まで、又は±１％まで、を示す。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、２又は２超のエレメント、例えば、ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列の間の物理的又は機能的連結を示し、これは、それらが意図された様式で作動することを可能にする。例えば、本明細書中に記載される核酸分子又は核酸分子中のコード配列およびプロモーター配列の文脈で使用される場合、用語「作動可能に連結された」とは、コード配列およびプロモーター配列が、転写因子又はＲＮＡポリメラーゼによるそれぞれの結合が転写に及ぼす影響を可能にするために、インフレームであり、適切な空間的および距離的に離れていることを意味する。作動可能に連結されたエレメントは、連続的であっても非連続的であってもよい（例えば、リンカーを介して互いに連結されている）ことが理解されるべきである。ポリペプチド構築物の文脈において、「作動可能に連結された」とは、構築物の記載された活性を提供するためのアミノ酸配列（例えば、異なるセグメント、部分、領域、又はドメイン）間の物理的連結（例えば、直接的又は間接的に連結された）を指す。本明細書に開示されるポリペプチド又は核酸分子の作動可能に連結されたセグメント、部分、領域、およびドメインは、連続的であっても非連続的であってもよい（例えば、リンカーを介して互いに連結される）。

本明細書で使用される「部分」という用語は、断片を指す。ポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列又はタンパク質などの特定の構造に関して、その「部分」という用語は、前記構造の連続的又は不連続的な断片を示してもよい。例えば、アミノ酸配列の部分は、前記アミノ酸配列のアミノ酸の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、及び少なくとも９０％を含む。追加的又は代替的に、部分が不連続断片である場合、前記不連続断片は、構造（例えば、タンパク質のドメイン）の２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上の部分から構成され、各部分は構造の連続エレメントである。例えば、アミノ酸配列の不連続断片は、前記アミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上、例えば４つ以下の部分から構成され得、各部分は、アミノ酸配列の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個の連続アミノ酸、少なくとも１０個の連続アミノ酸、少なくとも２０個の連続アミノ酸、又は少なくとも３０個の連続アミノ酸を含む。

値の範囲が提供される場合、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在する値と、その記載された範囲内の他の記載された値又は介在する値とは、本開示内に包含されると理解される。これらの小さい範囲の上限値及び下限値は、独立して小さい範囲に含まれることがあり、また、記載された範囲内の特に除外された限界値に従い、本開示内に包含される。記載された範囲が境界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる境界の一方又は両方を除いた範囲も本開示に含まれる。

特定の範囲が、「約」という用語がその前に置かれた数値と共に本明細書に存在する。「約」という用語は、本明細書において、その用語が先行する正確な数値、およびその用語が先行する数値に近い又は近似する数値の文字通りの裏付けを提供するために使用される。ある数値が、具体的に言及された数値に近いか、又は近似しているかどうかを判断する際、近い数値又は近似していない数値は、それが提示される文脈において、具体的に言及された数値の実質的な等価性を提供する数値であってもよい。

２又は２超の核酸又はタンパク質の文脈において、本明細書で使用される「同一性パーセント」という用語は、同一であるか、又は同一であるヌクレオチドもしくはアミノ酸の指定されたパーセンテージを有する２又は２超の配列又は部分配列を指す（例えば、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、後述のデフォルトパラメーターで、又は手動アライメントと目視検査で測定された、比較ウィンドウ又は指定された領域にわたって、最大対応で比較及びアライメントされた場合、約６０％の配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は指定された領域にわたってより高い同一性を有する配列又は部分配列）。例えば、ＮＣＢＩウェブサイトのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを参照のこと。この定義はまた、クエリー配列の相補体を指すか、又はクエリー配列の相補体に適用されることもある。この定義には、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大の一致を与えるようにアルゴリズムのパラメーターが選択されるＢＬＡＳＴアルゴリズムによって実行される配列比較が含まれる。この定義には、欠失および／又は付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も含まれる。配列同一性は、少なくとも約２０アミノ酸もしくはヌクレオチドの長さの領域にわたって、又は１０～１００アミノ酸もしくはヌクレオチドの長さの領域にわたって、又は所与の配列の全長にわたって計算することができる。配列同一性は、公表された技術および広く利用可能なコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＳプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ（１９８４）１２：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、ＪＭｏｌＢｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３）を用いて計算することができる。配列同一性は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ（１７１０ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）のＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐのＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅのような配列解析ソフトウェアを、そのデフォルトパラメーターで使用して測定することができる。類似性又は同一性アミノ酸配列を決定するために好適に利用され得る追加の方法論には、Ｒｏｓｅｔｔａからの構造予測スコアを組み込んだ位置特異的構造スコアリング行列（Ｐ３ＳＭ）に依存するもの、及び例えば、Ｓｅｔｃｌｉｆｆら、ＣｅｌｌＨｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ２３（６）、２０１８年５月に以前に記載されたような長さ正規化編集距離に基づくものが含まれる。

本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、対象化合物を対象に投与するための薬学的に許容される担体、添加剤、又は希釈剤を提供する任意の適切な物質を指す。このように、「薬学的に許容される賦形剤」は、薬学的に許容される希釈剤、薬学的に許容される添加剤、および薬学的に許容される担体と呼ばれる物質を包含し得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語には、生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤など、薬学的投与に適合するものが含まれるが、これらに限定されない。補足的な活性化合物（例えば、抗生物質および追加の治療剤）もまた、組成物に組み込むことができる。

本明細書で使用される場合、「対象」又は「個体」には、ヒト（例えば、ヒト個体）及びヒト以外の動物などの動物が含まれる。いくつかの実施形態では、「対象」又は「個体」は、医師の管理下にある患者である。従って、対象は、ヒト患者、又は関心のある健康状態（例えば、がん又は感染症）および／又は健康状態の1又は複数の症状を有する、有する危険性がある、又は有する疑いがある個体であり得る。対象はまた、診断時又はそれ以降に、対象となる健康状態のリスクを有すると診断された個体であり得る。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳類、例えばげっ歯類、例えばマウス、非ヒト霊長類、および例えばヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリなどの他の哺乳類、および両生類、爬虫類などの非哺乳類を含む。

本明細書に記載される本開示の態様および実施形態は、態様および実施形態の「含む」、「からなる」、および「本質的にからなる」を含むことが理解される。本明細書で使用される場合、「含む」は、「含む」、「含有する」、又は「～によって特徴付けられる」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の、再現されない要素又は方法ステップを除外しない。本明細書で使用される場合、「からなる」は、クレームされた組成物又は方法において規定されていない要素、ステップ、又は成分を除外する。本明細書で使用される場合、「本質的にからなる」は、クレームされた組成物又は方法の基本的かつ新規な特性に重大な影響を与えない材料又はステップを除外しない。本明細書において、特に組成物の成分の記載又は方法のステップの記載において、「含む」という用語のいかなる記載も、本質的に記載された成分又はステップからなる組成物および方法を包含すると理解される。

値の範囲が提供される場合、本明細書に開示されるすべての範囲は、あらゆる可能なサブ範囲およびそのサブ範囲の組み合わせを包含することが、当業者には理解される。どのような記載された範囲も、同じ範囲を少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解することを十分に説明し、可能にするものとして容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で議論される各範囲は、下位３分の１、中位３分の１、および上位３分の１などに容易に分解することができる。また、当業者には理解されるように、「～まで」、「少なくとも」、「～より大きい」、「～より小さい」等のすべての文言は、言及された数を含み、上述したように、その後サブ範囲に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者には理解されるであろうが、範囲は個々のメンバーを含む。従って、例えば、１～３個の成形品を有するグループは、１、２又は３個の成形品を有するグループを指す。同様に、１～５個の成形品を有するグループは、１個、２個、３個、４個又は５個の成形品を有するグループを指す。

見出し、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｉ）等は、単に明細書及び特許請求の範囲を読みやすくするために提示されている。明細書又は特許請求の範囲における見出しの使用は、ステップ又は要素がアルファベット順又は数字順、又はそれらが提示される順序で実行されることを要求するものではない。

明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明されている本開示の特定の特徴も、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明されている本開示の様々な特徴も、別個に、又は任意の適切なサブコンビネーションで提供され得る。本開示に係る実施形態の全ての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、本明細書では、各組み合わせが個別に明示的に開示されているかのように開示される。加えて、様々な実施形態およびその要素の全ての下位組合せもまた、本開示によって具体的に包含され、そのような下位組合せの１つ１つが本明細書において個別にかつ明示的に開示されているかのように、本明細書において開示される。

アルファウィルス
アルファウイルスとは、少なくとも３０のメンバーを含むＩＶ族トガウイルス科の遺伝学的、構造学的、及び血清学的に関連するウイルスの属であり、各々がウイルスのスパイクタンパク質を含むエンベロープに囲まれたヌクレオカプシドに囲まれた正極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。現在、アルファウイルス属には、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）を含み、これらはすべて近縁で、そして、様々な脊椎動物、例えば、哺乳類、げっ歯類、魚類、鳥類、ヒトやウマなどの大型哺乳類、並びに無脊椎動物、例えば、昆虫に感染する。種間や個体間の感染は主に蚊を介して起こるため、アルファウイルスはアルボウィルス又は節足動物が媒介するウイルスのコレクションの一因となっている。特にシンドビスウイルスとセムリキ森林ウイルスは広く研究されており、これらのウイルスのライフサイクル、複製様式などはよく特徴付けられている。特にアルファウイルスは動物細胞内で非常に効率よく複製することが示されており、動物細胞内でタンパク質や核酸を生産するためのベクターとして価値がある。

これらのアルファウイルスの各々は、ウイルスのスパイクタンパク質を含むエンベロープに囲まれたヌクレオカプシドに囲まれた正極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。アルファウイルス粒子はエンベロープを有し、球形の傾向があり（わずかに多形であるが）、等尺性のヌクレオカプシドを有する。アルファウイルスゲノムは長さ約１１－１２ｋｂの正極性の一本鎖ＲＮＡで、５’キャップ、３’ポリＡテール、および酵素機能を持つ非構造タンパク質をコードする第１フレームとウイルス構造タンパク質（例えば、カプシドタンパク質ＣＰ、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ２糖タンパク質、Ｅ３タンパク質および６Ｋタンパク質）をコードする第２フレームの２つのオープンリーディングフレームを含む。

アルファウイルスゲノムの５′ ２／３は、ウイルスＲＮＡの転写および複製に必要な多数の非構造タンパク質（ｎｓＰ）をコードしている。これらのタンパク質はＲＮＡから直接翻訳され、細胞タンパク質と共にウイルスゲノムの複製とｓｇＲＮＡの転写に不可欠なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを形成する。４つのｎｓＰ（ｎｓＰ１－４）は単一のポリタンパク質として産生され、ウイルスの複製機構を構成する。ポリタンパク質のプロセシングは高度に制御された方法で行われ、Ｐ２／３接合部での切断がゲノム複製中のＲＮＡ鋳型利用に影響を与える。この部位は狭い裂け目の基部にあり、容易にアクセスできない。一旦切断されると、ｎｓＰ３はｎｓＰ２を取り囲むリング構造を作る。これら２つのタンパク質は広範な界面を持つ。非細胞毒性ウイルスや温度感受性表現型を作り出すｎｓＰ２の変異は、Ｐ２／Ｐ３界面領域に集中している。ｎｓＰ２の非細胞毒性変異の位置と反対側のＰ３変異は、Ｐ２／３の効率的な切断を妨げる。その結果、ＲＮＡ感染性に影響を与え、ウイルスＲＮＡ産生レベルを変化させる可能性がある。

ゲノムの３’ ３分の１は、ウイルス粒子の形成に必要なすべての構造タンパク質の翻訳の鋳型となるｓｇＲＮＡを含む。：コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃと、ヘテロ二量体として会合するエンベロープタンパク質Ｐ６２とＥ１である。ウイルス膜に固定された表面糖タンパク質は、レセプターの認識と膜融合による標的細胞への侵入を担っている。ｓｇＲＮＡはｎｓｐ４タンパク質をコードするＲＮＡ配列の３′末端に存在するｐ２６Ｓサブゲノムプロモーターから転写される。Ｐ６２のＥ２およびＥ３へのタンパク質分解成熟は、ウイルス表面の変化を引き起こす。Ｅ１、Ｅ２、場合によってはＥ３、糖タンパク質「スパイク」は一緒になってＥ１／Ｅ２二量体又はＥ１／Ｅ２／Ｅ３三量体を形成し、Ｅ２は中心から頂点まで伸び、Ｅ１は頂点間の空間を満たし、Ｅ３は存在すればスパイクの遠位端にある。ウイルスがエンドソームの酸性にさらされると、Ｅ１はＥ２から解離してＥ１ホモ３量体を形成し、細胞膜とウイルス膜を融合させるステップに必要となる。アルファウイルス糖タンパク質Ｅ１はクラスＩＩのウイルス融合タンパク質であり、インフルエンザウイルスやＨＩＶに見られるクラスＩの融合タンパク質とは構造的に異なる。Ｅ２糖タンパク質は、その細胞質ドメインを通してヌクレオカプシドと相互作用する一方で、そのエクトドメインは細胞レセプターとの結合を担っている。ほとんどのアルファウイルスは周辺タンパク質のＥ３を失っているが、セムリキウイルスではＥ３はウイルス表面と結合したままである。

アルファウイルスの複製は、宿主細胞内の膜表面で起こることが報告されている。感染サイクルの第一段階において、ゲノムＲＮＡの５′末端は、ゲノムＲＮＡに相補的なネガティブ鎖を産生するＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリタンパク質（ｎｓＰ１－４）に翻訳される。ゲノムＲＮＡの３’末端の配列は、ネガティブ鎖合成の開始において重要な役割を果たしており、複製が起こるためには最小限のアデニル酸残基数が必須であることが同定されている。特に、アルファウイルスゲノムが複製されるためには、効率的にマイナス鎖合成を開始し、複製を起こす３’ＵＴＲに続くポリ（Ａ）テールに少なくとも１１残基があるに違いないと以前に報告されている。ポリ（Ａ）テールを２５残基まで長くすると複製が促進されることも以前に報告されているが、ポリ（Ａ）をさらに３４残基まで長くしても、それ以上の複製促進は観察されなかった。さらに、ポリ（Ａ）の内部の非Ａ残基は複製に有害であることが最も多く、このことは、酵素的ポリ（Ａ）テーリングが、３’ＵＴＲに続く３’アデニル酸残基のみを含まないレプリコンＲＮＡには有益でないことを示唆している。ポリ（Ａ）テールに２５超のアデニル酸残基を持つＲＮＡ鋳型では、マイナス鎖合成が促進されないことが以前に報告されている。複製の第二段階において、ネガティブ鎖を鋳型として、それぞれ２つのＲＮＡが産生される：（１）翻訳によって他のｎｓＰを産生し、ウイルスのゲノムとして機能する二次ウイルスのゲノムに対応する正のゲノムＲＮＡ、および（２）感染性粒子を形成するウイルスの構造タンパク質をコードするｓｇＲＮＡ。正のゲノムＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの比率は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４へのポリタンパク質のタンパク質分解による自己切断によって制御される。実際には、ウイルス遺伝子の発現は２段階で行われる。第一段階では、主にポジティブゲノム鎖とネガティブゲノム鎖が合成される。第二段階では、ｓｇＲＮＡの合成は事実上独占的に行われ、その結果、大量の構造タンパク質が産生される。

上述したように、アルファウイルス間にはしばしば大きな違いがある。異なる又は同義の機能を持つ成分をゲノムのどの部分に含むかもアルファウイルス間で異なる。個々のアルファウイルス間の差異だけでなく、アルファウイルスの株内にもしばしば差異があり、病原性などの特性の変化を説明することができる。例えば、ＥＥＥＶの北米株と南米株との間の配列変異は、ＳＴＡＴ１経路を調節する能力を変化させ、Ｉ型インターフェロンの誘導に差異をもたらし、結果として病原性に変化をもたらす。以下に記載するように、本開示のいくつかの実施形態は、ＥＥＥＶに基づく改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡに関する。さらなる例として、ＳＩＮＶ株Ｓ．Ａ．ＡＲ８６（ＡＲ８６）は、ＩＦＮ－γおよび／又はＩＦＮ－βに応答して、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のチロシンリン酸化を迅速かつ強固に阻害するが、関連するＳＩＮＶ株Ｇｉｒｄｗｏｏｄは、ＳＴＡＴ１／２活性化の非効率的な阻害剤である。ＡＲ８６の非構造タンパク質における５３８位のユニークなスレオニンは、非構造タンパク質のプロセシングをより遅くし、関連するＳＩＮＶ株ＧｉｒｄｗｏｏｄからのサブゲノムＲＮＡ合成を遅延させ、このことは、成体マウスの神経病原性表現型に寄与し、異種タンパク質発現の速度論と収率に有利であり、ＡＲ８６ベースのレプリコンベクターから発現されるワクチン抗原に対するより強固な免疫応答に寄与する可能性がある。報告されているゲノム配列（ＧｅｎｂａｎｋＵ３８３０５）を用いた機能的なＡＲ８６レプリコンは作成されていない。おそらく上記のＴ５３８表現型のためと思われ、そのため既存のＡＲ８６ベースのレプリコンには、Ｔ５３８Ｉ変異の減弱を含む多くの改変が含まれていると推測される。しかしながら、本明細書で示した実験結果は、Ｇｉｒｄｗｏｏｄ由来のｎｓＰ遺伝子との特異的キメラを作製することにより、Ｔ５３８を依然として有する機能的ＡＲ８６レプリコンを作製できることを示している。以下にさらに記載するように、本開示のいくつかの実施形態は、ＳＩＮＶ株ＡＲ８６に基づく改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡに関する。

本開示の組成物
以下により詳細に記載されるように、本開示の１つの態様は、対応する非改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡの１又は複数の構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部が除去されている、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡをコードする核酸配列を有する核酸構築物に関する。本開示のいくつかの実施形態は、非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４のコード配列が存在するが、１又は複数の構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部又は全体が存在しない、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードする配列が存在するが、構造タンパク質をコードする配列の実質的な部分が存在しない、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを提供する。また、本明細書に開示されるような核酸構築物を含むように操作された組換え細胞および細胞培養物も提供される。

核酸構築物
以下により詳細に記載されるように、本開示の一態様は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）又はシンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）などのアルファウイルスの改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡをコードする核酸配列を含む新規核酸構築物に関する。例えば、改変アルファウイルスゲノムは、親アルファウイルスゲノムのゲノム領域の１又は複数における欠失、置換、および／又は挿入を含み得る。

本開示の核酸構築物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１又は複数を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含み、ここで、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡのウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分は、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡへの異種配列の挿入を容易にするように構成された合成アダプター分子によって置換される。いくつかの実施形態では、式Ｉを有する合成アダプター分子であって：

ここで、
ａ）ｎは１～６の整数であり；
ｂ）前記制限部位が制限エンドヌクレアーゼにより切断可能であり；そして、
ｃ）前記５’フランキングドメインおよび３’フランキングドメインはそれぞれ、最小限の二次構造を有すると予測される核酸配列を含む、
改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む核酸構築物である。

いくつかの実施形態では、ｎは、１～６までの整数であり、例えば、１～２まで、１～３、１～４、１～５、２～３、２～４、２～５、２～６、３～４、３～５、３～６、４～５、４～６、又は５～６の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは１である。

いくつかの実施形態では、核酸構築物は、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡをコードする核酸配列を含み、ここで、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡの１又は複数の構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分が除去されており、例えば、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、アルファウイルス構造タンパク質ＣＰ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、および６Ｋの１又は複数をコードする配列の少なくとも一部を含まない。

本開示の核酸構築物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１又は複数を含み得る。いくつかの実施形態では、未改変ウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡのウイルス構造タンパク質ＣＰ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、および６Ｋの１又は複数をコードする核酸配列の少なくとも一部が除去されている。いくつかの実施形態では、ＣＰをコードする配列の一部又は全体が除去されている。いくつかの実施形態では、Ｅ１をコードする配列の一部又は全体が除去されている。いくつかの実施形態では、Ｅ２をコードする配列の一部又は配列全体が除去されている。いくつかの実施形態では、Ｅ３をコードする配列の一部又は配列全体が除去されている。いくつかの実施形態では、６Ｋをコードする配列の一部又は全体が除去されている。いくつかの実施形態では、ＣＰ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、および６Ｋの組み合わせをコードする配列の一部又は配列全体が除去されている。本開示のいくつかの実施形態は、改変されていないアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４のコード配列が存在するが、アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡの１又は複数の構造タンパク質（例えば、ＣＰ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、および６Ｋ）をコードする配列の少なくとも一部又は全体が存在しない、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡの構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分が除去された、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを提供する。

いくつかの実施形態では、１又は複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分が除去されている。当業者は、ウイルス構造ポリペプチドをコードする核酸配列の実質的な部分が、当業者による配列の手動評価によって、又はＢＬＡＳＴのようなアルゴリズムを使用するコンピュータ自動化配列比較および同定によって、そのポリペプチドの推定同定を可能にするのに十分な量を含み得ることを理解するであろう。（例えば、「ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ」；ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、１９９３参照）。従って、ヌクレオチド配列の実質的な部分は、その配列を含む核酸フラグメントの特異的同定および／又は単離を可能にするのに十分な配列を含む。例えば、核酸配列の実質的部分は、全長核酸配列の少なくとも約２０％、例えば、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％を含み得る。上記のように、本開示は、１又は複数のウイルス構造タンパク質をコードする部分的又は完全な核酸配列を欠く核酸分子および構築物を提供する。本明細書中に開示される配列の利益を有する当業者は、開示される配列の全て又は実質的な部分を、本開示の組成物および方法のために容易に使用することができる。従って、本出願は、本明細書中に開示されるような完全な配列、例えば、添付の配列表に記載される配列、および上記で定義されるようなそれらの配列の実質的な部分を含む。

いくつかの実施形態では、ウイルス構造タンパク質をコードする配列全体が除去されており、例えば、改変ウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ウイルス未改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡの構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない。

本開示のｓｒＲＮＡ構築物は一般に、少なくとも約２ｋｂの長さを有する。例えば、ｓｒＲＮＡは、少なくとも約２ｋｂ、少なくとも約３ｋｂ、少なくとも約４ｋｂ、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約６ｋｂ、少なくとも約７ｋｂ、少なくとも約８ｋｂ、少なくとも約９ｋｂ、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約１１ｋｂ、少なくとも約１２ｋｂ、又は１２ｋｂ超の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、ｓｒＲＮＡは、約４ｋｂ～約２０ｋｂ、約４ｋｂ～約１８ｋｂ、約５ｋｂ～約１６ｋｂ、約６ｋｂ～約１４ｋｂ、約７ｋｂ～約１２ｋｂ、約８ｋｂ～約１６ｋｂ、約９ｋｂ～約１４ｋｂ、約１０ｋｂ～約１８ｋｂ、約１１ｋｂ～約１６ｋｂ、約５ｋｂ～約１８ｋｂ、約６ｋｂ～約２０ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約６ｋｂ～約１２ｋｂ、約６ｋｂ～約１１ｋｂ、約６ｋｂ～約１０ｋｂ、約６ｋｂ～約９ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、約７ｋｂ～約１１ｋｂ、約７ｋｂ～約１０ｋｂ、約７ｋｂ～約９ｋｂ、約７ｋｂ～約８ｋｂ、約８ｋｂ～約１１ｋｂ、約８ｋｂ～約１０ｋｂ、約８ｋｂ～約９ｋｂ、約９ｋｂ～約１１ｋｂ、約９ｋｂ～約１０ｋｂ、又は約１０ｋｂ～約１１ｋｂを有し得る。いくつかの実施形態では、ｓｒＲＮＡは、約６ｋｂ～約１４ｋｂの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、ｓｒＲＮＡは約６ｋｂ～約１６ｋｂの長さを有し得る。

アダプター分子の合成
上述したように、合成アダプター分子の５’フランキングドメインおよび３’フランキングドメインはそれぞれ、ポリメラーゼ終結シグナルとして潜在的に機能し得るステム－ループ構造又はヘアピン構造などの最小限の二次構造を有すると予測される核酸配列を含み、その結果、早すぎる終結を引き起こす可能性がある。当業者は、核酸配列の二次構造は、所与の核酸配列のフォールディングΔＧ値を決定又は予測するために開発されたもの、又は核酸配列の最小自由エネルギー（ＭＦＥ）構造を決定するために開発されたものを含む様々な方法論によって評価され得ることを理解するであろう。したがって、いくつかの実施形態では、合成アダプター分子の５’フランキングドメインの配列は、予め定義された閾値よりも高いＭＦＥ構造のフォールディングΔＧ値を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列のＭＦＥ構造は、例えば、ＺｕｋｅｒＭ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ３１，Ｉｓｓｕｅ１３，１Ｊｕｌｙ２００３に先に記載されているように、ＭＦＥＲＮＡ構造予測のためのＭｆｏｌｄツールを使用し、その構造に基づいてΔＧ計算することによって決定することができる。あるいは、又はそれに加えて、ＲＮＡ配列の折り畳み、設計および解析のための一般的に使用されるプログラムのコレクションを有する、ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／で公的に入手可能なＶｉｅｎｎａＲＮＡＰａｃｋａｇｅもまた使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、合成アダプター分子の５’フランキングドメインの配列は、局所ヘアピン／ステムループ構造について、約＞－９．６ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きいＭＦＥ構造のフォールディングΔＧ値を有する。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、ステムループ構造を形成することができるＲＮＡ配列をコードする配列を含まない。

いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、自己タンパク質分解ペプチドのコード配列を含み、これは、Ｎ末端リーダー配列なしで、目的のタンパク質のシームレス発現および／又は隔離発現を容易にするのに有用であり得る。適切な自己タンパク質分解ペプチドとしては、カルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼ（ｆｕｒｉｎ）、豚テシオウイルス－１２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質ポリヘドロシスウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、Ｆｌａｃｈｅｒｉｅウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）由来の自己タンパク質分解切断配列を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、自己タンパク質分解ペプチドのコード配列は、制限部位の上流に組み込まれる。本出願の目的のために、核酸配列に関する「上流」という用語は、当該核酸配列の５’末端に位置する領域を指定し、そして、「下流」という用語は、当該核酸配列の３’末端に位置する領域を指定する。従って、いくつかの実施形態では、合成アダプター分子の５’フランキングドメインは、カルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼ（ｆｕｒｉｎ）、豚テシオウイルス－１２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質ポリヘドロシスウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、Ｆｌａｃｈｅｒｉｅウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、又はそれらの組み合わせに由来する１又は複数の自己タンパク質分解切断配列のコード配列を含む。

いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、目的のタンパク質の隔離発現を促進するのに有用な内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳエレメントは制限部位の上流に組み込まれる。本開示の組成物および方法に適したＩＲＥＳ配列としては、ウイルスＩＲＥＳ配列、細胞ＩＲＥＳ配列、および人工ＩＲＥＳ配列を含むが、これらに限定されない。ＩＲＥＳ配列の非限定的な例は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ＩＲＥＳ、肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、クリパウイルスＩＲＥＳ、ロパロシプムパディウイルスＩＲＥＳ、線維芽細胞増殖因子ＩＲＥＳ、血小板由来増殖因子ＩＲＥＳ、血小板由来成長因子ＩＲＥＳ、血管内皮成長因子ＩＲＥＳ、インスリン様成長因子ＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ、Ｐｉｍ－１ＩＲＥＳ、ｐ５３ＩＲＥＳ、Ａｐａｆ－１ＩＲＥＳ、ＴＤＰ２ＩＲＥＳ、Ｌ－ｍｙｃＩＲＥＳ、及びｃ－ｍｙｃＩＲＥＳを含む。

いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、いずれのリーディングフレームにおいても翻訳開始部位を含まない。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、５’アダプター配列の最後のヌクレオチドとして翻訳開始部位又はその一部（例えば、「Ａ」又は「ＡＴ」又は「ＡＴＧ」で終わる）を含む。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、５’アダプター配列の最後の３つのヌクレオチドとしてメチオニンコドンを含む。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、約１５ヌクレオチド～約３５ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、約３０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、配列番号１に対して、少なくとも７０％の配列同一性を有し、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、配列番号１に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、５’フランキングドメインは、配列番号１に対して１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、１’フランキングドメインは、配列番号１に対して１００％の配列同一性を有する核酸配列を含み、さらに、核酸配列中の１、２、３、４、又は５個のヌクレオチドが、異なるヌクレオチドによって置換される。

上述のように、本開示のいくつかの実施形態では、合成アダプター分子の３’フランキングドメインは、ステムループ構造などの最小二次構造を有すると予測される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインの配列は、予め定義された閾値よりも高い最小自由エネルギー（ＭＦＥ）構造のフォールディングΔＧ値を有する。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、ステムループ構造を形成することができるＲＮＡ配列をコードする配列を含まない。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、３’アダプター配列の最初の３ヌクレオチドとして翻訳終止コドンを含む。適切な停止コドンは、ＴＡＧ、ＴＡＡ、およびＴＧＡを含む。従って、いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、３’アダプター配列の最初の３ヌクレオチドとしてＴＡＧ終止コドンを含む。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、３’アダプター配列の最初の３ヌクレオチドとしてＴＡＡ終止コドンを含む。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、３’アダプター配列の最初の３ヌクレオチドとしてＴＡＧ終止コドンを含む。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、配列番号２に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、配列番号２に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、配列番号２と１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、３’フランキングドメインは、配列番号２に対して１００％の配列同一性を有する核酸配列を含み、さらに、核酸配列中の１、２、３、４、又は５個のヌクレオチドが異なるヌクレオチドで置換されている。

いくつかの実施形態では、合成アダプター分子は、配列番号２０に対して、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、合成アダプター分子は、配列番号２０に対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、合成アダプター分子は、配列番号２０に対して１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、合成アダプター分子は、配列番号２０に対して１００％の配列同一性を有する核酸配列を含み、さらに、核酸配列中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドが異なるヌクレオチドで置換されている。

制限部位
いくつかの実施形態では、合成アダプター分子内の制限部位は、Ｉ型制限酵素、ＩＩ型制限酵素、ＩＩＩ型制限酵素、ＩＶ型制限酵素、Ｖ型制限酵素、およびホーミングエンドヌクレアーゼから選択される制限酵素によって切断可能である。いくつかの実施形態では、合成アダプター分子内の制限部位は、一意に切断可能であり、例えば、核酸構築物全体における一意の制限部位である。制限部位を一意にするために、任意選択で、サイレント変異は、核酸構築物のレプリコンコード配列中の制限部位に操作されてもよい。

いくつかの実施形態では、制限部位は、Ｉ型制限酵素から選択される制限酵素によって切断可能であり、この制限酵素は、その認識部位とは異なり、ランダムな距離（少なくとも１０００ｂｐ）離れた部位でＤＮＡを切断する、複雑な、多サブユニットの、組み合わせ制限および修飾酵素である。このようなランダムな部位での切断は、ＤＮＡの移動の過程をたどることから、これらの酵素が分子モーターでもあることがわかる。認識部位は非対称で、３－４ヌクレオチドを含む部分と４－５ヌクレオチドを含む部分の２つの特異的部分から構成され、約６－８ヌクレオチドの非特異的スペーサーで隔てられている。これらの酵素は多機能であり、標的ＤＮＡのメチル化状態に応じて、制限酵素分解活性と修飾活性の両方が可能である。補酵素であるＳ－アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）、加水分解されたアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウム（Ｍｇ^２＋）イオンは、その完全な活性に必要である。

いくつかの実施形態では、制限部位は、ＩＩ型制限酵素から選択される制限酵素によって切断可能であり、この制限酵素は、典型的には回文である特定の４～８ヌクレオチド配列を認識し、認識配列内の規定された位置で切断し、突出末端（５′又は３′オーバーハング）又は平滑末端（例えば、図７を参照）を残す。これらの酵素は、個別の制限フラグメントと明確なゲルバンドパターンを生成し、ルーチンのＤＮＡ分析および遺伝子クローニングのために実験室でしばしば使用される。典型的なＩＩ型酵素にはＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩがあり、これらは認識配列内でＤＮＡを切断する。多くのＩＩ型酵素が市販されている。多くはホモダイマーとしてＤＮＡに結合するため、対称的なＤＮＡ配列を認識するが、少数（例えばＢｂｖＣＩ）はヘテロダイマーとして結合するため、非対称的なＤＮＡ配列を認識する。ＩＩ型酵素の中には、認識配列の２つのハーフサイトが隣接している連続配列（例えばＥｃｏＲＩ）を認識するものもあれば、ハーフサイトが離れている不連続配列（例えばＢｇｌＩ）を認識するものもある。切断により、それぞれの切断の片側には３´－ヒドロキシルが残り、もう片側には５´－リン酸が残る。ＩＩ型酵素は活性のためにマグネシウムを必要とし、対応する修飾酵素はＳ－アデノシルメチオニンを必要とする。ＩＩ型酵素は小さい傾向があり、サブユニットは２００－３５０アミノ酸の範囲である。いくつかの実施形態では、合成アダプター分子の制限部位はＳｐｅＩ又はそのアイソシゾマーによって切断可能である。ＳｐｅＩの適切なアイソシゾマーとしては、ＡｈＩＩ、ＢｃｕＩ、およびＳｐｅＩ－ＨＦが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、合成アダプター分子の制限部位は、ＩＩＳ型制限酵素によって切断可能である。ＩＩＳ型制限酵素は、認識配列の下流又は上流の規定された距離でＤＮＡを切断する酵素群を含む。これは、触媒ドメインと認識ドメインがポリペプチドリンカーによって分離されている酵素構造によるものである。切断部位の塩基の同一性に関する配列要件はない。したがって、認識部位を越える配列は、ヌクレオチドのどのような組み合わせでもよい（例えば、図７参照）。ＩＩＳ型制限酵素には、ＦｏｋＩやＡｌｗＩのような、認識配列の片側の外側を切断するものがある。これらの酵素は４００－６５０アミノ酸長の中間の大きさで、連続的で非対称な配列を認識する。酵素は２つの異なるドメインを含み、１つはＤＮＡ結合用、もう１つはＤＮＡ切断用である。ほとんどの場合、単量体としてＤＮＡに結合するが、隣接する酵素分子の切断ドメインが二量体化することにより、協力的にＤＮＡを切断すると考えられている。このため、いくつかのＩＩＳ型酵素は、複数の認識部位を持つＤＮＡ分子に対してより活性が高い。

いくつかの実施形態では、制限部位は、大きな、組合せ制限および修飾酵素であるＩＩＩ型制限酵素（例えば、ＥｃｏＰ１５）から選択される制限酵素によって切断可能である。ＩＩＩ型制限酵素は、逆向きの２つの別々の非回文配列を認識する。認識部位の約２０－３０塩基対後にＤＮＡを切断する。これらの酵素は１超のサブユニットを含み、ＤＮＡメチル化と制限分解の役割のためにそれぞれＡｄｏＭｅｔとＡＴＰ補因子を必要とする。ＩＩＩ型制限酵素は原核生物のＤＮＡ制限修飾機構の構成要素であり、外来ＤＮＡの侵入から生物を守っている。ＩＩＩ型制限酵素は、Ｒｅｓ（Ｐ０８７６４）とＭｏｄ（Ｐ０８７６３）の２つのサブユニットから構成されるヘテロオリゴマーの多機能タンパク質である。Ｍｏｄサブユニットはその系に特異的なＤＮＡ配列を認識し、修飾メチルトランスフェラーゼである。そのため、機能的にはＩ型制限酵素のＭおよびＳサブユニットと同等である。Ｒｅｓは制限酵素分解に必要であるが、それ自身は酵素活性を持たない。ＩＩＩ型酵素は５－６ｂｐ長の短い非対称ＤＮＡ配列を認識し、２５－２７ｂｐ下流で切断して短い一本鎖の５’突起を残す。制限酵素による分解が起こるためには、２つの逆向きのメチル化されていない認識部位が必要である。これらの酵素はＤＮＡの片方の鎖、アデノシル残基のＮ－６位のみをメチル化するので、新しく複製されたＤＮＡは片方の鎖のみがメチル化されることになり、制限酵素による分解を防ぐには十分である。ＩＩＩ型酵素はＮ６アデニンメチルトランスフェラーゼのβサブファミリーに属し、モチーフＩ、ＡｄｏＭｅｔ結合ポケット（ＦＸＧＸＧ）、モチーフＩＶ、触媒領域（Ｓ／Ｄ／Ｎ（ＰＰ）Ｙ／Ｆ）など、このファミリーを特徴づける９つのモチーフを持つ。タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶＶＤＮＡ制限系に関する追加情報は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＬｅｏｎｅｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ（２０１４）４２（１）：３－１９）に記載されている。

いくつかの実施形態では、制限部位は、修飾された、任意にメチル化されたＤＮＡを認識し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＭｃｒＢＣおよびＭｒｒ系によって例示されるＩＶ型制限酵素から選択される制限酵素によって切断可能である。

いくつかの実施形態では、制限部位は、タイプＶ制限酵素から選択される制限酵素によって切断可能であり、この制限酵素は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を利用して、侵入生物上に見出される特定の非回文配列を標的とする。Ｖ型制限酵素は、適切なガイドＲＮＡが提供されれば、可変長のＤＮＡを切断することができる。Ｖ型制限酵素の非限定的な例としては、ＣＲＩＳＰＲのｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体が挙げられる。

いくつかの実施形態では、制限部位はホーミングエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ）によって切断可能である。ホーミングエンドヌクレアーゼは、大きな非対称認識部位（１２～４０塩基対）および通常イントロン又はインテインに埋め込まれるコード配列を有する二本鎖ＤＮアーゼである。一般に、ホーミングエンドヌクレアーゼは、その大きな非対称認識配列（１２－４０塩基対）の下流又は上流に定義された距離でＤＮＡを切断する。これらの酵素については、過去数十年の間に大量の生化学的・構造的データが報告されており、例えばＣｈｅｖａｌｉｅｒａｎｄＳｔｏｄｄａｒｄ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４）に記載されており、これは援用により本明細書に組み込まれる。本開示の組成物および方法に好適なホーミングエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、およびＰＩ－ＳｃｅＩが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡのポリ（Ａ）テールをコードする配列のすぐ下流に組み込まれた追加の制限部位をさらに含む。核酸構築物が環状である例では、ポリ（Ａ）テールをコードする配列のすぐ下流に組み込まれた追加の制限部位は、環状核酸構築物の直鎖化を促進でき、それにより「クリーンな」ポリ（Ａ）テンプレート末端を生成し、および／又は同じ末端同一性を有する核酸産物を生成する。いくつかの実施形態では、このような制限部位は、ｄｅ－ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚｅｄローリングサークル増幅（ＲＣＡ）産物の生成又は同じ末端同一性を残すポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の処理を可能にし得る。「クリーンな」ポリ（Ａ）テンプレート末端は、一般に、ランオフ転写によって終結し、３’非Ａ残基のないポリ（Ａ）配列を含むＲＮＡ産物をもたらすＲＮＡＩＶＴ産物をテンプレートするホモポリマー配列を有するＤＮＡ配列末端を示すことを、当業者は理解するであろう。一態様では、本開示のいくつかの実施形態は、ポリ（Ａ）テールを含む改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む核酸構築物に関し、ここで、追加の制限部位が、アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡのポリ（Ａ）テールをコードする配列のすぐ下流に操作される。いくつかの実施形態では、追加の制限部位は、ＩＩＳ型制限酵素によって切断可能である。本開示の組成物および方法に好適なＩＩＳ型制限酵素の例としては、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｅＩ、ＢｂｉＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｓＩ－ＨＦ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ．ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＩ－ＨＦ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ－ｖ２、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ－ｖ２、およびＢｔｓＩＭｕｔＩを含む。追加の適切なＩＩＳ型制限酵素としては、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｐｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、およびＳｆａＮＩが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、追加の制限部位は、ＳａｐＩ、ＢｐｉＩ、ＢｍｓＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ又はそれらのいずれかのアイソシゾマーによって切断可能である。いくつかの実施形態では、追加の制限部位は、ＳａｐＩ又はそのアイソシゾマーによって切断可能である。いくつかの実施形態では、ＳａｐＩのアイソシゾマーは、ＬｇｕＩ、ＰｃｉＳＩ、又はＢｓｐＱＩである。

本明細書に開示されるような改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ）、例えば、ポリ（Ａ）テールをコードする配列の下流に組み込まれた制限部位を含み、３’末端に非アデニル酸残基を含まない改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ）をもたらすものが、最先端のレプリコンが最も一般的に３’末端に非アデニル酸残基を含むことから、驚くほど増強された生物学的活性を示すことが実証された。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、本明細書に開示されるようなｓｒＲＮＡ）の複製、発現、又は翻訳増強活性は、対応する改変されていない３’末端に非アデニル酸残基を有するレプリコン（例えば、ｓｒＲＮＡ）から検出される複製、発現、又は翻訳レベルに対して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍（２倍）、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、本明細書に開示されるようなｓｒＲＮＡ）は、対応する改変されていないレプリコン（例えば、ｓｒＲＮＡ）、例えば、３’末端に非アデニル酸残基を有するレプリコン（例えば、ｓｒＲＮＡ）から検出される複製、発現、又は翻訳レベルと比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％増加する。増強活性のレベルは、転写物レベル、タンパク質の量、タンパク質活性などを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の便利な方法および技術によって測定することができる。いくつかの実施形態では、増強活性のレベルは、組織培養において細胞に形質転換されたＲＮＡの所与の質量（用量）において、二本鎖ＲＮＡを含む細胞の割合がより高いことによって証明され得る。いくつかの実施形態では、増強活性のレベルは、組織培養において細胞に形質転換されたＲＮＡの所与の質量（用量）において、タンパク質を発現する細胞の割合がより高いことによって証明され得る。

特定の理論に限定されることなく、強化された複製、発現、又は翻訳レベルは、通常のアルファウイルス生物学において正規には出現しない、組換えＲＮＡ分子の３’末端の非Ａヌクレオチドの不在に起因し得る。本明細書に記載の改変アルファウイルスデザインは、既存のアルファウイルスベクターとは対照的であり、ＳＰ６又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼがしばしばＲＮＡ産物の転写に使用され、ポリ（Ａ）の下流の配列（非Ａを含む）を転写する間に、ターミネータとして知られる特徴で、終結する、又は、ランオフ転写により終結するが、ＲＮＡの３’末端に非アデニル酸残基が組み込まれるＲＮＡ産物をコードする鋳型を線状化するために制限酵素が使用される。

以下にさらに詳しく述べるように、線状ＤＮＡ鋳型を生成するために続いて切断されるポリ（Ａ）テールの下流にＩＩＳ型制限酵素を組み込むと、ＲＮＡポリメラーゼターミネーター配列が存在しなくても、ランオフ転写によって転写の終結が起こる。以下に述べる実験では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ部位はＳａｐＩ部位であり、ＳａｐＩ認識配列の上流で切断され、直鎖化ＤＮＡの３’末端にはポリ（Ａ）鋳型のみが残る（すなわち、ＤＮＡ鋳型や転写されたＲＮＡ産物には非Ａヌクレオチドは存在しない）。このアプローチはレプリコンについては記載されておらず、ポリ（Ａ）テール中のアデニル酸残基のみがレプリコンに生物学的活性を付与することは記載されていない。最も一般的な方法は、転写ターミネーターやランオフ転写を使用することであり、これらは両方とも通常転写産物の末端に非アデニル酸ヌクレオチドを残すか、あるいは３’ＵＴＲの後にまだ非アデニル酸残基を含むインビトロ転写産物の酵素的ポリ（Ａ）テールを残す。

上述したように、アルファウイルスゲノムが複製するためには、３’ＵＴＲに続くポリ（Ａ）テールの１１残基が、効率的にマイナス鎖合成を開始し、そして、複製が生じるために必要であることが以前に報告されている。加えて、ポリ（Ａ）の内部の非Ａ残基は複製に有害であることが多く、このことは、酵素的ポリ（Ａ）テーリングが、３’ＵＴＲに続く３’アデニル酸残基のみを含まないレプリコンＲＮＡに利益をもたらさないことを示唆している。ポリ（Ａ）テールのアデニル酸残基が２５超のＲＮＡ鋳型、例えばポリ（Ａ）テールのアデニル酸残基が３４個の鋳型では、マイナス鎖合成が促進されないことが以前に報告されている。この点に関する追加情報は、例えばＨａｒｄｙ＆Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｐｐ．４６３０－４６３９，Ａｐｒｉｌ２００５に記載されている。

本開示のいくつかの実施形態では、アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ）のポリ（Ａ）テールは、報告されたアルファウイルス生物学又はアルファウイルスレプリコンに基づいて予期されない複製、発現、又は翻訳レベルを増強するために、ＤＮＡ鋳型上のポリ（Ａ）の長さを増加させることによって延長される。特に、本明細書において提示された実験データは、ポリ（Ａ）テールの長さを増加させることによる、ＲＮＡ複製およびタンパク質発現の形態における生物学的活性レベルの驚くべき変化（例えば、増加）を実証している。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールをコードする延長された配列は、約３０～約１２０のアデニル酸残基、例えば、約３０～約６０、約４０～約７０、約５０～約８０、約６０～約９０、約７０～約１００、約４０～約８０、約５０～約７０、約６０～約９０、又は約４０～約９０のアデニル酸残基の範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、延長されたポリ（Ａ）テールは、約３４残基より長い。いくつかの実施形態では、延長されたポリ（Ａ）テールは、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、および約１００アデニル酸残基の長さを有する。いくつかの実施形態では、延長されたポリ（Ａ）テールは、３０アデニル酸残基の長さを有する。いくつかの実施形態では、延長されたポリ（Ａ）テールは、４９アデニル酸残基の長さを有する。いくつかの実施形態では、延長されたポリ（Ａ）テールは、９１アデニル酸残基の長さを有する。いくつかの実施形態では、延長されたポリ（Ａ）テールは、９０アデニル酸残基の長さを有する。いくつかの実施形態では、延長されたポリ（Ａ）テールは、６４アデニル酸残基の長さを有する。

増強された活性のレベルは、転写物レベル、タンパク質の量、および／又はタンパク質活性などを測定する方法および技術を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の適切な方法および技術によって測定されてもよい。

いくつかの実施形態では、核酸構築物は、トガウイルス科アルファウイルス属に属するウイルスの改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ）を含む改変レプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ）を含む。強毒性アルファウイルス株および無害アルファウイルス株の両方が好適である。いくつかの実施形態にでは、改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶグループ、又はＳＦＶグループ、又はＳＩＮＶグループに属するアルファウイルスのものである。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドルバーグウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）（Ｏ’Ｎｙｏｎｇ－Ｎｙｏｎｇｖｉｒｕｓ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ホワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキーウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガッチェウイルス（ＫＹＺＶ）（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈｖｉｒｕｓ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウイルス（ＦＭＶ）、ヌドゥムウイルス（ＮＤＵＶ）、又はバギークリークウイルスからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）である。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）である。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）である。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）である。

本開示の組成物および方法に適したＣＨＩＫＶ株の非限定的な例としては、ＣＨＩＫＶＳ２７、ＣＨＩＫＶＬＲ２００６－ＣＯＰＹ－１、ＣＨＩＫＶＹＯ１２３２２３、ＣＨＩＫＶＤＲＤＥ、ＣＨＩＫＶ３７９９７、ＣＨＩＫＶ９９６５３、ＣＨＩＫＶＡｇ４１８５５、およびＮａｇｐｕｒ（Ｉｎｄｉａ）６５３４９６株を含む。本開示の組成物および方法に適したＣＨＩＫＶ株のさらなる例としては、Ａｆｒｅｅｎｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４，５８：６８８－６９６，ＬａｎｃｉｏｔｔｉａｎｄＬａｍｂｅｒｔＡＳＴＭＨ２０１６，９４（４）：８００－８０３ａｎｄＬａｎｇｓｊｏｅｎｅｔａｌ．ｍＢｉｏ．２０１８，９（２）：ｅ０２４４９－１７に記載されているものを含むがこれには限定されない。いくつかの実施形態では、改変ＣＨＩＫＶゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ）は、ＣＨＩＫＶ株Ｓ２７に由来する。いくつかの実施形態では、改変ＣＨＩＫＶゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ＣＨＩＫＶ株ＤＲＤＥに由来する。いくつかの実施形態では、改変ＣＨＩＫＶゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ）は、ＣＨＩＫＶ株ＤＲＤＥ－０６に由来する。いくつかの実施形態では、改変ＣＨＩＫＶゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ）は、ＣＨＩＫＶ株ＤＲＤＥ－０７に由来する。

本開示の組成物および方法に適したＳＩＮＶ株の非限定的な例としては、ＳＩＮＶ株ＡＲ３３９、ＡＲ８６、およびＧｉｒｄｗｏｏｄを含む。本開示の組成物および方法に好適なＳＩＮＶ株のさらなる例としては、Ｓａｍｍｅｌｓｅｔａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９，８０（３）：７３９－７４８，ＬｕｎｄｓｔｒｏｍａｎｄＰｆｅｆｆｅｒＶｅｃｔｏｒＢｏｒｎｅＺｏｏｎｏｔｉｃＤｉｓ．２０１０，１０（９）：８８９－９０７，Ｓｉｇｅｉｅｔａｌ．Ａｒｃｈ．ｏｆＶｉｒｏｌ．２０１８，１６３：２４６５－２４６９ａｎｄＬｉｎｇｅｔａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１９，９３：ｅ００６２０－１９に記載されているものを含むがこれには限定されない。いくつかの実施形態では、改変ＳＩＮＶゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ）は、ＳＩＮＶ株Ｇｉｒｄｗｏｏｄに由来する。いくつかの実施形態では、改変ＳＩＮＶゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ）は、ＳＩＮＶＧｉｒｄｗｏｏｄ株とＳＩＮＶＡＲ８６株とのキメラである。

本開示の組成物および方法に適したＶＥＥＶ株の非限定的な例としては、２０４３８１、３０６４２５、３８８０、３９０８、６１１９、６６６３７、６８Ｕ２０１、６９Ｚ１、８３Ｕ４３４、９３－４２１２４、９６－３２８６３、ＡＢ６６６４０、Ａｎ９００４、Ｃ－８４、ＣＰＡ－２０１、ＦＳＬ０２０１、ＩＮＨ－６８０３、ＩＮＨ－９８１３、Ｐａｎ３６０８０、Ｐ６７６、ＳＨ３、ＴＣ－８３、ＴＲＤ、Ｖ１７８、Ｖ１９８、Ｖ２０９Ａ、Ｖ３５２６、およびＺＰＣ７３８を含む。

本開示の組成物および方法に適したＥＥＥＶ株の非限定的な例としては、３００８５１、４３６０８７、７８３３７２、７９２１３８、ＡＲ３６、ＡＲ３８、ＡＲ５９、ＢＧ６０、ＢＲ５６、ＢＲ６０、ＢＲ６５、ＢＲ６７、ＢＲ７５、ＢＲ７６、ＢＲ７７、ＢＲ７８、ＢＲ８３、ＢＲ８５、Ｃ－４９、ＣＯ９２、ＣＴ９０、ＥＣ７４、ＦＬ０２ａ－ｂ、ＦＬ８２、ＦＬ９１、ＦＬ９３－１６３７、ＦＬ９３－９３９、ＦＬ９３－９６９、ＦＬ９６、ＧＡ０１、ＧＡ９１、ＧＡ９７、ＧＭＬ、ＧＭＬ９０３８３６、ＧＵ６８、ＬＡ０２、ＬＡ４７、ＬＡ５０、ＭＡ０６、ＭＡ３８、ＭＡ７７、ＭＤ８５、ＭＤ９０Ａ、ＭＰ－９、ＭＳ８３、ＭＸ９７、ＮＪ０３ａ－ｂ、ＮＪ６０、ＮＹ０３ａ－ｄ、ＮＹ０４ａ－ｋ、ＮＹ０５ａ－ｆ、ＮＹ６９、ＮＹ７１ａ－ｃ、ＮＹ７３、ＮＹ７４ａ-ｈ、ＮＹ７５、ＰＡ６２、ＰＡ８４、ＰＡ８６、ＰＥ－０．０１５５－９６、ＰＥ－１６．００５０－９８、ＰＥ－１８．０１４０－９９、ＰＥ－１８．０１７２－９９、ＰＥ－３．０８１５－９６、ＰＥ６、ＰＥ７０、ＰＥ７５、ＴＮ０８、ＴＲ５９、ＴＶＰ８５１２、ＴＸ０３、ＴＸ９１、ＴＸ９５、ＶＡ０３、ＶＡ３３、ＶＡ３３、ＶＥ７６、ＶＥ８０、及びＷ１８０を含む。いくつかの実施形態では、改変ＥＥＥＶゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ）は、ＥＥＥＶ株ＦＬ９３－９３９に由来する。

本開示の組成物および方法に適したＷＥＥＶ株の非限定的な例としては、ＷＥＥＶＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＭｃＭｉｌｌａｎ、ＩＭＰ１８１、Ｉｍｐｅｒｉａｌ、Ｉｍｐｅｒｉａｌ１８１、ＩＭＰＲ４４１、７１Ｖ－１６５８、ＡＧ８０－６４６、ＢＦＳ９３２、ＣＯＡ５９２、ＥＰ－６、Ｅ１４１６、ＢＦＳ１７０３、ＢＦＳ２００５、ＢＳＦ３０６０、ＢＳＦ０９９９７、ＣＨＬＶ５３、ＫＥＲＮ５５４７、８５４５２ＮＭ、Ｍｏｎｔａｎａ－６４、Ｓ８－１２２、およびＴＢＴ－２３５を含む。本開示の組成物および方法に適したＷＥＥＶ株のさらなる例としては、５６１４、９３Ａ２７、９３Ａ３０、９３Ａ３８、９３Ａ７９、Ｂ６２８（Ｃｌ１５）、ＣＢＡ８７、ＣＮＴＲ３４、ＣＯ９２１３５６、Ｆｌｅｍｉｎｇ、Ｌａｋｅ４３、ＰＶ０１２３５７Ａ、ＰＶ０２８０８Ａ、ＰＶ７２１０２、Ｒ０２ＰＶ００１８０７Ａ、Ｒ０２ＰＶ００２９５７Ｂ、Ｒ０２ＰＶ００３４２２Ｂ、Ｒ０５ＰＶ００３４２２Ｂ、Ｒ０ＰＶ００３８１４ＡおよびＲ０ＰＶ００３８４Ａを含む。追加の適したＷＥＥＶ株としては、ＢｅｒｇｒｅｎＮＡｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８（１６）：９２６０-９２６７，Ａｕｇ２０１４、およびＶｉｒｕｓＰａｔｈｏｇｅｎＲｅｓｏｕｒｃｅｗｅｂｓｉｔｅ（ＶｉＰＲ；ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝８６８＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｔｏｇａ）で公に入手可能である）に記載されているものを含むがこれには限定されない。いくつかの実施形態では、改変ＷＥＥＶゲノム又はｓｒＲＮＡは、ＷＥＥＶＩｍｐｅｒｉａｌ株に由来する。

いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、１又は複数の発現カセットをさらに含む。原則として、本明細書に開示される核酸構築物は、一般に、任意の数の発現カセットを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの発現カセットを含み得る。当業者は、「発現カセット」という用語が、コード配列と、インビボおよび／又はエキソビボで、細胞におけるコード配列の適切な転写および／又は翻訳を指示するのに十分な調節情報とを含む遺伝物質の構築物を指すことを理解するであろう。発現カセットは、所望の宿主細胞および／又は対象へのターゲティングのためにベクターに挿入されてもよい。従って、いくつかの実施形態では、発現カセットという用語は、「発現構築物」という用語と互換的に使用され得る。いくつかの実施形態では、用語「発現カセット」は、例えば、プロモーターおよび／又は終結シグナルなどの調節エレメントに作動可能に連結されたタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする遺伝子、及び任意選択で、遺伝子の転写又は翻訳に影響を及ぼす他の核酸配列のいずれか又は組み合わせを含む核酸構築物を指す。

いくつかの実施形態では、発現カセットの少なくとも１つは、異種核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。従って、本明細書で提供されるような核酸構築物は、例えば、異種核酸配列に作動可能に連結された調節エレメント（例えば、プロモーター）を含む場合、異種核酸配列の発現に影響を及ぼし得る発現ベクターとしての使用を見出すことができる。いくつかの実施形態では、発現カセットの少なくとも１つは、異種核酸配列に作動可能に連結されたサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇプロモーターは、２６Ｓサブゲノムプロモーターである。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、１又は複数の非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＵＴＲの少なくとも１つは、異種ＵＴＲである。いくつかの実施形態では、異種ＵＴＲの少なくとも１つは、配列番号：１６の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、異種ＵＴＲの少なくとも１つは、配列番号：１７の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、発現カセットの少なくとも１つは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩコード配列は、合成アダプター分子の３’フランキングドメインの上流に位置する停止コドンを含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、所望の特性に対して最適化される。例えば、いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルでの発現に対して最適化される。ヌクレオチド配列の配列最適化に関して、遺伝暗号の縮重は、遺伝子から産生されるポリペプチドのアミノ酸配列の変更を引き起こすことなく、遺伝子のタンパク質コード配列の少なくとも１つの塩基を異なる塩基で置換する可能性を提供する。したがって、本開示の核酸構築物はまた、遺伝暗号の縮重に従った置換によって、本明細書に開示される任意のポリヌクレオチド配列から変更された任意の塩基配列を有してもよい。コドンの使用法を記載する参考文献は、容易に公的に入手可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列バリアントは、例えば、特定の宿主に対する発現を最適化するため（例えば、アルファウイルスｍＲＮＡにおけるコドン用法を、ヒト、非ヒト霊長類、ハムスター、マウス、又はサルなどの他の生物によって好まれるものに変更するため）などの、種々の理由で作製され得る。従って、いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、発現に最適化されたコドンの使用を通じて、標的宿主細胞における発現に最適化される。宿主細胞の発現に最適な好ましいコドンを使用してＧＯＩをコードする合成核酸配列を構築するための技術は、宿主細胞ゲノムのネイティブタンパク質をコードするためのコドン用法の共通性およびそれらの相対的存在量を、当該技術分野において周知の技術によって分析する計算的手法によって決定され得る。コドン使用データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ）は、哺乳動物細胞環境におけるコドン最適化配列の生成に使用することができる。さらに、ＪＣａｔコドン最適化ツール（ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ）、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）コドン最適化ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ）又はＯｐｔｉｍｉｚｅｒオンラインコドン最適化ツール（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ）のような、ある生物からの配列を異なる宿主生物に最適なコドン使用量に変換するための様々なソフトウェアツールが利用可能である。このような合成配列は、合成核酸分子の構築のための当該技術分野で公知の技術によって構築され得、そして、様々な市販業者から入手され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、例えば、コドン最適化されていないコード配列などの参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルで発現するように最適化される。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコドン最適化された配列は、コドン最適化されていない参照コード配列と比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％の発現レベルの増加をもたらす。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコドン最適化配列は、コドン最適化されていない参照コード配列と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、又は少なくとも５倍の発現レベルの増加をもたらす。

ＧＯＩによってコードされるポリペプチドは、一般に任意のポリペプチドであり得、例えば、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、抗体、抗原、免疫調節因子、酵素、シグナル伝達タンパク質、又はサイトカインであり得るポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、微生物タンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質、哺乳動物タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせをコードし得る。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のヘマグルチニン前駆体（ＨＡ）をコードする。ＧＯＩの非限定的な例としては、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０様、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１８ＢＰ、ＩＬ－１様、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－２０、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６様、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＬＩＦ、およびＯＳＭを含む、インターロイキンおよび相互作用タンパク質を含む。追加の適切なＧＯＩとしては、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ）、ＴＮＦ（例えば、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、およびＴＲＡＮＣＥ）、ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３など）、ヘマトポエチン（例えば、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＳＰなど）、ケモカインおよびそれらのレセプター（例えば、以下の通り、ｘｃｌ１、ｘｃｌ２、ｃｃｌ１、ｃｃｌ２、ｃｃｌ３、ｃｃｌ４、ｃｃｌ５、ｃｃｌ７、ｃｃｌ８、ｃｃｌ１１、ｃｃｌ１３、ｃｃｌ１４、ｃｃｌ１５、ｃｃｌ１６、ｃｃｌ１７、ｃｃｌ１８、ｃｃｌ１９、ｃｃｌ２０、ｃｃｌ２１、ｃｃｌ２２、ｃｃｌ２３、ｃｃｌ２４、ｃｃｌ２５、ｃｃｌ２６、ｃｃｌ２７、ｃｃｌ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、およびＣＸ３ＣＬ１）、免疫抑制遺伝子産物および関連する転写因子（ｅ．ｇ．，ＰＥＣＡＭ１、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＯＳ、ＮＦＫＢ１、ＪＵＮ、ＨＩＦ１Ａ、ＰＤ－Ｌ１、ｍＴＯＲ、ＳＴＡＴ５Ｂ、およびＳＴＡＴ４）を含むがこれには限定されない。本開示の組成物および方法に適切な追加のＧＯＩとしては、免疫賦活性遺伝子産物（例えば、ｃｄ２７／ｃｄ７０、ｃｄ４０、ｃｄ４０ｌ、ｂ７．１、ＢＴＬＡ、ＭＡＶＳ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＲＩＧ－Ｉ、およびＳＴＩＮＧ）、薬剤耐性変異体／遺伝子のバリアント、例えば、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＧ２、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＡＦＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ．ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＫ２、ＥＳＲ１、ＧＲＢ２、ＫＲＡＳ、ＭＤＲ１、ＭＲＰ１、ＮＴＲＫ１、ＰＤＣ４、Ｐ－ｇｐ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＳＨＩＰ、およびＳＴＫ１１を含むが、これらに限定されない。また、本開示の組成物および方法に適切なものとしては、ウイルスタンパク質、特にスパイクタンパク質、繊維タンパク質、構造タンパク質、および付着タンパク質をコードする配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、抗体又は抗体バリアント（例えば、単鎖Ｆｖ、二特異性、カメロイド（ｃａｍｅｌｉｄｓ）、Ｆａｂ、およびＨＣＡｂ）をコードし得る。いくつかの実施形態では、抗体は、がんに関連する、若しくはがんをアップレギュレートする表面分子、又は感染症に関連する表面分子を標的とする。いくつかの実施形態では、抗体は、免疫刺激機能を有する表面分子、又は免疫抑制機能を有する表面分子を標的とする。

いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、例えば、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、イミグルセラーゼ、タリグルセラーゼアルファ、ベラグルセラーゼアルファ、アルグルセラーゼ、セベリパーゼアルファ、ラロニダーゼ、イドゥルスルファーゼ、エロスルファーゼアルファ、ガルスルファーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、およびＣＴＦＲのような、欠損又は変異が疾患又は健康状態に関連する酵素をコードし得る。

いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、抗原分子、生物治療分子、又はそれらの組み合わせから選択されるポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、新抗原、およびそれらの組み合わせから選択されるポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、エストロゲン受容体、細胞内シグナル伝達酵素、およびヒト上皮成長受容体から選択されるポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、免疫調節因子、血管新生の調節因子、細胞外マトリックスの調節因子、代謝の調節因子、神経調節因子、およびそれらの組み合わせから選択される生物治療ポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンパカイン、および腫瘍壊死因子から選択されるサイトカインをコードし得る。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、ＩＦＮγ、およびそれらのいずれかのサブユニットから選択されるインターロイキンをコードし得る。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、ＩＬ－１２Ａ、ＩＬ－１２Ｂ、ＩＬ－１ＲＡ、およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される生物治療ポリペプチドをコードし得る。

いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ）をコードする核酸構築物を直鎖化するために使用される制限酵素部位を含まない。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、ベクター内に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、一本鎖ベクター、例えば、ｓｓＤＮＡベクター又はｓｓＲＮＡベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、二本鎖ベクター、例えば、ｄｓＤＮＡベクター又はｄｓＲＮＡベクターであり得る。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、プラスミドであり得る。以下により詳細に記載されるように、本開示のベクターは、組換えＤＮＡ技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、分子クローニングなど、又は化学合成を用いて作製され得る。従って、いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、完全合成ベクター、例えば、完全合成ｓｓＤＮＡベクターであり得る。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、完全合成ｄｓＤＮＡベクターであり得る。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、ＰＣＲ反応の産物であり得る。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、ＲＣＡ反応の産物であり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、遺伝子送達ベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、遺伝子を細胞に導入するための遺伝子送達ビヒクルとして使用され得る。

いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号３～２７からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する改変アルファウイルスをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する改変アルファウイルスをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する改変アルファウイルスをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する改変アルファウイルスをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する改変アルファウイルスをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号２２の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する改変アルファウイルスをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号２３の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する改変アルファウイルスをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号２４の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する改変アルファウイルスをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号２５の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する改変アルファウイルスをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号２７の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する改変アルファウイルスをコードする核酸配列を含む。

目的の改変アルファウイルスの配列に対する高度の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）を有する核酸配列は、本明細書中で同定された配列（例えば、配列番号３－２７）、又は当該技術分野で公知の任意の他のものを用いて、ゲノム配列解析、ハイブリダイゼーション、および／又はそれぞれのアルファウイルスゲノムにおいて同定された配列からの縮重プライマーもしくは遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲによって、同定および／又は単離することができる。

これらの新規核酸構築物が組み立てられ、そして、特性決定された分子技術および方法は、本出願の本明細書の実施例にさらに十分に記載されている。実施例の項では、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、およびベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスは、本明細書に開示される組成物および方法を説明するために使用されている。

いくつかの実施形態では、核酸分子は組換え核酸分子である。本明細書で使用される場合、組換えという用語は、すなわち、又は間接的であるにせよその結果である、人為的な操作由来の任意の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド）を意味する。非限定的な例として、ｃＤＮＡは組換えＤＮＡ分子であり、インビトロポリメラーゼ反応によって生成された、又はリンカーが結合された、又はクローニングベクターや発現ベクターなどのベクターに組み込まれた核酸分子も組換えＤＮＡ分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子は、１）インビトロで、例えば、化学的又は酵素的技術（例えば、化学的核酸合成の使用、又は核酸分子の複製、重合、エキソヌクレアーゼ分解、エンドヌクレアーゼ分解、ライゲーション、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化を含む）、又は組換え（相同組換えおよび部位特異的組換えを含む）のための酵素の使用）の使用により、インビトロで合成又は改変される；２）自然界では結合していない結合ヌクレオチド配列を含む；３）天然に存在するヌクレオチド配列に対して１又は複数のヌクレオチドを欠くように、分子クローニング技術を用いて操作された；および／又は４）天然に存在するヌクレオチド配列に対して１又は複数の配列変化又は再配列をするように、分子クローニング技術を用いて操作されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニングなど）又は化学合成を用いて産生される。本明細書に開示される核酸分子には、天然の対立遺伝子バリアント、および１又は複数のヌクレオチド残基が挿入、欠失、および／又は置換された改変核酸分子を含むがこれらに限定されない、天然の核酸分子およびそのホモログが含まれ、このような改変は、本明細書に記載されるような生物学的活性をもたらす際に所望の特性を提供する。

天然に存在する核酸配列のバリアントを含む核酸分子は、当業者に公知の多くの方法を用いて産生することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，Ｉｎ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照のこと）。これには限定されないが、以下を含む：古典的な突然変異誘発技術、及び組換えＤＮＡ技術、例えば、以下には限定されないが、部位特異的突然変異誘発、変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片のライゲーション、核酸配列の選択領域のＰＣＲ増幅および／又は変異誘発、組換えクローニング、及びオリゴヌクレオチド混合物の化学合成、核酸分子の混合物を「構築」するための混合群のライゲーション、およびそれらの組み合わせを含む化学合成を使用して、核酸分子の配列は、それが由来する天然に存在する塩基配列に対して変更することができる。核酸分子ホモログは、核酸分子によってコードされるタンパク質又はレプリコン（例えば、ｓｒＲＮＡ）の機能をスクリーニングすることによって、および／又は野生型遺伝子又はその断片とのハイブリダイゼーションによって、あるいは標的又は野生型核酸分子又は配列と相同性を有するプライマーを用いたＰＣＲによって、改変核酸分子の混合物から選択されてもよい。

以下により詳細に記載されるように、本開示の一態様は、本明細書に記載される核酸構築物を含むように、および／又は本明細書に記載される（例えば、発現する）核酸構築物を含むように操作された組換え細胞に関する。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ）を宿主細胞に導入して、核酸構築物および／又はｓｒＲＮＡ構築物を含む組換え細胞を産生することができる。例えば、本開示の核酸構築物は、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの宿主細胞に導入して、核酸分子を含む組換え細胞を産生することができる。従って、本明細書に記載の核酸構築物を含む原核細胞又は真核細胞もまた、本開示の特徴である。関連する態様において、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、動物細胞などの宿主細胞に、本明細書に提供されるような核酸構築物を導入し、次いで形質転換細胞を選択又はスクリーニングすることを含む、細胞を形質転換する方法に関する。本開示の核酸構築物（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡを含むＲＮＡ）又はベクターの細胞への導入は、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸デリバリーなどの当業者に公知の方法によって達成され得る。例えば、異種核酸分子を哺乳動物細胞に導入する方法は当技術分野で知られており、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、核酸分子のリポソームへの封入、脂質ナノ粒子技術、生物学的注入、ＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションなどを含む。

１つの態様では、本開示のいくつかの実施形態は、組換え細胞、例えば、組換え真核細胞、例えば、本明細書に記載の核酸構築物を含む動物細胞に関する。核酸構築物は、宿主ゲノムに安定に組み込まれ得るか、又はエピソーム複製され得るか、又は安定発現もしくは一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞中に存在し得る。従って、本開示のいくつかの実施形態では、核酸構築物は、エピソーム単位として組換え宿主細胞中で維持されかつ複製される。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、組換え細胞のゲノムに安定に組み込まれる。安定な組込みは、古典的なランダムゲノム組換え技術を使用して、又はガイドＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９もしくはＴＡＬＥＮゲノム編集を使用するような、より精密なゲノム編集技術を使用して完了することができる。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、安定発現又は一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞中に存在する。

宿主細胞は、形質転換されていない細胞、又は少なくとも１つの核酸分子で既にトランスフェクトされた細胞のいずれかであり得る。従って、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、少なくとも１つの核酸分子で遺伝子操作（例えば、形質導入又は形質転換又はトランスフェクト）され得る。

本明細書に記載の目的のタンパク質のクローニング又は発現に適した宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。従って、いくつかの実施形態では、本開示の組換え細胞は、細菌大腸菌などの原核細胞、又は昆虫細胞（例えば、蚊細胞又はＳｆ２１細胞）、又は哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、又はＨｅＬａ細胞）などの真核細胞である。いくつかの実施形態では、組換え細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、原核細胞は大腸菌細胞である。例えば、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、目的のタンパク質は細菌中で産生されてもよい。発現後、目的のタンパク質は、可溶性画分として細菌細胞ペーストから単離することができ、さらに精製することができる。

いくつかの実施形態では、細胞はインビボであり、例えば、生体内の組換え細胞、例えば、トランスジェニック対象の細胞である。いくつかの実施形態では、対象は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、対象は昆虫である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物対象である。いくつかの実施形態では、組換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はインビボである。いくつかの実施形態では、細胞はエクスビボであり、例えば、治療又は処置のために、個々の細胞として、又は臓器もしくは組織の一部として、生体又は生物から抽出され、次いで生体又は生物に戻された。ある実施形態では、細胞はインビトロであり、例えばリポジトリから得られたものである。

本開示のいくつかの実施形態では、本開示の組換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、組換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、脊椎動物細胞又は無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、組換え動物細胞は哺乳動物細胞である。グリコシル化タンパク質の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来し得る。無脊椎動物細胞の例には昆虫細胞が含まれる。

脊椎動物の細胞も宿主として使用できる。この点で、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は脊椎動物細胞又は無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、組換え細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は非ヒト動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は非ヒト霊長類細胞である。有用な哺乳動物宿主細胞株のさらなる例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胚性腎臓株（例えば、２９３又は２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞；およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。

いくつかの実施形態では、組換え細胞は、アフリカミドリザル腎臓細胞（Ｖｅｒｏ細胞）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒトＡ５４９細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒトＣＨＭＥ５細胞、ヒト表皮喉頭細胞、ヒト線維芽細胞、ヒトＨＥＫ－２９３細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、ヒトＨｅｐＧ２細胞、ヒトＨＵＨ－７細胞、ヒトＭＲＣ－５細胞、ヒト筋肉細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウス結合組織細胞、マウス筋肉細胞、ウサギ腎臓細胞からなる群より選択される。

本開示のいくつかの実施形態では、組換え細胞は昆虫細胞、例えば昆虫細胞株の細胞である。いくつかの実施形態では、昆虫細胞はＳｆ２１細胞である。追加の適切な昆虫細胞株としては、双翅目、鱗翅目および半翅目の昆虫から樹立された細胞株を含むが、これらに限定されず、異なる組織源に由来し得る。いくつかの実施形態では、本開示の組換え細胞は、鱗翅目昆虫細胞株の細胞である。過去数十年間で、鱗翅目昆虫細胞株の利用可能性は、１０年当たり約５０株ずつ増加している。利用可能な鱗翅目昆虫細胞株に関する詳細は、例えば、ＬｙｎｎＤ．Ｅ．，Ａｖａｉｌａｂｌｅｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎｉｎｓｅｃｔｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００７；３８８：１１７－３８に記載されており、これは援用により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、蚊細胞、例えば、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ（Ａｎ．）属、Ｃｕｌｅｘ（Ｃｘ．）属、およびＡｅｄｅｓ（Ｓｔｅｇｏｍｙｉａ）（Ａｅ．）属内の蚊種の細胞である。本明細書に記載の組成物および方法に好適な例示的な蚊細胞株としては、以下の蚊種由来の細胞株が挙げられる：Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ，Ａｅｄｅｓａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ，Ａｅｄｅｓｐｓｅｕｄｏｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ，Ａｅｄｅｓｔｒｉｓｅｒｉａｔｕｓ，Ａｅｄｅｓｖｅｘａｎｓ，Ａｎｏｐｈｅｌｅｓｇａｍｂｉａｅ，Ａｎｏｐｈｅｌｅｓｓｔｅｐｈｅｎｓｉ，Ａｎｏｐｈｅｌｅｓａｌｂｉｍａｎｕｓ，Ｃｕｌｅｘｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ，Ｃｕｌｅｘｔｈｅｉｌｅｒｉ，Ｃｕｌｅｘｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ，Ｃｕｌｅｘｂｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ，及びＴｏｘｏｒｈｙｎｃｈｉｔｅｓａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓ。適切な蚊細胞株としては、ＣＣＬ－１２５、Ａａｇ－２、ＲＭＬ－１２、Ｃ６／２６、Ｃ６／３６、Ｃ７－１０、ＡＰ－６１、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－１、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－２、ＵＭ－ＡＶＥ１、Ｍｏｓ．５５、Ｓｕａ１Ｂ、４ａ－３Ｂ、Ｍｏｓ．４３、ＭＳＱ４３、およびＬＳＢ－ＡＡ６９５ＢＢを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、蚊細胞は、Ｃ６／２６細胞株の細胞である。

また、別の態様では、本明細書に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック動物が提供される。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック哺乳動物は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、本明細書に記載の組換えＲＮＡ分子を産生する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、本明細書に記載の目的のタンパク質を産生する。

本開示のトランスジェニック非ヒト宿主動物は、外来性核酸を非ヒト動物のゲノムに導入するための当技術分野で公知の標準的方法を用いて調製される。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト動物は、非ヒト霊長類である。本開示の組成物および方法に適した他の動物種としては、（ｉ）遺伝子組み換えに適しており、かつ（ｉｉ）抗体応答を産生するために免疫グロブリン遺伝子セグメントを再配列することができる動物を含む。このような種の例としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ヒツジおよびウシが挙げられるが、これらに限定されない。トランスジェニック非ヒト動物を調製するためのアプローチや方法は当技術分野で知られている。例示的な方法としては、前核マイクロインジェクション、ＤＮＡマイクロインジェクション、レンチウイルスベクターを介した初期胚へのＤＮＡ導入および精子を介したトランスジェネシス、アデノウイルスを介した動物の精子へのＤＮＡ導入（例えば、ブタ）、レトロウイルスベクター（例えば、鳥類）、体細胞核移植（例えば、ヤギ）を含む。トランスジェニック家畜動物の調製に関する技術の現状は、Ｎｉｅｍａｎｎ，Ｈ．ｅｔａｌ．（２００５）Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．２４：２８５－２９８において概説されている。

いくつかの実施形態では、動物は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、動物は哺乳動物対象である。いくつかの実施形態では、哺乳動物が非ヒト動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物が非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック動物は、古典的なランダムゲノム組換え技術を用いて、又はガイドＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集、もしくはＮｇＡｇｏ（ＮａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒｅｇｏｒｙｉＡｒｇｏｎａｕｔｅ）を用いたＤＮＡ誘導エンドヌクレアーゼゲノム編集、もしくはＴＡＬＥＮｓゲノム編集（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）などのより精密な技術を用いて作製することができる。いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック動物は、トランスジェニックマイクロインジェクション技術を用いて作製することができ、相同組換え技術の使用を必要としないため、相同組換えを用いるアプローチよりも調製および選択が容易であると考えられる。

別の態様では、組換えＲＮＡ分子を産生するための方法が本明細書に提供され、当該方法は、（ｉ）本明細書に記載のトランスジェニック動物を飼育すること、又は（ｉｉ）本明細書に記載の組換え細胞を、組換えＲＮＡ分子がトランスジェニック動物又は組換え細胞において産生されるような条件下で培養することを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック動物又は組換え細胞であって、組換えＲＮＡ分子をコードする配列が、ポリ（Ａ）テールをコードする配列の末端後に操作された制限部位を切断することができる制限酵素によって任意選択で分解され、ポリ（Ａ）テールおよび３’末端にアデニル酸残基のみを有するＲＮＡをコードする鋳型を生成する、組換えＲＮＡ分子をコードする配列が提供される。従って、本明細書に記載の方法に従って産生された組換えＲＮＡ分子もまた、本開示によって提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック動物又は組換え細胞であって、組換えＲＮＡ分子をコードする配列が、延長されたポリ（Ａ）テールを含む。従って、本明細書に記載の方法に従って産生される組換えＲＮＡ分子もまた、本開示によって提供される。

別の態様では、目的のポリペプチドを産生するための方法が、本明細書において提供され、当該方法は、（ｉ）本明細書に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック動物を飼育すること、又は（ｉｉ）ＧＯＩによってコードされるポリペプチドがトランスジェニック動物によって、又は組換え細胞において産生される条件下で、本明細書に記載の核酸構築物を含む組換え細胞を培養することを含む。別の態様では、目的のポリペプチドを産生するための方法が本明細書で提供され、該方法は、本明細書に記載の核酸構築物を対象に投与することを含む。本開示の方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１又は複数を含み得る。いくつかの実施形態では、対象は、脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物対象である。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象はヒト対象である。従って、本明細書に開示される方法によって産生される組換えポリペプチドもまた、本開示の範囲内である。

組換えポリペプチドを産生するための開示された方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１又は複数を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の組換えポリペプチドを産生するための方法は、産生されたポリペプチドを単離および／又は精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドを産生するための方法は、産生されたポリペプチドを構造的に修飾して半減期を増加させることをさらに含む。本明細書に記載の組換えポリペプチドを産生する方法のいくつかの実施形態では、産生されたポリペプチドのＮ末端は、半減期を増加させるためにさらに化学的又は酵素的に修飾され得る。いくつかの実施形態では、産生されたポリペプチドのＣ末端は、半減期を増加させるために化学的又は酵素的に修飾される。本明細書に記載の方法に適した化学的および酵素的修飾の非限定的な例としては、ＰＥＧ化、ＸＴＥＮ化、ＰＡＳ化（登録商標）、ＥＬＰ化、およびＨＡＰ化を含む。これらの修飾に適した技術、システム、および試薬は当技術分野で公知である。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生されるポリペプチドは、ＰＥＧ化、ＸＴＥＮ化、ＰＡＳ化、ＥＬＰ化、および／又はＨＡＰ化されて半減期を増加させる。いくつかの実施形態では、産生されたポリペプチドは、別のタンパク質又はペプチド（例えば、血清アルブミン、抗体Ｆｃドメイン、トランスフェリン、ＧＬＫ、又はＣＴＰペプチド）にコンジュゲートされ、半減期を増加させる。

D．医薬組成物
本開示の核酸構築物、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチドは、医薬組成物を含む組成物に組み込まれてもよい。このような組成物は、一般に、本明細書に記載され提供される核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチドの１又は複数と、薬学的に許容される賦形剤、例えば、担体又は希釈剤とを含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、免疫疾患又は微生物感染症などの健康状態の予防、治療、又は管理のために製剤化される。例えば、本開示の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、もしくはその混合物を含む、予防組成物、治療組成物、又は医薬組成物として製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ワクチンとして使用するために製剤化される。いくつかの実施形態では、本願の組成物は、アジュバントとして使用するために製剤化される。

従って、１つの態様では、薬学的に許容される賦形剤と、ａ）本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）；ｂ）本開示の組換え細胞；および／又はｃ）本開示の組換えポリペプチドを含む医薬組成物が本明細書で提供される。

本開示の医薬組成物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１又は複数を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるような核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換え細胞および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換えＲＮＡ分子および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に開示されるような組換えポリペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）は、裸の形態で使用され得るか、又は送達ビヒクルとともに製剤化され得る。本開示の組成物および方法に適した例示的な送達ビヒクルとしては、リポソーム（例えば、中性リポソーム又は陰イオン性リポソーム）、ミクロスフェア、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、脂質ベースナノ粒子（ＬＮＰ）、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ポリプレックス、ポリマーナノ粒子、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）、又は生物活性リガンドとのコンジュゲートであって、送達を容易にし、および／もしくは免疫応答を増強し得るものを含むが、これらに限定されない。これらの化合物は当業者に容易に入手可能である；例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＲＣＰＮｅｗＥｄ，ＩＲＬｐｒｅｓｓ（１９９０）。リポソームなど以外のアジュバントも使用され、当技術分野で知られている。アジュバントは、抗原（例えば、核酸構築物、ベクター、ｓｒＲＮＡ分子）を局所的な沈殿物に補足することによって急速な飛散から保護することもできるし、宿主を刺激してマクロファージおよび免疫系の他の構成要素に対して走化性を示す因子を分泌させる物質を含有することもできる。当業者であれば、例えば以下に述べるものから適切に選択することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、生理学的緩衝液、リポソーム、脂質ベースナノ粒子（ＬＮＰ）、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ポリプレックス、ポリマーナノ粒子、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）、ミクロスフェア、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、生物活性リガンドのコンジュゲート、又はそれらのいずれかの組み合わせのうちの１又は複数を含み得る。

本開示の組成物は、リポソーム、脂質ベースのナノ粒子（ＬＮＰ）、又はポリマーナノ粒子など、意図される投与経路に適合する形式で製剤化され得る。従って、いくつかの実施形態では、リポソーム中に製剤化された本開示の組成物である。いくつかの実施形態では、脂質ベースのナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化された本開示の組成物である。ＬＮＰは、一般に、ウイルス粒子よりも免疫原性が低い。多くのヒトはウイルス粒子に対する既存の免疫を持っているが、ＬＮＰに対する既存の免疫はない。加えて、ＬＮＰに対する適応免疫応答が起こりにくいため、ＬＮＰの反復投与が可能となる。

本明細書に記載の組成物および方法に適した脂質は、カチオン性脂質、イオン化可能なカチオン性脂質、アニオン性脂質、又は中性脂質であり得る。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、１又は複数のイオン化可能な脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「イオン化可能な脂質」という用語は、ｐＨが脂質のイオン化可能な基のｐＫａより低くなるとカチオン性又はイオン化可能（プロトン化）になるが、より高いｐＨ値ではより中性である脂質を指す。ｐＫａ以下のｐＨ値では、脂質は負に帯電した核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と会合することができる。本明細書で使用する「イオン化可能な脂質」という用語は、生理的ｐＨからｐＨが低下すると正電荷を帯びる脂質、および生理的ｐＨなどの選択的ｐＨで正電荷を帯びる多数の脂質種のいずれかを含む。ＤＯＴＭＡのような永久カチオン性脂質は、臨床使用には毒性が高すぎることが証明されている。イオン化可能脂質は、他の実施形態による脂質配合物中に、好ましくは、ある実施形態では約３０～約７０Ｍｏｌ％、他の実施形態では約３０Ｍｏｌ％、他の実施形態では約４０Ｍｏｌ％、他の実施形態では約４５Ｍｏｌ％、他の実施形態では約４７．５Ｍｏｌ％、さらに他の実施形態では約５０Ｍｏｌ％、さらに他の実施形態では約６０Ｍｏｌ％の割合で存在し得る（「Ｍｏｌ％」とは、特定の成分の全モル数に対する割合を意味する）。この段落における用語「約」は、プラスマイナス５Ｍｏｌ％の範囲を意味する。ＤＯＤＭＡ、すなわち、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパンは、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又は０－（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ－ヘプタトリアコンタ－６，９，２６，２９－テトラエン－１９－イル）－４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）（「ＭＣ３」）と同様に、イオン化可能な脂質である。

本開示の組成物および方法に適切な例示的なイオン化可能脂質としては、ＰＣＴ公開ＷＯ２０２０２５２５８９Ａ１およびＷＯ２０２１００００４１Ａ１、米国特許第８，４５０，２９８号および第１０，８４４，０２８号、ならびにＬｏｖｅＫ．Ｔ．ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，Ｆｅｂ．２，２０１０１０７（５）１８６４－１８６９に記載されているものを含み、これらはすべて、援用によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、Ｃ１６－９６、Ｃ１４－１１０、およびＣ１２－２００などの、ＬｏｖｅＫ．Ｔ．ｅｔａｌ．（２０１０上掲）に記載される１又は複数の脂質化合物を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＡＬＣ－０３１５、Ｃ１２－２００、ＬＮ１６、ＭＣ３、ＭＤ１、ＳＭ－１０２、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるイオン化可能なカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、Ｃ１２－２００脂質を含む。Ｃ１２－２００脂質の構造は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第８，４５０，２９８号および同第１０，８４４，０２８号に記載されており、これらは援用によりその全体が本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、Ｃ１２－２００は、コレステロール、Ｃ１４－ＰＥＧ２０００、およびＤＯＰＥと組み合わされる。いくつかの実施形態では、Ｃ１２－２００は、ＤＳＰＣおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と組み合わされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、１又は複数のカチオン性脂質を含む。いくつかの異なるイオン化可能なカチオン性脂質が、ＬＮＰにおける使用のために開発されている。適切なカチオン性脂質としては、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、Ｃ１４－ＰＥＧ２０００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、および７Ｃ１を含むが、これらに限定されない。あるタイプのＬＮＰでは、ＧａｌＮＡｃ部分がＬＮＰの外側に結合し、アシアリロ糖タンパク質レセプター（ａｓｉａｌｙｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）を介して肝臓に取り込まれるためのリガンドとして働く。これらのカチオン性脂質はいずれも、本開示のｓｒＲＮＡ構築物および核酸構築物の送達のためにＬＮＰを製剤化するのに用いることができる。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、１又は複数の中性脂質を含む。本開示の組成物および方法に適切な非限定的な中性脂質としては、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０２０２５２５８９Ａ１およびＷＯ２０２１００００４１Ａ１に記載される１又は複数のイオン化可能な脂質化合物を含む。

ＬＮＰを製造するために、当技術分野で知られている多数の他の脂質又は脂質の組み合わせを使用することができる。ＬＮＰを製造するために使用するのに適した脂質の非限定的な例としては、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ、およびＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。カチオン性脂質の追加の非限定的な例としては、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、Ｃ１４－ＰＥＧ２０００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、７Ｃ１、およびそれらのいずれかの組み合わせを含む。中性脂質の追加の非限定的な例としては、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭを含む。ＰＥＧ修飾脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、およびＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０を含む。

いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達系中の脂質対核酸の質量比は、約１００：１～約３：１、約７０：１～約１０：１、又は約１６：１～約４：１である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達システム中の脂質対核酸の質量比は、約１６：１～約４：１である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達システム中の脂質対核酸の質量比は、約２０：１である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達系中の脂質対核酸の質量比は、約８：１である。いくつかの実施形態では、脂質ベースのナノ粒子は、約１０００ｎｍ、約５００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約７５ｎｍ、約５０ｎｍ、又は約２５ｎｍ未満の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約７０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約８８ｎｍ～約９２ｎｍ、約８２ｎｍ～約８６ｎｍ、又は約８０ｎｍ～約９５ｎｍの範囲の平均直径を有する。

いくつかの実施形態では、ポリマーナノ粒子に製剤化された本開示の組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、免疫原性組成物、例えば、対象において免疫応答を刺激することができる組成物である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、ワクチンとして製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとして製剤化される。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、バイオ治療薬、例えば、生物活性を有する異なる分子の遺伝子送達のためのビヒクルとして製剤化される。バイオ治療薬の非限定的な例としては、サイトカイン、ケモカイン、および他の可溶性免疫調節物質、酵素、ペプチドおよびタンパク質アゴニスト、ペプチドおよびタンパク質アンタゴニスト、ホルモン、受容体、抗体および抗体誘導体、成長因子、転写因子、ならびに遺伝子サイレンシング／編集分子を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとして製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、非免疫原性又は最小限の免疫原性（例えば、対象において免疫応答を最小限に刺激する組成物）である。いくつかの実施形態では、非免疫原性又は最小限の免疫原性の組成物は、バイオ治療薬として製剤化される。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、対象に対して実質的に非免疫原性である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経鼻投与、経皮投与、腹腔内投与、筋肉内投与、気管内投与、結節内投与、腫瘍内投与、関節内投与、静脈内投与、皮下投与、膣内投与、眼内投与、直腸内投与、および経口投与のうちの1又は複数のために製剤化される。

注射用に適した医薬組成物には、無菌の水溶液又は分散液、および無菌の注射液又は分散液を即座に調製するための無菌の粉末が含まれる。静脈内投与に適した担体としては、生理的食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬＴＭ．（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。これらの場合、組成物は無菌であるべきであり、容易なシリンジ性能（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。また、製造および保存の条件下で安定であり、細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されうる。担体としては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適当な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒子径の維持、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムの使用によって維持されうる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成されうる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、および／又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが一般的であろう。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされうる。

無菌注射液は、活性化合物を必要量、適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した成分の1つ又は組合せとともに取り込み、次いで濾過滅菌することにより調製されうる。一般に、分散液は、活性化合物を無菌ビヒクルに取り込むことにより調製されるが、このビヒクルには、塩基性分散媒と、上記に列挙した成分のうち必要な他の成分が含まれている。

いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、エアロゾル、スプレー、ミスト、液体、又は粉末などの吸入用に製剤化される。吸入による投与は、乾燥粉末又はエアロゾル製剤のいずれかの形態であってもよく、これらの製剤は、吸入デバイス、例えば、マイクロスプレー、加圧式定量吸入器、又はネブライザーを使用して、対象（例えば、患者）によって吸入される。

いくつかの実施形態では、組成物は、経鼻投与、経皮投与、筋肉内投与、結節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、膣内投与、腫瘍内投与、皮下投与、関節内投与、又は頭蓋内投与のうちの1又は複数のために製剤化される。いくつかの実施形態では、投与された組成物は、対象におけるインターフェロンの調節された（例えば、増加又は減少した）産生をもたらす。

本開示の方法
本明細書に記載される治療組成物のいずれか１つ、例えば、核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物の投与は、関連健康状態、例えば、増殖性疾患（例えば、増殖性疾患（例えば、がん）、感染性疾患（例えば、急性感染症、慢性感染症、又はウイルス感染症）、希少疾患、および／又は自己免疫疾患、および／又は炎症性疾患の治療および予防に有効でありうる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ構築物）、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物は、それを必要とする対象において免疫応答を調節する、例えば、惹起又は抑制するために有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物は、１又は複数の関連する健康状態又は疾患を有するか、有する疑いがあるか、又は発症するリスクが高い可能性がある対象を治療する方法において使用するための治療剤に組み込むことができる。例示的な健康状態又は疾患には、限定されないが、がん、免疫疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、遺伝子治療、遺伝子置換、心血管疾患、加齢関連病態、希少疾患、急性感染症、および慢性感染症が含まれ得る。いくつかの実施形態では、対象は、医師の管理下にある患者である。

本開示の方法に適した自己免疫疾患の例としては、関節リウマチ、変形性関節症、スチル病、家族性地中海熱、全身性硬化症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管症、糖尿病性神経痛、不随膜炎、乾癬、円形脱毛症、温・寒冷自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、悪性貧血、急性炎症性疾患、自己免疫性副腎炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、ランバート・イートン症候群、苔癬性硬化症、ライム病、バセドウ病、ベーチェット病、メニエール病、反応性関節炎（ライター症候群）、Ｃｈｕｒｇ－Ｓｔｒａｕｓｓ症候群、Ｃｏｇａｎ症候群、ＣＲＥＳＴ症候群、尋常性天疱瘡および落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、膵炎、腹膜炎、乾癬性関節炎、リウマチ熱、サルコイドーシス、シェールゲンセン症候群、強皮症、セリアック病、スティッフマン症候群、高安動脈炎、一過性グルテン不耐症、自己免疫性ぶどう膜炎、白斑、多発性軟骨炎、疱疹状皮膚炎（ＤＨ）又はデューリング病、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、自己免疫性肝炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、免疫複合体障害、糸球体腎炎、結節性多発動脈炎、抗リン脂質症候群、多腺性自己免疫症候群、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、蕁麻疹、自己免疫性不妊症、若年性関節リウマチ、サルコイドーシス、及び自己免疫性心筋症を含むが、これらに限定されない。

本開示の方法に好適な感染の非限定的な例としては、ウィルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、インフルエンザウイルス、およびエボラウイルスなどによる感染を含む。本開示の方法に適したその他の感染症には、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、マイコバクテリア、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）およびトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）などの細胞内寄生虫による感染症が含まれる。

いくつかの実施形態では、核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物は、免疫疾患、自己免疫疾患、又は炎症性疾患、例えば、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、腎炎、腹膜炎、乾癬性関節炎、変形性関節、スティル病、家族性地中海熱、全身性強皮症および硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性肺障害、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、多発性骨髄腫、糸球体腎炎、腎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、白血球接着欠損症、多発性硬化症、レイノー症候群、シェーグレン症候群、若年発症糖尿病、ライター病、ベーチェット病、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発神経炎、免疫介在性血小板減少症、溶血性貧血、重症筋無力症、ループス腎炎、エリテマトーデス、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎、天疱瘡、バセドウ病、橋本甲状腺炎、小血管炎、オーメン症候群、慢性腎不全、自己免疫性甲状腺疾患、急性伝染性単核球症、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス関連疾患、ヒトウイルス感染症、コロナウイルス、その他のエンテロウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス又はアデノウイルス感染症、細菌性肺炎、創傷、敗血症、脳卒中／脳浮腫、虚血再灌流障害、Ｃ型肝炎症などの治療および／又は予防に有用であり得る。

本開示の方法に適した炎症の非限定的な例としては、喘息、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、慢性大腸炎、脾腫、および関節リウマチなどの炎症性疾患を含む。

従って、本開示の１つの態様では、それを必要とする対象において免疫応答を調節するための方法が本明細書で提供され、該方法は、以下の１又は複数を含む組成物を対象に投与することを含む：ａ）本開示の核酸構築物；ｂ）本開示の組換えＲＮＡ分子；ｃ）本開示の組換え細胞；ｄ）本開示の組換えポリペプチド；およびｅ）本開示の医薬組成物。

別の態様において、それを必要とする対象における健康状態を予防および／又は治療するための方法が本明細書で提供され、該方法は、以下の１又は複数を含む組成物を対象に予防的又は治療的に投与することを含む：ａ）本開示の核酸構築物；ｂ）本開示の組換えＲＮＡ分子；ｃ）本開示の組換え細胞；ｄ）本開示の組換えポリペプチド；およびｅ）本開示のいずれか１つの医薬組成物。

いくつかの実施形態では、健康状態は、増殖性障害又は微生物感染（例えば、細菌感染、微小真菌感染、又はウイルス感染）である。いくつかの実施形態では、対象は、増殖性障害又は微生物感染（例えば、細菌感染、微小真菌感染、又はウイルス感染）に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。

いくつかの実施形態では、健康状態は、希少疾患、例えば、希少医薬品法（ＴｈｅＯｒｐｈａｎＤｒｕｇＡｃｔ）（ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｐａｔｉｅｎｔｓ／ｒａｒｅ－ｄｉｓｅａｓｅｓ－ｆｄａ）によって定義される、米国において２０万人未満に罹患する疾患又は状態、および／又は炎症性疾患および／又は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、対象は、炎症性疾患および／又は自己免疫疾患および／又は希少疾患（例えば、家族性地中海熱又は成人発症スティル病を含むが、これらに限定されない）に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。

いくつかの実施形態では、開示される組成物は、その意図される投与経路に適合するように製剤化される。例えば、本開示の核酸構築物、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物は、経口又は吸入によって投与され得るが、非経口経路を介して投与される可能性がより高い。非経口投与経路の例としては、例えば、静脈内投与、結節内投与、皮内投与、腫瘍内投与、関節内投与、皮下投与、経皮投与（局所投与）、経粘膜投与、膣内投与、および直腸投与を含む。非経口適用に使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、その他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールやメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸や重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；アセテート、シトラート、ホスフェートなどの緩衝剤、塩化ナトリウムやブドウ糖などの浸透圧調整剤。ｐＨは、酸又は塩基、例えば、一塩基性および／又は二塩基性のリン酸ナトリウム、塩酸又は水酸化ナトリウムで調整されてもよい。（例えば、ｐＨを約７．２～７．８、例えば７．５）。非経口製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は多回投与バイアルに封入されてもよい。

このような主題の核酸構築物、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は本開示の医薬組成物の用量、毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％に致死する用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０の比で表すことができる。高い治療指数を示す化合物は一般的に適している。有毒な副作用を示す化合物を使用することもできるが、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を軽減するために、そのような化合物を罹患した組織の部位に標的化する送達システムを設計するように注意すべきである。

例えば、細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに使用するための投与量の範囲を策定する際に使用されうる。このような化合物の投与量は、一般にＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある、又は、ほとんど毒性がない。投与量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本開示の方法で使用されるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定されうる。動物モデルでは、細胞培養で決定されたＩＣ_５０（例えば、症状の半減期阻害を達成する被験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように用量を設定されうる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために用いられうる。血漿中の濃度は、例えば高速液体クロマトグラフィーで測定されうる。

本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物は、１日１回又は複数回から１週間に１回又は複数回（１日おきに１回を含む）投与されてもよい。当業者は、特定の因子が、対象を効果的に処置するために必要な投与量およびタイミングに影響し得ること、そして、特定の因子は、疾患の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康および／又は年齢、および存在する他の疾患を含むがこれらに限定されないものを含むことを理解するであろう。さらに、治療有効量の本開示の対象多価ポリペプチドおよび多価抗体による対象の治療は、単一の治療を含み得るか、又は一連の治療を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、５日間、８時間ごとに投与され、その後、２～１４日間、例えば９日間の休息期間が続き、その後、さらに５日間、８時間ごとに投与される。核酸構築物、組換えＲＮＡ分子、および組換えポリペプチドに関して、本開示の核酸構築物、組換えＲＮＡ分子、又は組換えポリペプチドの治療有効量（例えば、有効量）は、選択される核酸構築物、組換えＲＮＡ分子、又は組換えポリペプチドに依存する。例えば、患者体重の約０．００１～０．１ｍｇ／ｋｇの範囲の単回投与量が投与され得；いくつかの実施形態では、約０．００５、０．０１、０．０５ｍｇ／ｋｇが投与され得る。いくつかの実施形態では、本開示の１つ、２つ、３つ、４つ、又は４超の核酸構築物、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、又は組換えポリペプチドを組み合わせて使用されてもよい。

上述したように、いくつかの実施形態における治療上有効な量は、健康状態、例えば疾患又は感染症を有するか、有する疑いがあるか、又はその危険性がある対象などに投与された場合に、特定の効果を促進するのに十分な量の治療用組成物であり得る。いくつかの実施形態では、有効量には、疾患又は感染症の症状の発症を予防又は遅延させる、疾患又は感染症の症状の経過を変化させる（例えば、疾患又は感染症の症状の進行を遅らせるが、これらに限定されない）、又は疾患又は感染症の症状を逆転させるのに十分な量が含まれる。どのような場合であっても、適切な有効量は、日常的な実験を用いて当業者が決定できることが理解される。

疾患又は感染の処置のための開示された治療組成物を含む処置の有効性は、当業者の臨床医によって決定され得る。しかし、疾患又は感染の徴候又は症状の少なくともいずれか１つ又はすべてが改善又は改善される場合、治療は有効な治療とみなされる。有効性はまた、入院又は医療介入の必要性によって評価されるように、個体が悪化しないこと（例えば、疾患又は感染の進行が停止しているか、又は少なくとも遅くなっている）によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、及び／又は本明細書に記載されている。治療には、対象又は動物（いくつかの非限定的な例には、ヒト、又は哺乳動物が含まれる）における疾患又は感染の任意の治療が含まれ、以下が含まれる：（１）疾患又は感染を阻害すること、例えば、症状の進行を阻止すること、又は遅らせること；又は（２）疾患又は感染を緩和すること、例えば、症状の退行を引き起こすこと；および（３）症状の発症を予防すること、又は発症の可能性を低減すること。

いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物は、薬学的に許容される担体を有する組成物中で、免疫応答を刺激するのに有効な量で対象に投与されてもよい。一般に、対象は、最初の一連の注射（又は以下に記載される他の経路の１つによる投与）によって免疫化され得、その後、最初の一連の投与によって与えられる防御を増大させるためにブースターを投与され得る。最初の一連の注射およびその後のブースターは、対象において免疫応答を刺激するのに必要な用量および期間にわたって投与される。いくつかの実施形態では、投与された組成物は、組成物が投与されていない対象におけるインターフェロン産生と比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％、対象におけるインターフェロン産生の増加をもたらす。開示される方法のいくつかの実施形態では、対象は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物対象である。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象はヒト対象である。

上述のように、注射使用に適した薬学的に許容される担体には、無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散液、および無菌の注射用溶液又は分散液を即座に調製するための無菌の粉末を含む。これらの場合、組成物は無菌でなければならず、シリンジ性能が存在する程度に流動性であるべきである。組成物はさらに、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌や真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、それらの適当な混合物、および植物油を含む溶媒又は分散媒体とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒子径の維持、界面活性剤の使用によって維持されうる。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アソルビン酸、チメロサールなどの各種抗菌剤、抗真菌剤によって達成されうる。

滅菌注射液は、核酸構築物、組換え細胞、および／又は組換えポリペプチドを、必要に応じて上記に列挙した成分の1つ又は組合せを含む適切な溶媒中に必要な量で組み込み、次いで濾過滅菌することにより調製することができる。

本明細書に記載の核酸構築物、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物が、上記のように適切に保護されている場合、それらは、例えば、不活性希釈剤又は同化可能な食用担体とともに経口投与することができる。核酸構築物、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物および他の成分はまた、硬質又は軟質の殻ゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されるか、又は個人の食事に直接組み込まれ得る。経口治療投与の場合、活性化合物は賦形剤とともに取り込まれ、摂取可能な錠剤、頬錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハース剤などの形態で使用されてもよい。

いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物、組換えＲＮＡ分子、および組換えポリペプチドは、脂質ベースのナノ粒子（ＬＮＰ）によって細胞又は対象に送達され得る。多くのヒトはウイルス粒子に対する既存の免疫を持っているが、ＬＮＰに対する既存の免疫はない。加えて、ＬＮＰに対する適応免疫応答は起こりにくく、ＬＮＰの反復投与が可能である。

ＬＮＰに使用するために、いくつかの異なるイオン化可能なカチオン性脂質が開発されている。イオン化可能なカチオン性脂質の非限定的な例としては、特にＣ１２－２００、ＭＣ３、ＬＮ１６、ＭＤ１を含む。例えば、あるタイプのＬＮＰでは、ＧａｌＮＡｃ部分がＬＮＰの外側に結合し、アシアリロ糖タンパク質レセプターを介して肝臓に取り込まれるためのリガンドとして働く。これらのカチオン性脂質はいずれも、本開示の核酸構築物および組換えポリペプチドを肝臓に送達するためのＬＮＰを形成するのに用いることができる。

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、又は２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。あるいは、ナノ粒子の大きさは、１～１０００ｎｍ、１～５００ｎｍ、１～２５０ｎｍ、２５～２００ｎｍ、２５～１００ｎｍ、３５～７５ｎｍ、又は２５～６０ｎｍの範囲であり得る。

ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性、又は中性脂質から作られうる。融合性リン脂質ＤＯＰＥや膜成分コレステロールのような中性脂質は、トランスフェクション活性とナノ粒子の安定性を高める「ヘルパー脂質」としてＬＮＰに含めることができる。カチオン性脂質の限界には、安定性の低さやクリアランスの速さによる効力の低さ、炎症反応や抗炎症反応の発生を含む。ＬＮＰは疎水性脂質、親水性脂質、あるいは疎水性脂質と親水性脂質の両方を持つこともできる。

ＬＮＰを製造するために、当技術分野で知られている任意の脂質又は脂質の組み合わせを使用されてもよい。ＬＮＰを製造するために使用される脂質の例は以下の通りである：ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ、およびＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。カチオン性脂質の例は以下の通りである：９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、および７Ｃ１。中性脂質の例は以下の通りである：ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭ。ＰＥＧ修飾脂質の例は以下の通りである：ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、及びＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０。

いくつかの実施形態では、脂質は、ＬＮＰを生成するために任意の数のモル比で組み合わされてもよい。さらに、ポリヌクレオチドは、ＬＮＰを産生するために広範囲のモル比で脂質と組み合わされてもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物は、がん、自己免疫疾患、および／又は感染症を発症している、発症している疑いがある、又は発症するリスクが高い可能性がある対象を予防又は治療する方法に使用するための治療用組成物に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物は、微生物感染を有するか、有する疑いがあるか、又は微生物感染を発症するリスクが高い可能性がある対象を予防又は治療する方法に使用するための治療用組成物に組み込まれる。いくつかの実施形態では、微生物感染は細菌感染である。いくつかの実施形態では、微生物感染は真菌感染である。いくつかの実施形態では、微生物感染はウイルス感染である。

追加療法
いくつかの実施形態では、本開示による組成物は、単一の療法（単独療法）として、又は少なくとも１つの追加の療法（例えば、第２の療法）と組み合わせた第１の療法として、対象に個別に投与される。いくつかの実施形態では、第２の療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、および手術からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、第２の療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、又は手術からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、第１の療法および第２の療法は、付随して投与される。いくつかの実施形態では、第１の療法は、第２の療法と同時に投与される。いくつかの実施形態では、第１の療法と第２の療法は順次投与される。いくつかの実施形態では、第１の療法は第２の療法の前に投与される。いくつかの実施形態では、第１の療法は第２の療法の後に投与される。いくつかの実施形態では、第１の療法は、第２の療法の前および／又は後に投与される。いくつかの実施形態では、第１の療法と第２の療法は交互に投与される。いくつかの実施形態では、第１の療法と第２の療法は単一の製剤で一緒に投与される。

キット
また、本明細書には、本明細書に記載される方法を実施するための様々なキット、ならびに同じものを作製および使用するための説明書が提供される。特に、本開示のいくつかの実施形態は、対象における免疫応答を調節するためのキットを提供する。他のいくつかの実施形態は、それを必要とする対象における健康状態の予防のためのキットに関する。いくつかの他の実施形態は、それを必要とする対象における健康状態を治療する方法のためのキットに関する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供および記載される核酸構築物（例えば、ベクターおよびｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物の１又は複数を含むキット、ならびにこれらを作製および使用するための書面による説明書が本明細書で提供される。

いくつかの実施形態では、本開示のキットは、提供される核酸構築物（例えば、ベクターおよびｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物のいずれか１つを対象に投与するのに有用な１又は複数の手段をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のキットは、提供される核酸構築物（例えば、ベクターおよびｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物のいずれか１つを対象に投与するために使用される１つ又は複数のシリンジ（充填済みシリンジを含む）および／又はカテーテル（充填済みシリンジを含む）をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、所望の目的、例えば、それを必要とする対象における状態の診断、予防、又は処置のために、他のキット成分と同時又は逐次的に投与され得る１又は複数の追加の治療剤を有してもよい。

上記のキットのいずれかは、1つ以上の追加の試薬をさらに含み得、ここで、このような追加の試薬は、以下から選択され得る：希釈緩衝液；再構成溶液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照発現ベクター、陰性対照、陽性対照、提供される核酸構築物のインビトロ産生に適した試薬、組換え細胞、組換えポリペプチド、および／又は本開示の医薬組成物。

いくつかの実施形態では、キットの構成成分は別々の容器に入れてもよい。いくつかの他の実施形態では、キットの構成要素は、単一の容器に組み合わされてもよい。従って、本開示のいくつかの実施形態では、キットは、本明細書に提供および記載される核酸構築物（例えば、ベクターおよびｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、組換えポリペプチド、および／又は医薬組成物のうちの１又は複数を１つの容器（例えば、滅菌ガラス又はプラスチックバイアル内）に含み、かつ、さらなる治療剤を別の容器（例えば、滅菌ガラス又はプラスチックバイアル内）に含む。

別の実施形態では、キットは、本開示の１又は複数の核酸構築物、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、および／又は組換えポリペプチドを含む本明細書に記載の組成物の組合せを、１又は複数のさらなる治療剤と組み合わせて、任意選択で、医薬組成物中に、単一の共通の容器に一緒に製剤化したものを含む。

キットが対象への非経口投与のための医薬組成物を含む場合、キットはそのような投与を行うための装置（例えば、注射装置又はカテーテル）を含んでもよい。例えば、キットは、本開示の１又は複数の核酸構築物、組換え細胞、組換えＲＮＡ分子、および／又は組換えポリペプチドを含む、１又は複数の皮下注射針又は上記で議論したような他の注射デバイスを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示された方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための説明書をさらに含んでもよい。例えば、キットは、キット中の医薬組成物および剤形に関する情報を含む添付文書を含んでもよい。一般に、このような情報は、同封された医薬組成物および剤形を効果的かつ安全に使用する際に患者および医師を助ける。例えば、本開示の組み合わせに関する以下の情報が、添付文書中に提供され得る：薬物動態学、薬力学、臨床試験、有効性パラメータ、適応症および使用法、禁忌、警告、注意事項、副作用、過量投与、適切な用法および用量、供給方法、適切な保存条件、参考文献、製造業者／販売業者情報、および知的財産情報。

本方法を実施するための説明書は、一般に適切な記録媒体に記録される。例えば、説明書は紙やプラスチックなどの基材に印刷することができる。説明書は、キットの容器又はその構成要素（例えば、包装又は副包装に関連する）のラベリングなどにおいて、パッケージ挿入物としてキット中に存在してもよい。説明書は適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えばＣＤ－ＲＯＭ、フロッピーディスク、フラッシュドライブ等に存在する電子記憶データファイルとして存在することができる。ある実施態様では、実際の説明書はキット内に存在しないが、遠隔ソースから（例えば、インターネットを介して）説明書を取得するための手段を提供することができる。この実施形態の例は、説明書を見ることができ、および／又は説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、この説明書を入手するための手段は、適切な基板上に記録することができる。

本開示において言及されているすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が援用により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、援用により本明細書に組み込まれる。

本書に引用された文献が先行技術であることを認めるものではない。引用文献の考察は、その著者が主張することを述べたものであり、出願人は、引用文献の正確性および適切性に異議を唱える権利を留保する。本明細書では、科学雑誌の論文、特許文献、教科書を含む多くの情報源が参照されているが、この参照は、これらの文献のいずれかが当該技術分野における一般的な知識の一部を形成していることを認めるものではないことを明確に理解されたい。

本明細書で示す一般的な方法の考察は、例示のみを目的としたものである。他の代替方法および代替案は、本開示を検討すれば当業者には明らかであり、本出願の精神および範囲に含まれるものとする。

追加の実施形態は、以下の実施例においてさらに詳細に開示されるが、これは例示のために提供されるものであり、本開示又は特許請求の範囲を限定することを決して意図するものではない。

本発明の実施では、特に断らない限り、当業者に周知の分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来技術を用いる。このような技術は、以下の文献で十分に説明されており、それらは援用により本明細書に組み込まれる。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２０１２）．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（４ｔｈｅｄ．）．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｄＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，＆Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３ｒｄｅｄ．）．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ｊｏｉｎｔｌｙｒｅｆｅｒｒｅｄｔｏｈｅｒｅｉｎａｓ “Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｔｈｒｏｕｇｈ２０１４）；Ｂｏｌｌａｇ，Ｄ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９６）．ＰｒｏｔｅｉｎＭｅｔｈｏｄｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ；Ｈｕａｎｇ，Ｌ．ｅｔａｌ．（２００５）．ＮｏｎｖｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．ＳａｎＤｉｅｇｏ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ｅｔａｌ．（１９９５）．ＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ：ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙａｎｄＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ｉ．（１９９７）．ＴｈｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＭｅｔｈｏｄｓＭａｎｕａｌ：ＴｈｅＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＳｏｕｒｃｅｂｏｏｋｏｆＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；Ｄｏｙｌｅ，Ａ．ｅｔａｌ．（１９９８）．ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ；Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，Ｆｅｒｒｅ，Ｆ．＆Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．（１９９４）．ＰＣＲ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ．Ｂｏｓｔｏｎ：ＢｉｒｋｈａｕｓｅｒＰｕｂｌｉｓｈｅｒ；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｅ．Ａ．（２０１４）．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｎｄｅｄ．）．ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔａｌ．（２０００）．ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ，（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｔｈｒｏｕｇｈ２０１４）；ａｎｄＭａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．（２００３）．ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ：ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅｓＢ．Ｖ．

実施例１：改変アルファウィルスベクターの構築
この実施例は、目的の遺伝子（例えば、インフルエンザ由来のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子）の発現のために使用された、多数のベースアルファウイルスベクター（例えば、異種遺伝子を含まない）を構築するために行われた実験の結果を記述している。

ユニバーサルアダプターを有するＶＥＥ空ベクター（図２Ａ）は、５’バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’；配列番号２８）および３’３８残基ポリ（Ａ）に続くＴ７ターミネーター配列（５’－ＡＡＣＣＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴ－３’；配列番号２９）に続くｐＹＬプラスミド骨格における下流ＮｏｔＩ部位が続くＶＥＥＴＣ－８３レプリコン（ＧｅｎｂａｎｋＬ０１４４３）を、ＳｐｅＩ部位を含むユニバーサルアダプター配列を含む合成フォワードプライマー（５’－ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＣＣＣＧＡＣＣＡＧＣ－３’）と合成リバースプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅し、末端に３０ｂｐのホモロジーを有するＰＣＲ産物を生成することで構築され、そして、ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順により環状化した。サイレント変異Ａ２０８７Ｇを導入して、ｎｓＰ２のＳｐｅＩ部位を除去した。この産物は構造遺伝子の代わりにユニバーサルアダプターを持つ。ＳｐｅＩとＮｏｔＩで分解して直鎖化した産物に、３０ｂｐ相同性末端をもつポリ（Ａ）のＳａｐＩ部位下流を含む、３０ｂｐ相同性のフランクを持つ合成ＤＮＡ断片を挿入し、最終ベクターを作製した。

ユニバーサルアダプターを有するＣＨＩＫＶＳ２７空ベクター（図２Ｂ）は、５’バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’；配列番号２８）および３’３７残基ポリ（Ａ）に続くＴ７ターミネーター配列（５’－ＡＡＣＣＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴ－３’；配列番号２９）に続くｐＹＬプラスミド骨格における下流ＮｏｔＩ部位が続くＣＨＩＫＶＳ２７レプリコン（ＧｅｎｂａｎｋＡＦ３６９０２４）を、ＳｐｅＩ部位を含むユニバーサルアダプター配列を含む合成フォワードプライマー（５’－ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＣＣＣＧＡＣＣＡＧＣ－３’；配列番号２０）と合成リバースプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅し、末端に３０ｂｐのホモロジーを有するＰＣＲ産物を生成することで構築され、そして、ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順により環状化した。この産物は構造遺伝子の代わりにユニバーサルアダプターを持つ。ＳｐｅＩとＮｏｔＩで分解して直鎖化した産物に、３０ｂｐ相同性末端をもつポリ（Ａ）のＳａｐＩ部位下流を含む、３０ｂｐ相同性のフランクを持つ合成ＤＮＡ断片を挿入し、最終ベクターを作製した。

ユニバーサルアダプターを有するＣＨＩＫＶＤＲＤＥ空ベクター（図２Ｃ）は、５’バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’；配列番号２８）および３’３７残基ポリ（Ａ）に続くＴ７ターミネーター配列（５’－ＡＡＣＣＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴ－３’；配列番号２９）に続くｐＹＬプラスミド骨格における下流ＮｏｔＩ部位が続く、ＣＨＩＫＶＳ２７３’ ＵＴＲ（ＧｅｎｂａｎｋＡＦ３６９０２４）を含むＣＨＩＫＶＤＲＤＥレプリコン（ＧｅｎｂａｎｋＥＦ２１０１５７）を、ＳｐｅＩ部位を含むユニバーサルアダプター配列を含む合成フォワードプライマー（５’－ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＣＣＣＧＡＣＣＡＧＣ－３’；配列番号２０）と合成リバースプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅し、末端に３０ｂｐのホモロジーを有するＰＣＲ産物を生成することで構築され、そして、ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順により環状化した。この産物は構造遺伝子の代わりにユニバーサルアダプターを持つ。ＳｐｅＩとＮｏｔＩで分解して直鎖化した産物に、３０ｂｐホモロジーをもつポリ（Ａ）のＳａｐＩ部位下流を含む、３０ｂｐ相同性末端を持つ合成ＤＮＡ断片を挿入し、最終ベクターを作製した。

ユニバーサルアダプターを有するＥＥＥＶＦＬ９３－９３９空ベクター（図２Ｄ）は、５’バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’；配列番号２８）および３’３７残基ポリ（Ａ）に続くＴ７ターミネーター配列（５’－ＡＡＣＣＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴ－３’；配列番号２９）に続くｐＹＬプラスミド骨格における下流ＮｏｔＩ部位が続くＥＥＥＶＦＬ９３－９３９レプリコン（ＧｅｎｂａｎｋＥＦ１５１５０２）を、ＳｐｅＩ部位を含むユニバーサルアダプター配列を含む合成フォワードプライマー（５’－ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＣＣＣＧＡＣＣＡＧＣ－３’；配列番号２０）と合成リバースプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅し、末端に３０ｂｐのホモロジーを有するＰＣＲ産物を生成することで構築され、そして、ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順により環状化した。サイレント変異Ａ３５５０Ｃを導入して、ｎｓＰ２のＳｐｅＩ部位を除去した。サイレント変異Ｇ３０１Ａ、Ｇ４５１６Ａ、及びＧ７３９９を導入して、それぞれｎｓＰ１、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４のＳａｐＩ部位を除去した。この産物は構造遺伝子の代わりにユニバーサルアダプターを持つ。ＳｐｅＩとＮｏｔＩで分解して直鎖化した産物に、３０ｂｐホモロジーをもつポリ（Ａ）のＳａｐＩ部位下流を含む、３０ｂｐ相同性末端を持つ合成ＤＮＡ断片を挿入し、最終ベクターを作製した。

ユニバーサルアダプターを有するＳＩＮＶＧｉｒｄｗｏｏｄ空ベクター（配列番号２７）（図２Ｅ）は、５’バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’；配列番号２８）および３’３７残基ポリ（Ａ）に続くＴ７ターミネーター配列（５’－ＡＡＣＣＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴ－３’；配列番号２９）に続くｐＹＬプラスミド骨格における下流ＮｏｔＩ部位が続くＳＩＮＶＧｉｒｄｗｏｏｄレプリコン（ＧｅｎｂａｎｋＭＦ４５９６８３）を、ＳｐｅＩ部位を含むユニバーサルアダプター配列を含む合成フォワードプライマー（５’－ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＣＣＣＧＡＣＣＡＧＣ－３’；配列番号２０）と合成リバースプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅し、末端に３０ｂｐのホモロジーを有するＰＣＲ産物を生成することで構築され、そして、ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順により環状化した。この産物は構造遺伝子の代わりにユニバーサルアダプターを持つ。サイレント変異Ａ５４２０Ｇを導入して、ＧｉｒｄｗｏｏｄｎｓＰ３のＳａｐＩ部位を除去した。ＳｐｅＩとＮｏｔＩで分解して直鎖化した産物に、３０ｂｐホモロジーをもつポリ（Ａ）のＳａｐＩ部位下流を含む、３０ｂｐ相同性末端を持つ合成ＤＮＡ断片を挿入し、最終ベクターを作製した。

ユニバーサルアダプターを有するＳＩＮＶＡＲ８６－Ｇｉｒｄｗｏｏｄキメラ空ベクター（図２Ｆ－Ｉ）は、ＳＩＮＶＧｉｒｄｗｏｏｄ空ベクター（図２Ｅ）をＰＣＲ増幅することによって構築され、ＡＲ８６配列（ＧｅｎｂａｎｋＵ３８３０５）から増幅されたＰＣＲ産物に対して３０ｂｐの相同性末端を有する産物を生成した。この断片をＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順で結合し、最終的なベクターを作製した。キメラ１（図２Ｆ）では、ＧｉｒｄｗｏｏｄのｎｓＰ１、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４が、それぞれＡＲ８６のｎｓＰ１、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４で置換された。サイレント変異Ａ５３６６Ｇを導入して、ＡＲ８６ｎｓＰ３のＳａｐＩ部位を除去した。キメラ２（図２Ｇ）については、ＧｉｒｄｗｏｏｄｎｓＰ４をＡＲ８６ｎｓＰ４で置換した。キメラ３（図２Ｈ）については、ＧｉｒｄｗｏｏｄｎｓＰ３をＡＲ８６ｎｓＰ３で置換した。サイレント変異Ａ５３６６Ｇを導入して、ＡＲ８６ｎｓＰ３のＳａｐＩ部位を除去した。キメラ４（図２Ｉ）については、ＧｉｒｄｗｏｏｄｎｓＰ１をＡＲ８６ｎｓＰ１で置換した。キメラ１－４の配列は配列番号２２－２５に記載されている。

実施例２：目的の遺伝子を組み込んだ改変アルファウイルスベクターの構築
図３Ａのアルファウイルスベクターは、図２の空のＥＥＥＶユニバーサルベクターをＳｐｅＩ分解により直鎖化することにより構築した。インフルエンザ由来のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋＡＹ６５１３３４）をインシリコでヒト発現用にコドンリファクタリングし、合成した（ＩＤＴ）。合成産物は、ＰＣＲ産物にユニバーサルアダプターを３０ｂｐ相同性末端として付加した以下のプライマーを用いて増幅した。
フォワードプライマー
（５’－ＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧ－３’；配列番号３０）
リバースプライマー
（５’－ＧＣＴＧＧＴＣＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＧＧＣＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＡＴＴＧＴＡＡＣＧ－３’；配列番号３１）
分解産物とＰＣＲ産物は、ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）の手順で結合され、最終的なベクターとなった。

図３Ｂ－Ｅのアルファウイルスベクターは、ＨＡ遺伝子をコードするＳＩＮＶＧｉｒｄｗｏｏｄ（ＧｅｎｂａｎｋＭＦ４５９６８３）レプリコンを含むプラスミドから構築した。キメラ１（図３Ｂ）ではｎｓｐ１、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４遺伝子をＡＲ８６ｎｓｐ１、ｎｓｐ３、ｎｓＰ４遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋＵ３８３０５）に置換した。キメラ２（図３Ｃ）では、ｎｓＰ４遺伝子をＡＲ８６ｎｓＰ４遺伝子で置換した。キメラ３（図３Ｄ）については、ｎｓＰ３遺伝子をＡＲ８６ｎｓＰ３遺伝子で置換した。キメラ４（図３Ｅ）については、ｎｓＰ１遺伝子をＡＲ８６ｎｓＰ１遺伝子で置換した。この置換は、３０ｂｐの相同性末端を持つＰＣＲ産物を増幅し、ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）の手順で結合することで行った。ＡＲ８６ｎｓＰ２遺伝子を含むコンストラクトは複製できなかった。

実施例３：延長されたポリ（Ａ）を持つ改変アルファウィルスベクターの構築
ＶＥＥ空ベクター（図２Ａ）をＳａｐＩとＮｏｔＩで直鎖化し、そして、１７０Ａ残基のポリ（Ａ）配列を含む合成ＤＮＡ断片と、続くＳａｐＩ部位、Ｔ７ターミネーター、および直鎖化空ベクターに対する３０ｂｐのホモロジーをＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順で結合した。サンガー配列決定により、約１２０Ａｓの産物が単離された。

実施例４：５’フランキングドメインと３’フランキングドメインの最小自由エネルギー（ＭＦＥ）の評価
５’および３’フランキングドメインの最小自由エネルギー（ＭＦＥ）構造およびそれらのΔＧ値は、ＭＦＥＲＮＡ構造予測およびΔＧ計算のためのＭｆｏｌｄツール（ｗｗｗ．ｕｎａｆｏｌｄ．ｏｒｇ／，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｇ５９５）を用いてインシリコで生成した。

実施例５：改変アルファウィルスベクターのインビトロ評価
この実施例は、上記の実施例１および２ならびに３に記載された改変アルファウイルスベクター構築物の発現レベルを評価するため、およびその差異の挙動（例えば、複製およびタンパク質発現）を調べるために実施されたインビトロ実験の結果を記載する。

ベクターのリスト：ユニバーサルアダプターを持つＶＥＥレプリコン、ユニバーサルアダプターを持つＣＨＩＫＶＳ２７レプリコン、ユニバーサルアダプターを持つＣＨＩＫＶＤＲＤＥレプリコン、ユニバーサルアダプターを持つＥＥＥＶＦＬ９３－９３９レプリコン、ＳＩＮＶＧｉｒｄｗｏｏｄ、ＳＩＮＶＡＲ８６／Ｇｉｒｄｗｏｏｄキメラレプリコン、ユニバーサルアダプターとポリ（Ａ）中にアデニル酸残基のみを持つＶＥＥレプリコン、及びユニバーサルアダプターと長いポリ（Ａ）中にアデニル酸残基のみを持つＶＥＥレプリコン。

分析：
インビトロ転写：
ＲＮＡは、酵素分解によって直鎖化されたプラスミドＤＮＡ鋳型を用いたインビトロ転写によって調製する。これらの例では、ＤＮＡはＴ７ターミネーターの下流で切断するＮｏｔＩで直鎖化するか、ポリ（Ａ）の末端で切断するＳａｐＩで直鎖化する。バクテリオファージＴ７ポリメラーゼは、５’ＡＲＣＡキャップ（ＨｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７ＡＲＣＡｍＲＮＡＫｉｔ、ＮＥＢ）、又はキャップなし転写（ＨｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７ＨｉｇｈＹｉｅｌｄＲＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ、ＮＥＢ）、次いで５’キャップ１（ＶａｃｃｉｎｉａＣａｐｐｉｎｇＳｙｓｔｅｍ、ｍＲＮＡＣａｐ２´－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＮＥＢ）の添加によるインビトロ転写に使用する。ＲＮＡはフェノール／クロロホルム抽出、又はカラム精製（Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＲＮＡＣｌｅａｎｕｐＫｉｔ，ＮＥＢ）を用いて精製する。ＲＮＡ濃度は２６０ｎｍの吸光度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定する。

複製：
ＲＮＡはＢＨＫ－２１又はＶｅｒｏ細胞にエレクトロポレーションにより形質転換される（例えば、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｌｏｎｚａ）。形質転換後１７－２０時間で、細胞を固定し透過処理し（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）Ｆｏｘｐ３／ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＳｔａｉｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒＳｅｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＥコンジュゲート抗ｄｓＲＮＡマウスモノクローナル抗体（Ｊ２、Ｓｃｉｃｏｎｓ）を用いて染色し、蛍光フローサイトメトリーによりｄｓＲＮＡ＋細胞の頻度と個々の細胞におけるｄｓＲＮＡの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を定量する。

タンパク質発現：
ＲＮＡはＢＨＫ－２１細胞又はＶｅｒｏ細胞（例えば４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｌｏｎｚａ）へのエレクトロポレーションにより形質転換する。形質転換後１８－２０時間で、細胞を固定し透過処理し（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）Ｆｏｘｐ３／ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＳｔａｉｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒＳｅｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＰＣコンジュゲート抗ＨＡマウスモノクローナル抗体（２Ｂ７、Ａｂｃａｍ）を用いて染色し、蛍光フローサイトメトリーによりＨＡタンパク質＋細胞の頻度と個々の細胞におけるＨＡタンパク質の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を定量する。

追加の実験：
ＢＨＫ－２１又はＶｅｒｏ細胞を、ＲＮＡのエレクトロポレーションに先立ち、組換えＩＦＮの滴定曲線で前処理し、上記のアッセイを用いて、各ベクターの複製およびタンパク質発現への影響を測定する。

実施例６：改変アルファウィルスベクターのインビボ評価
本実施例は、上記の実施例１および２および３に記載された改変アルファウイルスベクター構築物（例えば、未製剤化ベクターおよびＬＮＰ製剤化ベクターの両方）によるワクチン接種後の任意の差異免疫応答を評価するために実施されたインビボ実験の結果を記載する。

ベクターのリスト：
ユニバーサルアダプターを持つＶＥＥレプリコン、ユニバーサルアダプターを持つＣＨＩＫＶＳ２７レプリコン、ユニバーサルアダプターを持つＣＨＩＫＶＤＲＤＥレプリコン、ユニバーサルアダプターを持つＥＥＥＶＦＬ９３－９３９レプリコン、ＳＩＮＶＧｉｒｄｗｏｏｄ、ＳＩＮＶＡＲ８６／Ｇｉｒｄｗｏｏｄキメラレプリコン、ユニバーサルアダプターとポリ（Ａ）中にアデニル酸残基のみを持つＶＥＥレプリコン、ユニバーサルアダプターと長いポリ（Ａ）中にアデニル酸残基のみを持つＶＥＥレプリコン。

分析：
マウスおよび注射。
雌のＣ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｓ又はＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入する。投与日に、０．１－１０μｇの材料を両大腿四頭筋に分割して筋肉内に注射する。ベクターは、生理食塩水で製剤化されていない、又はＬＮＰで製剤化して投与する。試験期間中、動物を体重およびその他の一般的な観察についてモニターする。免疫原性試験では、動物に０日目と２１日目に投与する。脾臓は３５日目に採取され、血清は０日目、１４日目、３５日目に単離した。タンパク質発現研究では、動物に０日目に投与し、生物発光は１日目、３日目、７日目に評価する。ルシフェラーゼ活性のインビボイメージングは、ＩＶＩＳシステムを用いて指示された時点で行う。

ＬＮＰ製剤。
レプリコンＲＮＡをマイクロ流体ミキサーを用いて脂質ナノ粒子に製剤化し、そして、粒子径、動的光散乱を用いた多分散性、カプセル化効率を分析した。ＬＮＰ粒子の製剤化に使用した脂質のモル比は、３０％Ｃ１２－２００、４６．５％コレステロール、２．５％ＰＥＧ－２Ｋ、１６％ＤＯＰＥである。

ＥＬＩＳｐｏｔ。
インフルエンザ特異的Ｔ細胞応答の大きさを測定するために、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ分析を、製造業者の指示に従って、ＭｏｕｓｅＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳＫｉｔ（ＨＲＰ）（ＭａｂＴｅｃｈ）を用いて実施する。簡単に述べると、脾臓細胞を単離し、ＨＰＶに対するＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを表すペプチド、陽性対照としてのＰＭＡ／イオノマイシン、又は模擬刺激としてのＤＭＳＯを含む培地中で５×１０^６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁する。

細胞内サイトカイン染色。
脾臓を、ＥＬＩＳｐｏｔについて概説した方法に従って単離し、そして、１×１０^６個の細胞を、ウェルあたり２００μＬの総容量で、細胞を含む培地に添加する。各ウェルには、ＨＰＶに対するＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのいずれかを表すペプチド、陽性対照としてのＰＭＡ／イオノマイシン、又は模擬刺激としてのＤＭＳＯを含む。１時間後、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（登録商標）タンパク質輸送阻害剤（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を各ウェルに添加する。細胞をさらに５時間インキュベートする。インキュベーション後、標準的な方法でＣＤ８＋（５３－６．７）、ＣＤ４＋（ＧＫ１．５）、Ｂ２２０（Ｂ２３８１２８）、Ｇｒ－１（ＲＢ６－８Ｃ５）、ＣＤ１６／３２（Ｍ９３）を細胞表面染色する。表面染色後、細胞を固定し、ＩＦＮγ（ＲＰＡ－Ｔ８）、ＩＬ－２（ＪＥＳ６－５Ｈ４）、ＴＮＦ（ＭＰ６－ＸＴ２２）について標準的な方法で細胞内タンパク質を染色する。その後、細胞をフローサイトメーターで分析し、取得したＦＣＳファイルをＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０．４．１を用いて解析する。

抗体。
総ＨＰＶＥ６／Ｅ７特異的ＩｇＧを測定するための抗体反応は、ＡｌｐｈａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のＥＬＩＳＡキットを使用し、メーカーの指示に従って測定する。

実施例７：延長されたポリ（Ａ）を持つ改変アルファウイルスベクターの評価
本実施例では、様々な長さのポリ（Ａ）を持つ改変アルファウイルスｓｒＲＮＡ構築物のＲＮＡ複製活性を評価するために行ったインビトロ実験の結果を記述する。

ＶＥＥ空ベクターをＳｐｅＩとＮｏｔＩで直鎖化し（フラグメント１）、インフルエンザ由来のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋＡＹ６５１３３４）を含むＰＣＲ産物を、フラグメント１とフラグメント３に対して３０ｂｐの相同性末端を持つように生成し（フラグメント２）、種々の長さのポリ（Ａ）配列（例えば、３０、４９、６４、８１、９０アデニル酸残基）、続くＳａｐＩ部位、Ｔ７ターミネーターと、フラグメント２および直鎖化した空のベクター（フラグメント１）に対する３０ｂｐの相同性末端を持つ合成ＤＮＡ断片（断片３）を３フラグメントＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順で結合した。得られたプラスミド中のポリ（Ａ）配列の長さは、サンガー配列決定で確認した。次に、上記の実施例５に記載したように、ＳａｐＩ酵素分解によって直鎖化したプラスミドＤＮＡ鋳型を用いて、インビトロ転写によってＲＮＡを調製した。ＲＮＡはＬｉＣｌ沈殿で精製した。その後、アガロースゲルでの電気泳動分析によりＲＮＡの完全性を評価し、その結果を図８）にまとめる。

ＲＮＡ複製活性を定量するために、各サンプルについて、ｓｒＲＮＡ構築物を８Ｅ５ＢＨＫ－２１細胞（例えば４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｌｏｎｚａ）にエレクトロポレーションにより形質転換した。各ｓｒＲＮＡ構築物は、３、１０、２０、３０、４０、及び５０ｎｇの用量でトリプルケートで形質転換した。形質転換後２０時間で、細胞を固定して透過処理し（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）Ｆｏｘｐ３／ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＳｔａｉｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒＳｅｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＥコンジュゲート抗ｄｓＲＮＡマウスモノクローナル抗体（Ｊ２、Ｓｃｉｃｏｎｓ）を用いて染色し、蛍光フローサイトメトリーでｄｓＲＮＡ＋細胞（ＲＮＡ複製が検出可能な細胞）の頻度を定量した。各ｓｒＲＮＡ構築物の対数変換ＲＮＡ投与量における各サンプル中のｄｓＲＮＡ＋細胞の頻度を図９に示す。

Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、データをボトムコンストレインツ＞０の４ＰＬ曲線にフィットさせることにより、各ｓｒＲＮＡ構築物についてｌｏｇ（ＥＣ５０）値を算出した。ｌｏｇ（ＥＣ５０）値と逆変換したＥＣ５０値を表１に示す。ＥＣ５０値は、ＲＮＡ複製頻度が最大値の半分になるのに必要なＲＮＡの量を示している。

結果をよりよく視覚化するために、最低のＥＣ５０値は、機能的に、質量ＲＮＡあたりの複製活性が最も高いことに等しいので、ＥＣ５０の逆数を図１０に示す。実験ＥＣ５０値間の統計的有意性を決定するために、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ）を用いて一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計解析を実施し、図１０に図示し、かつ表２に示す。これらの実験では、３０個のアデニル酸（Ａ）残基からなる最も短いポリ（Ａ）テールを有するｓｒＲＮＡ構築物が、最も低いＲＮＡ複製活性を示すことが見出された。また、６４個のＡ残基からなる中間の長さのポリ（Ａ）を持つｓｒＲＮＡ構築物が最も高い活性を示すこともわかった。図１０に示すように、活性の順序は以下の通りであった：３０A＜４９A＜８１A＜９０A＜６４Aの順であった。

３０Ａを超えるポリ（Ａ）長を有する全てのｓｒＲＮＡ構築物は、３０Ａ残基を有するポリ（Ａ）配列を含む参照ｓｒＲＮＡ構築物よりも有意に高い活性を示した。６４Ａ残基を有するｓｒＲＮＡ構築物は、４９Ａ残基を有するｓｒＲＮＡ構築物よりも有意に高い活性を示したが、より長いポリ（Ａ）配列を有するｓｒＲＮＡ構築物（例えば、８１Ａ、９０Ａ）は、４９Ａよりも有意に高い活性を示さなかった。

これらの実験では、試験したポリ（Ａ）配列が最も長いｓｒＲＮＡ構築物（例えば、８１Ａ、９０Ａ）は、中間の６４Ａの長さのｓｒＲＮＡ構築物よりも活性が低い傾向にあったが、活性は６４Ａからの活性よりも有意に低いとは認められなかった。これらのデータは、６４Ａ又は少なくとも６４Ａのポリ（Ａ）がｓｒＲＮＡ構築体の活性を有意に高めることを示唆している。

本開示の特定の代替案が開示されているが、添付の特許請求の範囲の真の精神および範囲内において、様々な変更および組み合わせが可能であり、企図されていることを理解されたい。したがって、本明細書で提示される正確な要旨および開示に限定する意図はない。

Claims

改変されたαウイルスゲノム又はレプリコンRNAを含む核酸構築物であって、
前記改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡのウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的部分が、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡへの異種配列の挿入を容易にするように構成された合成アダプター分子によって置換されており、前記合成アダプター分子は、以下の式Ｉ：

ここで、
a）ｎは１～６の整数であり；
b）前記制限部位が制限エンドヌクレアーゼにより切断可能であり；そして、
c）前記５’フランキングドメインおよび３’フランキングドメインはそれぞれ、最小限の二次構造を有すると予測される核酸配列を含む、
を有する、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む核酸構築物。
前記５’フランキングドメインの配列が、予め定義された閾値よりも高い最小自由エネルギー（ＭＦＥ）構造のフォールディングΔＧ値を有する、請求項１に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインが、ステムループ構造を形成することができるＲＮＡ配列をコードする配列を含まない、請求項１～２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインが自己タンパク質分解ペプチドのコード配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記自己タンパク質分解ペプチドが、カルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼ（ｆｕｒｉｎ）、豚テシオウイルス－１２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質ポリヘドロシスウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、Ｆｌａｃｈｅｒｉｅウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、又はそれらの組み合わせに由来する１又は複数の自己タンパク質分解性切断配列を含む、
請求項４に記載の核酸構築物。
前記自己タンパク質分解ペプチドのコード配列が、前記制限部位の上流に組み込まれている、請求項４～５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記ＩＲＥＳエレメントが、制限部位の上流に組み込まれている、請求項７に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインが、いずれのリーディングフレームにおいても翻訳開始部位を含まない、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインが、５’アダプター配列の最後のヌクレオチドとして翻訳開始部位又はその一部を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインが、５’アダプター配列の最後の３ヌクレオチドとしてメチオニンコドンを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインが、約１５ヌクレオチド～約３５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインが、約３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１２に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインが、配列番号１に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記３’フランキングドメインの配列が、予め定義された閾値よりも高い最小自由エネルギー（ＭＦＥ）構造のフォールディングΔＧ値を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインが、ステムループ構造を形成することができるＲＮＡ配列をコードする配列を含まない、請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記３’フランキングドメインが、前記３’アダプター配列の最初の３ヌクレオチドとして翻訳終止コドンを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記終止コドンが、ＴＡＧ、ＴＡＡ又はＴＧＡから選択される、請求項１７に記載の核酸構築物。
前記３’フランキングドメインが、配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記合成アダプター分子が、配列番号２０に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記制限部位が、Ｉ型制限酵素、ＩＩ型制限酵素、ＩＩＩ型制限酵素、ＩＶ型制限酵素、およびＶ型制限酵素から選択される制限酵素により切断可能である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記制限部位が、ＩＩ型制限酵素により切断可能である、請求項２１に記載の核酸構築物。
前記制限部位が、ＳｐｅＩ又はそのアイソシゾマーにより切断可能である、請求項２２に記載の核酸構築物。
ポリ（Ａ）テールを含む改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む核酸構築物であって、前記ポリ（Ａ）テールが３’非Ａ残基を含まない核酸構築物。
アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡのポリ（Ａ）テールをコードする配列に操作された追加の制限部位をさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡのポリ（Ａ）テールをコードする配列の末端に組み込まれた追加の制限部位をさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記追加の制限部位が、ＩＩＳ型制限酵素又はホーミングエンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項２６に記載の核酸構築物。
前記ＩＩＳ型制限酵素が、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｅＩ、ＢｂｉＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｓＩ－ＨＦ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＩ－ＨＦ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ－ｖ２、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ－ｖ２、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｐｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、又はＳｆａＮＩである、請求項２７に記載の核酸構築物。
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、又はＰＩ－ＳｃｅＩである、請求項２７に記載の核酸構築物。
ポリ（Ａ）テールを含む改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む核酸構築物であって、ポリ（Ａ）テールをコードする延長された配列が３４残基より長い核酸構築物。
前記延長されたポリ（Ａ）テールが、約３０～約１２０アデニル酸残基の範囲の長さを有する、請求項３０に記載の核酸構築物。
前記延長されたポリ（Ａ）テールが、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、および約１００のアデニル酸残基の長さを有する、請求項３０又は３１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡが、トガウイルス科アルファウイルス属に属するウイルスのものである、請求項１～３１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡが、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶグループ、又はＳＦＶグループ、又はＳＩＮＶグループに属するアルファウイルスのものである、請求項３３に記載の核酸構築物。
前記アルファウイルスが、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドルバーグウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）（Ｏ’Ｎｙｏｎｇ－Ｎｙｏｎｇｖｉｒｕｓ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ホワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキーウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガッチェウイルス（ＫＹＺＶ）（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈｖｉｒｕｓ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウイルス（ＦＭＶ）、ヌドゥムウイルス（ＮＤＵＶ）、又はバギークリークウイルスである、請求項３４に記載の核酸構築物。
前記アルファウィルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、又はシンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）である、請求項３５に記載の核酸構築物。
１又は複数の発現カセットをさらに含み、発現カセットの各々が、異種核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
前記発現カセットの少なくとも１つが、異種核酸配列に作動可能に連結されたサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む、請求項３７に記載の核酸構築物。
前記ｓｇプロモーターが、２６Ｓサブゲノムプロモーターである、請求項３８に記載の核酸構築物。
１又は複数の非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載の核酸構築物。
前記ＵＴＲの少なくとも１つが、異種ＵＴＲである、請求項４０に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインが、そのすぐ上流に位置する配列（例えば、ｓｇＲＮＡの５’ＵＴＲ内）又はそのすぐ下流に位置する配列（例えば、ＧＯＩのコード配列内）とステムループ構造を形成することができるＲＮＡ配列をコードしない、請求項１～４１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記３’フランキングドメインが、そのすぐ上流に位置する配列（例えば、ＧＯＩのコード配列内）又はすぐ下流に位置する配列（例えば、３’ＵＴＲ内）とステムループ構造を形成することができるＲＮＡ配列をコードしない、請求項１～４２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインおよび／又は３’フランキングドメインが、３’ＵＴＲ内に位置する配列と相補性を有する配列を含まない、請求項１～４３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記５’フランキングドメインおよび／又は３’フランキングドメインが、前記３’ＵＴＲの３’末端と相補性を有する配列を含まない、請求項１～４３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
発現カセットの少なくとも１つが、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記ＧＯＩコード配列が、合成アダプター分子の３’フランキングドメインの上流に位置する終止コドンを含む、請求項４６に記載の核酸構築物。
前記ＧＯＩが、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項４６又は４７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記ＧＯＩが、抗体、抗原、免疫調節因子、酵素、シグナルタンパク質、およびサイトカインからなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記ＧＯＩのコード配列が、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルで発現するように最適化されている、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記核酸構築物がベクター内に組み込まれる、請求項１～５０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
前記ベクターが自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターである、請求項５１に記載の核酸構築物。
前記核酸配列が、配列番号３～２７からなる群より選択される核酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項１～５２のいずれか１項に記載の核酸構築物。
請求項１～５３のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む組換え細胞。
前記組換え細胞が、真核細胞である、請求項５４に記載の組換え細胞。
前記組換え細胞が、動物細胞である、請求項５５に記載の組換え細胞。
前記動物細胞が、脊椎動物細胞又は無脊椎動物細胞である、請求項５６に記載の組換え細胞。
前記組換え細胞が、哺乳動物細胞である、請求項５７に記載の組換え細胞。
前記組換え細胞が、アフリカミドリザル腎臓細胞（Ｖｅｒｏ細胞）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒトＡ５４９細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒトＣＨＭＥ５細胞、ヒト表皮喉頭細胞、ヒト線維芽細胞、ヒトＨＥＫ－２９３細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、ヒトＨｅｐＧ２細胞、ヒトＨＵＨ－７細胞、ヒトＭＲＣ－５細胞、ヒト筋肉細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウス結合組織細胞、マウス筋肉細胞、およびウサギ腎臓細胞からなる群より選択される、請求項５８に記載の組換え細胞。
請求項５４～５９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組換え細胞および培地を含む細胞培養物。
請求項１～５３のいずれか１項に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック動物。
前記動物が脊椎動物又は無脊椎動物である、請求項６１に記載のトランスジェニック動物。
前記動物が哺乳動物である、請求項６２に記載のトランスジェニック動物。
前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、請求項６３に記載のトランスジェニック動物。
組換えＲＮＡ分子を生産する方法であって、
組換えＲＮＡ分子が生産されるような条件下で、
（ｉ）請求項６１～６４のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物を飼育すること、又は
（ｉｉ）請求項５４～５９のいずれか１項に記載の組換え細胞を培養することを含む、
方法。
前記トランスジェニック動物又は前記組換え細胞が請求項２４～５３のいずれか１項に記載の核酸構築物を含み、そして、前記組換えＲＮＡ分子をコードする配列が、ポリ（Ａ）テールをコードする配列の末端の後に操作された制限部位を切断することができる制限酵素によって任意に分解される、請求項６５に記載の方法。
請求項６５～６６のいずれか１項に記載の方法により産生される組換えＲＮＡ分子。
前記組換えＲＮＡ分子が、増強された生物学的活性を示す、請求項６７に記載の組換えＲＮＡ分子。
目的のポリペプチドを産生する方法であって、
ＧＯＩによりコードされるポリペプチドが産生される条件下で、
（ｉ）請求項４８～５３のいずれか１項に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック動物を飼育すること、又は
（ｉｉ）請求項４８～５０のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む組換え細胞を培養することを含む、方法。
対象に請求項４８～５３のいずれか一項に記載の核酸構築物を投与することを含む、対象において目的のポリペプチドを産生する方法。
前記対象が、脊椎動物又は無脊椎動物である、請求項７０に記載の方法。
前記対象が、哺乳動物対象である、請求項７１に記載の方法。
前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項７２に記載の方法。
請求項６９～７３のいずれか１項に記載の方法により産生される組換えポリペプチド。
薬学的に許容される賦形剤と、
ａ）請求項１～５３のいずれか１項に記載の核酸構築物；
ｂ）請求項６７に記載の組換えＲＮＡ分子；
ｃ）請求項５４～５９のいずれか１項に記載の組換え細胞；および／又は
ｄ）請求項７４に記載の組換えポリペプチド
を含む医薬組成物。
請求項１～５３のいずれか１項に記載の核酸構築物、および薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項７５に記載の医薬組成物。
請求項６７に記載の組換えＲＮＡ分子、および薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項７５に記載の医薬組成物。
請求項５４～５９のいずれか１項に記載の組換え細胞、および薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項７５に記載の医薬組成物。
請求項７４に記載の組換えポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項７５に記載の医薬組成物。
前記組成物が、リポソーム、脂質ベースのナノ粒子（ＬＮＰ）、又はポリマーナノ粒子中に製剤される、請求項７５～７９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記組成物が、免疫原性組成物である、請求項７５～８０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記免疫原性組成物が、バイオ治療薬（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）として製剤化される、請求項８１に記載の医薬組成物。
前記免疫原性組成物が、ワクチンとして製剤化される、請求項８１に記載の医薬組成物。
前記組成物が、対象に対して実質的に非免疫原性である、請求項７５～８０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記非免疫原性組成物が、バイオ治療薬として製剤化される、請求項８４に記載の医薬組成物。
前記非免疫原性組成物が、ワクチンとして製剤化される、請求項８４に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、アジュバントとして製剤化される、請求項７５～８０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、経鼻投与、経皮投与、腹腔内投与、筋肉内投与、結節内投与、腫瘍内投与、関節内投与、静脈内投与、皮下投与、膣内投与、および経口投与のうちの１又は複数のために製剤化される、請求項７５～８７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
免疫応答を調節するための方法であって、それを必要とする対象に
以下：
ａ）請求項１～５３のいずれか１項に記載の核酸構築物；
ｂ）請求項６７に記載の組換えＲＮＡ分子；
ｃ）請求項５４～５９のいずれか１項に記載の組換え細胞；
ｄ）請求項７４に記載の組換えポリペプチド；および／又は
ｅ）請求項７５～８８のいずれか１項に記載の医薬組成物
を含む組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
健康状態を予防および／又は治療するための方法であって、それを必要とする対象に
以下：
ａ）請求項１～５３のいずれか１項に記載の核酸構築物；
ｂ）請求項６７に記載の組換えＲＮＡ分子；
ｃ）請求項５４～５９のいずれか１項に記載の組換え細胞；
ｄ）請求項７４に記載の組換えポリペプチド；および／又は
ｅ）請求項７５～８８のいずれか１項に記載の医薬組成物
を含む組成物を前記対象に予防的又は治療的に投与することを含む、方法。
前記健康状態が、増殖性障害、炎症性障害、自己免疫障害、又は微生物感染である、請求項８９～９０のいずれか１項に記載の方法。
前記対象が、増殖性障害、炎症性障害、自己免疫障害、又は微生物感染に関連する健康状態を有するか、又は有する疑いがある、請求項８９～９１のいずれか１項に記載の方法。
前記組成物が、単一療法（単剤療法）として、又は少なくとも１つの追加の療法と組み合わせた第１の療法として、前記対象に個別に投与される、請求項８９～９２のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１つの追加療法が、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、および手術からなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
免疫応答を調節するための、健康状態又は微生物感染の予防のための、および／又は治療のためのキットであって、以下：
ａ）請求項１～５３のいずれか１項に記載の核酸構築物；
ｂ）請求項６７に記載の組換えＲＮＡ分子；
ｃ）請求項５４～５９のいずれか１項に記載の組換え細胞；
ｄ）請求項７４に記載の組換えポリペプチド；および／又は
ｅ）請求項７５～８８のいずれか１項に記載の医薬組成物
を含むキット。