CN118119714A - 具有异源非结构蛋白的经修饰的甲病毒 - Google Patents

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Abstract

本公开文本涉及分子病毒学领域，包括包含经修饰的病毒基因组或复制子(例如，自复制RNA)的核酸分子、含有所述核酸分子的药物组合物以及此类核酸分子和组合物用于在细胞培养物或活体中产生所需产物的用途。还提供了用于在有需要的受试者中引发免疫应答的方法以及用于预防和/或治疗多种健康状况的方法。

Description

具有异源非结构蛋白的经修饰的甲病毒
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年9月2日提交的美国临时专利申请序列号63/240,297的优先权权益。将上文引用的申请的公开内容通过引用以其整体(包括任何附图)明确地并入本文。
技术领域
本公开文本涉及分子病毒学和免疫学领域，并且具体地涉及编码经修饰的病毒基因组和复制子(例如，自复制RNA)的核酸分子、含有所述核酸分子的药物组合物以及此类核酸分子和组合物用于在细胞培养物或活体中产生所需产物的用途。还提供了用于诱导药效学作用(例如，在有需要的受试者中引发免疫应答)的方法以及用于预防和/或治疗多种健康状况的方法。
序列表的并入
将所附序列表中的材料通过引用特此并入本申请。所附的名称为058462_504001WO_SequenceListing.XML的序列表XML文件创建于2022年8月28日，并且为95KB。
背景技术
近年来，已经将若干个不同的动物病毒群通过其基因组的同源重组或直接工程化进行基因操纵。DNA和RNA病毒两者的反向遗传系统的可用性已经为使用重组病毒(例如，作为疫苗、表达载体、抗肿瘤剂、基因疗法载体和药物递送媒介物)创造了新的前景。
例如，许多基于病毒的表达载体已经被开发用于在培养的重组细胞中表达异源蛋白。例如，经修饰的病毒载体在宿主细胞中用于基因表达的应用不断扩大。这方面的最新进展包括进一步开发用于产生多亚基蛋白质复合物以及共表达蛋白质修饰酶的技术和系统以改善异源蛋白产生。关于病毒表达载体技术的其他最新进展包括用于控制基因表达、制备病毒载体、体内基因疗法应用以及产生疫苗递送载体的许多先进的基因组工程化应用。
因此，仍然需要用于在基于RNA复制子的表达平台中表达目的产物的更有效的方法和系统。
发明内容
本公开文本总体上涉及开发用于在预防和管理多种健康状况(如增殖性障碍和微生物感染)中使用的免疫治疗剂，如重组核酸构建体和包含所述重组核酸构建体的药物组合物。具体地，如下文更详细地所述，本公开文本的一些实施方案尤其提供了具有至少一种异源非结构蛋白(nsP)或其部分的编码序列的编码重组甲病毒的核酸构建体。还公开了含有本文公开的核酸构建体的重组细胞、含有本文公开的核酸构建体的转基因动物、用于产生本文公开的核酸构建体的方法、用于离体地或在体内产生目的重组多肽的方法、以及由此产生的重组多肽、以及含有所述核酸构建体、所述重组细胞和所述重组多肽的药物组合物。本文还提供了用于在有需要的受试者中引发免疫应答的方法和用于预防和/或治疗有需要的受试者的健康状况的方法，其中所述方法包括施用本公开文本的核酸构建体、本公开文本的重组细胞、本公开文本的重组多肽和/或本公开文本的药物组合物。
在本公开文本的一个方面，本文提供了包含甲病毒种的经修饰的基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的核酸构建体，其中所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的至少一种非结构蛋白(nsP)或其部分相对于所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。
本公开文本的核酸构建体的非限制性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述至少一种异源nsP或其部分是nsP1、nsP2、nsP3、nsP4或其任一种的一部分，或任何前述的组合。在一些实施方案中，所述至少一种异源nsP或其部分源自同一甲病毒种的另一种毒株。在一些实施方案中，所述至少一种异源nsP或其部分源自另一种甲病毒种。
在一些实施方案中，所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的至少一部分。在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或RNA复制子缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的很大一部分。在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或RNA复制子不包含编码病毒结构蛋白的核酸序列。
在一些实施方案中，本公开文本的经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)进一步包含一个或多个表达盒，其中所述表达盒中的每一个都包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子。在一些实施方案中，所述表达盒中的至少一个包含可操作地连接至异源核酸序列的亚基因组(sg)启动子。在一些实施方案中，所述sg启动子是26S亚基因组启动子。在一些实施方案中，本公开文本的经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子进一步包含一个或多个非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，所述UTR中的至少一个是异源UTR。
在一些实施方案中，表达盒中的至少一个包含目的基因(GOI)的编码序列。在一些实施方案中，所述GOI编码选自以下的多肽：治疗性多肽、预防性多肽、诊断性多肽、营养保健性多肽、工业酶和报告多肽。在一些实施方案中，所述GOI编码选自以下的多肽：抗体、抗原、免疫调节剂、酶、信号传导蛋白和细胞因子。在一些实施方案中，所述GOI的编码序列被优化以用于以高于参考编码序列的表达水平的水平表达。在一些实施方案中，所述GOI的编码序列被优化以用于增强RNA稳定性。
在一些实施方案中，本公开文本的经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)属于选自以下的甲病毒种：奥拉病毒(Aura virus，AURAV)、巴班肯病毒(Babankivirus，BABV)、巴马森林病毒(Barmah Forest virus，BFV)、比巴鲁病毒(Bebaru virus，BEBV)、博吉河病毒(Buggy Creek virus)、卡因瓜病毒(Caaingua virus)、卡巴斯欧病毒(Cabassou virus)、基孔肯亚病毒(CHIKV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、埃拉特病毒(Eilatvirus)、沼泽地病毒(Everglades virus，EVEV)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus，FMV)、盖塔病毒(GETV)、高地J病毒(Highlands J virus，HJV)、克孜拉加奇病毒(Kyzylagachvirus，KYZV)、马达里亚加病毒(Madariaga virus，MADV)、马雅罗病毒(MAYV)、米德尔堡病毒(Middelburg virus，MIDV)、莫斯达斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedras virus)、穆坎布病毒(Mucambo virus，MUCV)、恩杜姆病毒(Ndumu virus，NDUV)、阿尼昂尼昂病毒(O'nyong'nyong virus，ONNV)、皮春纳病毒(Pixuna virus，PIXV)、里奥内格罗病毒(Rio Negrovirus，RNV)、罗斯河病毒(RRV)、鲑鱼胰腺病病毒(Salmon pancreas disease virus，SPDV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、辛德比斯病毒(SINV)、嗜睡症病毒(Sleeping diseasevirus，SDV)、南方象海豹病毒(Southern elephant seal virus，SESV)、大森林病毒(TaiForest virus，TFV)、图那特病毒(Tonate virus)、特罗卡拉病毒(Trocara virus)、乌纳病毒(Una virus，UNAV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和瓦塔罗阿病毒(Whataroa virus，WHAV)。
在一些实施方案中，本公开文本的经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)属于辛德比斯病毒(SINV)。在一些实施方案中，本公开文本的经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子属于SINV毒株Girdwood。
在一些实施方案中，所述经修饰的基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的至少一种异源nsP或其部分源自SINV毒株AR86。在一些实施方案中，所述经修饰的基因组或RNA复制子的至少一种异源nsP或其部分源自SINV毒株Girdwood。
在一些实施方案中，所述至少一种异源nsP或其部分是nsP1、nsP3、nsP4或其任一种的一部分，或任何前述的组合。在一些实施方案中，所述经修饰的基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)属于SINV毒株AR86。在一些实施方案中，所述经修饰的SINV-AR86基因组或RNA复制子的至少一种异源nsP或其部分源自SINV毒株Girdwood。在一些实施方案中，所述经修饰的SINV-AR86基因组或RNA复制子的至少一种异源nsP或其部分源自SINV毒株Girdwood的nsP2。
在一些实施方案中，将本公开文本的核酸构建体掺入载体中。在一些实施方案中，所述载体是自复制RNA(srRNA)载体。
在本公开文本的一些实施方案中，所述核酸构建体包含与选自SEQ ID NO:1-4的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸序列。
在一个方面，本文提供了重组细胞，所述重组细胞包含如本文所公开的核酸构建体。在一些实施方案中，所述重组细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是脊椎动物细胞或无脊椎动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是昆虫细胞。在一些实施方案中，所述昆虫细胞是蚊细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞选自由SV40转化的猴肾CV1细胞(COS-7)、人胚肾细胞(例如，HEK 293或HEK 293细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠支持细胞(例如，TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、人宫颈癌细胞(HeLa)、犬肾细胞(MDCK)、水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞、FS4细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、人A549细胞、人宫颈细胞、人CHME5细胞、人PER.C6细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、人表皮样喉细胞、人成纤维细胞、人HUH-7细胞、人MRC-5细胞、人肌肉细胞、人内皮细胞、人星形胶质细胞、人巨噬细胞、人RAW 264.7细胞、小鼠3T3细胞、小鼠L929细胞、小鼠结缔组织细胞、小鼠肌肉细胞和兔肾细胞。在相关方面，还提供了细胞培养物，所述细胞培养物包含至少一种如本文所公开的重组细胞和培养基。
在另一个方面，本文提供了转基因动物，所述转基因动物包含如本文所述的核酸构建体。在一些实施方案中，所述动物是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，所述动物是昆虫。在一些实施方案中，所述动物是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是非人哺乳动物。在另一个方面，本文提供了用于产生目的多肽的方法，其中所述方法包括(i)在一定条件下饲养如本文所公开的动物；或(ii)在一定条件下培养包含如本文所公开的核酸构建体的重组细胞，在所述条件下所述转基因动物或重组细胞产生由所述GOI编码的多肽。
在另一个方面，本文提供了用于在受试者中产生目的多肽的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用如本文所公开的核酸构建体。在一些实施方案中，所述受试者是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，所述受试者是昆虫。在一些实施方案中，所述昆虫是蚊。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，所述哺乳动物受试者是人类受试者。在又另一个方面，本文提供了通过本公开文本的方法产生的重组多肽。
在又另一个方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和：a)本公开文本的核酸构建体；b)本公开文本的重组细胞；和/或c)本公开文本的重组多肽。
本公开文本的药物组合物的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，本文提供了组合物，所述组合物包含如本文所公开的核酸构建体和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，本文提供了组合物，所述组合物包含如本文所公开的重组细胞和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物包含如本文所公开的重组多肽和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，本文提供了组合物，所述组合物被配制在脂质体、基于脂质的纳米颗粒(LNP)或聚合物纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述组合物是免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物被配制为疫苗。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物对于受试者是基本上非免疫原性的。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制为佐剂。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于鼻内施用、结内施用、透皮施用、腹膜内施用、肌内施用、瘤内施用、关节内施用、静脉内施用、皮下施用、阴道内施用、眼内施用、口服施用和直肠施用中的一种或多种。
在另一个方面，本文提供了用于功能化/工程化甲病毒基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的方法，所述方法包括：(a)提供非功能性甲病毒基因组或RNA复制子；(b)将所述非功能性甲病毒基因组或RNA复制子的非结构蛋白(nsP)或其部分用源自不同甲病毒毒株的相应nsP或其部分的异源编码序列替代，以产生经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子；(c)评估所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的功能性；以及(d)如果所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子能够进行RNA复制和/或表达，则将所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子鉴定为功能性的。
本公开文本的用于功能化和/或工程化甲病毒基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述异源nsP或其部分源自同一甲病毒种的另一种毒株。在一些实施方案中，所述异源nsP或其部分源自另一种甲病毒种。在一些实施方案中，所述异源nsP或其部分是nsP1、nsP2、nsP3、nsP4或其任一种的一部分。在一些实施方案中，所述甲病毒基因组或RNA复制子的非功能性通过在宿主细胞内自复制的缺乏来确定。在一些实施方案中，所述评估所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的功能性包括选自以下的测定：RNA复制的检测、病毒蛋白表达的检测、致细胞病变效应(CPE)的检测和异源转基因表达的检测。
在另一个方面，本文提供了用于在受试者中诱导药效学作用的方法，特别是用于在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下的组合物：a)本公开文本的核酸构建体；b)本公开文本的重组细胞；c)本公开文本的重组多肽；和/或d)本公开文本的药物组合物。
在又另一个方面，本文提供了用于预防和/或治疗有需要的受试者的健康状况的方法，所述方法包括向所述受试者预防性地或治疗性地施用包含以下的组合物：a)本公开文本的核酸构建体；b)本公开文本的重组细胞；c)本公开文本的重组多肽；和/或d)本公开文本的任一项的药物组合物。
本公开文本的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述病症是增殖性障碍或微生物感染。在一些实施方案中，所述受试者患有或被怀疑患有与增殖性障碍或微生物感染相关的病症。在一些实施方案中，所施用的组合物导致所述受试者中干扰素的产生增加。在一些实施方案中，将所述组合物作为单一疗法(单药疗法)单独地或作为第一疗法与至少一种另外的疗法组合地施用于所述受试者。在一些实施方案中，所述至少一种另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法和手术。
在又另一个方面，本文提供了用于诱导药效学作用、用于引发免疫应答、用于预防和/或用于治疗健康状况或微生物感染的试剂盒，所述试剂盒包含：a)本公开文本的核酸构建体；b)本公开文本的重组细胞；c)本公开文本的重组多肽；和/或d)本公开文本的药物组合物。
除非明确地或清楚地从实施方案或方面的上下文中排除，否则本文所述的每个方面和实施方案都能够一起使用。
前述发明内容仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了本文所述的说明性实施方案和特征之外，根据附图和具体实施方式以及权利要求，本公开文本的其他方面、实施方案、目的和特征将变得完全清楚。
附图说明
图1是根据本公开文本的一些实施方案的甲病毒基因组设计的四个非限制性例子的示意图。示出了非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。这些甲病毒设计各自含有(i)置于26S亚基因组启动子控制下的异源目的基因(GOI)；以及(ii)源自SINV毒株AR86的天然5’UTR和3’UTR序列。在AR86-Girdwood杂交体1中，结构蛋白nsP1、nsP3和nsP4来自SINV毒株AR86，而nsP2来自SINV毒株Girdwood。在AR86-Girdwood杂交体2中，nsP4来自AR86毒株，而nsP1、nsP2和nsP3来自Girdwood毒株。在AR86-Girdwood杂交体3中，nsP3来自AR86毒株，而nsP1、nsP2和nsP4来自Girdwood毒株。在AR86-Girdwood杂交体4中，nsP1来自AR86毒株，而nsP2、nsP3和nsP4来自Girdwood。
图2A是图1中描述的基础辛德比斯AR86-Girdwood杂交体1载体的结构示意图，所述载体没有目的基因(GOI)的编码序列。图2B是图1中描述的辛德比斯AR86-Girdwood杂交体1载体的结构示意图，所述载体具有置于26S亚基因组启动子控制下的示例性GOI(例如，甲型流感病毒H5N1的血凝素前体(HA)(H5N1 HA))的编码序列。
图3A是图1中描述的基础辛德比斯AR86-Girdwood杂交体2载体的结构示意图，所述载体没有GOI的编码序列。图3B是图1中描述的辛德比斯AR86-Girdwood杂交体2载体的结构示意图，所述载体具有置于26S亚基因组启动子控制下的示例性GOI(例如，H5N1 HA)的编码序列。
图4A是图1中描述的基础辛德比斯AR86-Girdwood杂交体3载体的结构示意图，所述载体没有GOI的编码序列。图4B是图1中描述的辛德比斯AR86-Girdwood杂交体3载体的结构示意图，所述载体具有置于26S亚基因组启动子控制下的示例性GOI(例如，H5N1 HA)的编码序列。
图5A是图1中描述的辛德比斯AR86-Girdwood杂交体4载体的结构示意图，所述载体没有GOI的编码序列。图5B是图1中描述的辛德比斯AR86-Girdwood杂交体4载体的结构示意图，所述载体具有置于26S亚基因组启动子控制下的示例性GOI(例如，H5N1 HA)的编码序列。
图6以图形方式总结了为了证明通过用源自异源甲病毒基因组或RNA复制子的相应功能性nsP序列替代有缺陷的nsP序列可以功能化非功能性甲病毒基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)而进行的实验的结果。图6描绘了已经用根据本公开文本的一些实施方案的示例性甲病毒基因组设计转化的BHK-21细胞的等高线图。在这些实验中，通过电穿孔将甲病毒基因组设计各自引入BHK-21细胞中，并且转化后20小时，将细胞固定并透化，并且使用PE缀合的抗双链RNA(dsRNA)小鼠单克隆抗体(J2，Scicons)进行染色，以通过荧光流式细胞术定量dsRNA+细胞的频率。指示了甲病毒基因组设计进行RNA复制以产生dsRNA的能力。
图7以图形方式总结了为了证明可以从具有异源非结构蛋白基因的srRNA载体中检测到GOI的表达而进行的实验的结果。图7是展示已经通过根据本公开文本的一些实施方案的srRNA载体设计转化的细胞中甲型禽流感H5N1的HA多肽的相对表达的定量的条形图。在这些实验中，通过电穿孔将甲病毒srRNA设计各自引入BHK-21细胞中，并且转化后20小时，将细胞固定并透化，并且使用APC缀合的抗H5N1小鼠单克隆抗体(2B7，Abcam；APC：别藻蓝蛋白)进行染色，以通过荧光流式细胞术定量H5N1+细胞的平均荧光强度(MFI)。
图8A-图8B示意性地总结了实验结果，证明根据本公开文本的一些实施方案设计的含有异源非结构蛋白基因的经修饰的srRNA载体可以用于表达以下两种示例性生物活性蛋白：(i)白介素-1受体拮抗剂蛋白(IL-1RA)和(ii)白介素-12(IL-12)。图8A-图8B是展示来自用srRNA转化的BHK-21细胞的分泌蛋白生物活性的定量的条形图。图8A-图8B所示的srRNA是两种不同构型的SINV AR86-Girdwood杂交体1srRNA(RBI307、RBI308)，其各自编码IL-1RA和IL-12两种蛋白质。这些实验中还包括如下的四种基于VEEV的对照srRNA：两种构型的编码IL-1RA和IL-12两者的VEEV srRNA(RBI299、RBI300)以及具有对照转基因的VEEVsrRNA(RBI296、RBI298)。这些实验中还包括两种不同构型的两种基于SINV Girdwood的对照srRNA(RBI309、RBI310)，其各自编码IL-1RA和IL-12两种蛋白质。图8A示出了srRNA转化后24和48小时细胞培养基中生物活性IL-1RA的定量。图8B示出了srRNA转化后24和48小时细胞培养基中生物活性IL-12的定量。
图9A-图9B是展示编码示例性病毒抗原的一组srRNA的体内免疫原性的条形图，所述示例性病毒抗原是狂犬病病毒的包膜糖蛋白G(RABV-G)。该组包括源自委内瑞拉马脑炎病毒(VEE.TC83)、基孔肯亚病毒毒株S27(CHIK.S27)和DRDE-06(CHIK.DRDE)、辛德比斯病毒毒株Girdwood(SIN.GW)和AR86-Girdwood杂交体1(SIN.AR86)以及东方马脑炎病毒(EEE.FL93)的srRNA。图9A示出了两次免疫接种后通过ELISpot评价的抗原特异性脾T细胞应答的定量。图9B示出了两次免疫接种后来自血清的抗狂犬病病毒中和抗体滴度。
图10A-图10C是示出编码示例性肿瘤相关抗原的一组srRNA的体内免疫原性的条形图，所述示例性肿瘤相关抗原用作疫苗(例如，用于在受试者中引发免疫应答)。该组包括源自辛德比斯AR86-Girdwood杂交体1(SIN.AR86)和以下五种其他甲病毒的srRNA：委内瑞拉马脑炎病毒(VEE.TC83)、基孔肯亚病毒毒株S27(CHIK.S27)和DRDE-06(CHIK.DRDE)、辛德比斯病毒毒株Girdwood(SIN.GW)以及东方马脑炎病毒(EEE.FL93)。每种srRNA包含编码以下三种多肽的序列：雌激素受体1(ESR1)、人表皮生长因子2(HER2)和人表皮生长因子2(HER3)的序列。图10A-图10C示出了在已经接受两次免疫接种的小鼠中使用ELISpot分析测定的对这三种抗原的脾T细胞应答，其中在所测试的每种抗原之间进行统计学比较。
具体实施方式
本文尤其提供了具有优异表达潜力的病毒表达系统，所述病毒表达系统适用于在重组细胞中表达重组多肽，例如像疫苗和治疗性多肽。例如，本公开文本的一些实施方案涉及含有甲病毒种的经修饰的基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的核酸构建体(例如像表达构建体和载体)，其中经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的至少一种非结构蛋白(nsP)或其部分相对于经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。在本公开文本的一些实施方案中还提供了基于病毒的表达载体，所述基于病毒的表达载体包含编码由目的基因(GOI)编码的目的多肽的一个或多个表达盒。进一步提供了被基因工程化以包含本文公开的一种或多种核酸构建体的重组细胞。源自此类重组细胞的生物材料和重组产物也在本申请的范围内。还提供了可用于在有需要的受试者中诱导药效学作用(例如，用于引发免疫应答)的组合物和方法以及用于预防和/或治疗多种健康状况的方法。
基于RNA病毒(例如，甲病毒)的自扩增RNA(例如，自复制RNA或复制子)可以用作稳健的表达系统。例如，据报道，使用甲病毒(如SINV)作为病毒表达载体的优势在于，它们可以指导重组宿主细胞中大量重组蛋白的合成。除这些优势外，多肽(如治疗性单链抗体)如果在体内以高水平表达则可以是最有效的。此外，为了产生从培养(离体地)的细胞纯化的重组抗体，来自复制子RNA的高蛋白质表达可以增加抗体产物的总产量。此外，如果所表达的蛋白质是疫苗抗原，则高水平表达可以在体内诱导最稳健的免疫应答。
甲病毒利用其UTR、结构区和非结构区中包含的基序来影响其在宿主细胞中的复制。这些区域也含有逃避宿主细胞先天免疫的机制。然而，据报道在甲病毒种之间存在显著差异，例如在免疫逃避机制、组织嗜性、异嗜性宿主以及疾病症状和严重程度方面。
鉴于在甲病毒的非结构区和结构区中宿主细胞减毒因子的差异性存在，使结构基因缺失以允许目的基因在合成载体中的表达将对单独载体产生不同的影响。在非结构区中具有不同宿主减毒因子的合成复制子(例如，自复制RNA)在诱导对所表达的目的基因的免疫应答方面将具有不同的优势。无毒的辛德比斯Girdwood毒株无法抑制STAT1使得它成为表达重组蛋白而不会对所编码的蛋白质形成稳健的免疫应答的有利载体。到目前为止，这些单独的载体赋予的优势一直是未被完全探索和预测的。
如下文更详细地所述，初步观察到，可公开获得的甲病毒基因组数据并不总是提供这样的核苷酸序列，其能够用目的基因(GOI)直接替代编码结构蛋白的核酸序列，以产生自复制RNA和转基因表达复制子。特别地，发现大量可公开获得的甲病毒基因组是非功能性的，例如不能进行复制和/或表达转基因。如以下工作例子中更详细地所述，本文尤其提供了可用于功能化有缺陷的(例如，非功能性)甲病毒基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的新程序，通过将有缺陷的甲病毒基因组或RNA复制子的非结构蛋白(nsP)序列用源自不同甲病毒毒株的相应nsP序列替代，以产生功能性的经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子。
尚未完全认识到全长病毒和合成复制子(例如，自复制RNA)不具有相同的复制能力。特别地，来自可公开获得的资源的许多全长病毒和复制子是有功能缺陷的。目前，一种功能化有缺陷的甲病毒基因组或RNA复制子(例如，使其有功能)的修饰方法是恢复一个或多个在毒株之间不同的与毒力有关的关键点突变，例如在功能性毒株(例如，Girdwood)与非功能性毒株(例如，AR86)之间不同的突变。然而，此策略经常失败或随意地得出解决方案，表明在毒株之间存在更多的未表征且因此不可预测的序列差异。因此，需要更快速且有效的方法来鉴定功能性甲病毒毒株(而不是简单地恢复点突变或选择任意区域来产生嵌合体)。
如上文所述，在病毒复制期间，nsP多蛋白复合物的每个nsP亚基(例如，nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)被分别加工成单独的蛋白质。然后这些蛋白质聚集在一起形成nsP多蛋白复合物，其执行基因组和亚基因组转录功能。不受任何特定理论的束缚，假设每种nsP本身在促进复制子(例如，自复制RNA)的整体功能方面在生物学上是合理独立的，并且应当被视为离散的模块单元。如下文更详细地所述，本公开文本的一些实施方案涉及功能化非功能性甲病毒基因组或RNA复制子的方法，其中每个nsP亚基都被视为离散的模块单元，并且可以被来自另一种病毒(例如，另一种物种或同一物种的另一种毒株)的相应模块单元替代(替换)，产生具有新特征的嵌合病毒。本发明公开的方法允许在以下最小集合中对替换掉nsp的影响进行新的组合观察：(1)不在体外启动的复制子；以及(2)在体外启动的复制子。此方法快速给出了关于哪种nsP给任何给定毒株产生问题的信息，而不需要产生大量的新构建体。因此，本发明描述的新程序是一种快速的、技术上可行的方法，其比任何目前已知的方法都有显著的改进。
如下文更详细地所述，本公开文本的一些实施方案涉及含有异源非结构蛋白基因的自复制RNA(srRNA)载体，所述异源非结构蛋白基因已经被工程化以表达一个或多个异源目的基因(GOI)。例如，发现可以用一个或多个GOI替代含有一个或多个异源非结构蛋白基因的srRNA载体中的结构多蛋白基因。在一个例子中，含有异源非结构蛋白基因的辛德比斯srRNA载体(SINV AR86-Girdwood杂交体1)已经被工程化以用合成人IL-1RA基因或IL-12基因盒替代结构多蛋白基因，以产生能够在转染的BHK-21细胞中进行RNA复制和转基因表达的自复制载体(参见例如，图8)。此外，如下文更详细地所述，如本文所述的一些基于SINVAR86-Girdwood杂交体1的srRNA构建体可以用于表达目的抗原分子，并且被配制为具有可测量的体内药效学作用的疫苗(参见例如，图9和图10)。此外，图7A-图7B中描述的实验数据证明，基于SINV AR86-Girdwood杂交体1的srRNA载体可用于表达多种蛋白质，其编码序列在单个开放阅读框内(例如，在多顺反子ORF中)彼此可操作地连接，并且具有如通过体内药效学作用所测量的生物活性(参见例如，图10)。总之，这些研究进一步证明了具有异源非结构蛋白基因的srRNA载体和基于SINV AR86-Girdwood杂交体1的srRNA载体在治疗和疫苗应用中的用途。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语、符号和其他科学术语或用辞都旨在具有本申请所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括此类定义不一定应当被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。本文描述或提及的许多技术和程序是本领域技术人员很好理解的并且通常由本领域技术人员使用常规方法加以采用。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“一个细胞”包括一个或多个细胞，包括其混合物。在本文中使用“A和/或B”来包括所有以下替代形式：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。
应理解，本文所述的本公开文本的方面和实施方案包括“包含方面和实施方案”、“由方面和实施方案组成”和“基本上由方面和实施方案组成”。如本文所用，“包含”与“包括”、“含有”或“其特征在于”同义，并且是包含性的或开放式的，并不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。如本文所用，“由……组成”排除不在所要求保护的组合物或方法中指定的任何要素、步骤或成分。如本文所用，“基本上由……组成”不排除不实质上影响所要求保护的组合物或方法的基本和新颖特征的材料或步骤。在本文中、特别是在组合物的组分的描述中或在方法的步骤的描述中对术语“包含”的任何表述都应理解为涵盖那些基本上由所列举的组分或步骤组成以及由所列举的组分或步骤组成的组合物和方法。
如本文所用，术语“施用”及其任何语法变体是指通过施用途径递送生物活性组合物或配制品，所述施用途径包括但不限于鼻内、透皮、静脉内、动脉内、肌内、结内、腹膜内、皮下、肌内、口服、阴道内和局部施用或其组合。所述术语包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。
术语“细胞”、“细胞培养物”和“细胞系”不仅指代特定的主题细胞、细胞培养物或细胞系，而且指代这样的细胞、细胞培养物或细胞系的子代或潜在子代，而不考虑培养中的转移或传代次数。应当理解，并非所有子代都与亲代细胞完全相同。这是因为某些修饰可能由于突变(例如，故意或无意的突变)或环境影响(例如，甲基化或其他表观遗传修饰)而在后代中发生，使得子代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍然被包括在如本文所用的术语的范围内，只要子代保留与原始细胞、细胞培养物或细胞系的功能相同的功能即可。
术语本公开文本的组合物(例如，核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物)的“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”通常是指相对于不存在组合物足以使组合物实现陈述的目的(例如，实现其施用所为的效果、刺激免疫应答、预防或治疗疾病或者减轻疾病、障碍、感染或健康状况的一种或多种症状)的量。“有效量”的例子是足以促成治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可以被称为“治疗有效量”。症状的“减轻”意指一种或多种症状的严重程度或频率的降低或者一种或多种症状的消除。组合物的确切量(包括“治疗有效量”)将取决于治疗的目的，并且将可由本领域技术人员使用已知的技术来确定(参见例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,TheArt,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,DosageCalculations(1999)；以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。
术语“核酸构建体”是指包含来自异源来源的一个或多个分离的核酸序列的重组核酸分子。例如，本公开文本的核酸构建体可以是嵌合核酸分子，其中两个或更多个不同起源的核酸序列被组装成单个核酸分子。因此，代表性核酸构建体包括含有以下的任何构建体：(1)核酸序列，包括在自然界中未发现彼此邻接的调节和编码序列(例如，核苷酸序列中的至少一个相对于它的其他核苷酸序列中的至少一个是异源的)；或(2)编码未天然邻接的功能性RNA分子或蛋白质的部分的序列；或(3)非天然邻接的启动子的部分。代表性核酸构建体可以包含源自能够进行基因组整合或自主复制的任何来源(如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体)的任何重组核酸分子(线性或环状的单链或双链DNA或RNA核酸分子)，包括一个或多个核酸序列已经可操作地连接的核酸分子。本公开文本的构建体可以包含指导也包含在构建体中的目的核酸序列的表达所必需的元件。此类元件可以包括控制元件(如可操作地连接至目的核酸序列(以便指导其转录)的启动子)，并且任选地包括多腺苷酸化序列。
在本公开文本的一些实施方案中，可以将核酸构建体掺入载体内。术语“载体”在本文中用于指代能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子或序列。因此，术语“载体”涵盖基于DNA的载体和基于RNA的载体两者。术语“载体”包括克隆载体和表达载体以及病毒载体和整合载体。“表达载体”是包含调节区从而能够在体外、离体地和/或在体内表达DNA序列和片段的载体。在一些实施方案中，载体可以包含在细胞中指导自主复制的序列，例如像质粒(基于DNA的载体)或自复制RNA载体。在一些实施方案中，载体可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。在一些实施方案中，载体可以包含可以在体外和/或在体内转录成RNA的DNA序列。有用的载体包括例如质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。在一些实施方案中，本公开文本的载体可以是单链载体(例如，ssDNA或ssRNA)。在一些实施方案中，本公开文本的载体可以是双链载体(例如，dsDNA或dsRNA)。在一些实施方案中，载体是基因递送载体。在一些实施方案中，将载体用作基因递送媒介物以将基因转移至细胞中。
除了构建体的组分之外，载体还可以包含例如一种或多种选择性标志物、一个或多个复制起点(如原核和真核起点)、至少一个多克隆位点和/或促进构建体稳定地整合到细胞的基因组中的元件。两个或更多个构建体可以掺入在单个核酸分子(如单个载体)内，或者可以包含在两个或更多个单独的核酸分子(如两个或更多个单独的载体)内。“表达构建体”通常至少包含可操作地连接至目的核苷酸序列的控制序列。以这种方式，例如，在表达构建体中提供与待表达的核苷酸序列可操作地连接的启动子，以用于在细胞中表达。对于本公开文本的实践，组合物以及用于制备和使用构建体和细胞的方法是本领域技术人员已知的。
术语本公开文本的组合物(例如，核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物)的“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”通常是指相对于不存在组合物足以使组合物实现陈述的目的(例如，实现其施用所为的效果、刺激免疫应答、预防或治疗疾病或者减轻疾病、障碍、感染或健康状况的一种或多种症状)的量。“有效量”的例子是足以促成治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可以被称为“治疗有效量”。症状的“减轻”意指一种或多种症状的严重程度或频率的降低或者一种或多种症状的消除。组合物的确切量(包括“治疗有效量”)将取决于治疗的目的，并且将可由本领域技术人员使用已知的技术来确定(参见例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,TheArt,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,DosageCalculations(1999)；以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。
如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或更多个元件(例如，多肽序列或多核苷酸序列)之间的物理或功能连接，其允许它们以它们预期的方式操作。例如，当在本文所述的核酸分子或核酸分子中的编码序列和启动子序列的上下文中使用时，术语“可操作地连接”意指编码序列和启动子序列在框内，并且在适当的空间和距离内，以允许转录因子或RNA聚合酶的相应结合对转录施加影响。应当理解，可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的(例如，通过接头彼此连接)。在多肽构建体的上下文中，“可操作地连接”是指在氨基酸序列(例如，不同的区段、部分、区域或结构域)之间的物理连接(例如，直接或间接地连接)，以提供构建体的所描述的活性。本文公开的多肽或核酸分子的可操作地连接的区段、部分、区域和结构域可以是连续的或非连续的(例如，通过接头彼此连接)。
在两个或更多个核酸或蛋白质的上下文中，如本文所用的术语“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸(例如，当在比较窗口或指定区域上比较和比对以获得最大对应时，在指定区域上的约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高序列同一性)，如使用采用下文所述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和目视检查所测量。参见例如，NCBI网站ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。然后此类序列被说成“基本上相同”。此定义也涉及或可以应用于序列的互补体。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。可以使用已公布的技术和广泛可用的计算机程序来计算序列同一性，所述计算机程序如GCS程序包(Devereux等人,Nucleic Acids Res.12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人,J Mol Biol 215:403,1990)。可以使用序列分析软件采用其默认参数来测量序列同一性，所述序列分析软件如威斯康星大学生物技术中心(University of WisconsinBiotechnology Center)(大学大道1710号，威斯康星州麦迪逊，53705)的遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的序列分析软件包。
如本文所用的术语“部分(portion)”可以指代小部分(fraction)。关于特定结构(如氨基酸序列或蛋白质)，术语其“部分(portion)”可以表示所述结构的连续或不连续部分(fraction)。例如，氨基酸序列的一部分包含所述氨基酸序列的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％和至少90％的氨基酸。另外地或可替代地，如果所述部分(portion)是不连续部分(fraction)，则所述不连续部分(fraction)由结构的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个部分(part)构成，每个部分(part)都是结构的连续元件。例如，氨基酸序列的不连续部分可以由所述氨基酸序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个(例如，不多于4个)部分构成，其中每个部分包含氨基酸序列的至少2个、3个、4个、5个连续氨基酸、至少10个连续氨基酸、至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸。
如本文所用的术语“药学上可接受的赋形剂”是指提供药学上可接受的载体、添加剂或稀释剂以用于向受试者施用一种或多种目的化合物的任何合适的物质。因此，“药学上可接受的赋形剂”可以涵盖称为药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的添加剂和药学上可接受的载体的物质。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括但不限于与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。也可以将补充性活性化合物(例如，抗生素和另外的治疗剂)掺入组合物中。
当关于细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组的”表明细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过人干预而改变或产生，例如像已经通过实验室方法进行修饰或者是实验室方法的结果。因此，例如，重组蛋白质和核酸包括通过实验室方法产生的蛋白质和核酸。重组蛋白可以包含在蛋白质的天然(非重组或野生型)形式内未发现的氨基酸残基，或者可以包含已经被修饰(例如，被标记)的氨基酸残基。所述术语可以包括对肽、蛋白质或核酸序列的任何修饰。此类修饰可以包括以下：对肽、蛋白质或核酸序列的任何化学修饰，包括对一个或多个氨基酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的任何化学修饰；肽或蛋白质中一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代；融合蛋白(例如，包含抗体片段的融合蛋白)的产生；以及核酸序列中一个或多个核酸的添加、缺失和/或取代。当关于细胞使用时，术语“重组的”并不旨在包括天然存在的细胞，但是涵盖已经被工程化/修饰以包含或表达在细胞未被工程化/修饰时不存在于细胞中的多肽或核酸的细胞。
如本文所用，术语“复制子RNA”或“RNA复制子”是指含有在允许细胞内指导其自身的扩增或自复制所需的所有遗传信息的RNA。因此，复制子RNA有时也被称为“自扩增RNA”(saRNA)或“自复制RNA”(srRNA)。为了指导其自身的复制，RNA分子1)编码聚合酶、复制酶或其他可以与病毒或宿主细胞来源的蛋白质、核酸或核糖核蛋白相互作用以催化RNA扩增过程的蛋白质；并且2)含有亚基因组复制子编码的RNA的复制和转录所需的顺式作用RNA序列。这些序列可以在复制过程期间结合至其自身编码的蛋白质或非自身编码的细胞来源的蛋白质、核酸或核糖核蛋白或任何这些组分之间的复合物。为了本公开文本的目的，甲病毒复制子RNA分子(例如，srRNA或saRNA分子)通常含有以下有序元件：复制所需的一个或多个顺式5’病毒RNA序列、编码生物活性甲病毒非结构蛋白(例如，nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)的序列、亚基因组RNA(sgRNA)的启动子、复制所需的顺式3’病毒序列和聚腺苷酸束(聚(A))。此外，术语复制子RNA(例如，srRNA或saRNA分子)通常是指正极性或有义(“message”sense)的分子，并且复制子RNA的长度可以不同于任何已知的天然存在的甲病毒的长度。在本公开文本的一些实施方案中，复制子RNA不含至少一种结构病毒蛋白的序列；和/或编码结构基因的序列可以被异源序列取代。在那些情形下，在复制子RNA将被包装到重组甲病毒颗粒中的情况下，它可以含有一个或多个用于启动与甲病毒结构蛋白的相互作用从而导致颗粒形成的序列(所谓的包装信号)。
如本文所用，“受试者”或“个体”包括动物，如人(例如，人类个体)和非人动物。在一些实施方案中，“受试者”或“个体”是在医生护理下的患者。因此，受试者可以是患有、有风险患上或怀疑患有目的健康状况(例如，癌症或感染)和/或健康状况的一种或多种症状的人类患者或个体。受试者也可以是在诊断时或之后被诊断为有目的健康状况和/或疾病的风险的个体。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如啮齿动物(例如，小鼠)、非人灵长类动物和其他哺乳动物，例如像绵羊、狗、牛；鸡；以及非哺乳动物，如两栖动物、爬行动物等。
在提供值范围的情况下，本领域普通技术人员应理解，本文公开的所有范围都涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以被容易地识别为充分描述相同的范围并且使得相同的范围能够分解成至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围都可以容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言都包括所列举的数字，并且是指可以随后分解成如上文所讨论的子范围的范围。此外，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组，等等。
某些范围在本文中以前面带有术语“约”的数值呈现，如本文所用，术语“约”具有其大约的通常含义。使用术语“约”是为了对其后的精确数字以及接近或近似于所述术语后的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在呈现它的上下文中提供具体列举的数字的基本等效形式的数字。如果根据上下文原本不清楚近似度，则“约”意指在所提供值的±10％内，或者四舍五入到最接近的有效数字，在所有情况下都包括所提供的值。在一些实施方案中，术语“约”指示指定值±至多10％、至多±5％或至多±1％。
呈现标题(例如，(a)、(b)、(i)等)只是为了便于阅读说明书和权利要求。说明书或权利要求中标题的使用不要求步骤或要素按字母或数字顺序或呈现它们的顺序进行。
应理解，为清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开文本的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开文本的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供。属于本公开文本的实施方案的所有组合都确切地被本公开文本所涵盖并且在本文中公开，如同每一个组合都单独且明确地公开一样。此外，各种实施方案及其要素的所有子组合也都确切地被本公开文本所涵盖并且在本文中公开，如同每一个这样的子组合都单独且明确地在本文中公开一样。
甲病毒
甲病毒是具有单链正义RNA基因组的小包膜RNA病毒。甲病毒属(alphavirus)尤其包括辛德比斯病毒(SINV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、罗斯河病毒(RRV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)和东方马脑炎病毒(EEEV)，其都是密切相关的并且能够感染多种脊椎动物(如哺乳动物、啮齿动物、鱼类、鸟类物种和大型哺乳动物(如人和马))以及无脊椎动物(如昆虫)。特别地，辛德比斯和塞姆利基森林病毒已经被广泛研究，并且这些病毒的生命周期、复制模式等是良好表征的。非限制性示例性甲病毒种包括奥拉病毒(AURAV)、巴班肯病毒(BABV)、巴马森林病毒(BFV)、比巴鲁病毒(BEBV)、博吉河病毒、卡因瓜病毒、卡巴斯欧病毒、基孔肯亚病毒(CHIKV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、埃拉特病毒、沼泽地病毒(EVEV)、摩根堡病毒(FMV)、盖塔病毒(GETV)、高地J病毒(HJV)、克孜拉加奇病毒(KYZV)、马达里亚加病毒(MADV)、马雅罗病毒(MAYV)、米德尔堡病毒(MIDV)、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎布病毒(MUCV)、恩杜姆病毒(NDUV)、阿尼昂尼昂病毒(ONNV)、皮春纳病毒(PIXV)、里奥内格罗病毒(RNV)、罗斯河病毒(RRV)、鲑鱼胰腺病病毒(SPDV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、辛德比斯病毒(SINV)、嗜睡症病毒(SDV)、南方象海豹病毒(SESV)、大森林病毒(TFV)、图那特病毒、特罗卡拉病毒、乌纳病毒(UNAV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和瓦塔罗阿病毒(WHAV)。
甲病毒基因组长大约12kb，并且它由以下两个开放阅读框(ORF)组成：7kb编码非结构蛋白(nsP)的框和4kb编码结构多蛋白的框。非结构多蛋白(nsP)被切割成四种不同的蛋白质(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)，其是病毒mRNA在宿主细胞的细胞质内转录和翻译所必需的。
nsP1蛋白是具有鸟嘌呤-7-甲基转移酶(MTase)和鸟苷酸转移酶(GTase)两种活性的mRNA加帽酶，这两种活性指导新合成的病毒基因组和亚基因组RNA的甲基化和加帽。nsP1的N末端结构域中的MTase基序催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)转移到GTP分子的N7位置(m7Gppp)。GTase然后结合m7Gppp，与催化组氨酸形成共价连接(m7Gp-GTase)并且释放PPi。然后GTase将m7Gp分子转移到5'-二磷酸RNA，以产生m7GpppNp-RNA。所得帽结构对于病毒mRNA翻译至关重要，并且防止mRNA被细胞5'外切核酸酶降解。在N末端结构域之后是允许nsP1蛋白与细胞膜缔合的特征。α螺旋两亲性环和棕榈酰化位点的存在允许nsP1蛋白和含有nsP1的复制复合物可能通过nsP1与膜阴离子磷脂的相互作用锚定在质膜上。
nsP2蛋白具有多种酶活性和功能作用。N末端区域含有具有超家族1(SF1)解旋酶的七个特征基序的解旋酶结构域。它作为进行第一个病毒RNA加帽反应的RNA三磷酸酶发挥作用。它还作为核苷酸三磷酸酶(NTPase)发挥作用，增强RNA解旋酶活性。nsP2的C末端区域含有木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶，其负责加工病毒非结构多蛋白。所述蛋白酶识别多蛋白内的保守基序。这种蛋白水解功能是高度受调节的，并且由nsP2的其他结构域调节。甲病毒nsP2蛋白也已经被描述为毒力因子，负责受感染的宿主细胞中的转录和翻译关闭，以及干扰素(IFN)介导的抗病毒应答的抑制，有助于病毒因子控制翻译机器。
不太清楚甲病毒nsP3蛋白在复制复合物中的一种或多种确切作用。nsP3蛋白具有以下三个识别的结构域：具有磷酸酶活性和核酸结合能力的N末端宏结构域、甲病毒独特结构域(AUD)和C末端高变结构域。已经证明，SFV nsP3中此结构域的缺失导致低病毒致病性，表明其在病毒RNA转录调节中的重要性。
nsP4聚合酶是甲病毒中最高度保守的蛋白质，其中当与其他甲病毒nsP4相比时，差异最大者的氨基酸序列>50％相同。nsP4在C末端含有核心RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)结构域，其被确定为仅负责病毒复制复合物的RNA合成特性。RdRp经由负链RNA参与基因组RNA的复制以及26S亚基因组RNA的转录。N末端结构域是甲病毒特异性的并且可以在结构上部分无序。
甲病毒基因组的5′端三分之二编码病毒RNA转录和复制所必需的许多非结构蛋白(nSP)。这些蛋白质直接从RNA翻译，并且与细胞蛋白一起形成对于病毒基因组复制和亚基因组RNA转录至关重要的RNA依赖性RNA聚合酶。四种非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)作为单个多蛋白产生，构成病毒的复制机器。多蛋白的加工以高度受调节的方式进行，其中P2/3连接处的切割影响基因组复制期间RNA模板的使用。此位点位于狭窄的裂口的底部并且不易到达。一旦被切割，nsP3就产生环绕nsP2的环形结构。这两种蛋白质具有广泛的界面。产生非致细胞病变病毒或温度敏感表型的nsP2中的突变在P2/P3界面区域聚集。与nsP2非致细胞病变突变的位置相对的P3突变阻止了P2/3的有效切割。这进而可能影响RNA感染性，改变病毒RNA产生水平。
基因组的3’端三分之一包含亚基因组RNA，其用作形成病毒颗粒所需的所有结构蛋白(核心核衣壳蛋白C和作为异二聚体缔合的包膜蛋白P62和E1)的翻译模板。病毒膜锚定的表面糖蛋白负责受体识别并且通过膜融合进入靶细胞。亚基因组RNA从存在于编码nsP4蛋白的RNA序列3′端的p26S亚基因组启动子转录。P62蛋白水解成熟为E2和E3引起病毒表面的变化。E1、E2和有时E3糖蛋白“刺突”一起形成E1/E2二聚体或E1/E2/E3三聚体，其中E2从中心延伸到顶点，E1填充顶点之间的空间，并且E3(如果存在)位于刺突的远端。当病毒暴露于内体的酸度时，E1与E2解离以形成E1同三聚体，这对于驱动细胞膜与病毒膜在一起的融合步骤是必需的。甲病毒糖蛋白E1是II类病毒融合蛋白，其与流感病毒和HIV中发现的I类融合蛋白在结构上不同。E2糖蛋白通过其胞质结构域发挥功能以与核衣壳相互作用，而其胞外结构域负责结合细胞受体。大多数甲病毒失去周边蛋白E3，而在塞姆利基病毒中，它仍然与病毒表面缔合。
据报道，甲病毒复制发生在宿主细胞内的膜表面上。在感染周期的第一步中，将基因组RNA的5′端翻译成具有RNA聚合酶活性的多蛋白(nsP1-4)，其产生与基因组RNA互补的负链。在第二步中，将负链分别用作产生以下两种RNA的模板：(1)与通过翻译产生其他nsP的次级病毒的基因组相对应并且充当病毒基因组的正基因组RNA；以及(2)编码形成感染颗粒的病毒的结构蛋白的亚基因组RNA。通过多蛋白到nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的蛋白水解自切割来调节正基因组RNA/亚基因组RNA比率。实际上，病毒基因表达分两个阶段进行。在第一阶段中，主要合成正基因组链和负链。在第二阶段期间，亚基因组RNA的合成实际上是排他性的，因此导致产生大量的结构蛋白。
本公开文本的组合物
如下文更详细地所述，本公开文本的一个方面涉及包含编码甲病毒种的经修饰的病毒基因组或复制子RNA(例如，自复制RNA)的核酸序列的核酸构建体、包含所述核酸构建体的重组细胞、包含所述核酸构建体的转基因动物和通过本公开文本的方法产生的重组多肽。
本公开文本的一些实施方案提供了经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA(例如，自复制RNA)，其中经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的至少一种结构蛋白(nsP)或其部分相对于经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的，其中至少一种异源nsP或其部分是nsP1、nsP2、nsP3、nsP4或其任一种的一部分，或任何前述的组合。在一些实施方案中，nsP1或其部分相对于经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。在一些实施方案中，nsP2或其部分相对于经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。在一些实施方案中，nsP3或其部分相对于经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。在一些实施方案中，nsP4或其部分相对于经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。在一些实施方案中，两种nsP蛋白相对于经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。在一些实施方案中，三种nsP蛋白相对于经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。在一些实施方案中，nsP1、nsP2和nsP3或其部分相对于经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。在一些实施方案中，nsP1、nsP2和nsP4或其部分相对于经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。在一些实施方案中，nsP2、nsP3和nsP4或其部分相对于经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。
A.核酸构建体
如下文更详细地所述，本公开文本的一个方面涉及包含编码甲病毒(如辛德比斯病毒(SINV))的经修饰的基因组或复制子RNA(例如，自复制RNA)的核酸序列的新型核酸构建体，其中经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的至少一种非结构蛋白(nsP)或其部分相对于经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。例如，至少一种异源nsP或其部分是nsP1、nsP2、nsP3、nsP4或其任一种的一部分，或任何前述的组合。如上文所述，熟练技术人员将理解，编码非结构多肽的核酸序列的一部分可以包含编码非结构多肽的足够的核酸序列，以提供该多肽的推定鉴定，抑或通过由本领域技术人员对序列进行手动评价，抑或通过使用诸如BLAST(参见例如，“Basic Local Alignment Search Tool”；Altschul SF等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1993)的算法进行计算机自动序列比较和鉴定。因此，核苷酸序列的一部分包含足够的序列以提供包含序列的核酸片段的特异性鉴定和/或分离。例如，核酸序列的一部分可以包含全长核酸序列的至少约20％，例如约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％。
适用于本公开文本的组合物和方法的非限制性示例性甲病毒种包括奥拉病毒(AURAV)、巴班肯病毒(BABV)、巴马森林病毒(BFV)、比巴鲁病毒(BEBV)、博吉河病毒、卡因瓜病毒、卡巴斯欧病毒、基孔肯亚病毒(CHIKV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、埃拉特病毒、沼泽地病毒(EVEV)、摩根堡病毒(FMV)、盖塔病毒(GETV)、高地J病毒(HJV)、克孜拉加奇病毒(KYZV)、马达里亚加病毒(MADV)、马雅罗病毒(MAYV)、米德尔堡病毒(MIDV)、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎布病毒(MUCV)、恩杜姆病毒(NDUV)、阿尼昂尼昂病毒(ONNV)、皮春纳病毒(PIXV)、里奥内格罗病毒(RNV)、罗斯河病毒(RRV)、鲑鱼胰腺病病毒(SPDV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、辛德比斯病毒(SINV)、嗜睡症病毒(SDV)、南方象海豹病毒(SESV)、大森林病毒(TFV)、图那特病毒、特罗卡拉病毒、乌纳病毒(UNAV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和瓦塔罗阿病毒(WHAV)。强毒和无毒的甲病毒毒株都是合适的。在一些实施方案中，甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)。在一些实施方案中，甲病毒是东方马脑炎病毒(EEEV)。在一些实施方案中，甲病毒是西方马脑炎病毒(WEEV)。
在一些实施方案中，甲病毒是基孔肯亚病毒(CHIKV)。适用于本公开文本的组合物和方法的CHIKV毒株的非限制性例子包括CHIKV S27、CHIKV LR2006-OPY-1、CHIKVYO123223、CHIKV DRDE、CHIKV 37997、CHIKV 99653、CHIKV Ag41855和Nagpur(印度)653496毒株。强毒和无毒的CHIKV毒株都是合适的。适用于本公开文本的组合物和方法的CHIKV毒株的另外的例子包括但不限于以下中描述的毒株：Afreen等人Microbiol.Immunol.2014,58:688-696、Lanciotti和Lambert ASTMH 2016,94(4):800-803以及Langsjoen等人mBio.2018,9(2):e02449-17。在一些实施方案中，经修饰的CHIKV基因组或复制子RNA(例如，自复制RNA)源自CHIKV毒株S27。在一些实施方案中，经修饰的CHIKV基因组或复制子RNA源自CHIKV毒株DRDE。在一些实施方案中，经修饰的CHIKV基因组或复制子RNA源自CHIKV毒株DRDE-06。在一些实施方案中，经修饰的CHIKV基因组或复制子RNA源自CHIKV毒株DRDE-07。
在一些实施方案中，甲病毒是东方马脑炎病毒(EEEV)。适用于本公开文本的组合物和方法的EEEV毒株的非限制性例子包括EEEV792138、EEEV783372、BeAn5122、BeAr300851、BeAr436087、C-49、FL91-4679、FL93-939、GML903836、MP-9、PE6和V105-00210。强毒和无毒的EEEV毒株都是合适的。另外的合适的EEEV毒株包括但不限于在病毒病原体资源(Virus Pathogen Resource)网站(ViPR；其可在www.viprbrc.org/brc/vipr_genome_search.spg？method＝SubmitForm&blockId＝868&decorator＝toga公开获得)中描述的毒株。在一些实施方案中，经修饰的EEEV基因组或复制子RNA(例如，自复制R NA)源自EEEV毒株FL93-939。
在一些实施方案中，甲病毒是辛德比斯病毒(SINV)。在一些实施方案中，经修饰的基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)属于SINV毒株。适用于本公开文本的组合物和方法的SINV毒株的非限制性例子包括SINV毒株AR339、AR86和Girdwood。适用于本公开文本的组合物和方法的SINV毒株的例子包括但不限于以下中描述的毒株：Sam mels等人J.Gen.Virol.1999,80(3):739-748、和Pfeffer Vector Borne Zoonoti cDis.2010,10(9):889-907、Sigei等人Arch.of Virol.2018,163:2465-2469以及Ling等人J.Virol.2019,93:e00620-19。另外的合适的SINV毒株包括但不限于在病毒病原体资源网站(ViPR；其可在www.viprbrc.org/brc/vipr_genome_search.spg？method＝SubmitForm&blockId＝868&decorator＝toga公开获得)中描述的毒株。强毒和无毒的SINV毒株都是合适的。在一些实施方案中，经修饰的基因组或RNA复制子属于SINV毒株Girdwood。在一些实施方案中，经修饰的基因组或RNA复制子属于SINV毒株AR86。在一些实施方案中，经修饰的SINV基因组或复制子RNA源自SINV毒株Girdwood。在一些实施方案中，经修饰的SINV基因组或复制子RNA源自SINV毒株AR86。在一些实施方案中，经修饰的基因组或RNA复制子的至少一种异源nsP或其部分源自SINV毒株AR86。在一些实施方案中，至少一种异源nsP或其部分是nsP1、nsP3、nsP4或其任一种的一部分，或任何前述的组合。在一些实施方案中，经修饰的基因组或RNA复制子属于SINV毒株AR86。
在一些实施方案中，甲病毒是西方马脑炎病毒(WEEV)。适用于本公开文本的组合物和方法的WEEV毒株的非限制性例子包括WEEV California、McMillan、IMP181、Imperial、Imperial181、IMPR441、71V-1658、AG80-646、BFS932、COA592、EP-6、E1416、BFS1703、BFS2005、BSF3060、BSF09997、CHLV53、KERN5547、85452NM、Montana-64、S8-122和TBT-235。适用于本公开文本的组合物和方法的WEEV毒株的另外的例子包括5614、93A27、93A30、93A38、93A79、B628(Cl 15)、CBA87、CNTR34、CO921356、Fleming、Lake43、PV012357A、PV02808A、PV72102、R02PV001807A、R02PV002957B、R02PV003422B、R05PV003422B、R0PV003814A和R0PV00384A。强毒和无毒的WEEV毒株都是合适的。另外的合适的WEEV毒株包括但不限于以下中描述的毒株：Bergren NA等人,J.Virol.88(16):9260-9267,2014年8月，以及病毒病原体资源网站(ViPR；其可在https://www.viprbrc.org/brc/vipr_genome_search.spg？method＝SubmitForm&blockId＝57240&decorator＝toga公开获得)。在一些实施方案中，经修饰的WEEV基因组或srRNA源自WEEV毒株Imperial。在一些实施方案中，经修饰的WEEV基因组或srRNA源自WEEV毒株McMillan。
在一些实施方案中，至少一种异源nsP或其部分源自同一甲病毒种的另一种毒株。在一些实施方案中，至少一种异源nsP或其部分源自另一种甲病毒种。例如，在一些实施方案中，经修饰的SINV-AR86基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的至少一种异源nsP或其部分源自SINV毒株Girdwood。在一些实施方案中，经修饰的SINV-AR86基因组或RNA复制子的至少一种异源nsP或其部分源自SINV毒株Girdwood的nsP2。在一些实施方案中，结构蛋白nsP1、nsP3和nsP4来自SINV毒株AR86，而nsP2来自SINV毒株Girdwood。在一些实施方案中，nsP4来自AR86毒株，而nsP1、nsP2和nsP3来自Girdwood毒株。在一些实施方案中，nsP3来自AR86毒株，而nsP1、nsP2和nsP4来自Girdwood毒株。在一些实施方案中，nsP1来自AR86毒株，而nsP2、nsP3和nsP4来自Girdwood(参见例如，图1和图6)。
在一些实施方案中，编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的很大一部分已经被去除。在一些实施方案中，经修饰的病毒基因组或复制子RNA(例如，自复制RNA)缺乏编码病毒结构蛋白的整个序列，例如，经修饰的病毒基因组或复制子RNA不包含编码未经修饰的病毒基因组或复制子RNA的结构蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的至少一部分。在一些实施方案中，经修饰的病毒基因组或RNA复制子缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的很大一部分。在一些实施方案中，经修饰的病毒基因组或RNA复制子不包含编码病毒结构蛋白的核酸序列。熟练技术人员将理解，编码病毒结构多肽的核酸序列的很大一部分可以包含编码病毒结构多肽的足够的核酸序列，以提供该多肽的推定鉴定，抑或通过由本领域技术人员对序列进行手动评价，抑或通过使用诸如BLAST(参见例如，“Basic LocalAlignment Search Tool”；Altschul SF等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1993)的算法进行计算机自动序列比较和鉴定。因此，核苷酸序列的很大一部分包含足够的序列以提供包含序列的核酸片段的特异性鉴定和/或分离。例如，核酸序列的很大一部分可以包含全长核酸序列的至少约20％，例如约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％。如上文所述，本公开文本提供了缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的部分或完整的核酸序列的核酸分子和构建体。
在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体包含编码经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA(例如，自复制RNA)的核酸序列，其中编码经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA的一种或多种结构蛋白的核酸序列的很大一部分已经被去除，例如，经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA不包含甲病毒结构蛋白CP、E1、E2、E3和6K中的一种或多种的编码序列的至少一部分。
本公开文本的核酸构建体的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，编码未经修饰的病毒基因组或复制子RNA(例如，自复制RNA)的病毒结构蛋白CP、E1、E2、E3和6K中的一种或多种的核酸序列的至少一部分已经被去除。在一些实施方案中，编码CP的部分或整个序列已经被去除。在一些实施方案中，编码E1的部分或整个序列已经被去除。在一些实施方案中，编码E2的部分或整个序列已经被去除。在一些实施方案中，编码E3的部分或整个序列已经被去除。在一些实施方案中，编码6K的部分或整个序列已经被去除。在一些实施方案中，编码CP、E1、E2、E3和6K的组合的部分或整个序列已经被去除。在一些实施方案中，编码病毒结构蛋白的整个序列已经被去除，例如，经修饰的病毒基因组或复制子RNA不包含编码未经修饰的病毒基因组或复制子RNA的结构蛋白的核酸序列。
本公开文本的非限制性示例性核酸构建体可以包含与选自SEQ ID NO:1-4的任何一个核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体可以包含与选自SEQ ID NO:1的任何一个核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体可以包含与选自SEQ ID NO:2的任何一个核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体可以包含与选自SEQ ID NO:3的任何一个核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体可以包含与选自SEQ ID NO:4的任何一个核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸序列。
本公开文本的核酸构建体(例如，载体或srRNA构建体)的长度通常为至少约2kb。例如，核酸构建体(例如，载体或srRNA)的长度可以为至少约2kb、至少约3kb、至少约4kb、至少约5kb、至少约6kb、至少约7kb、至少约8kb、至少约9kb、至少约10kb、至少约11kb、至少约12kb或多于12kb。在一些实施方案中，核酸构建体(例如，载体或srRNA)的长度可以为约4kb至约20kb、约4kb至约18kb、约5kb至约16kb、约6kb至约14kb、约7kb至约12kb、约8kb至约16kb、约9kb至约14kb、约10kb至约18kb、约11kb至约16kb、约5kb至约18kb、约6kb至约20kb、约5kb至约10kb、约5kb至约8kb、约5kb至约7kb、约5kb至约6kb、约6kb至约12kb、约6kb至约11kb、约6kb至约10kb、约6kb至约9kb、约6kb至约8kb、约6kb至约7kb、约7kb至约11kb、约7kb至约10kb、约7kb至约9kb、约7kb至约8kb、约8kb至约11kb、约8kb至约10kb、约8kb至约9kb、约9kb至约11kb、约9kb至约10kb或约10kb至约11kb。在一些实施方案中，核酸构建体(例如，载体或srRNA)的长度可以为约6kb至约14kb。在一些实施方案中，核酸构建体(例如，载体或srRNA)的长度可以为约6kb至约16kb。
在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体进一步包含一个或多个表达盒。原则上，本文公开的核酸构建体通常可以包含任何数量的表达盒。在一些实施方案中，本文公开的核酸构建体可以包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个表达盒。熟练技术人员将理解，术语“表达盒”是指遗传物质的构建体，其含有编码序列和足够的调节信息以指导编码序列在体内和/或离体地在细胞中正确地转录和/或翻译。可以将表达盒插入用于靶向所需宿主细胞的载体中和/或受试者中。因此，在一些实施方案中，术语表达盒可以与术语“表达构建体”可互换地使用。在一些实施方案中，术语“表达盒”是指这样的核酸构建体，其包含可操作地连接至调节元件(例如像启动子和/或终止信号以及任选地影响基因转录或翻译的任何其他核酸序列或其他核酸序列的组合)的编码蛋白质或功能RNA的基因。
在一些实施方案中，表达盒中的至少一个可以包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子。因此，如本文提供的核酸构建体可用作例如表达载体，当包含可操作地连接至异源核酸序列的调节元件(例如，启动子)时，所述表达载体可以影响异源核酸序列的表达。在一些实施方案中，表达盒中的至少一个包含可操作地连接至异源核酸序列的亚基因组(sg)启动子。在一些实施方案中，sg启动子是26S亚基因组启动子。在一些实施方案中，本公开文本的核酸分子进一步包含一个或多个非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，UTR中的至少一个是异源UTR。在一些实施方案中，经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的5’UTR序列是例如源自异源来源(例如，来自同一甲病毒种的不同毒株或来自不同的甲病毒种)的异源5’UTR序列，例如来自基孔肯亚病毒的UTR序列。在一些实施方案中，经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的3’UTR序列是异源3’UTR序列。在一些实施方案中，经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的5’UTR和3’UTR序列都是异源UTR序列。在一些实施方案中，异源5’UTR和/或3’UTR序列可以来自基孔肯亚病毒。在一些实施方案中，异源5’UTR和/或3’UTR序列可以来自基孔肯亚毒株S27。在一些实施方案中，异源5’UTR和/或3’UTR序列可以来自基孔肯亚毒株DRDE。
在一些实施方案中，表达盒中的至少一个包含目的基因(GOI)的编码序列。在一些实施方案中，重新设计和/或优化GOI的编码序列以获得所需特性，如增加的稳定性、效力和表达(例如，翻译效率)，这进而可以使产生、递送和施用生物治疗剂的影响最大化。例如，在一些实施方案中，GOI的编码序列被优化以用于以高于参考编码序列的表达水平的水平(例如，比参考编码序列高20％、高30％、高40％、高50％、高60％、高70％、高80％、高90％或高95％)表达。在一些实施方案中，参考编码序列是野生型非优化序列。关于核苷酸序列的序列优化，遗传密码的简并性提供了将编码蛋白质的基因序列的至少一个碱基用不同的碱基取代而不会导致由基因产生的多肽的氨基酸序列被改变的可能性。因此，本公开文本的核酸构建体还可以具有根据遗传密码的简并性通过取代已经从本文公开的任何多核苷酸序列改变的任何碱基序列。可容易地公开获得描述密码子使用的参考文献。在一些实施方案中，可以出于多种原因产生多核苷酸序列变体，例如以优化特定宿主的表达(例如，将甲病毒mRNA中的密码子使用改变为其他生物体(如人、非人灵长类动物、仓鼠、小鼠或猴)优选的密码子使用)。因此，在一些实施方案中，GOI的编码序列被优化以用于以高于参考编码序列(例如像在靶宿主细胞中未通过使用针对表达优化的密码子进行密码子优化的编码序列)的表达水平的水平表达。在一些实施方案中，与未经密码子优化的参考编码序列相比，GOI的经密码子优化的序列导致表达水平增加至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。在一些实施方案中，与未经密码子优化的参考编码序列相比，GOI的经密码子优化的序列导致表达水平增加至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。
在一些实施方案中，GOI的编码序列被优化以用于增强RNA稳定性和/或表达。RNA的稳定性通常与RNA的“半衰期”相关。“半衰期”是指消除分子活性、量或数量的一半所需的时间段。在本公开文本的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可以影响RNA的“表达持续时间”。可用于评价RNA稳定性的几种方法和技术是已知的，包括各种计算机方法和/或具有不同GOI密码子使用的复制子(例如，自复制RNA)的储存及其对复制子效力(例如，转染后检查细胞中的dsRNA)和基因表达的影响的经验压力测试(stress-testing)。这方面的另外的信息可见于例如Wayment-Steele,H.等人(2021).Cold SpringHarbor Laboratory(doi.org/10.1101/2020.08.22.262931)。关于用于在增强RNA稳定性中使用的原理、策略和方法的进一步的信息可见于例如Leppek K.等人,Combinatorialoptimization of mRNA structure,stability,and translation for RNA-basedtherapeutics.bioRxiv.(预印本).2021年3月30日.doi:10.1101/2021.03.29.437587。
由GOI编码的多肽通常可以是任何多肽，并且可以是例如治疗性多肽、预防性多肽、诊断性多肽、营养保健性多肽、工业酶和报告多肽。在一些实施方案中，GOI编码选自以下的多肽：抗体、抗原、免疫调节剂、酶、信号传导蛋白和细胞因子。在一些实施方案中，GOI编码如下多肽，所述多肽可以是抗体、抗原、免疫调节剂、酶、信号传导蛋白或细胞因子。在一些实施方案中，GOI可以编码微生物蛋白、病毒蛋白、细菌蛋白、真菌蛋白、哺乳动物蛋白以及其中任何的组合。GOI的非限制性例子包括白介素和相互作用蛋白，如G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-10、IL-10样蛋白、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-18BP、IL-1样蛋白、IL-1RA、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-20、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6样蛋白、IL-7、IL-9、IL-21、IL-22、IL-33、IL-37、IL-38、LIF和OSM。另外的合适的GOI包括但不限于干扰素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ)，TNF(例如，CD154、LT-β、TNF-α、TNF-β、4-1BBL、APRIL、CD70、CD153、CD178、GITRL、LIGHT、OX40L、TALL-1、TRAIL、TWEAK和TRANCE)，TGF-β(例如，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)，血细胞生成素(例如，Epo、Tpo、Flt-3L、SCF、M-CSF、MSP)，趋化因子及其受体(例如，XCL1、XCL2、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14和CX3CL1)，免疫抑制基因产物和相关转录因子(例如，PECAM1、FCGR3A、FOS、NFKB1、JUN、HIF1A、PD-L1、mTOR、STAT5B和STAT4)。
适用于本公开文本的组合物和方法的另外的GOI包括但不限于免疫刺激基因产物(例如，CD27/CD70、CD40、CD40L、B7.1、BTLA、MAVS、OX40、OX40L、RIG-I和STING)，耐药基因突变体/变体，如ABCB1、ABCC1、ABCG2、AKT1、ALK、BAFF、BCR-ABL、BRAF、CCND1、cMET、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERK2、ESR1、GRB2、KRAS、MDR1、MRP1、NTRK1、PDC4、P-gp、PI3K、PTEN、RET、ROS1、RSK1、RSK2、SHIP和STK11。还适用于本公开文本的组合物和方法的包括编码病毒蛋白，特别是刺突蛋白、纤维蛋白、结构蛋白和吸附蛋白的序列。
在一些实施方案中，GOI可以编码抗体或抗体变体(例如，单链Fv、双特异型、骆驼型、Fab和HCAb)。在一些实施方案中，抗体靶向与癌症相关或癌症中上调的表面分子，或与感染性疾病相关的表面分子。在一些实施方案中，抗体靶向具有免疫刺激功能或具有免疫抑制功能的表面分子。
在一些实施方案中，GOI可以编码其缺乏或突变与疾病或健康状况相关的酶，例如像阿加糖酶β(agalsidase beta)、阿加糖酶α(agalsidase alfa)、伊米苷酶、他利苷酶α(taliglucerase alfa)、维拉苷酶α(velaglucerase alfa)、阿糖脑苷酶、色贝脂酶α(sebelipase alpha)、拉罗尼酶、艾度硫酸酯酶、依洛硫酸酯酶α(elosulfase alpha)、加硫酶、阿糖苷酶α和CTFR。
在一些实施方案中，GOI可以编码选自以下的多肽：抗原分子、生物治疗性分子或其中任何的组合。在一些实施方案中，GOI可以编码选自以下的多肽：肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原、新抗原以及其中任何的组合。在一些实施方案中，GOI可以编码选自以下的多肽：雌激素受体、细胞内信号转导酶和人表皮生长受体。在一些实施方案中，GOI可以编码选自以下的生物治疗性多肽：免疫调节剂、血管生成调节剂、细胞外基质调节剂、代谢调节剂、神经调节剂以及其中任何的组合。在一些实施方案中，GOI可以编码选自以下的细胞因子：趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。在一些实施方案中，GOI可以编码选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27、IL-35的白介素，IFNγ以及其任一种的亚基。在一些实施方案中，GOI可以编码选自以下的生物治疗性多肽：IL-12A、IL-12B、IL-1RA以及其中任何的组合。
在一些实施方案中，可以将本公开文本的核酸构建体掺入载体内。在一些实施方案中，本公开文本的载体可以是单链载体，例如ssDNA载体或ssRNA载体。在一些实施方案中，本公开文本的载体可以是双链载体，例如dsDNA载体或dsRNA载体。在一些实施方案中，本公开文本的载体可以是质粒。如下文更详细地所述，本公开文本的载体可以使用重组DNA技术(例如，聚合酶链式反应(PCR)扩增、滚环扩增(RCA)、分子克隆等)或化学合成来产生。因此，在一些实施方案中，本公开文本的载体可以是全合成载体，例如全合成ssDNA载体。在一些实施方案中，本公开文本的载体可以是全合成dsDNA载体。在一些实施方案中，本公开文本的载体可以是PCR反应的产物。在一些实施方案中，本公开文本的载体可以是RCA反应的产物。在一些实施方案中，载体可以是基因递送载体。在一些实施方案中，载体可以用作基因递送媒介物以将基因转移至细胞中。
在一些实施方案中，由GOI编码的多肽是重组多肽。在一些实施方案中，GOI编码甲型禽流感H5N1的抗原HA多肽。在一些实施方案中，GOI编码与肿瘤学相关的蛋白质(如ESR1、HER2和HER3)或其部分。在一些实施方案中，GOI编码细胞因子，如IL-1RA或IL-12。
在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体包含与选自SEQ ID NO:1-4的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的编码甲病毒种的经修饰的基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的核酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体包含与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的编码甲病毒种的经修饰的基因组或RNA复制子的核酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体包含与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的编码甲病毒种的经修饰的基因组或RNA复制子的核酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体包含与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的编码甲病毒种的经修饰的基因组或RNA复制子的核酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体包含与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的编码甲病毒种的经修饰的基因组或RNA复制子的核酸序列。
表1：序列表中序列的简要描述。
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与目的甲病毒种的经修饰的基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的序列具有高度序列同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的核酸序列可以通过使用本文鉴定的序列(例如，SEQ ID NO:1-4)或本领域已知的任何其他序列，通过用来自在甲病毒种基因组中鉴定的序列的简并引物或基因特异性引物进行的基因组序列分析、杂交和/或PCR来鉴定和/或分离。
在本申请的本文实施例中更全面地描述了组装和表征这些新核酸构建体的分子技术和方法。
在一些实施方案中，核酸分子是重组核酸分子。如上文所述，术语重组核酸分子意指来自人操纵或产生自(然而是间接的)人操纵的任何核酸分子(例如，DNA、RNA)。作为非限制性例子，cDNA是重组DNA分子，如已经通过一个或多个体外聚合酶反应产生或已经与接头附接或已经整合到载体(如克隆载体或表达载体)中的任何核酸分子。作为非限制性例子，重组核酸分子：1)已经在体外例如使用化学或酶促技术合成或修饰，例如通过使用化学核酸合成，或通过使用酶进行核酸分子的复制、聚合、核酸外切消化、核酸内切消化、连接、逆转录、转录、碱基修饰(包括例如甲基化)或重组(包括同源重组和位点特异性重组)；2)包含在自然界中不连接的连接的核苷酸序列；3)已经使用分子克隆技术进行工程化，使得相对于天然存在的核苷酸序列，它缺乏一个或多个核苷酸；和/或4)已经使用分子克隆技术进行操纵，使得相对于天然存在的核苷酸序列，它具有一个或多个序列变化或重排。
在一些实施方案中，使用重组DNA技术(例如，聚合酶链式反应(PCR)扩增、克隆等)或化学合成产生本文公开的核酸分子。如本文所公开的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于天然等位基因变体和经修饰的核酸分子，在所述经修饰的核酸分子中一个或多个核苷酸残基已经以这样的方式被插入、缺失和/或取代，使得此类修饰提供了实现如本文所述的生物活性的所需特性。
核酸分子(包括天然存在的核酸序列的变体)可以使用本领域技术人员已知的多种方法来产生(参见例如，Sambrook等人,于:Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。核酸分子的序列可以使用多种技术相对于衍生出它的天然存在的序列进行修饰，所述技术包括但不限于经典诱变技术和重组DNA技术，如但不限于定点诱变、对核酸分子进行化学处理以诱导突变、核酸片段的限制性酶切割、核酸片段的连接、核酸序列的所选区域的PCR扩增和/或诱变、重组克隆；以及化学合成，包括寡核苷酸混合物的化学合成和混合组的连接以“构建”核酸分子的混合物；及其组合。可以通过以下方式从经修饰的核酸分子的混合物选择核酸分子同源物：针对由核酸分子编码的蛋白质或复制子(例如，srRNA)的功能进行筛选，和/或与野生型基因或其片段杂交，或使用与靶或野生型核酸分子或序列具有同源性的引物进行PCR。
B.重组细胞
如下文更详细地所述，本公开文本的一个方面涉及重组细胞，所述重组细胞已经被工程化以包含(例如，表达)如本文所述的核酸构建体。在一些实施方案中，可以将本公开文本的核酸构建体(例如，载体或srRNA)引入宿主细胞中以产生含有核酸构建体和/或srRNA构建体的重组细胞。例如，可以将本公开文本的核酸构建体引入宿主细胞中以产生含有核酸构建体的重组细胞。因此，含有如本文所述的编码甲病毒种的经修饰的基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的核酸构建体的原核细胞或真核细胞也是本公开文本的特征。在相关方面，本文公开的一些实施方案涉及转化细胞的方法，所述方法包括将如本文提供的核酸构建体引入宿主细胞(如动物细胞)中，然后选择或筛选经转化的细胞。将本公开文本的核酸构建体引入细胞中可以通过本领域技术人员已知的方法来实现，所述方法例如像病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质体转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。
在一个方面，本公开文本的一些实施方案涉及包含本文所述的核酸构建体的重组细胞，例如重组真核细胞，例如昆虫细胞或动物细胞。核酸构建体可以稳定地整合到宿主基因组中，或者可以以附加体复制，或者作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于稳定或瞬时表达。因此，在本公开文本的一些实施方案中，将核酸构建体在重组宿主细胞中作为附加体单元维持和复制。在一些实施方案中，将核酸构建体稳定地整合到重组细胞的基因组中。稳定整合可以使用经典随机基因组重组技术或用更精确的基因组编辑技术(如使用指导RNA引导的CRISPR/Cas9或TALEN基因组编辑)完成。在一些实施方案中，核酸构建体作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于稳定或瞬时表达。
宿主细胞可以是未转化的细胞或已经用至少一种核酸分子转染的细胞。因此，在一些实施方案中，宿主细胞可以用至少一种核酸分子基因工程化(例如，转导或转化或转染)。
用于克隆或表达如本文所述的目的蛋白的合适的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。因此，在一些实施方案中，重组细胞是原核细胞，如细菌大肠杆菌(E.coli)；或真核细胞，如昆虫细胞(例如，蚊细胞或Sf21细胞)或哺乳动物细胞(例如，COS细胞、NIH 3T3细胞或HeLa细胞)。在一些实施方案中，细胞是在体内的，例如活体中的重组细胞，例如转基因受试者的细胞。在一些实施方案中，受试者是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，受试者是昆虫。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，哺乳动物受试者是人类受试者。在一些实施方案中，细胞是离体的，例如已经作为单独的细胞或作为器官或组织的一部分，从活体或生物体中提取出来进行治疗或程序，然后再返回至活体或生物体中。在一些实施方案中，细胞是在体外的，例如从储存库获得。在一些实施方案中，重组细胞是真核细胞。在一些实施方案中，重组细胞是动物细胞。在一些实施方案中，动物细胞是脊椎动物细胞或无脊椎动物细胞。在一些实施方案中，重组细胞是哺乳动物细胞。
对于糖基化蛋白的表达，合适的宿主细胞可以源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞。脊椎动物细胞也可以用作宿主。在这方面，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。在一些实施方案中，重组细胞是动物细胞。在一些实施方案中，动物细胞是脊椎动物细胞或无脊椎动物细胞。在一些实施方案中，重组细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，动物细胞是非人动物细胞。在一些实施方案中，细胞是非人灵长类动物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的另外的例子包括由SV40转化的猴肾CV1细胞(COS-7)、人胚肾细胞(例如，HEK 293或HEK 293细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠支持细胞(例如，TM4细胞)、人宫颈癌细胞(HeLa)、犬肾细胞(MDCK)、水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞、FS4细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、人A549细胞、人宫颈细胞、人CHME5细胞、人PER.C6细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、人表皮样喉细胞、人成纤维细胞、人HUH-7细胞、人MRC-5细胞、人肌肉细胞、人内皮细胞、人星形胶质细胞、人巨噬细胞、人RAW 264.7细胞、小鼠3T3细胞、小鼠L929细胞、小鼠结缔组织细胞、小鼠肌肉细胞和兔肾细胞。
在一些实施方案中，重组细胞选自非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、人A549细胞、人宫颈细胞、人CHME5细胞、人表皮样喉细胞、人成纤维细胞、人HEK-293细胞、人HeLa细胞、人HepG2细胞、人HUH-7细胞、人MRC-5细胞、人肌肉细胞、小鼠3T3细胞、小鼠结缔组织细胞、小鼠肌肉细胞和兔肾细胞。在一些实施方案中，重组细胞是BHK细胞。在一些实施方案中，BHK细胞是BHK-21细胞。在一些实施方案中，重组细胞是Vero细胞。
在一些实施方案中，重组细胞是昆虫细胞，例如昆虫细胞系的细胞。在一些实施方案中，重组细胞是Sf21细胞。另外的合适的昆虫细胞系包括但不限于从昆虫目双翅目(Diptera)、鳞翅目(Lepidoptera)和半翅目(Hemiptera)建立的细胞系，并且可以源自不同的组织来源。在一些实施方案中，重组细胞是鳞翅目昆虫细胞系的细胞。在过去的几十年里，鳞翅目昆虫细胞系的可用性以每十年约50个系增加。关于可用的鳞翅目昆虫细胞系的更多信息可见于例如Lynn D.E.,Available lepidopteran insect cell lines.MethodsMol Biol.2007；388:117-38，将其通过引用并入本文。在一些实施方案中，重组细胞是蚊细胞，例如按蚊属(Anopheles，An.)、库蚊属(Culex，Cx.)和伊蚊属(Aedes)(覆蚊亚属(Stegomyia))(Ae.)内的蚊物种的细胞。适用于本文所述的组合物和方法的示例性蚊细胞系包括来自以下蚊物种的细胞系：埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)、假鳞斑伊蚊(Aedes pseudoscutellaris)、三列伊蚊(Aedes triseriatus)、刺扰伊蚊(Aedes vexans)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、斯氏按蚊(Anophelesstephensi)、白魔按蚊(Anopheles albimanus)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)、泰氏库蚊(Culex theileri)、三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)、二带喙库蚊(Culexbitaeniorhynchus)和安邦巨蚊(Toxorhynchites amboinensis)。合适的蚊细胞系包括但不限于CCL-125、Aag-2、RML-12、C6/26、C6/36、C7-10、AP-61、A.t.GRIP-1、A.t.GRIP-2、UM-AVE1、Mos.55、Sua1B、4a-3B、Mos.43、MSQ43和LSB-AA695BB。在一些实施方案中，蚊细胞是C6/26细胞系的细胞。
C.细胞培养
在另一个方面，本文提供了包含至少一种如本文所公开的重组细胞和培养基的细胞培养物。通常，培养基可以是用于培养本文所述的细胞的任何合适的培养基。用于转化各种各样的上文提到的宿主细胞和物种的技术是本领域已知的并且描述于技术和科学文献中。因此，包含至少一种如本文所公开的重组细胞的细胞培养物也在本申请的范围内。适用于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。
D.转基因动物
在另一个方面，还提供了包含如本文所述的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)的转基因动物。在一些实施方案中，转基因动物是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，转基因动物是哺乳动物。在一些实施方案中，转基因哺乳动物是非人哺乳动物。通常，本公开文本的转基因动物可以是本领域已知的任何非人动物。在一些实施方案中，本公开文本的非人动物是非人灵长类动物。适用于本公开文本的组合物和方法的其他动物物种包括这样的动物，其(i)适用于转基因作用，并且(ii)能够将免疫球蛋白基因区段重排以产生抗体应答。此类物种的例子包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、鸡、山羊、猪、绵羊和牛。适用于本公开文本的组合物和方法的非人动物的另外的例子可以包括但不限于实验动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、豚鼠等)、家畜(例如，马、牛、猪、绵羊、山羊、鸭、鹅、鸡等)、非人灵长类动物(例如，猿、黑猩猩、猩猩、猴等)、鱼类、两栖动物(例如，青蛙、蝾螈等)、爬行动物(例如，蛇、蜥蜴等)和其他动物(例如，狐狸、黄鼠狼、兔、水貂、海狸、貂、水獭、黑貂、海豹、土狼、毛丝鼠、鹿、麝鼠、负鼠等)。
在一些实施方案中，转基因动物是昆虫。在一些实施方案中，昆虫是蚊。在一些实施方案中，本公开文本的转基因动物是嵌合转基因动物。在一些实施方案中，本公开文本的转基因动物是具有这样的生殖细胞和体细胞的转基因动物，所述生殖细胞和体细胞含有一种或多种(例如，一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种等)本公开文本的核酸构建体。在一些实施方案中，将一种或多种核酸构建体稳定地整合到转基因动物的基因组中。在一些实施方案中，本公开文本的转基因动物的基因组可以包含本公开文本的一种或多种核酸构建体的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个拷贝中的任一者。
用于制备转基因非人动物的方式和方法是本领域已知的。示例性方法包括原核显微注射、DNA显微注射、慢病毒载体介导的将DNA转移至早期胚胎中和精子介导的转基因作用、腺病毒介导的将DNA引入动物精子中(例如，在猪中)、逆转录病毒载体(例如，鸟类物种)、体细胞核转移(例如，在山羊中)。转基因家畜农场动物的制备的最新技术水平综述于Niemann,H.等人(2005)Rev.Sci.Tech.24:285-298中。在一些实施方案中，使用本领域已知的用于将外源核酸引入非人动物的基因组中的标准方法来制备本公开文本的转基因非人宿主动物。在一些实施方案中，本公开文本的转基因动物可以使用经典随机基因组重组技术或者用更精确的技术来产生，所述更精确的技术如指导RNA引导的CRISPR/Cas基因组编辑，或采用NgAgo(格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute)的DNA指导的核酸内切酶基因组编辑，或TALEN基因组编辑(转录激活因子样效应物核酸酶)。在一些实施方案中，本公开文本的转基因动物可以使用转基因显微注射技术来制备，并且不需要使用同源重组技术，因此被认为比使用同源重组的方法更易于制备和选择。在一些实施方案中，转基因动物产生如本文所述的目的蛋白。
E.药物组合物
可以将本公开文本的核酸构建体、重组细胞、重组多肽掺入组合物(包括药物组合物)中。此类组合物通常包含本文描述和提供的核酸构建体、重组细胞、重组多肽中的一种或多种和药学上可接受的赋形剂(例如，载体)。在一些实施方案中，本公开文本的组合物被配制用于预防、治疗或管理健康状况，如免疫性疾病或微生物感染。例如，本公开文本的组合物可以被配制为包含药学上可接受的赋形剂的预防性组合物、治疗性组合物或药物组合物或其混合物。在一些实施方案中，本公开文本的组合物被配制用作疫苗。在一些实施方案中，本申请的组合物被配制用作佐剂。
因此，在一个方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和：a)本公开文本的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)；b)本公开文本的重组细胞；和/或c)本公开文本的重组多肽。本公开文本的药物组合物的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，本文提供了包含如本文所公开的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)和药学上可接受的赋形剂的组合物。在一些实施方案中，本文提供了包含如本文所公开的重组细胞和药学上可接受的赋形剂的组合物。在一些实施方案中，组合物包含如本文所公开的重组多肽和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，可以将本公开文本的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)以裸形式使用或与递送媒介物一起配制。适用于本公开文本的组合物和方法的示例性递送媒介物包括但不限于脂质体(例如，中性或阴离子脂质体)、微球、免疫刺激复合物(ISCOM)、基于脂质的纳米颗粒(LNP)、固体脂质纳米颗粒(SLN)、多聚复合物、聚合物纳米颗粒、病毒复制子颗粒(VRP)或与生物活性配体的缀合物，其可以促进递送和/或增强免疫应答。这些化合物是本领域技术人员可容易获得的；例如，参见Liposomes:A Practical Approach,RCPNew Ed,IRL press(1990)。也使用除脂质体等之外的佐剂，并且所述佐剂是本领域已知的。佐剂可以通过将抗原(例如，核酸构建体、载体、srRNA分子)隔离在局部沉积物中而保护其免于快速扩散，或者它们可以含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统的其他组分具有趋化性的因子的物质。本领域技术人员可以例如从下文所述的那些中进行适当的选择。
在一些实施方案中，本公开文本的组合物可以包含以下中的一种或多种：生理缓冲液、脂质体、基于脂质的纳米颗粒(LNP)、固体脂质纳米颗粒(SLN)、多聚复合物、聚合物纳米颗粒、病毒复制子颗粒(VRP)、微球、免疫刺激复合物(ISCOM)、生物活性配体的缀合物或其中任何的组合。在一些实施方案中，本公开文本的组合物被配制在脂质体中。在一些实施方案中，本公开文本的组合物被配制在基于脂质的纳米颗粒(LNP)中。LNP的免疫原性通常低于病毒颗粒。虽然许多人对病毒颗粒具有预先存在的免疫力，但对LNP却没有预先存在的免疫力。此外，不太可能发生针对LNP的适应性免疫应答，这使得能够重复给药LNP。
适用于本文所述的组合物和方法的脂质可以是阳离子脂质、可电离阳离子脂质、阴离子脂质或中性脂质。
在一些实施方案中，本公开文本的LNP可以包含一种或多种可电离脂质。如本文所用，术语“可电离脂质”是指当pH降低至脂质的可电离基团的pKa以下时为阳离子的或变得可电离(质子化)但在较高的pH值下更中性的脂质。在低于pKa的pH值下，脂质然后能够与带负电的核酸(例如，寡核苷酸)缔合。如本文所用，术语“可电离脂质”包括在pH从生理pH降低时呈现正电荷的脂质，以及在选择性pH(如生理pH)下携带净正电荷的许多脂质种类中的任何一种。永久阳离子脂质(如DOTMA)已经被证明对于临床使用毒性太大。可电离脂质可以存在于根据其他实施方案的脂质配制品中，优选地比率在一些实施方案中为约30Mol％至约70Mol％，在其他实施方案中为约30Mol％，在其他实施方案中为约40Mol％，在其他实施方案中为约45Mol％，在其他实施方案中为约47.5Mol％，在仍其他实施方案中为约50Mol％，以及在又其他实施方案中为约60Mol％(“Mol％”意指特定组分的总摩尔的百分比)。在此段落中的术语“约”表示5Mol％的正负范围。DODMA或1,2-二油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷是可电离脂质，DLin-MC3-DMA或0-(Z,Z,Z,Z-三十七-6,9,26,29-四烯-19-基)-4-(N,N-二甲基氨基)(“MC3”)也是可电离脂质。
适用于本公开文本的组合物和方法的示例性可电离脂质包括以下中描述的可电离脂质：PCT公开案WO 2020252589 A1和WO 2021000041 A1、美国专利号8,450,298和10,844,028以及Love K.T.等人,Proc Natl Acad Sci USA,2010年2月2日107(5)1864-1869，将其全部通过引用以其整体特此并入。因此，在一些实施方案中，本公开文本的LNP包含一种或多种在Love K.T.等人(2010同上)中描述的脂质化合物，如C16-96、C14-110和C12-200。在一些实施方案中，LNP包含选自以下的可电离阳离子脂质：ALC-0315、C12-200、LN16、MC3、MD1、SM-102以及其中任何的组合。在一些实施方案中，本公开文本的LNP包含C12-200脂质。C12-200脂质的结构是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号8,450,298和10,844,028中，将所述专利通过引用以其整体特此并入。在一些实施方案中，将C12-200与胆固醇、C14-PEG2000和DOPE组合。在一些实施方案中，将C12-200与DSPC和DMG-PEG2000组合。
在一些实施方案中，本公开文本的LNP包含一种或多种阳离子脂质。已经开发出几种不同的可电离阳离子脂质以用于在LNP中使用。合适的阳离子脂质包括但不限于98N12-5、C12-200、C14-PEG2000、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1和7C1。在一种类型的LNP中，GalNAc部分附接至LNP的外部，并且充当配体，以经由脱唾液酸糖蛋白受体吸收到肝脏中。这些阳离子脂质中的任一种都可以用于配制LNP以递送本公开文本的srRNA构建体和核酸构建体。
在一些实施方案中，本公开文本的LNP包含一种或多种中性脂质。适用于本公开文本的组合物和方法的非限制性中性脂质包括DPSC、DPPC、POPC、DOPE和SM。在一些实施方案中，本公开文本的LNP包含一种或多种在PCT公开案WO 2020252589 A1和WO 2021000041 A1中描述的可电离脂质化合物。
本领域已知的许多其他脂质或脂质组合可以用于产生LNP。适合用于产生LNP的脂质的非限制性例子包括DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE和GL67A-DOPE-DMPE-聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质的另外的非限制性例子包括98N12-5、C12-200、C14-PEG2000、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1、7C1以及其中任何的组合。中性脂质的另外的非限制性例子包括DPSC、DPPC、POPC、DOPE和SM。经PEG修饰的脂质的非限制性例子包括PEG-DMG、PEG-CerC14和PEG-CerC20。
在一些实施方案中，在LNP递送系统中，脂质与核酸的质量比为约100:1至约3:1、约70:1至10:1或16:1至4:1。在一些实施方案中，在LNP递送系统中，脂质与核酸的质量比为约16:1至4:1。在一些实施方案中，在LNP递送系统中，脂质与核酸的质量比为约20:1。在一些实施方案中，在LNP递送系统中，脂质与核酸的质量比为约8:1。在一些实施方案中，基于脂质的纳米颗粒的平均直径小于约1000nm、约500nm、约250nm、约200nm、约150nm、约100nm、约75nm、约50nm或约25nm。在一些实施方案中，LNP的平均直径的范围为约70nm至100nm。在一些实施方案中，LNP的平均直径的范围为约88nm至约92nm、82nm至约86nm或约80nm至约95nm。
在一些实施方案中，本公开文本的组合物被配制在聚合物纳米颗粒中。在一些实施方案中，组合物是免疫原性组合物，例如可以刺激受试者的免疫应答的组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物被配制为疫苗。在一些实施方案中，药物组合物被配制为佐剂。
在一些实施方案中，免疫原性组合物对受试者基本上是非免疫原性的，例如最小地刺激受试者的免疫应答的组合物。在一些实施方案中，非免疫原性或最小免疫原性组合物被配制为生物治疗剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于鼻内施用、透皮施用、腹膜内施用、肌内施用、结内施用、瘤内施用、关节内施用、静脉内施用、皮下施用、阴道内施用、眼内施用、直肠施用和口服施用中的一种或多种。
适用于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，新泽西州帕西帕尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在这些情况下，组合物应当是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。它在制造和储存的条件下可以是稳定的，并且可以抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而被保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，组合物中通常将包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)和/或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所枚举成分中的一种或其组合的适当溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文所枚举成分的所需其他成分。
在一些实施方案中，本公开文本的药物组合物被配制用于吸入，如气雾剂、喷雾剂、雾剂、液体或散剂。通过吸入施用可以呈干粉或气雾剂配制品的形式，所述干粉或气雾剂配制品由受试者(例如，患者)通过使用吸入装置(例如，微喷雾器、压力定量吸入器或雾化器)吸入。
在一些实施方案中，组合物被配制用于鼻内施用、透皮施用、肌内施用、结内施用、瘤内施用、关节内施用、静脉内施用、腹膜内施用、口服施用、阴道内施用、眼内施用、直肠施用或颅内施用中的一种或多种。在一些实施方案中，所施用的组合物导致受试者中干扰素的产生增加。
本公开文本的方法
如下文更详细地所述，本公开文本的一个方面尤其涉及通过替代nsP编码序列的至少一部分来功能化甲病毒的方法、产生由目的基因(GOI)编码的目的多肽的方法、在有需要的受试者中引发免疫应答的方法以及预防和/或治疗有需要的受试者的健康状况的方法。
功能化甲病毒的方法
如上文所概述，本公开文本的一个方面涉及用于功能化/工程化甲病毒基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的方法。所述方法包括(a)提供非功能性甲病毒基因组或RNA复制子；(b)将非功能性甲病毒基因组或RNA复制子的非结构蛋白(nsP)或其部分用源自不同甲病毒毒株的相应nsP或其部分的异源编码序列替代，以产生经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子；(c)评估经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的功能性；(d)如果经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子能够进行RNA复制和/或表达，则将经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子鉴定为功能性的。
在一些实施方案中，异源nsP或其部分源自同一甲病毒种的另一种毒株。在一些实施方案中，异源nsP或其部分源自另一种甲病毒种。在一些实施方案中，异源nsP或其部分是nsP1、nsP2、nsP3、nsP4或其任一种的一部分。在一些实施方案中，甲病毒基因组或RNA复制子(例如，自复制RNA)的非功能性通过在宿主细胞内自复制的缺乏来确定。通常，本公开文本的经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的功能性可以通过使用本领域已知的一种或多种测定和方法来评价，所述测定和方法如RNA复制的检测、病毒蛋白表达的检测、致细胞病变效应(CPE)的检测和异源转基因表达的检测。特别地，非功能性甲病毒可以被鉴定为不能在细胞培养物或原代细胞系(例如但不限于BHK、VERO或HEK293)内自复制。如上文所述，当发现保藏的甲病毒序列(例如，从公共数据库检索的序列)在合成地繁殖以自复制时不足时，可以确定甲病毒的非功能性。
产生目的多肽的方法
在一个方面，本文提供了用于产生目的多肽的方法，其中所述方法包括在一定条件下培养包含如本文所公开的核酸构建体的重组细胞，在所述条件下重组细胞产生由GOI编码的多肽。在另一个方面，本文提供了用于在受试者中产生目的多肽的方法，其中所述方法包括向受试者施用如本文所公开的核酸构建体。在一些实施方案中，受试者是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，哺乳动物受试者是人类受试者。因此，通过本文公开的方法产生的重组多肽也在本公开文本的范围内。
所公开的用于产生重组多肽的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，用于产生本公开文本的重组多肽的方法进一步包括分离和/或纯化所产生的多肽。在一些实施方案中，用于产生本公开文本的多肽的方法进一步包括在结构上修饰所产生的多肽以增加半衰期。在一些实施方案中，所产生的多肽的N末端可以被进一步通过化学或酶促方式修饰以增加半衰期。在一些实施方案中，所产生的多肽的C末端被通过化学和/或酶促方式修饰以增加半衰期。适用于本文所述的方法的化学和酶促修饰的非限制性例子包括PEG化、XTEN化、ELP化和HAP化。适用于这些修饰的技术、系统和试剂是本领域已知的。因此，在一些实施方案中，通过本文所述的方法产生的多肽可以被PEG化、XTEN化、PAS化、ELP化和/或HAP化以增加半衰期。在一些实施方案中，所产生的多肽与另一种蛋白质或肽(例如，血清白蛋白、抗体Fc结构域、转铁蛋白、GLK或CTP肽)缀合以增加半衰期。/>
在一个实施方案中，用于产生目的多肽的方法包括(i)在一定条件下饲养本公开文本的转基因动物，或(ii)在一定条件下培养包含本公开文本的核酸构建体的重组细胞，在所述条件下重组细胞产生由GOI编码的多肽。
在一个实施方案中，用于在受试者中产生目的多肽的方法包括向受试者施用本公开文本的核酸构建体。在一些实施方案中，受试者是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，动物是昆虫。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，哺乳动物受试者是人类受试者。
诱导药效学作用、引发免疫应答、预防或治疗健康状况的方法
施用本文所述的任何一种治疗性组合物(例如，核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物)可以用于治疗相关的健康状况，如增殖性障碍(例如，癌症)、感染性疾病(例如，急性感染、慢性感染或病毒感染)、罕见疾病、和/或自身免疫性疾病、和/或炎性疾病。在一些实施方案中，可以将如本文所述的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物掺入治疗剂中，以用于在治疗患有、怀疑患有或可能有高风险患上一种或多种相关健康状况或疾病的个体的方法中使用。示例性健康状况或疾病可以包括但不限于癌症、免疫性疾病、基因疗法、基因置换、心血管疾病、年龄相关性病状、急性感染和慢性感染。在一些实施方案中，个体是在医生护理下的患者。
在一些实施方案中，如本文所述的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物可用于在受试者中诱导药效学作用。在一些实施方案中，如本文所述的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物可用于在有需要的受试者中调节(例如，引发或抑制)免疫应答。因此，在一个方面，本文提供了用于在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用包含以下的组合物：a)本公开文本的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)；b)本公开文本的重组细胞；c)本公开文本的重组多肽；和/或d)本公开文本的药物组合物。
可以在体内和/或离体地分析本文所述的组合物赋予药效学作用的能力。可以分析的药效学作用的例子包括：免疫原性作用(例如，在体内引发免疫应答)、生物标志物应答、治疗作用、预防作用、期望的作用、不期望的作用、副作用和在疾病模型中的作用。在一些实施方案中，药效学作用的评估包括评估体内免疫应答的诱导。在一些实施方案中，药效学作用的评估包括评估可以增强免疫应答并预防血管生成和转移的细胞因子途径的诱导。
在另一个方面，本文提供了用于预防和/或治疗有需要的受试者的健康状况的方法，所述方法包括向受试者预防性或治疗性地施用包含以下的组合物：a)本公开文本的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)；b)本公开文本的重组细胞；c)本公开文本的重组多肽；和/或d)本公开文本的任一项的药物组合物。
在一些实施方案中，健康状况是增殖性障碍或微生物感染。在一些实施方案中，受试者患有或被怀疑患有与增殖性障碍或微生物感染相关的病症。
在一些实施方案中，所公开的组合物被配制成与其预期的施用途径相容。例如，本公开文本的核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物可以口服或通过吸入给予，但是更可能的是，它们将通过肠胃外途径施用。肠胃外施用途径的例子包括例如静脉内、结内、皮内、皮下、透皮(局部)、经粘膜、阴道内和直肠施用。用于肠胃外应用的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱(如磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠、盐酸或氢氧化钠)调节pH(例如，调节至pH为约7.2-7.8，例如7.5)。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
可以在细胞培养物或实验动物中通过例如用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)的标准药物程序来确定本公开文本的此类主题核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物的剂量、毒性和治疗功效。毒性效应与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比率LD50/ED50。展现出高治疗指数的化合物通常是合适的。虽然可以使用展现出毒性副作用的化合物，但应当谨慎设计将此类化合物靶向至受影响组织部位的递送系统，以使对未感染细胞的潜在损伤最小化，从而减少副作用。
例如，从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于制定用于在人中使用的剂量范围。此类化合物的剂量通常处于包括ED50的具有很小或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径在此范围内变化。对于在本公开文本的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初从细胞培养测定中估计。可以在动物模型中制定剂量以达到包括如在细胞培养中所确定的IC50(例如，测试化合物的实现对症状的半最大抑制的浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可以用于更准确地确定在人中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱测量血浆中的水平。
可以每天施用一次或多次至每周施用一次或多次(包括每隔一天施用一次)本文所述的治疗性组合物，例如核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物。熟练技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，所述因素包括但不限于疾病的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的本公开文本的主题多价多肽和多价抗体治疗受试者可以包括单次治疗，或者可以包括一系列治疗。在一些实施方案中，将组合物每8小时施用持续五天，然后是2至14天(例如，9天)的休息期，然后另外五天每8小时施用。关于核酸构建体和重组多肽，本公开文本的核酸构建体或重组多肽的治疗有效量(例如，有效剂量)取决于所选择的核酸构建体或重组多肽。例如，可以施用大约0.001至0.1mg/kg患者体重范围内的单次剂量量。在一些实施方案中，可以施用约0.005、0.01、0.05mg/kg。在一些实施方案中，可以施用大约0.03μg至300μg/kg患者体重范围内的单次剂量量。在一些实施方案中，可以施用大约0.3mg至3mg/kg患者体重范围内的单次剂量量。
如上文所讨论，治疗有效量包括治疗性组合物当施用于受试者时足以促进特定作用的量，所述受试者如患有、怀疑患有或有风险患上健康状况(例如，疾病或感染)的受试者。在一些实施方案中，有效量包括足以预防或延迟疾病或感染的症状的发展、改变疾病或感染的症状的进程(例如但不限于减缓疾病或感染的症状的进展)或逆转疾病或感染的症状的量。应理解，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员都可以使用常规实验确定适当的有效量。
包括所公开治疗性组合物的治疗用于治疗疾病或感染的功效可以由熟练的临床医生确定。然而，如果疾病或感染的至少任何一种或全部体征或症状得到改善或改进，则治疗被认为是有效的治疗。也可以通过如住院治疗或对医疗干预的需要所评估的个体恶化的失败(例如，疾病或感染进展停止或至少减缓)来测量功效。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中有描述。治疗包括对受试者或动物(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)的疾病或感染的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病或感染，例如停止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病或感染，例如导致症状消退；以及(3)预防症状的发展或降低其可能性。
在一些实施方案中，可以将本公开文本的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物以具有药学上可接受的载体的组合物并且以有效刺激免疫应答的量施用于受试者。通常，受试者可以通过最初的一系列注射(或通过下文所述的其他途径之一施用)进行免疫，随后给予加强剂以增加最初的一系列施用所提供的保护。以刺激受试者的免疫应答(例如，与未施用组合物的受试者中的干扰素产生相比增加至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％)所必需的剂量并且经刺激受试者的免疫应答所必需的时间段施用最初的一系列注射和随后的加强剂。在一些实施方案中，所施用的组合物导致受试者中干扰素的产生增加。在所公开的方法的一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
如上文所述，适用于注射使用的药学上可接受的载体包括无菌水性溶液(在水溶性的情况下)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在这些情况下，组合物必须是无菌的并且必须是易于注射的程度的流体。组合物在制造和储存的条件下必须也是稳定的，并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而被保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油。例如，可以通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞和/或重组多肽以所需量掺入视需要具有上文所枚举成分中的一种或其组合的适当溶剂中，然后过滤灭菌。
当核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物被适当地保护时，如上文所述，它们可以例如用惰性稀释剂或可同化的可食用载体口服施用。也可以将核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物和其他成分封装在硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或者直接掺入个体的饮食中。对于口服治疗施用，活性化合物可以与赋形剂合并并且以可摄入片剂、口含片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。
在一些实施方案中，可以将本公开文本的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)和重组多肽通过基于脂质的纳米颗粒(LNP)递送至细胞或受试者。LNP的免疫原性通常低于病毒颗粒。虽然许多人对病毒颗粒具有预先存在的免疫力，但对LNP却没有预先存在的免疫力。此外，不太可能发生针对LNP的适应性免疫应答，这使得能够重复给药LNP。
如上文所讨论，已经开发出几种不同的可电离阳离子脂质以用于在LNP中使用。这些尤其包括C12-200、MC3、LN16和MD1。例如，在一种类型的LNP中，GalNAc部分附接至LNP的外部，并且充当配体，以经由脱唾液酸糖蛋白受体吸收到肝脏中。这些阳离子脂质中的任一种都可以用于配制LNP以将本公开文本的核酸构建体和重组多肽递送至肝脏。
在一些实施方案中，LNP是指直径小于1000nm、500nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm或25nm的任何颗粒。可替代地，纳米颗粒的尺寸的范围可以为1-1000nm、1-500nm、1-250nm、25-200nm、25-100nm、35-75nm或25-60nm。
LNP可以由阳离子、阴离子或中性脂质制成。中性脂质(如促融合磷脂DOPE或膜组分胆固醇)可以作为“辅助脂质”被包含在LNP中以增强转染活性和纳米颗粒稳定性。阳离子脂质的局限性包括由于稳定性差和快速清除而导致的低功效，以及产生炎性应答或抗炎性应答。LNP也可以具有疏水性脂质、亲水性脂质或既疏水又亲水的脂质。
如上文所述，已经开发以用于在LNP中使用的许多脂质或脂质组合可以用于产生本公开文本的LNP。适合用于在产生LNP中使用的脂质的非限制性例子包括DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE和GL67A-DOPE-DMPE-聚乙二醇(PEG)。适合用于在产生LNP中使用的阳离子脂质的非限制性例子包括98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1和7C1。适合用于在产生LNP中使用的中性脂质的非限制性例子包括DPSC、DPPC、POPC、DOPE和SM。适合用于在产生LNP中使用的经PEG修饰的脂质的非限制性例子包括PEG-DMG、PEG-CerC14和PEG-CeraC20。
在一些实施方案中，脂质可以以任何数量的摩尔比组合以产生LNP。在一些实施方案中，在LNP递送系统中，脂质与核酸的质量比为约100:1至约3:1、约70:1至10:1或16:1至4:1。在一些实施方案中，在LNP递送系统中，脂质与核酸的质量比为约16:1至4:1。在一些实施方案中，在LNP递送系统中，脂质与核酸的质量比为约20:1。在一些实施方案中，在LNP递送系统中，脂质与核酸的质量比为约8:1。此外，一种或多种多核苷酸可以以宽范围的摩尔比与一种或多种脂质组合以产生LNP。
在一些实施方案中，将本文所述的治疗性组合物(例如，核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物)掺入治疗性组合物中，以用于在预防或治疗患有、怀疑患有或可能有高风险患上一种或多种相关健康状况或疾病的受试者的方法中使用。示例性健康状况或疾病可以包括但不限于癌症、免疫性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、基因疗法、基因置换、心血管疾病、年龄相关性病状、罕见疾病、急性感染和慢性感染。
在一些实施方案中，核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物可用于治疗和/或预防免疫性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病，例如像肾小球肾炎、炎性肠病、肾炎、腹膜炎、银屑病关节炎、骨关节炎、斯蒂尔病、家族性地中海热、系统性硬皮病和硬化病、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、急性肺损伤、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、多发性骨髓瘤、肾小球肾炎、肾炎、哮喘、动脉粥样硬化、白细胞粘附缺陷症、多发性硬化、雷诺综合征、舍格伦综合征、幼年型糖尿病、赖特病、白塞病、免疫复合物肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经病、免疫介导的血小板减少症、溶血性贫血、重症肌无力、狼疮性肾炎、红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊柱炎、天疱疮、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、小血管炎、奥梅恩综合征(Omen's syndrome)、慢性肾衰竭、自身免疫性甲状腺疾病、急性传染性单核细胞增多症、HIV、疱疹病毒相关疾病、人类病毒感染、冠状病毒、其他肠道病毒、疱疹病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒或腺病毒感染、细菌性肺炎、创伤、脓毒症、脑卒中/脑水肿、缺血-再灌注损伤和丙型肝炎。
适用于本公开文本的方法的炎性疾病的非限制性例子包括诸如哮喘、炎性肠病(IBD)、慢性结肠炎、脾肿大和类风湿性关节炎的炎性疾病。
适用于本公开文本的方法的自身免疫性疾病的例子包括但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、斯蒂尔病、家族性地中海热、系统性硬化病、多发性硬化、强直性脊柱炎、桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性血管病变、糖尿病性神经痛、胰岛炎、银屑病、斑秃、温型和冷型自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血、急性炎性疾病、自身免疫性肾上腺炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、兰伯特-伊顿综合征、硬化性苔癣、莱姆病、格雷夫斯病、白塞病、梅尼埃病、反应性关节炎(赖特综合征)、许尔-斯特劳斯综合征、科根综合征(Cogan syndrome)、CREST综合征、寻常型天疱疮和落叶型天疱疮、大疱性类天疱疮、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、胰腺炎、腹膜炎、银屑病关节炎、风湿热、结节病、薛根森综合征(syndrome)、硬皮病、乳糜泻、僵人综合征、大动脉炎、短暂麸质不耐症、自身免疫性葡萄膜炎、白癜风、多软骨炎、疱疹样皮炎(DH)或杜林病、纤维肌痛、古德帕斯丘综合征、吉兰-巴雷综合征、桥本甲状腺炎、自身免疫性肝炎、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、重症肌无力、免疫复合物障碍、肾小球肾炎、结节性多动脉炎、抗磷脂综合征、多腺体自身免疫性综合征、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、荨麻疹、自身免疫性不孕不育症、幼年型类风湿性关节炎、结节病和自身免疫性心肌病。
在一些实施方案中，将本文所述的治疗性组合物(例如，核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物)掺入治疗性组合物中，以用于在预防或治疗患有、怀疑患有或可能有高风险患上微生物感染(例如，细菌感染、微真菌感染或病毒感染)的受试者的方法中使用。适用于本公开文本的方法的感染的非限制性例子包括诸如以下的病毒的感染：人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、乙型肝炎病毒(HCV)、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人乳头瘤病毒(HPV)、EB病毒(EBV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征(MERS)、流感病毒和埃博拉病毒。适用于本公开文本的方法的另外的感染包括诸如以下的细胞内寄生虫的感染：利什曼原虫属(Leishmania)、立克次体属(Rickettsia)、衣原体属(Chlamydia)、柯克斯体属(Coxiella)、疟原虫属(Plasmodium)、布鲁氏菌属(Brucella)、分枝杆菌、李斯特菌属(Listeria)、弓形虫属(Toxoplasma)和锥虫属(Trypanosoma)。在一些实施方案中，微生物感染是细菌感染。在一些实施方案中，微生物感染是真菌感染。在一些实施方案中，微生物感染是病毒感染。
在一些实施方案中，健康状况是如根据孤儿药法案(www.fda.gov/patients/rare-dis eases-fda)定义的罕见疾病(例如，在美国影响少于200,000人的疾病或病症)和/或炎性和/或自身免疫性障碍。在一些实施方案中，受试者患有或被怀疑患有与炎性和/或自身免疫性障碍和/或罕见疾病(例如，包括但不限于家族性地中海热或成年发作型斯蒂尔病)相关的病症。
另外的疗法
在一些实施方案中，将根据本公开文本的组合物作为单一疗法(单药疗法)单独地或作为第一疗法与至少一种另外的疗法(例如，第二疗法)组合地施用于受试者。在一些实施方案中，第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法和手术。在一些实施方案中，第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法或手术。在一些实施方案中，将第一疗法和第二疗法伴随施用。在一些实施方案中，将第一疗法与第二疗法同时施用。在一些实施方案中，将第一疗法和第二疗法依序施用。在一些实施方案中，在第二疗法之前施用第一疗法。在一些实施方案中，在第二疗法之后施用第一疗法。在一些实施方案中，在第二疗法之前和/或之后施用第一疗法。在一些实施方案中，将第一疗法和第二疗法轮流施用。在一些实施方案中，将第一疗法和第二疗法以单一配制品一起施用。
试剂盒
本文还提供了用于实践本文所述的方法的各种试剂盒。具体地，本公开文本的一些实施方案提供了用于在受试者中引发免疫应答的试剂盒。一些其他实施方案涉及用于预防有需要的受试者的健康状况的试剂盒。一些其他实施方案涉及用于治疗有需要的受试者的健康状况的方法的试剂盒。例如，在一些实施方案中，本文提供了试剂盒，所述试剂盒包含如本文提供和描述的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物中的一种或多种以及制备和使用它们的书面说明书。
在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒进一步包含一种或多种可用于向受试者施用所提供的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物中的任何一种的器件。例如，在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒进一步包含一个或多个用于向受试者施用所提供的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物中的任何一种的注射器(包括载药注射器)和/或导管(包括载药注射器)。在一些实施方案中，试剂盒可以具有一种或多种另外的治疗剂，其可以与其他试剂盒组分同时或依序施用以用于所需目的，例如用于诊断、预防或治疗有需要的受试者的病症。
上文所述的试剂盒中的任一种都可以进一步包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：稀释缓冲液、重构溶液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照表达载体、阴性对照、阳性对照、适用于体外产生本公开文本的所提供的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物的试剂。
在一些实施方案中，试剂盒的组分可以在单独的容器中。在一些其他实施方案中，试剂盒的组分可以在单个容器中组合。因此，在本公开文本的一些实施方案中，试剂盒包含在一个容器中(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)的如本文提供和描述的核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物中的一种或多种以及在另一个容器中(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)的另一治疗剂。
在另一个实施方案中，试剂盒包含以药物组合物形式并且任选地在单个共同容器中一起配制的本文所述的组合物(包含本公开文本的一种或多种核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞和/或重组多肽)与一种或多种另外的治疗剂组合的组合。
如果试剂盒包含用于向受试者肠胃外施用的药物组合物，则试剂盒可以包含用于进行这样的施用的装置(例如，注射装置或导管)。例如，试剂盒可以包含一个或多个含有本公开文本的一种或多种核酸构建体(例如，载体或srRNA分子)、重组细胞和/或重组多肽的皮下注射针或如上文所讨论的其他注射装置。
在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含使用试剂盒的组分来实践本文公开的方法的说明书。例如，试剂盒可以包含含有关于试剂盒中的药物组合物和剂型的信息的包装插页。通常，这样的信息帮助患者和医生有效且安全地使用经封装的药物组合物和剂型。例如，可以在插页中提供以下关于本公开文本的组合的信息：药代动力学、药效学、临床研究、功效参数、适应证和用法、禁忌证、警告、注意事项、不良反应、用药过量、正确的剂量和施用、供应规格、正确的储存条件、参考、制造商/经销商信息和知识产权信息。
用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基材(如纸或塑料等)上。说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，可以存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(例如，与包装或子包装相关)等。说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、软盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件存在。在一些情形下，真实的说明书不存在于试剂盒中，而是可以提供用于从远程源(例如，经由因特网)获得说明书的手段。此实施方案的例子是包含网址的试剂盒，在所述网址中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，可以将这种用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。
将本公开文本中提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同确切且单独地指示每个单独出版物或专利申请都通过引用并入一般。
不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述其著者的主张，并且申请人保留质疑所引用文件的准确性和相关性的权利。将清楚地理解，尽管在本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但此提及并不构成承认任何这些文件构成本领域公知常识的一部分。
本文给出的一般方法的讨论仅旨在用于说明目的。在审阅本公开文本后，其他替代方法和替代方案对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且将被包括在本申请的精神和范围内。
在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅通过说明的方式提供，并不旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。
实施例
除非另外指示，否则本发明的实践将采用本领域技术人员熟知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。此类技术充分解释于诸如以下的文献中：Sambrook,J.和Russell,D.W.(2012).Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第4版).Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory以及Sambrook,J.和Russel,D.W.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版).Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory(在本文中统称为“Sambrook”)；Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology.NewYork,NY:Wiley(包括至2014年的增刊)；Bollag,D.M.等人(1996).Protein Methods.NewYork,NY:Wiley-Liss；Huang,L.等人(2005).Nonviral Vectors for Gene Therapy.SanDiego:Academic Press；Kaplitt,M.G.等人(1995).Viral Vectors:Gene Therapy andNeuroscience Applications.San Diego,CA:Academic Press；Lefkovits,I.(1997).TheImmunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques.SanDiego,CA:Academic Press；Doyle,A.等人(1998).Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology.New York,NY:Wiley；Mullis,K.B.,Ferré,F.和Gibbs,R.(1994).PCR:The Polymerase Chain Reaction.Boston:Birkhauser Publisher；Greenfield,E.A.(2014).Antibodies:A Laboratory Manual(第2版).New York,NY:ColdSpring Harbor Laboratory Press；Beaucage,S.L.等人(2000).Current Protocols inNucleic Acid Chemistry.New York,NY:Wiley(包括至2014年的增刊)；以及Makrides,S.C.(2003).Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells.Amsterdam,NL:Elsevier Sciences B.V.，将其公开内容通过引用并入本文。
在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅通过说明的方式提供，并不旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。
实施例1
基础载体SINV AR86-Girdwood的设计与构建
此实施例描述了为了构建多种基础甲病毒载体(例如，没有异源基因)而进行的实验的结果，这些基础甲病毒载体随后用于表达目的基因(例如，来自流感病毒的血凝素(HA)基因)。
如下构建图2A中描述的辛德比斯AR86-Girdwood杂交体1载体。从具有独特的限制性酶切割位点(SpeI，5’-A'CTAG,T-3’)的AR-86参考序列(Genbank U38305)以四个约4kb的部分(Twist Bioscience)从头合成基础SINV AR86-Girdwood杂交体1载体，该独特的限制性酶切割位点替代SINV结构基因的编码序列(其中5’A是在结构多蛋白基因的核苷酸93之后的P2A序列之后的下一个核苷酸，并且3’T与结构多蛋白的终止密码子TGA的位置匹配)。在SINV基因组序列的上游包含噬菌体T7 RNA聚合酶启动子(5’-TAATACGACTCACTATAG-3’；SEQ ID NO:12)，并且下游含有聚A序列，然后是独特的限制性酶切位点(SapI，5’-GCTCTTC(N)1’(N)3,-3’)，然后是T7终止子序列(5’-AACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT-3’；SEQ IDNO:13)，然后是独特的限制性酶切割位点(NotI，5’-GC'GGCC,GC-3’)。将这些部分在五件式(five-piece)Gibson反应(例如，线性化的pYL骨架和四个合成的片段)中组合。在所得载体中，AR86 nsP2基因被Girdwood nsP2基因(Genbank MF459683)替代，产生最终的SINV AR86-Girdwood杂交体1基础载体(SEQ ID NO:1)。
如下构建图3A中描述的辛德比斯AR86-Girdwood杂交体2载体。从具有独特的限制性酶切割位点(SpeI，5’-A'CTAG,T-3’)的Girdwood毒株参考序列(Genbank MF459683)以四个约4kb的部分(Twist Bioscience，Thermo Fisher GeneArt)从头合成基础SINVGirdwood载体，该独特的限制性酶切割位点替代SINV结构基因的编码序列(其中5’A是在结构多蛋白基因的核苷酸93之后的P2A序列之后的下一个核苷酸，并且3’T与结构多蛋白的终止密码子TGA的位置匹配)。在SINV基因组序列的上游包含噬菌体T7 RNA聚合酶启动子(5’-TAATACGACTCACTATAG-3’；SEQ ID NO:12)，并且下游含有聚A序列，然后是独特的限制性酶切位点(SapI，5’-GCTCTTC(N)1’(N)3,-3’)，然后是T7终止子序列(5’-AACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT-3’；SEQ ID NO:13)，然后是独特的限制性酶切割位点(NotI，5’-GC'GGCC,GC-3’)。将这些部分在五件式Gibson 反应(例如，线性化的pYL骨架和四个合成的片段)中组合。在所得载体中，Girdwood nsP4基因被AR86 nsP4基因替代，产生最终的SINV AR86-Girdwood杂交体2基础载体(SEQ ID NO:2)。
如下构建图4A中描述的辛德比斯AR86-Girdwood杂交体3载体。类似于辛德比斯AR86-Girdwood杂交体2基础载体，取而代之通过用AR86 nsP3基因替代Girdwood nsP3基因来构建辛德比斯AR86-Girdwood杂交体3基础载体(SEQ ID NO:3)。
如下构建图5A中描述的辛德比斯AR86-Girdwood杂交体4载体。类似于辛德比斯AR86-Girdwood杂交体2基础载体，取而代之通过用AR86 nsP1基因替代Girdwood nsP1基因来构建辛德比斯AR86-Girdwood杂交体4基础载体(SEQ ID NO:4)。
实施例2
用于表达目的基因的经修饰的甲病毒载体的构建
图2B、图3B、图4B和图5B中的甲病毒载体分别通过SpeI核酸内切酶消化对图2A、图3A、图4A和图5A中的空基础载体进行线性化来构建。对来自流感病毒的血凝素(HA)基因(Genbank#AY651334)进行密码子重构以用于计算机模拟的人表达，并且进行合成(IDT)。使用以下引物扩增合成产物，这些引物向PCR产物上的基础载体添加30bp的侧翼同源末端。
正向引物：
(5’-GCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTG-3’；SEQ IDNO:10)。
反向引物：
(5’-GCTGGTCGGGTCATTGGGGCGTAGCGGTCAAATGCAAATTCTGCATTGTAACG-3’；SEQ IDNO:11)。
将消化产物(即，线性化的载体)和PCR产物通过双片段Gibson 反应组合，以产生各自含有置于26S亚基因组启动子控制下的H5N1 HA编码序列(对于AR86-Girdwood杂交体1-4分别为SEQ ID NO:5-8)的最终载体。
实施例3
改善有缺陷的甲病毒基因组和RNA复制子的功能性
此实施例描述了为了证明通过用来自功能性甲病毒的相应nsP序列替代有缺陷的nsP序列可以功能化有缺陷的(非功能性)RNA复制子(例如，自复制RNA)(例如，使其有功能)而进行的实验的结果。
体外转录：使用通过酶消化线性化的质粒DNA模板通过体外转录来制备自复制RNA(srRNA)。在这些例子中，将DNA用在T7终止子的下游切割的NotI线性化，或者用在聚(A)的末端切割的SapI线性化。用5’ARCA帽(HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒，NEB)或通过无帽转录(HiScribeTMT7高产量RNA合成试剂盒，NEB)，然后添加5’帽1(牛痘病毒加帽系统，mRNA帽2′-O-甲基转移酶，NEB)，使用噬菌体T7聚合酶进行体外转录。使用苯酚/氯仿提取、LiCl沉淀或柱纯化(RNA清除试剂盒，NEB)来纯化srRNA。通过在260nm处的吸光度(Nanodrop，Thermo Fisher Scientific)测定srRNA浓度。
复制：通过电穿孔将srRNA转化到BHK-21或Vero细胞中(例如，4D-NucleofectorTM，Lonza)。在转化后17-20h，将细胞固定并透化(eBioscienceTMFoxp3/转录因子染色缓冲液组，Invitrogen)，并且使用PE缀合的抗双链RNA(dsRNA)小鼠单克隆抗体(J2，Scicons)进行染色，以通过荧光流式细胞术定量dsRNA+细胞的频率和单独细胞中dsRNA的平均荧光强度(MFI)。
非功能性RNA复制子(例如，自复制RNA)在对用srRNA转染的细胞进行染色后不能展现出信号(参见用X标记的RNA复制子(例如，自复制RNA))，其中转染的功能性RNA复制子(例如，自复制RNA)产生可检测的dsRNA(参见用“√”符号标记的RNA复制子)，其指示RNA复制并且是26S RNA转录和随后的转基因表达所必需的(图6)。不受任何特定理论的束缚，据信如本文所述的功能性复制srRNA可以被认为用作诱导药动学作用的实用载体。
实施例4
经修饰的甲病毒载体的体外评价
此实施例描述了为了评价上文实施例1和2中描述的经修饰的甲病毒载体构建体的表达水平以及为了研究其任何差异性行为(例如，复制和蛋白质表达)而进行的体外实验的结果。
在这些实验中，使用以下测定评价图2B、图3B、图4B和图5B中描述的经修饰的甲病毒设计的功能性。在这些实验中，也使用以下测定评价经修饰的甲病毒srRNA载体(具有异源AR86 nsP1、或nsP2、或nsP3、或nsP4的SINV Girdwood)，其编码甲型流感病毒H5N1的血凝素前体(HA)(H5N1 HA)。
体外转录：使用通过酶消化线性化的质粒DNA模板通过体外转录来制备自复制RNA(srRNA)。在这些例子中，将DNA用在T7终止子的下游切割的NotI线性化，或者用在聚(A)的末端切割的SapI线性化。用5’ARCA帽(HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒，NEB)或通过无帽转录(HiScribeTMT7高产量RNA合成试剂盒，NEB)，然后添加5’帽1(牛痘病毒加帽系统，mRNA帽2′-O-甲基转移酶，NEB)，使用噬菌体T7聚合酶进行体外转录。使用苯酚/氯仿提取、LiCl沉淀或柱纯化(RNA清除试剂盒，NEB)来纯化srRNA。通过在260nm处的吸光度(Nanodrop，Thermo Fisher Scientific)测定RNA浓度。
复制：通过电穿孔将srRNA转化到BHK-21或Vero细胞中(例如，4D-NucleofectorTM，Lonza)。在转化后17-20h，将细胞固定并透化(eBioscienceTMFoxp3/转录因子染色缓冲液组，Invitrogen)，并且使用PE缀合的抗dsRNA小鼠单克隆抗体(J2，Scicons)进行染色，以通过荧光流式细胞术定量dsRNA+细胞的频率和单独细胞中dsRNA的平均荧光强度(MFI)。
蛋白质表达。通过电穿孔将RNA转化到BHK-21或Vero细胞中(例如，4D-NucleofectorTM，Lonza)。在转化后17-20h，将细胞固定并透化(eBioscienceTMFoxp3/转录因子染色缓冲液组，Invitrogen)，并且使用APC缀合的抗HA小鼠单克隆抗体(2B7，Abca m；APC：别藻蓝蛋白)进行染色，以通过荧光流式细胞术定量HA蛋白+细胞的频率和单独细胞中HA蛋白的平均荧光强度(MFI)(图7)。
另外的实验。在RNA电穿孔之前，将BHK-21或Vero细胞用重组IFN的滴定曲线预处理，并且使用以上测定来测量对每种载体的复制和蛋白质表达的影响。
在对srRNA转染的细胞进行染色以检测GOI表达后，非功能性srRNA载体不能展现 出信号，其中功能性srRNA载体产生可检测的GOI表达。在此实验中，通过使用APC缀合的抗HA小鼠单克隆抗体染色阳性细胞的平均荧光强度(MFI)来定量GOI表达。图7说明，展示出RNA复制的基础srRNA载体(图6)在插入GOI后也展现出表达。这些功能性GOI表达srRNA可以用作诱导药动学作用(例如，在宿主中引发免疫应答)的实用载体。
实施例5
经修饰的甲病毒载体的体内评价
此实施例描述了为了评价用上文实施例1和2中描述的经修饰的甲病毒载体构建体(例如，未配制的载体和LNP配制的载体)进行疫苗接种后的任何差异性免疫应答而进行的体内实验的结果。
在这些实验中，使用以下测定评价图2B、图3B、图4B和图5B中描述的经修饰的甲病毒设计的功能性。
小鼠和注射。雌性C57BL/6或BALB/c小鼠购自Charles River Labs或JacksonLaboratories。在给药当天，将0.1-10μg之间的材料分开肌内注射到两个股四头肌中。以在盐水中未配制的形式或LNP配制的形式施用载体。在整个研究过程中，对动物进行体重监测和其他综合观察。对于免疫原性研究，在第0天和第21天向动物给药。在第35天收集脾脏，并且在第0天、第14天和第35天分离血清。对于蛋白质表达研究，在第0天向动物给药，并且在第1天、第3天和第7天评估生物发光。在指定的时间点使用IVIS系统进行萤光素酶活性的体内成像。
LNP配制品。将复制子RNA(例如，自复制RNA)使用微流体混合器配制在脂质纳米颗粒中，并且分析粒度、多分散性(使用动态光散射)和包封率。用于配制LNP颗粒的脂质的摩尔比为30％ C12-200、46.5％胆固醇、2.5％ PEG-2K和16％ DOPE。
ELISpot。为了测量流感病毒特异性T细胞应答的强度，根据制造商的说明，使用小鼠IFNγELISpot PLUS试剂盒(HRP)(MabTech)进行IFNγELISpot分析。简言之，分离脾细胞，并且将其在含有代表针对HA的CD4+或CD8+T细胞表位的肽、作为阳性对照的PMA/离子霉素、或作为模拟刺激的DMSO的培养基中重悬至5x 106个细胞/mL的浓度。
细胞内细胞因子染色。根据针对ELISpot概述的方法分离脾脏，并且将1x 106个细胞以每孔200μL的总体积添加到含有细胞的培养基中。每个孔含有代表针对HA的CD4+或CD8+T细胞表位的肽、作为阳性对照的PMA/离子霉素、或作为模拟刺激的DMSO。1小时后，将GolgiPlugTM蛋白质转运抑制剂(BD Biosciences)添加到每个孔中。将细胞再孵育5小时。孵育后，使用标准方法将细胞针对CD8+(53-6.7)、CD4+(GK1.5)、B220(B238128)、Gr-1(RB6-8C5)、CD16/32(M93)进行表面染色。表面染色后，将细胞固定并且按照标准方法对细胞内蛋白针对IFNγ(RPA-T8)、IL-2(JES6-5H4)和TNF(MP6-XT22)进行染色。然后随后在流式细胞仪上分析细胞，并且使用FlowJo软件10.4.1版分析获取的FCS文件。
抗体。根据制造商的说明，使用来自Alpha Diagnostic International的ELISA试剂盒测量用于测量总HA特异性IgG的抗体应答。
实施例6
具有异源非结构蛋白基因的经修饰的srRNA载体的体外评价
此实施例描述了为了评价具有异源非结构蛋白的合成自复制RNA(srRNA)的表达水平以及为了研究其任何差异性行为(例如，复制和蛋白质表达)而进行的体外实验的结果。
在这些实验中，设计并随后评价了源自SINV毒株Girdwood和AR86的合成srRNA，包括具有不相关转基因的对照VEEV srRNA(RBI296、RBI298)、两种构型的编码IL-1RA和IL-12两者的VEEV srRNA(RBI299、RBI300)、两种构型的编码IL-1RA和IL-12两者的SINV AR86-Girdwood杂交体1srRNA(RBI307、RBI308)、以及两种构型的编码IL-1RA和IL-12两者的SINVGirdwood srRNA(RBI309、RBI310)。
体外转录：通过无帽转录(HiScribeTMT7高产量RNA合成试剂盒，NEB)，然后添加5’帽1(牛痘病毒加帽系统，mRNA帽2′-O-甲基转移酶，NEB)，用噬菌体T7聚合酶通过从SapI线性化的质粒模板体外转录来制备srRNA。然后通过LiCl沉淀纯化srRNA。通过在260nm处的吸光度(Nanodrop，Thermo Fisher Scientific)测定srRNA浓度。
蛋白质表达：通过电穿孔将srRNA转化到BHK-21细胞中(4D-NucleofectorTM，Lonza)。在转化后24和48小时，从细胞中收集条件培养基。通过将HEK-BlueTMIL-1R细胞(InvivoGen)与一系列浓度的重组IL-1RA(Peprotech)或条件培养基一起预孵育在生物活性测定中评价分泌的IL-1RA。将重组IL-1B(Invivogen)添加到细胞中并且孵育过夜，然后使用QUANTI-BlueTM(Invivogen)定量SEAP报告物(图8A)。
通过在DMEM中将一系列浓度的重组IL-12(Peprotech)或条件培养基在IL-12生物测定细胞(Promega)上孵育过夜在生物活性测定中评价分泌的IL-12，然后使用Bio-GloTM萤光素酶(Promega)定量萤光素酶报告物(图8B)。
实施例8
具有异源非结构蛋白基因的经修饰的srRNA载体的体内评价
此实施例描述了为了评价用具有异源非结构蛋白的自复制RNA(srRNA)(作为未配制的载体和LNP配制的载体)进行疫苗接种后的任何差异性免疫应答而进行的体内实验的结果。
在这些实验中，设计并随后评价了源自SINV Girdwood-AR86杂交体1的合成srRNA构建体。
小鼠和注射。雌性C57BL/6或BALB/c小鼠购自Charles River Labs或JacksonLaboratories。在给药当天，将0.1-10μg之间的材料分开肌内注射到两个股四头肌中。以在盐水中未配制的形式或LNP配制的形式施用载体。在整个研究过程中，对动物进行体重监测和其他综合观察。对于免疫原性研究，在第0天和第21天向动物给药。在第14天和/或第35天收集脾脏，并且在第14天和/或第35天分离血清。
LNP配制品。对于一些研究，将srRNA使用微流体混合器配制在脂质纳米颗粒(LNP)中，并且分析粒度、多分散性(使用动态光散射)和包封率。LNP由可电离脂质、胆固醇、PEG-2K和DOPE构成。
ELISpot。为了测量抗原特异性T细胞应答的强度，根据制造商的说明，使用小鼠IFNγELISpot PLUS试剂盒(HRP)(MabTech)进行IFNγELISpot分析。简言之，分离脾细胞，并且将其在含有代表与狂犬病病毒糖蛋白G、ESR1、HER2或HER3相对应的肽池的肽，作为阳性对照的PMA/离子霉素，或作为模拟刺激的DMSO的培养基中重悬至2-5×106个细胞/mL的浓度。
抗体。使用快速荧光灶抑制试验测量对狂犬病病毒的中和抗体应答。简言之，将血清稀释液与标准量的活狂犬病病毒混合并且孵育。如果存在中和抗狂犬病病毒抗体，它们将中和病毒。接着，添加培养的细胞，并且将血清/病毒/细胞一起孵育。未包被的狂犬病病毒(即，未被抗体中和的狂犬病病毒)将感染细胞，并且这可以通过显微术可视化。由在载玻片上观察到的病毒感染的细胞的百分比进行终点滴度的计算。
两次免疫接种后通过评价抗原特异性脾T细胞应答(通过ELISpot)(图9A)和来自血清的抗狂犬病病毒中和抗体滴度(图9B)来评估编码病毒抗原(狂犬病病毒糖蛋白G)的srRNA的体内免疫原性。与盐水对照相比，所有srRNA免疫组都显示出稳健的T细胞应答(图9A)，但是在srRNA疫苗之间观察到差异性应答。类似地，所有srRNA免疫组都显示出保护性中和抗体滴度，其中在srRNA疫苗之间有一些变化(图9B)。除了感染性疾病抗原之外，还评估了基于srRNA的疫苗对癌症抗原的免疫原性(图10)。每种srRNA疫苗共编码来自ESR1、HER2和HER3的序列。使用ELISpot分析在已经接受两次免疫接种的小鼠中测定对这三种抗原的脾T细胞应答。观察到对所有三种靶标的稳健的T细胞应答，而应答模式在srRNA载体之间有所不同(图10)。
虽然已经公开了本公开文本的特定替代方案，但应理解，各种修改和组合都是可能的并且被考虑在所附权利要求的真实精神和范围内。因此，无意限制于本文呈现的确切摘要和公开文本。

Claims (74)

1.一种编码甲病毒种的经修饰的基因组或RNA复制子的核酸构建体，其中所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的至少一种非结构蛋白(nsP)或其部分相对于所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的剩余部分是异源的。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述至少一种异源nsP或其部分是nsP1、nsP2、nsP3、nsP4或其任一种的一部分，或任何前述的组合。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的核酸构建体，其中所述至少一种异源nsP或其部分源自同一甲病毒种的另一种毒株。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的核酸构建体，其中所述至少一种异源nsP或其部分源自另一种甲病毒种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸构建体，其中所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的至少一部分。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸构建体，其中所述经修饰的病毒基因组或RNA复制子缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的很大一部分。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸构建体，其中所述经修饰的病毒基因组或RNA复制子不包含编码病毒结构蛋白的核酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的核酸构建体，所述核酸构建体进一步包含一个或多个表达盒，其中所述表达盒中的每一个都包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子。
9.根据权利要求8所述的核酸构建体，其中所述表达盒中的至少一个包含可操作地连接至异源核酸序列的亚基因组(sg)启动子。
10.根据权利要求9所述的核酸构建体，其中所述sg启动子是26S亚基因组启动子。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸构建体，所述核酸构建体进一步包含一个或多个非翻译区(UTR)。
12.根据权利要求11所述的核酸构建体，其中所述UTR中的至少一个是异源UTR。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的核酸构建体，其中表达盒中的至少一个包含目的基因(GOI)的编码序列。
14.根据权利要求13所述的核酸构建体，其中所述GOI编码选自以下的多肽：治疗性多肽、预防性多肽、诊断性多肽、营养保健性多肽、工业酶和报告多肽。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的核酸构建体，其中所述GOI编码选自以下的多肽：抗体、抗原、免疫调节剂、酶、信号传导蛋白和细胞因子。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的核酸构建体，其中所述GOI的编码序列被优化以用于以高于参考编码序列的表达水平的水平表达。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的核酸构建体，其中所述GOI的编码序列被优化以用于增强RNA稳定性。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的核酸构建体，其中所述甲病毒种选自奥拉病毒(AURAV)、巴班肯病毒(BABV)、巴马森林病毒(BFV)、比巴鲁病毒(BEBV)、博吉河病毒、卡因瓜病毒、卡巴斯欧病毒、基孔肯亚病毒(CHIKV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、埃拉特病毒、沼泽地病毒(EVEV)、摩根堡病毒(FMV)、盖塔病毒(GETV)、高地J病毒(HJV)、克孜拉加奇病毒(KYZV)、马达里亚加病毒(MADV)、马雅罗病毒(MAYV)、米德尔堡病毒(MIDV)、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎布病毒(MUCV)、恩杜姆病毒(NDUV)、阿尼昂尼昂病毒(ONNV)、皮春纳病毒(PIXV)、里奥内格罗病毒(RNV)、罗斯河病毒(RRV)、鲑鱼胰腺病病毒(SPDV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、辛德比斯病毒(SINV)、嗜睡症病毒(SDV)、南方象海豹病毒(SESV)、大森林病毒(TFV)、图那特病毒、特罗卡拉病毒、乌纳病毒(UNAV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和瓦塔罗阿病毒(WHAV)。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的核酸构建体，其中所述经修饰的基因组或RNA复制子属于辛德比斯病毒(SINV)。
20.根据权利要求19所述的核酸构建体，其中所述经修饰的基因组或RNA复制子属于SINV毒株Girdwood。
21.根据权利要求20所述的核酸构建体，其中所述经修饰的基因组或RNA复制子的至少一种异源nsP或其部分源自SINV毒株AR86。
22.根据权利要求20-21中任一项所述的核酸构建体，其中所述至少一种异源nsP或其部分是nsP1、nsP3、nsP4或其任一种的一部分，或任何前述的组合。
23.根据权利要求19所述的核酸构建体，其中所述经修饰的基因组或RNA复制子属于SINV毒株AR86。
24.根据权利要求23所述的核酸构建体，其中所述经修饰的SINV-AR86基因组或RNA复制子的至少一种异源nsP或其部分源自SINV毒株Girdwood。
25.根据权利要求23-24中任一项所述的核酸构建体，其中所述经修饰的SINV-AR86基因组或RNA复制子的至少一种异源nsP或其部分源自SINV毒株Girdwood的nsP2。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的核酸构建体，其中将所述核酸构建体掺入载体中。
27.根据权利要求26所述的核酸构建体，其中所述载体是自复制RNA(srRNA)载体。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含与选自SEQ ID NO:1-4的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸序列。
29.一种重组细胞，所述重组细胞包含根据权利要求1-28中任一项所述的核酸构建体。
30.根据权利要求29所述的重组细胞，其中所述重组细胞是真核细胞。
31.根据权利要求30所述的重组细胞，其中所述重组细胞是动物细胞。
32.根据权利要求31所述的重组细胞，其中所述动物细胞是脊椎动物细胞或无脊椎动物细胞。
33.根据权利要求31所述的重组细胞，其中所述动物细胞是昆虫细胞。
34.根据权利要求33所述的重组细胞，其中所述昆虫细胞是蚊细胞。
35.根据权利要求32所述的重组细胞，其中所述重组细胞是哺乳动物细胞。
36.根据权利要求32所述的重组细胞，其中所述重组细胞选自由SV40转化的猴肾CV1细胞(COS-7)、人胚肾细胞(例如，HEK 293或HEK 293细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠支持细胞(例如，TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、人宫颈癌细胞(HeLa)、犬肾细胞(MDCK)、水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞、FS4细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、人A549细胞、人宫颈细胞、人CHME5细胞、人PER.C6细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、人表皮样喉细胞、人成纤维细胞、人HUH-7细胞、人MRC-5细胞、人肌肉细胞、人内皮细胞、人星形胶质细胞、人巨噬细胞、人RAW264.7细胞、小鼠3T3细胞、小鼠L929细胞、小鼠结缔组织细胞、小鼠肌肉细胞和兔肾细胞。
37.一种细胞培养物，所述细胞培养物包含至少一种根据权利要求29-36中任一项所述的重组细胞和培养基。
38.一种用于功能化/工程化甲病毒基因组或RNA复制子的方法，所述方法包括：
(a)提供非功能性甲病毒基因组或RNA复制子；
(b)将所述非功能性甲病毒基因组或RNA复制子的非结构蛋白(nsP)或其部分用源自不同甲病毒毒株的相应nsP或其部分的异源编码序列替代，以产生经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子；
(c)评估所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的功能性；
(d)如果所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子能够进行RNA复制和/或表达，则将所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子鉴定为功能性的。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述异源nsP或其部分源自同一甲病毒种的另一种毒株。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述异源nsP或其部分源自另一种甲病毒种。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述异源nsP或其部分是nsP1、nsP2、nsP3、nsP4或其任一种的一部分。
42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述甲病毒基因组或RNA复制子的非功能性通过在宿主细胞内自复制的缺乏来确定。
43.根据权利要求38-42中任一项所述的方法，所述评估所述经修饰的甲病毒基因组或RNA复制子的功能性包括选自以下的测定：RNA复制的检测、病毒蛋白表达的检测、致细胞病变效应(CPE)的检测和异源转基因表达的检测。
44.一种转基因动物，所述转基因动物包含根据权利要求1-28中任一项所述的核酸构建体。
45.根据权利要求44所述的转基因动物，其中所述动物是脊椎动物或无脊椎动物。
46.根据权利要求45所述的转基因动物，其中所述动物是昆虫。
47.根据权利要求45所述的转基因动物，其中所述动物是哺乳动物。
48.根据权利要求46所述的转基因动物，其中所述哺乳动物是非人哺乳动物。
49.一种用于产生目的多肽的方法，所述方法包括(i)在一定条件下饲养根据权利要求44-48中任一项所述的转基因动物，或(ii)在一定条件下培养包含根据权利要求1-28中任一项所述的核酸构建体的重组细胞，在所述条件下所述重组细胞产生由所述GOI编码的多肽。
50.一种用于在受试者中产生目的多肽的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-28中任一项所述的核酸构建体。
51.根据权利要求49-50中任一项所述的方法，其中所述受试者是脊椎动物或无脊椎动物。
52.根据权利要求49-51所述的方法，其中所述动物是昆虫。
53.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。
55.一种通过根据权利要求49-54中任一项所述的方法产生的重组多肽。
56.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和：
(a)根据权利要求1-28中任一项所述的核酸构建体；
(b)根据权利要求29-36中任一项所述的重组细胞；和/或
(c)根据权利要求55所述的重组多肽。
57.根据权利要求56所述的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-28中任一项所述的核酸构建体和药学上可接受的赋形剂。
58.根据权利要求56所述的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求29-36中任一项所述的重组细胞和药学上可接受的赋形剂。
59.根据权利要求56所述的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求55所述的重组多肽和药学上可接受的赋形剂。
60.根据权利要求56-59中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制在脂质体、基于脂质的纳米颗粒(LNP)或聚合物纳米颗粒中。
61.根据权利要求56-60中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是免疫原性组合物。
62.根据权利要求61所述的药物组合物，其中所述免疫原性组合物被配制为疫苗。
63.根据权利要求56-60中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物对于受试者是基本上非免疫原性的。
64.根据权利要求56-63中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为佐剂。
65.根据权利要求56-64中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于鼻内施用、透皮施用、腹膜内施用、肌内施用、结内施用、瘤内施用、关节内施用、静脉内施用、皮下施用、阴道内施用和口服施用中的一种或多种。
66.一种用于在有需要的受试者中诱导药效学作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下的组合物：
(a)根据权利要求1-28中任一项所述的核酸构建体；
(b)根据权利要求29-36中任一项所述的重组细胞；
(c)根据权利要求55所述的重组多肽；和/或
(d)根据权利要求56-65中任一项所述的药物组合物。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述药效学作用包括在所述受试者中引发免疫应答。
68.一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的健康状况的方法，所述方法包括向所述受试者预防性地或治疗性地施用包含以下的组合物：
(a)根据权利要求1-28中任一项所述的核酸构建体；
(b)根据权利要求29-36中任一项所述的重组细胞；
(c)根据权利要求55所述的重组多肽；和/或
(d)根据权利要求56-64中任一项所述的药物组合物。
69.根据权利要求66-67中任一项所述的方法，其中所述病症是增殖性障碍或微生物感染。
70.根据权利要求66-69中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或被怀疑患有与增殖性障碍或微生物感染相关的病症。
71.根据权利要求66-70中任一项所述的方法，其中所施用的组合物导致所述受试者中干扰素的产生增加。
72.根据权利要求66-71中任一项所述的方法，其中将所述组合物作为单一疗法(单药疗法)单独地或作为第一疗法与至少一种另外的疗法组合地施用于所述受试者。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述至少一种另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法和手术。
74.一种用于诱导药效学作用、用于引发免疫应答、用于预防和/或用于治疗健康状况或微生物感染的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)根据权利要求1-28中任一项所述的核酸构建体；
(b)根据权利要求29-36中任一项所述的重组细胞；
(c)根据权利要求55所述的重组多肽；和/或
(d)根据权利要求56-65中任一项所述的药物组合物。
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