KR20230172527A - 범용 클로닝 어댑터를 함유하는 알파바이러스 벡터 - Google Patents

범용 클로닝 어댑터를 함유하는 알파바이러스 벡터 Download PDF

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KR20230172527A
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나다니엘 스티븐 왕
시게키 조셉 미야케-스토너
애니 치아-종 슈
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레플리케이트 바이오사이언스, 인크.
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Abstract

본 발명의 개시는 변형된 바이러스 유전체 또는 레플리콘(예를 들어, 자가 복제 RNA)을 포함하는 핵산 분자, 이를 함유하는 약학적 조성물, 및 세포 배양물 또는 생체 내에서 원하는 생성물의 생산을 위한 이러한 핵산 분자 및 조성물의 용도를 포함하는 분자 바이러스학 분야에 관한 것이다. 또한, 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법뿐만 아니라 다양한 건강 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법이 제공된다.

Description

범용 클로닝 어댑터를 함유하는 알파바이러스 벡터
관련 출원에 대한 상호 참조
[0001] 본 출원은 2021년 4월 21일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 63/177,656호에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 상기 언급된 출원의 개시는 임의의 도면을 포함하여 그 전체가 참조로서 본원에 명백하게 포함된다.
분야
[0002] 본 발명의 개시는 분자 바이러스학 및 면역학 분야에 관한 것으로, 특히 변형된 바이러스 유전체 및 레플리콘(예를 들어, 자가-복제 RNA)을 인코딩하는 핵산 분자, 이를 함유하는 약학적 조성물, 및 세포 배양물 또는 생체에서 요망되는 생성물의 생산을 위한 이러한 핵산 분자 및 조성물의 용도에 관한 것이다. 또한, 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법, 뿐만 아니라 다양한 건강 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법이 제공된다.
서열 목록의 포함
[0003] 첨부된 서열 목록의 자료는 본 출원에 참조로서 포함된다. 058462-503001WO_Sequence_Listing.txt로 명명된 첨부된 서열 목록 텍스트 파일은 2022년 4월 12일에 생성되었으며, 227 KB이다.
[0004] 최근 몇 년 동안, 여러 상이한 그룹의 동물 바이러스가 상동성 재조합에 의해 또는 이들의 유전체의 직접 조작에 의해 유전자 조작을 겪었다. DNA 및 RNA 바이러스 둘 모두에 대한 역 유전학 시스템의 이용가능성은, 예를 들어, 백신, 발현 벡터, 항종양제, 유전자 요법 벡터, 및 약물 전달 비히클과 같은 재조합 바이러스의 사용에 대한 새로운 관점을 창출하였다.
[0005] 예를 들어, 많은 바이러스-기반 발현 벡터가 배양된 재조합 세포에서 이종성 단백질의 발현을 위해 배포되었다. 예를 들어, 숙주 세포에서 유전자 발현을 위한 변형된 바이러스 벡터의 적용은 계속 확대되고 있다. 이와 관련하여 최근의 발전은 다중-서브유닛 단백질 복합체의 생산을 위한 기술 및 시스템의 추가 개발, 및 이종성 단백질 생산을 개선하기 위한 단백질-변형 효소의 공동-발현을 포함한다. 바이러스 발현 벡터 기술과 관련된 다른 최근의 진전은 유전자 발현을 제어하기 위한 많은 진보된 유전체 공학 적용, 바이러스 벡터의 제조, 생체내 유전자 요법 적용, 및 백신 전달 벡터의 생성을 포함한다.
[0006] 그러나, RNA 레플리콘-기반 발현 플랫폼에서 관심 생성물을 발현시키기 위한 보다 효율적인 방법 및 시스템이 여전히 필요하다.
[0007] 본 발명의 개시는 일반적으로 증식성 장애 및 미생물 감염과 같은 다양한 건강 질환의 예방 및 관리에 사용하기 위한 면역-치료제, 예를 들어, 재조합 핵산 작제물 및 이를 포함하는 약학적 조성물의 개발에 관한 것이다. 특히, 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 알파바이러스의 변형된 유전체 또는 레플리콘을 인코딩하는 서열을 함유하는 핵산 작제물을 제공하며, 여기서 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 상당 부분은 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 인코딩하는 서열로의 이종성 서열의 삽입을 용이하게 하도록 구성된 합성 어댑터 분자에 의해 대체된다. 또한, 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 인코딩하는 서열을 함유하는 핵산 작제물이 개시되며, 여기서 아데닐레이트 잔기만 함유하는 레플리콘 RNA의 3' 말단을 생성하는 DNA 주형을 생성하기 위해 폴리(A) 서열 뒤에 삽입된 제한 효소 부위가 존재한다. 임의의 특정 이론에 구속됨이 없이, 아데닐레이트 잔기만을 함유하는 알파바이러스 레플리콘 RNA는 레플리콘 RNA의 생물학적 활성을 향상시키는 것으로 여겨진다. 또한, 본원에 개시된 핵산 작제물 중 하나 이상을 포함하도록 조작된 재조합 세포 및 트랜스제닉 동물, 관심 분자를 생산하는 방법, 뿐만 아니라 약학적 조성물이 개시된다. 본 발명의 개시의 특정 양태에서 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하기 위한, 및/또는 증식성 장애(예를 들어, 암) 및 만성 감염을 포함하는 다양한 건강 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물 및 방법이 추가로 제공된다.
[0008] 본 발명의 개시의 일 양태에서, 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 포함하는 핵산 작제물이 본원에 제공되고, 여기서 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 상당 부분은 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA로의 이종성 서열의 삽입을 용이하게 하도록 구성된 합성 어댑터 분자에 의해 대체되고, 상기 합성 어댑터 분자는 하기 화학식 I을 갖는다:
[5' 플랭킹 도메인]- [제한 부위]n -[3' 플랭킹 도메인] 화학식 I
[0009] 상기 식에서, a) n은 1 내지 6의 정수이고;
[0010] b) 제한 부위는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단 가능하고;
[0011] c) 5' 플랭킹 도메인 및 3' 플랭킹 도메인은 각각 최소 이차 구조를 갖는 것으로 예측되는 핵산 서열을 포함한다.
[0012] 본 발명의 개시의 핵산 작제물의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 서열을 인코딩하는 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인의 서열은 미리 정의된 임계값보다 높은 최소 자유 에너지(MFE) 구조의 폴딩 ΔG 값을 갖는다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 자가단백질분해 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가단백질분해 펩티드에 대한 코딩 서열은 제한 부위(들)의 상류에 혼입된다. 일부 구현예에서, 자가단백질분해 펩티드는 칼슘-의존성 세린 엔도프로테아제(푸린), 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A), 구제역 바이러스(FMDV) 2A(F2A), 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A(E2A), 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 2A(T2A), 세포질 다면체증 바이러스 2A (BmCPV2A), 플래쉐리(Flacherie) 바이러스 2A (BmIFV2A), 또는 이들의 조합으로부터 유래된 하나 이상의 자가단백질분해 절단 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가단백질분해 펩티드에 대한 코딩 서열은 제한 부위(들)의 상류에 혼입된다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함한다.
[0013] 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 임의의 리딩 프레임에 번역 시작 부위를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 5' 어댑터 서열의 마지막 뉴클레오티드로서 번역 시작 부위 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 5' 어댑터 서열의 마지막 3개의 뉴클레오티드로서 메티오닌 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 약 15개 뉴클레오티드 내지 약 35개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 약 30개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 SEQ ID NO: 1의 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0014] 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인의 서열은 미리 정의된 임계값보다 높은 최소 자유 에너지(MFE) 구조의 폴딩 ΔG 값을 갖는다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 서열을 인코딩하는 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 3' 어댑터 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드로서 번역 정지 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, 정지 코돈은 TAG, TAA, 또는 TGA로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0015] 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자의 5' 플랭킹 도메인은 바로 상류에(예를 들어, sgRNA 5' UTR에) 위치한 서열 또는 바로 하류에(예를 들어, GOI의 코딩 서열 내에) 위치한 서열과 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 서열을 인코딩하지 않는다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 바로 상류에(예를 들어, GOI의 코딩 서열 내에) 위치한 서열 또는 바로 하류에(예를 들어, 3' UTR에) 위치한 서열과 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 서열을 인코딩하지 않는다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인 및/또는 3' 플랭킹 도메인은 3' UTR 내에 위치한 서열과 상보성을 갖는 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인 및/또는 3' 플랭킹 도메인은 3' UTR의 3' 말단과 상보성을 갖는 서열을 포함하지 않는다.
[0016] 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자는 SEQ ID NO: 20과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0017] 일부 구현예에서, 제한 부위는 유형 I 제한 효소, 유형 II 제한 효소, 유형 III 제한 효소, 유형 IV 제한 효소, 및 유형 V 제한 효소로부터 선택된 제한 효소에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 제한 부위는 유형 II 제한 효소에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 제한 부위는 SpeI 또는 이의 이소스키조머(isoschizomer)에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, SpeI의 이소스키조머는 AhII, BcuI, 또는 SpeI-HF이다.
[0018] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열에 혼입된 추가 제한 부위를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 제한 부위는 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열의 말단에 혼입된다. 일부 구현예에서, 추가 제한 부위는 유형 IIS 제한 효소 또는 귀소 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 유형 IIS 제한 효소는 AcuI, AlwI, Alw26I, BaeI, BbiI, BbsI, BbsI-HF, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BsaI-HF, BsaI-HFv2, BsaXI, BseGI, BseRI, BsgI, BsmAI, BsmBI-v2, BsmFI, BsmI, BspCNI, BspMI, BspQI, BsrDI, BsrI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsIMutI, CspCI, EarI, EciI, Eco31I, Esp3I, FauI, FokI, HgaI, HphI, HpyAV, LpuI, MboII, MlyI, MmeI, MnlI, NmeAIII, PaqCI, PleI, SapI, 또는 SfaNI이다. 일부 구현예에서, 추가 제한 부위는 SapI 또는 이의 이소스키조머에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, SapI의 이소스키조머는 LguI, PciSI, 또는 BspQI이다. 일부 구현예에서, 추가 제한 부위는 귀소 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 귀소 엔도뉴클레아제는 I-CeuI, I-SceI, PI-PspI, PI-SceI이다.
[0019] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 효율적인 마이너스 가닥 합성에 충분한 것으로 이전에 고려된 11개 잔기보다 긴 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 연장된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 연장된 폴리(A) 꼬리는 34개 잔기보다 길고, 이는 25개 잔기의 폴리(A) 꼬리와 비교하여 복제를 추가로 향상시키는 것으로 이전에 관찰되지 않았다. 일부 구현예에서, 연장된 폴리(A) 꼬리는 약 30 내지 약 120개의 아데닐레이트 잔기 범위의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 연장된 폴리(A) 꼬리는 약 120개의 아데닐레이트 잔기의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 연장된 폴리(A) 꼬리는 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 및 약 100개의 아데닐레이트 잔기의 길이를 갖는다.
[0020] 일부 구현예에서, 변형된 유전체 또는 레플리콘 RNA는 토가바이러스과 과의 알파바이러스 속에 속하는 바이러스의 것이다. 일부 구현예에서, 변형된 유전체 또는 레플리콘 RNA는 VEEV/EEEV 그룹, 또는 SFV 그룹, 또는 SINV 그룹에 속하는 알파바이러스의 것이다. 일부 구현예에서, 알파바이러스는 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 에버글레이즈 바이러스(EVEV), 무캄보 바이러스(MUCV), 픽수나 바이러스(PIXV), 미들버그 바이러스(MIDV), 치쿤구니야 바이러스(CHIKV), 오녕-뇽 바이러스(O'Nyong-Nyong virus; ONNV), 로스 리버 바이러스(RRV), 바르마 포레스트 바이러스(BF), 게타 바이러스(GET), 사기야마 바이러스(SAGV), 베바루 바이러스(BEBV), 마야로 바이러스(MAYV), 우나 바이러스(UNAV), 신드비스 바이러스(SINV), 아우라 바이러스(AURAV), 와타로아 바이러스(WHAV), 바반키 바이러스(BABV), 키질라가흐 바이러스(KYZV), 서부 말 뇌염 바이러스(WEEV), 하이랜드 J 바이러스(HJV), 포트 모르간 바이러스(FMV), 은두무(NDUV), 또는 버기 크릭 바이러스이다. 일부 구현예에서, 알파바이러스는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV), 치쿤구니야 바이러스(CHIKV), 또는 신드비스 바이러스(SINV)이다.
[0021] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 하나 이상의 발현 카세트를 추가로 포함하고, 여기서 각각의 발현 카세트는 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트 중 적어도 하나는 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 하위유전체(subgenomic)(sg) 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, sg 프로모터는 26S 하위유전체 프로모터이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 하나 이상의 비번역 영역(UTR)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, UTR 중 적어도 하나는 이종성 UTR이다.
[0022] 일부 구현예에서, 발현 카세트 중 적어도 하나는 관심 유전자(GOI)에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, GOI 코딩 서열은 합성 어댑터 분자의 3' 플랭킹 도메인의 상류에 위치한 정지 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, GOI는 치료용 폴리펩티드, 예방용 폴리펩티드, 진단용 폴리펩티드, 기능식품용 폴리펩티드, 산업용 효소, 및 리포터 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, GOI는 항체, 항원, 면역 조절제, 효소, 신호전달 단백질, 및 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 참조 코딩 서열의 발현 수준보다 높은 수준에서의 발현을 위해 최적화된다. 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 인코딩하는 핵산 작제물을 선형화하는데 사용되는 제한 효소 부위(들)를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 벡터 내에 혼입된다. 일부 구현예에서, 벡터는 자가-복제 RNA(srRNA) 벡터이다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3-27로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
[0023] 일 양태에서, 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 재조합 세포가 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 본원에 설명된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 본원에 제공된다. 본 발명의 개시의 재조합 세포의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 척추동물 세포 또는 무척추 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(Vero 세포), 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 인간 A549 세포, 인간 자궁경부 세포, 인간 CHME5 세포, 인간 표피 후두 세포, 인간 섬유모세포, 인간 HEK-293 세포, 인간 HeLa 세포, 인간 HepG2 세포, 인간 HUH-7 세포, 인간 MRC-5 세포, 인간 근육 세포, 마우스 3T3 세포, 마우스 결합 조직 세포, 마우스 근육 세포, 및 토끼 신장 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0024] 또 다른 양태에서, 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 트랜스제닉 동물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 척추동물 또는 무척추동물이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 포유동물이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 포유동물은 비-인간 포유동물이다.
[0025] 또 다른 양태에서, 재조합 RNA 분자를 생산하기 위한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 (i) 본원에 설명된 바와 같은 트랜스제닉 동물을 사육하는 단계, 또는 (ii) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 세포를 재조합 RNA 분자가 트랜스제닉 동물에 의해 또는 재조합 세포에서 생산되도록 하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물 또는 재조합 세포는 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하며, 여기서 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 서열은 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열의 말단 뒤에 조작된 제한 부위를 절단할 수 있는 제한 효소에 의해 선택적으로 절단되어 폴리(A) 꼬리 및 3' 말단에 아데닐레이트 잔기만을 갖는 RNA를 인코딩하는 주형을 생성한다. 따라서, 본원에 설명된 방법에 따라 생산된 재조합 RNA 분자가 또한 본 발명의 개시에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 재조합 RNA 분자는 향상된 생물학적 활성을 나타낸다.
[0026] 또 다른 양태에서, 관심 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (i) 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 트랜스제닉 동물을 사육하는 단계, 또는 (ii) 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 재조합 세포를 GOI에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 트랜스제닉 동물에 의해 또는 재조합 세포에서 생산되는 조건 하에 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 관심 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에 설명된 핵산 작제물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 개시의 방법의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 척추동물 또는 무척추동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물 대상체이다. 일부 구현예에서, 포유동물 대상체는 인간 대상체이다. 따라서, 본원에 설명된 방법에 따라 생산된 재조합 폴리펩티드가 또한 본 발명의 개시에 의해 제공된다.
[0027] 일 양태에서, 약학적으로 허용되는 부형제 및 (a) 본원에 설명된 핵산 작제물; (b) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 RNA 분자; (c) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 세포; 및 (d) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
[0028] 본 발명의 개시의 약학적 조성물의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 설명된 바와 같은 재조합 세포, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 설명된 바와 같은 재조합 RNA 분자, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 설명된 바와 같은 재조합 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 리포솜, 지질-기반 나노입자(LNP), 또는 중합체 나노입자로 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 면역원성 조성물이다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 백신으로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 생물치료제, 예를 들어, 생물활성을 갖는 상이한 분자의 유전자 전달을 위한 비히클로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 대상체에 대해 실질적으로 비-면역원성이다. 일부 구현예에서, 비-면역원성 조성물은 백신으로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 비-면역원성 조성물은 생물치료제로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 애쥬번트로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 비강내 투여, 경피 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 결절내 투여, 종양내 투여, 관절내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 질내, 및 경구 투여 중 하나 이상을 위해 제형화된다.
[0029] 또 다른 양태에서, 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물; (b) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 RNA 분자; (c) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 세포; (d) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 폴리펩티드; 및 (e) 본원에 설명된 바와 같은 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
[0030] 또 다른 양태에서, 건강 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 건강 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물; (b) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 RNA 분자; (c) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 세포; (d) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 폴리펩티드; 및 (e) 본원에 설명된 바와 같은 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여하는 단계를 포함한다.
[0031] 본 발명의 개시에 따른 건강 질환을 예방, 및/또는 개선, 및/또는 치료하는 방법의 구현예의 구현은 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 건강 질환은 증식성 장애, 염증성 장애, 자가면역 장애, 또는 미생물 감염이다. 일부 구현예에서, 대상체는 증식성 장애, 염증성 장애, 자가면역 장애, 또는 미생물 감염과 관련된 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 대상체는 희귀 질병과 관련된 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 조성물은 단일 요법(단일요법)으로서 또는 적어도 하나의 추가 요법과 조합된 제1 요법으로서 대상체에게 개별적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가 요법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 표적화 요법, 및 수술로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0032] 또 다른 양태에서, 건강 질환 또는 미생물 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 면역 반응을 조절하기 위한 키트가 본원에 제공되며, 상기 키트는 (a) 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물; (b) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 RNA 분자; (c) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 세포; (d) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 폴리펩티드; 및 (e) 본원에 설명된 바와 같은 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함한다.
[0033] 본원에 설명된 각각의 양태 및 구현예는 구현예 또는 양태의 맥락에서 명시적으로 또는 명백하게 배제되지 않는 한 함께 사용될 수 있다.
[0034] 전술한 요약은 단지 예시적인 것이며 어떤 식으로든 제한하려는 것이 아니다. 본원에 설명된 예시적인 구현예 및 특징에 더하여, 본 발명의 개시의 추가 양태, 구현예, 목적 및 특징은 도면 및 상세한 설명 및 청구범위로부터 완전히 명백해질 것이다.
[0035] 도 1a-1b는 본 발명의 개시의 일부 구현예에 따른 알파바이러스 벡터 설계의 비제한적인 예의 개략도이며, 여기서 원래의 알파바이러스의 바이러스 구조 단백질의 코딩 서열은 결실되었고 합성 어댑터 분자는 3' UTR의 상류에 삽입되었다. 도 1a는 본 발명의 개시의 일부 구현예에 따른 예시적인 변형된 알파바이러스 벡터 설계의 비제한적인 예를 예시한다. 이 예에서, 합성 어댑터 분자는 5'→3' 방향으로 5' 플랭킹 도메인, SpeI 인식 제한 부위, 및 3' 플랭킹 도메인을 함유한다. 이러한 변형된 알파바이러스 벡터 설계(빈 벡터)는 또한 26S 하위유전체 프로모터(26S) 및 5' UTR 및 3' UTR 서열 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다. 비-구조 단백질 NSP1, NSP2, NSP3, 및 NSP4가 또한 제시된다. 도 1b는 도 1a에 설명된 벡터로부터 유래된 또 다른 알파바이러스 설계의 구조를 도시한다. 이러한 설계에서, 이종성 관심 유전자(GOI)는 이의 발현이 26S 하위유전체 프로모터의 제어 하에 놓이도록 SpeI 제한 부위 내로 클로닝된다.
[0036] 도 2a-2i는 본 발명의 개시의 일부 구현예에 따른 4개의 비제한적인 예시적인 알파바이러스 RNA 레플리콘 설계(빈 벡터)의 그래프 예시이며, 여기서 변형된 베네수엘라 말 뇌염(VEE) 유전체, 변형된 치쿤구니야 바이러스(CHIKV) 균주 27, 변형된 CHIKV 균주 DRDE, 변형된 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV), 변형된 SINV 균주 Girdwood, 또는 변형된 SINV 균주 AR86/Girdwood 키메라 유전체 각각을 인코딩하는 서열이 각각의 3' UTR 서열의 상류에 삽입된 합성 어댑터 분자를 또한 포함하는 발현 벡터에 혼입된다.
[0037] 도 3a-3f는 본 발명의 개시의 일부 구현예에 따른 5개의 비제한적인 예시적인 알파바이러스 RNA 레플리콘 설계의 그래프 예시이다. 도 3a에서, 본 발명의 개시의 일부 구현예에 따른 변형된 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV) 유전체는 예시적인 관심 유전자(GOI), 예를 들어, 합성 어댑터 분자에 삽입된 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 헤마글루티닌 전구체(HA)에 대한 코딩 서열을 또한 함유하는 발현 벡터에 혼입된다. 도 3b-3f에서, H5N1 HA에 대한 코딩 서열은 본 발명의 개시의 일부 구현예에 따른 변형된 SINV AR86-Girdwood 키메라 설계를 함유하는 발현 벡터에 삽입된다.
[0038] 도 4는 본 발명의 개시의 일부 구현예에 따른 알파바이러스 벡터 DNA 주형 설계의 비제한적인 예의 개략도이며, 여기서 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위는 폴리(A)의 하류에 첨가되었다. 도 4a는 알파바이러스 벡터 RNA의 시험관내 전사에 사용되는 최신 기술의 DNA 주형 서열을 예시하며, 여기서 RNA 전사는 5' T7 프로모터(T7 prom)의 부위에서 개시되고 T7 종료자(T7 term)으로의 전사에 의해 종료된다. 도 4b는 본 발명의 개시의 일부 구현예에 따른 예시적인 변형된 알파바이러스 벡터 설계의 비제한적인 예를 예시한다. 이 예에서, SapI 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위는 폴리(A) 서열의 바로 하류에 삽입된다. SapI는 이의 인식 부위(박스에 제시된 서열) 외부에서 DNA를 절단하는 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제이기 때문에, 절단 생성물은 RNA 생성물에서 아데노실 잔기를 인코딩하는 DNA 주형 서열의 5' 말단에 데옥시티미딘 잔기만을 남긴다. 이 예에서, DNA가 SapI 절단에 의해 선형화되고 시험관내 전사를 위한 주형으로서 사용될 때, RNA 전사는 5' T7 프로모터(T7 prom)의 부위에서 개시되고 폴리(A)의 말단에서 런-오프(run-off) 전사에 의해 종료되어 RNA 생성물의 3' 말단에 전사될 비-아데닐레이트 잔기를 생성시키는 T7 프로모터에 의한 종료와 대조적으로 RNA의 3' 말단에 아데닐레이트 잔기만을 남긴다.
[0039] 도 5는 (i) 30개의 아데닐레이트 잔기(A)로 구성되거나 (ii) 30개의 아데닐레이트 잔기에 이어 전사된 종료자(T7) 서열로 구성되는 3' 말단을 갖는 레플리콘 RNA 사이의 차이를 나타내는 막대 그래프이다. 상이한 양의 레플리콘 RNA를 BHK-21 세포에 3중으로 전기천공하고, 17.5시간 후에 레플리콘 복제 또는 인코딩된 관심 트랜스진(HA)의 발현의 결과로서 dsRNA를 함유하는 세포의 생성된 빈도를 형광 흐름세포측정법에 의해 정량화하였다. 이 시점에서, 형질감염된 레플리콘 RNA의 서브-포화 양(<250 ng)에서, T7 종료자 서열로 종료되는 것과 비교하여 아데닐레이트 잔기로 종료되는 3' 말단을 갖는 레플리콘 RNA에 대해 유의하게 더 높은 복제 및 트랜스진 발현의 형태로 향상된 생물학적 활성의 증거가 존재한다.
[0040] 도 6은 30개의 아데닐레이트 잔기에 이어 전사된 종료자(30; T7) 서열로 구성되거나 30개의 아데닐레이트 잔기(30; 클린(Clean)) 또는 대략 120개의 아데닐레이트 잔기(약 120; 클린)로 구성된 3' 말단을 갖는 레플리콘 RNA 사이의 차이를 나타내는 막대 그래프이다. 25 또는 100 ng의 레플리콘 RNA를 이중으로 BHK-21 세포에 전기천공하고, 20시간 후에 레플리콘 복제 또는 인코딩된 관심 트랜스진(HA)의 발현의 결과로서 dsRNA를 함유하는 세포의 생성된 빈도를 형광 흐름세포측정법에 의해 정량화하였다. 이 예에서, 연장된 폴리(A) 꼬리를 갖는 레플리콘 RNA는 더 높은 복제 및 트랜스진 발현의 형태로 향상된 생물학적 활성을 나타낸다.
[0041] 도 7은 유형 II 대 유형 IIS 제한 효소의 인식 서열 및 절단 부위를 개략적으로 비교한다.
[0042] 도 8은 효소 절단에 의해 선형화된 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 시험관내 전사(IVT)에 의해 제조된 srRNA 분자의 온전성을 평가하기 위해 수행된 전기영동 분석 실험의 결과를 그림으로 요약한 것이다. 이 예에서, DNA는 폴리(A) 서열의 말단에서 절단하는 SapI로 선형화되었다(예를 들어, 폴리(A) 서열의 바로 하류를 절단함).
[0043] 도 9는 폴리(A) 꼬리의 길이와 상관관계에 있는 srRNA의 RNA 복제 활성의 특정 차이를 예시하기 위해 수행된 실험의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 다양한 용량의 srRNA 작제물을 세포로 전기천공(EP)하고, RNA 복제의 빈도를 흐름세포측정법을 사용하여 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 검출에 의해 정량화하였다.
[0044] 도 10은 폴리(A) 꼬리의 길이와 상관관계에 있는 srRNA의 RNA 복제 활성의 정량적 차이를 개략적으로 요약한 것이다. 도 9에 제시된 데이터를 4PL 곡선에 피팅함으로써 EC50의 역수(최대 활성의 절반에 대한 RNA 용량)를 계산하고, Log(EC50) 값 사이의 유의성을 결정하기 위해 일원 ANOVA 통계 시험을 수행하였다.
[0045] 특히, 재조합 세포에서 이종성 분자, 예를 들어, 백신 및 치료용 폴리펩티드를 발현시키는데 적합한 우수한 발현 잠재성을 갖는 바이러스 발현 시스템이 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 구조 단백질을 인코딩하는 원래 바이러스 서열의 상당 부분이 결실된 알파바이러스의 변형된 유전체 또는 레플리콘 RNA를 함유하는, 예를 들어, 발현 작제물 및 벡터와 같은 핵산 작제물에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 개시의 일부 구현예에서 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 바이러스-기반 발현 벡터가 제공된다. 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, 구조 단백질을 인코딩하는 원래의 바이러스 서열의 적어도 일부가 결실된 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV) 또는 신드비스 바이러스(SINV)의 변형된 유전체 또는 레플리콘 RNA를 함유하는, 예를 들어, 발현 작제물 및 벡터와 같은 핵산 작제물이 추가로 제공된다. 본원에 개시된 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하도록 유전적으로 조작된 재조합 세포가 추가로 제공된다. 이러한 재조합 세포로부터 유래된 생체적합물질 및 재조합 생성물은 또한 본 출원의 범위 내에 있다. 또한, 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는데 유용한 조성물 및 방법, 뿐만 아니라 다양한 건강 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법이 제공된다.
[0046] RNA 바이러스(예를 들어, 알파바이러스)에 기반한 자가-증폭 RNA(레플리콘)는 강력한 발현 시스템으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 발현 벡터로서 EEEV 및 SINV와 같은 알파바이러스를 사용하는 비제한적인 이점은 이들이 재조합 숙주 세포에서 다량의 이종성 단백질의 합성을 지시할 수 있다는 것이 보고되었다. 특히, 본원에 개시된 알파바이러스 레플리콘 플랫폼 시스템은 높은 수준의 이종성 관심 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 다른 이점 중에서, 치료용 단일 사슬 항체와 같은 폴리펩티드는 생체내에서 높은 수준으로 발현되는 경우 가장 효과적일 수 있다. 또한, 배양물(생체외)에서 세포로부터 정제된 재조합 항체를 생산하기 위해, 레플리콘 RNA로부터의 높은 단백질 발현은 항체 생성물의 전체 수율을 증가시킬 수 있다. 또한, 발현되는 단백질이 백신 항원인 경우, 높은 수준의 발현은 생체내에서 가장 강력한 면역 반응을 유도할 수 있다.
[0047] 알파바이러스는 숙주 세포에서 이들의 복제에 영향을 미치기 위해 이들의 UTR, 구조적 영역, 및 비-구조적 영역에 함유된 모티프를 이용한다. 이러한 영역은 또한 숙주 세포 선천 면역을 회피하는 메커니즘을 함유한다. 알파바이러스 사이에는 종종 상당한 차이가 있을 수 있다. 유전체의 어느 부분이 이러한 기능적 성분을 함유하는지 또한 알파바이러스마다 다르다. 개별 알파바이러스 사이의 변이 외에도, 독성과 같은 특성의 변화를 설명할 수 있는 알파바이러스의 균주 내에 차이가 또한 종종 존재한다. 예를 들어, EEEV의 북미 및 남미 균주 사이의 서열 변이는 STAT1 경로를 조절하는 능력을 변화시켜 유형 I 인터페론의 차등 유도 및 결과적으로 독성의 변화를 초래한다. 하기 설명되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 EEEV에 기반한 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA에 관한 것이다. 추가 예로서, SINV 균주 S.A.AR86(AR86)은 IFN-γ 및/또는 IFN-β에 반응하여 STAT1 및 STAT2의 티로신 인산화를 빠르고 강력하게 억제하지만, 관련 SINV 균주 Girdwood는 STAT1/2 활성화의 비효율적인 억제제이다. AR86의 비-구조 단백질에서 위치 538에서의 독특한 트레오닌은 관련된 SINV 균주 Girdwood로부터의 더 느린 비-구조 단백질 프로세싱 및 지연된 하위유전체 RNA 합성을 초래하며, 이는 성체 마우스 신경독성 표현형에 기여하고, 이종성 단백질 발현의 동역학 및 수율에 유리할 수 있고, AR86-기반 레플리콘 벡터로부터 발현된 백신 항원에 대한 보다 강력한 면역 반응에 기여한다. T538을 함유하는 진정한 AR86 레플리콘은 설명되지 않았다. 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 보고된 유전체 서열(Genbank U38305)을 사용하는 기능성 AR86 레플리콘은 생성될 수 없었으며, 이는 아마도 기존의 AR86-기반 레플리콘이 약독화 T538I 돌연변이를 갖는 이유일 것이다. 그러나, Girdwood로부터의 nsP 유전자로 특정 키메라를 생성함으로써 T538을 여전히 보유하는 기능성 AR86 레플리콘을 생성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 하기에 추가로 설명되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 SINV 균주 AR86에 기반한 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA에 관한 것이다.
[0048] 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 증가된 수준의 복제, 발현, 및/또는 번역과 같은 향상된 생물학적 활성을 제공하기 위해 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열의 말단에 제한 부위를 혼입시키도록 조작된 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA에 관한 것이다.
[0049] 또한 하기에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 증가된 수준의 복제, 발현, 및/또는 번역과 같은 향상된 생물학적 활성을 제공하기 위해 연장된 폴리(A) 꼬리를 갖도록 조작된 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA에 관한 것이다.
정의
[0050] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 과학적 용어 또는 술어는 본 출원이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에 이러한 정의를 포함하는 것이 반드시 당 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 설명되거나 언급된 많은 기술 및 절차는 당업자에 의해 통상적인 방법을 사용하여 잘 이해되고 통상적으로 사용된다.
[0051] 단수 형태는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 세포의 혼합물을 포함하여 하나 이상의 세포를 포함한다. "A 및/또는 B"는 하기 대안 모두를 포함하기 위해 본원에서 사용된다: "A", "B", "A 또는 B", 및 "A 및 B".
[0052] 본원에서 사용되는 용어 "투여" 및 "투여하는"은 비강내, 경피, 정맥내, 동맥내, 근육내, 결절내, 복강내, 피하, 근육내, 경구, 질내, 및 국소 투여, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 투여 경로에 의한 생물활성 조성물 또는 제형의 전달을 지칭한다. 상기 용어는 의료 전문가에 의한 투여 및 자가 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0053] 용어 "세포", "세포 배양물", 및 "세포주"는 특정 대상체 세포, 세포 배양물, 또는 세포주 뿐만 아니라 배양물에서의 전달 또는 계대 수와 무관하게 이러한 세포, 세포 배양물, 또는 세포주의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 모든 자손이 모 세포와 정확히 동일한 것은 아님이 이해되어야 한다. 이는 돌연변이(예를 들어, 고의적이거나 부주의한 돌연변이) 또는 환경 영향(예를 들어, 메틸화 또는 다른 후성적 변형)으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있어 자손이 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있기 때문이나, 이는 자손이 원래의 세포, 세포 배양물, 또는 세포주의 것과 동일한 기능성을 유지하는 한 여전히 본원에서 사용되는 용어의 범위 내에 포함된다.
[0054] 용어 "작제물"은 이종성 공급원으로부터의 하나 이상의 분리된 핵산 서열을 포함하는 재조합 분자를 지칭한다. 예를 들어, 핵산 작제물은 상이한 기원의 2개 이상의 핵산 서열이 단일 핵산 분자로 조립된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 따라서, 대표적인 핵산 작제물은 (1) 자연에서 서로 인접하여 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열(예를 들어, 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나는 이의 다른 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나에 대해 이종성임), 또는 (2) 자연적으로 인접하지 않은 기능성 RNA 분자 또는 단백질의 부분을 인코딩하는 서열, 또는 (3) 자연적으로 인접하지 않은 프로모터의 부분을 함유하는 임의의 작제물을 포함한다. 대표적인 핵산 작제물은 하나 이상의 핵산 서열이 작동 가능하게 연결된 핵산 분자를 포함하는 유전체 통합 또는 자율 복제가 가능한 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 자가 복제 폴리뉴클레오티드 분자, 파지와 같은 임의의 공급원으로부터 유래된 임의의 재조합 핵산 분자, 선형 또는 원형, 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 개시의 작제물은 작제물에 또한 함유된 관심 핵산 서열의 발현을 지시하는데 필요한 요소를 포함할 수 있다. 이러한 요소는 관심 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된(이의 전사를 지시하기 위함) 프로모터와 같은 제어 요소를 포함할 수 있고, 선택적으로 폴리(A)데닐화 서열을 포함한다.
[0055] 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 벡터 내에 혼입될 수 있다. 용어 "벡터"는 또 다른 핵산 분자를 전달 또는 수송할 수 있는 핵산 분자 또는 서열을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 용어 "벡터"는 DNA-기반 벡터 및 RNA-기반 벡터 둘 모두를 포함한다. 용어 "벡터"는 클로닝 벡터 및 발현 벡터 뿐만 아니라 바이러스 벡터 및 통합 벡터를 포함한다. "발현 벡터"는 조절 영역을 포함하여, 시험관내, 생체외 및/또는 생체내에서 DNA 서열 및 단편을 발현할 수 있는 벡터이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 플라스미드(DNA-기반 벡터) 또는 자가-복제 RNA 벡터와 같은 벡터는 세포에서 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 숙주 세포 DNA로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는, 예를 들어, 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 및 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 벡터는 단일-가닥 벡터(예를 들어, ssDNA 또는 ssRNA)일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 벡터는 이중-가닥 벡터(예를 들어, dsDNA 또는 dsRNA)일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자 전달 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달 비히클로서 사용된다.
[0056] 작제물의 성분 이외에, 벡터는, 예를 들어, 하나 이상의 선택 가능한 마커, 하나 이상의 복제 기점, 예를 들어, 원핵 및 진핵 기점, 적어도 하나의 다중 클로닝 부위, 및/또는 세포의 유전체로의 작제물의 안정적인 통합을 용이하게 하는 요소를 포함할 수 있다. 2개 이상의 작제물은 단일 벡터와 같은 단일 핵산 분자 내에 혼입될 수 있거나, 2개 이상의 별개의 벡터와 같은 2개 이상의 별개의 핵산 분자 내에 혼입될 수 있다. "발현 작제물"은 일반적으로 관심 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 제어 서열을 포함한다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 발현될 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 발현 작제물에 제공된다. 본 발명의 개시의 실시를 위해, 작제물 및 세포를 제조하고 사용하기 위한 조성물 및 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
[0057] 용어 본 발명의 개시의 조성물, 예를 들어, 핵산 작제물(예를 들어, 폴리(A) 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물의 "유효량", "치료적 유효량", 또는 "약학적 유효량"은 일반적으로 조성물이 조성물의 부재에 비해 언급된 목적(예를 들어, 투여되는 효과를 달성하거나, 면역 반응을 자극하거나, 질병을 예방 또는 치료하거나, 질병, 장애, 감염, 또는 건강 질환의 하나 이상의 증상을 감소시킴)을 달성하기에 충분한 양을 지칭한다. "유효량"의 예는 질병의 증상 또는 증상들의 치료, 예방 또는 감소에 기여하기에 충분한 양이며, 이는 또한 "치료적 유효량"으로 지칭될 수 있다. 증상의 "감소"는 증상(들)의 중증도 또는 빈도의 감소, 또는 증상(들)의 제거를 의미한다. "치료적 유효량"을 포함하는 조성물의 정확한 양은 치료의 목적에 의존할 것이고, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 것이다(예를 들어, 문헌[Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins] 참조).
[0058] 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합"은 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가, 예를 들어, 실험실 방법에 의해 변형되거나 실험실 방법의 결과와 같은 인간 개입을 통해 변경되거나 생산된 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 단백질 및 핵산은 실험실 방법에 의해 생산된 단백질 및 핵산을 포함한다. 재조합 단백질은 단백질의 고유(비-재조합 또는 야생형) 형태 내에서 발견되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있거나, 변형된, 예를 들어, 표지된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 용어는 펩티드, 단백질, 또는 핵산 서열에 대한 임의의 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 하나 이상의 아미노산, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드를 포함하는 펩티드, 단백질 또는 핵산 서열의 임의의 화학적 변형; 펩티드 또는 단백질에서 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 및/또는 치환; 융합 단백질, 예를 들어, 항체 단편을 포함하는 융합 단백질의 생성; 및 핵산 서열에서 하나 이상의 핵산의 첨가, 결실, 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 세포와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합"은 자연-발생 세포를 포함하는 것으로 의도되지 않으며, 조작/변형되지 않은 경우 세포에 존재하지 않는 폴리펩티드 또는 핵산을 포함하거나 발현하도록 조작/변형된 세포를 포함한다.
[0059] 본원에서 사용되는 용어 "레플리콘 RNA"는 허용 세포 내에서 그 자신의 증폭 또는 자가-복제를 지시하는데 필요한 모든 유전 정보를 함유하는 RNA를 지칭한다. 따라서, 레플리콘 RNA는 때때로 "자가-증폭 RNA"(saRNA) 또는 "자가-복제 RNA"(srRNA)로도 지칭된다. 자체 복제를 지시하기 위해, RNA 분자는 1) RNA 증폭 과정을 촉매화하기 위해 바이러스 또는 숙주 세포-유래 단백질, 핵산 또는 리보핵단백질과 상호작용할 수 있는 중합효소, 레플리카제, 또는 다른 단백질을 인코딩하고; 2) 하위유전체 레플리콘-인코딩된 RNA의 복제 및 전사에 필요한 시스-작용 RNA 서열을 함유한다. 이러한 서열은 복제 과정 동안 이의 자가-인코딩된 단백질, 또는 비-자가-인코딩된 세포-유래 단백질, 핵산 또는 리보핵단백질, 또는 이들 성분들 중 임의의 것 사이의 복합체에 결합될 수 있다. 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, 알파바이러스 레플리콘 RNA 분자(예를 들어, srRNA 또는 saRNA 분자)는 일반적으로 하기 순서의 요소를 함유한다: 복제를 위해 시스에 필요한 5' 바이러스 또는 결함-간섭 RNA 서열(들), 생물학적 활성 알파바이러스 비-구조 단백질(예를 들어, nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4)을 코딩하는 서열, 하위유전체 RNA(sgRNA)에 대한 프로모터, 복제를 위해 시스에 필요한 3' 바이러스 서열, 및 폴리(A)데닐레이트 트랙(폴리(A)). 일부 예에서, 이종성 서열의 발현을 지시하는 하위유전체 프로모터(sg)는 본 발명의 개시의 srRNA 작제물에 포함될 수 있다. 추가로, 용어 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA 또는 saRNA)는 일반적으로 양성 극성 또는 "메시지" 센스의 분자를 지칭하고, 레플리콘 RNA는 임의의 공지된 자연-발생 알파바이러스의 길이와 상이한 길이일 수 있다. 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, 레플리콘 RNA는 구조 바이러스 단백질 중 적어도 하나의 서열을 함유하지 않고; 구조 유전자를 인코딩하는 서열은 이종성 서열로 치환될 수 있다. 레플리콘 RNA가 재조합 알파바이러스 입자로 패키징되는 그러한 경우에, 이는 입자 형성을 초래하는 알파바이러스 구조 단백질과의 상호작용을 개시하는 역할을 하는 하나 이상의 서열, 소위 패키징 신호를 함유할 수 있다.
[0060] 본원에서 사용되는 "대상체" 또는 "개체"는 인간(예를 들어, 인간 대상체) 및 비-인간 동물과 같은 동물을 포함한다. 일부 구현예에서, "대상체" 또는 "개체"는 의사의 치료를 받는 환자이다. 따라서, 대상체는 관심 질병(예를 들어, 암) 및/또는 질병의 하나 이상의 증상을 갖거나 이를 가질 위험이 있거나 이를 가질 것으로 의심되는 인간 환자 또는 대상체일 수 있다. 대상체는 또한 진단 시점 또는 그 이후에 관심 질환의 위험으로 진단된 대상체일 수 있다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스, 비-인간 영장류, 및 다른 포유동물, 예를 들어, 양, 개, 소, 닭, 및 비-포유동물, 예를 들어, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
[0061] 값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한, 상기 범위의 상한과 하한 사이의 하한 단위의 10분의 1까지의 각각의 개재 값 및 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 값 또는 개재 값이 본 발명의 개시 내에 포함되는 것이 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 따라 본 발명의 개시 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위가 또한 본 발명의 개시에 포함된다.
[0062] 특정 범위는 본원에서 사용되는 용어 "약"이 앞에 오는 수치 값으로 본원에 제시되며, 이는 대략의 통상적인 의미를 갖는다. 용어 "약"은 그것이 선행하는 정확한 숫자 뿐만 아니라 상기 용어가 선행하는 숫자에 가까운 숫자 또는 대략적인 그 숫자에 대한 문자 그대로의 지지를 제공하기 위해 사용된다. 숫자가 구체적으로 인용된 수에 가깝거나 대략적으로 구체적으로 인용된 수인지의 여부를 결정할 때, 언급되지 않은 수에 가깝거나 대략적인 언급되지 않은 수는 제시된 맥락에서 구체적으로 인용된 수와 실질적으로 등가물을 제공하는 수일 수 있다. 대략의 정도가 문맥상 달리 명확하지 않은 경우, "약"은 모든 경우에 제공된 값을 포함하여 제공된 값의 + 또는 - 10% 이내, 또는 가장 가까운 유효 숫자로 반올림됨을 의미한다. 일부 구현예에서, 용어 "약"은 지정된 값 ± 최대 10%, 최대 ± 5%, 또는 최대 ± 1%를 나타낸다.
[0063] 본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개 이상의 요소, 예를 들어, 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 물리적 또는 기능적 연결을 나타내며, 이는 이들이 의도된 방식으로 작동하도록 한다. 예를 들어, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 본원에 설명된 핵산 분자 또는 핵산 분자의 코딩 서열 및 프로모터 서열과 관련하여 사용될 때, 코딩 서열 및 프로모터 서열이 인-프레임이고 전사 인자 또는 RNA 중합효소에 의한 각각의 결합이 전사에 미치는 영향을 허용하도록 적절한 공간 및 거리에 있음을 의미한다. 작동 가능하게 연결된 요소는 인접하거나 비인접할 수 있음(예를 들어, 링커를 통해 서로 연결됨)이 이해되어야 한다. 폴리펩티드 작제물의 맥락에서, "작동 가능하게 연결된"은 작제물의 설명된 활성을 제공하기 위해 아미노산 서열(예를 들어, 상이한 세그먼트, 부분, 영역, 또는 도메인) 사이의 물리적 연결(예를 들어, 직접 또는 간접적으로 연결된)을 지칭한다. 본원에 개시된 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 작동 가능하게 연결된 세그먼트, 부분, 영역, 및 도메인은 인접하거나 비인접할 수 있다(예를 들어, 링커를 통해 서로 연결됨).
[0064] 본원에서 사용되는 용어 "일부"는 분획을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 특정 구조와 관련하여, 이의 용어 "일부"는 상기 구조의 연속 또는 불연속 분획을 지정할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열의 일부는 상기 아미노산 서열의 아미노산의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 및 적어도 90%를 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부가 불연속 분획인 경우, 상기 불연속 분획은 구조(예를 들어, 단백질의 도메인)의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 부분으로 구성되고, 각 부분은 구조의 연속적인 요소이다. 예를 들어, 아미노산 서열의 불연속 분획은 상기 아미노산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상, 예를 들어, 4개 이하의 부분으로 구성될 수 있고, 여기서 각 부분은 아미노산 서열의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5개의 연속 아미노산, 적어도 10개의 연속 아미노산, 적어도 20개의 연속 아미노산, 또는 적어도 30개의 연속 아미노산을 포함한다.
[0065] 값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한, 상기 범위의 상한과 하한 사이의 하한 단위의 10분의 1까지의 각각의 개재 값 및 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 값 또는 개재 값이 본 발명의 개시 내에 포함되는 것이 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 따라 본 발명의 개시 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위가 또한 본 발명의 개시에 포함된다.
[0066] 특정 범위는 본원에서 용어 "약"이 앞에 오는 수치 값으로 제시된다. 용어 "약"은 그것이 선행하는 정확한 숫자 뿐만 아니라 상기 용어가 선행하는 숫자에 가까운 숫자 또는 대략적인 그 숫자에 대한 문자 그대로의 지지를 제공하기 위해 본원에서 사용된다. 숫자가 구체적으로 인용된 수에 가깝거나 대략적으로 구체적으로 인용된 수인지의 여부를 결정할 때, 언급되지 않은 수에 가깝거나 대략적인 언급되지 않은 수는 제시된 맥락에서 구체적으로 인용된 수와 실질적으로 등가물을 제공하는 수일 수 있다.
[0067] 2개 이상의 핵산 또는 단백질과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "동일성 백분율"은 하기에 설명되는 디폴트 파라미터를 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정된 바와 같은 비교 창 또는 지정된 영역에 대한 최대 대응을 위해 비교 및 정렬된 경우 동일하거나 특정 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산(예를 들어, 특정 영역에 걸쳐 약 60% 서열 동일성, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성)을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 예를 들어, NCBI 웹 사이트(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 참조한다. 이 정의는 또한 질의 서열의 상보체를 지칭하거나 이에 적용될 수 있다. 이러한 정의는 BLAST 알고리즘에 의해 수행되는 서열 비교를 포함하며, 여기서 알고리즘의 파라미터는 각각의 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이에 가장 큰 일치를 제공하도록 선택된다. 이 정의는 또한 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열 뿐만 아니라 치환을 갖는 서열을 포함한다. 서열 동일성은 적어도 약 20개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역, 또는 10-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역, 또는 주어진 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산될 수 있다. 서열 동일성은 공개된 기술 및 널리 이용 가능한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, GCS 프로그램 패키지(Devereux et al., Nucleic Acids Res (1984) 12:387), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul et al., J Mol Biol (1990) 215:403)를 사용하여 계산될 수 있다. 서열 동일성은 디폴트 파라미터와 함께 위스콘신 대학교 생명공학 센터(University of Wisconsin Biotechnology Center)(1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)의 유전학 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지와 같은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정될 수 있다. 유사성 또는 동일성 아미노산 서열을 결정하기 위해 적합하게 사용될 수 있는 추가 방법은 Rosetta로부터의 구조-예측 스코어를 포함하는 위치-특이적 구조-스코어링 매트릭스(P3SM)에 의존하는 것 뿐만 아니라, 예를 들어, 문헌[Setcliff et al., Cell Host & Microbe 23(6), May 2018]에 이전에 설명된 바와 같은 길이-표준화된 편집 거리에 기반한 것을 포함한다.
[0068] 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 부형제"는 대상체에게 관심 화합물(들)을 투여하기 위한 약학적으로 허용되는 담체, 첨가제, 또는 희석제를 제공하는 임의의 적합한 물질을 지칭한다. 이와 같이, "약학적으로 허용되는 부형제"는 약학적으로 허용되는 희석제, 약학적으로 허용되는 첨가제, 및 약학적으로 허용되는 담체로 지칭되는 물질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 약학적 투여와 양립 가능한 염수, 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 보충 활성 화합물(예를 들어, 항생제 및 추가 치료제)이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
[0069] 본원에서 사용되는 "대상체" 또는 "개체"는 인간(예를 들어, 인간 개인) 및 비-인간 동물과 같은 동물을 포함한다. 일부 구현예에서, "대상체" 또는 "개체"는 의사의 치료를 받는 환자이다. 따라서, 대상체는 관심 건강 질환(예를 들어, 암 또는 감염) 및/또는 건강 질환의 하나 이상의 증상을 갖거나 이를 가질 위험이 있거나 가질 것으로 의심되는 인간 환자 또는 개인일 수 있다. 대상체는 또한 진단 시점 또는 그 이후에 관심 건강 질환의 위험으로 진단된 개인일 수 있다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스, 비-인간 영장류, 및 다른 포유동물, 예를 들어, 양, 개, 소, 닭, 및 비-포유동물, 예를 들어, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
[0070] 본원에 설명된 본 발명의 개시의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하는", 이로 "구성되는", 및 이를 "필수적 요소로 하여 포함하는"을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)", "함유하는", 또는 "~에 의해 특징지어지는"과 동의어이고, 포괄적이거나 개방적이며, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본원에서 사용되는 "구성되는"은 청구된 조성물 또는 방법에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용되는 "필수적 요소로 하여 포함하는"은 청구된 조성물 또는 방법의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 본원에서, 특히 조성물의 성분의 설명 또는 방법의 단계의 설명에서, 용어 "포함하는"의 임의의 언급은 언급된 성분 또는 단계를 필수적 요소로 하여 포함하거나 이로 구성되는 그러한 조성물 및 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
[0071] 값의 범위가 제공되는 경우, 당업자는 본원에 개시된 모든 범위가 임의의 및 모든 가능한 하위 범위 및 이들의 하위 범위의 조합을 포함하는 것으로 이해한다. 열거된 임의의 범위는 동일한 범위를 적어도 동일한 절반, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10 등으로 나눌 수 있도록 충분히 설명하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 논의된 각각의 범위는 하위 1/3, 중간 1/3 및 상위 1/3 등으로 쉽게 나눌 수 있다. 또한, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, "최대", "적어도", "보다 큰", "보다 작은" 등과 같은 모든 언어는 인용된 수를 포함하고, 상기 논의된 바와 같이 하위-범위로 후속적으로 나눌 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1-3개의 항목을 갖는 그룹은 1, 2, 또는 3개의 항목을 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 1-5개의 항목을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 항목을 갖는 그룹 등을 지칭한다.
[0072] 표제, 예를 들어, (a), (b), (i) 등은 단지 명세서 및 청구범위를 읽기 쉽게 하기 위해 제시된다. 명세서 또는 청구범위에서 표제의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳 또는 숫자 순서 또는 이들이 제시된 순서로 수행될 것을 요구하지 않는다.
[0073] 명확성을 위해, 별도의 구현예의 맥락에서 설명되는 본 개시의 특정 특징은 또한 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수 있음이 이해된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 구현예의 맥락에서 설명되는 본 발명의 개시의 다양한 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수 있다. 본 발명의 개시에 관한 구현예의 모든 조합은 본 발명의 개시에 의해 구체적으로 포함되며, 각각의 모든 조합이 개별적으로 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 구현예 및 이의 요소의 모든 하위-조합은 또한 본 발명의 개시에 의해 구체적으로 포함되며, 각각의 모든 이러한 하위 조합이 본원에 개별적으로 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
알파바이러스
[0074] 알파바이러스는 적어도 30개의 구성원을 포함하는 그룹 IV 토가바이러스과 과의 유전적으로, 구조적으로, 및 혈청학적으로 관련된 바이러스의 속이며, 각각은 바이러스 스파이크 단백질을 함유하는 외피에 의해 둘러싸인 뉴클레오캡시드에 둘러싸인 양성 극성의 단일 가닥 RNA 유전체를 갖는다. 현재, 알파바이러스 속은 특히 신드비스 바이러스(SIN), 셈리키 포레스트 바이러스(SFV), 로스 리버 바이러스(RRV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 및 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV)를 포함하며, 이들 모두는 밀접하게 관련되어 있고 포유동물, 설치류, 어류, 조류 종과 같은 다양한 척추동물, 및 인간 및 말과 같은 더 큰 포유동물 뿐만 아니라 곤충과 같은 무척추동물을 감염시킬 수 있다. 종과 개인 사이의 전파는 주로 모기를 통해 발생하여 알파바이러스를 아르보바이러스 또는 절지동물-유래 바이러스의 수집의 기여자로 만든다. 특히, 신드비스 및 셈리키 포레스트 바이러스는 널리 연구되어 왔으며, 이러한 바이러스의 생활 주기, 복제 방식 등은 잘 특성화되어 있다. 특히, 알파바이러스는 동물 세포에서 매우 효율적으로 복제되는 것으로 밝혀져, 이들을 이러한 세포에서 단백질 및 핵산의 생산을 위한 벡터로서 가치있게 만든다.
[0075] 이러한 알파바이러스 각각은 바이러스 스파이크 단백질을 함유하는 외피에 의해 둘러싸인 뉴클레오캡시드에 둘러싸인 양성 극성의 단일 가닥 RNA 유전체를 갖는다. 알파바이러스 입자는 외피화되고, 구형인 경향이 있고(약간 다형성이지만), 아이소메트릭(isometric) 뉴클레오캡시드를 갖는다. 알파바이러스 유전체는 5' 캡, 3' 폴리-A 꼬리, 및 효소 기능을 갖는 비-구조 단백질을 인코딩하는 제1 프레임 및 바이러스 구조 단백질(예를 들어, 캡시드 단백질 CP, E1 당단백질, E2 당단백질, E3 단백질 및 6K 단백질)을 인코딩하는 제2 프레임을 갖는 2개의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 대략 11-12 kb 길이의 양성 극성의 단일-가닥 RNA이다.
[0076] 알파바이러스 유전체의 5' 2/3는 바이러스 RNA의 전사 및 복제에 필요한 다수의 비-구조 단백질(nsP)을 인코딩한다. 이러한 단백질은 RNA로부터 직접 번역되고, 세포 단백질과 함께 sgRNA의 바이러스 유전체 복제 및 전사에 필수적인 RNA-의존성 RNA 중합효소를 형성한다. 4개의 nsP(nsP1-4)는 단일 폴리단백질이 바이러스의 복제 기구를 구성함에 따라 생산된다. 폴리단백질의 가공은 P2/3 접합부에서의 절단이 유전체 복제 동안 RNA 주형 사용에 영향을 미치면서 고도로 조절된 방식으로 발생한다. 이 부위는 좁은 틈의 바닥에 위치하고 있으며 쉽게 접근할 수 없다. 일단 절단되면, nsP3는 nsP2를 둘러싸는 고리 구조를 생성한다. 이들 2개의 단백질은 광범위한 계면을 갖는다. 비세포변성 바이러스 또는 온도 민감성 표현형을 생산하는 nsP2의 돌연변이는 P2/P3 계면 영역에서 클러스터링된다. nsP2 비세포변성 돌연변이의 위치 반대편에 있는 P3 돌연변이는 P2/3의 효율적인 절단을 방지한다. 이는 차례로 RNA 감염성에 영향을 주어 바이러스 RNA 생산 수준을 변경할 수 있다.
[0077] 유전체의 3' 1/3은 바이러스 입자를 형성하는데 필요한 모든 구조적 단백질: 코어 뉴클레오캡시드 단백질 C, 및 이종이량체로서 회합하는 외피 단백질 P62 및 E1의 번역을 위한 주형으로서 작용하는 sgRNA를 포함한다. 바이러스 막-고정된 표면 당단백질은 수용체 인식 및 막 융합을 통한 표적 세포로의 진입을 담당한다. sgRNA는 nsp4 단백질을 인코딩하는 RNA 서열의 3' 말단에 존재하는 p26S 하위유전체 프로모터로부터 전사된다. E2 및 E3로의 P62의 단백질분해성 성숙은 바이러스 표면의 변화를 야기한다. E1, E2, 및 때때로 E3, 당단백질 "스파이크"는 함께 E1/E2 이량체 또는 E1/E2/E3 삼량체를 형성하며, 여기서 E2는 중심으로부터 정점으로 연장되고, E1은 정점 사이의 공간을 채우고, E3은, 존재하는 경우, 스파이크의 원위 단부에 있다. 바이러스가 엔도솜의 산도에 노출되면, E1은 E2로부터 해리되어 E1 동종삼량체를 형성하는데, 이는 융합 단계가 세포 및 바이러스 막을 함께 구동시키는 데 필요하다. 알파바이러스 당단백질 E1은 인플루엔자 바이러스 및 HIV에서 발견되는 클래스 I 융합 단백질과 구조적으로 상이한 클래스 II 바이러스 융합 단백질이다. E2 당단백질은 이의 세포질 도메인을 통해 뉴클레오캡시드와 상호작용하는 기능을 하는 반면, 이의 엑토도메인은 세포 수용체에 결합하는 역할을 한다. 대부분의 알파바이러스는 말초 단백질 E3를 상실하는 반면, 셈리키 바이러스에서는 바이러스 표면과 회합된 채로 남아 있다.
[0078] 알파바이러스 복제는 숙주 세포 내의 막 표면에서 일어나는 것으로 보고되었다. 감염성 주기의 첫 번째 단계에서, 유전체 RNA의 5' 말단은 유전체 RNA에 상보적인 음성 가닥을 생성하는 RNA 중합효소 활성을 갖는 폴리단백질(nsP1-4)로 번역된다. 유전체 RNA의 3' 말단에 있는 서열은 음성-가닥 합성의 개시에서 중요한 역할을 하며, 여기서 최소 수의 아데닐레이트 잔기는 복제가 일어나는데 필수적인 것으로 확인되었다. 특히, 알파바이러스 유전체가 복제되기 위해서는, 마이너스-가닥 합성을 효율적으로 개시하고, 따라서 복제가 일어나기 위해 3' UTR 다음에 폴리(A) 꼬리에 적어도 11개의 잔기가 있어야 한다는 것이 이전에 보고되었다. 또한, 폴리(A) 꼬리를 25개 잔기로 연장하면 복제가 향상되지만, 폴리(A)가 34개 잔기로 추가로 연장될 때 복제의 추가 향상은 관찰되지 않은 것으로 이전에 보고되었다. 또한, 폴리(A)에서 내부 비-A 잔기는 가장 흔히 복제에 유해하며, 이는 효소적 폴리(A) 테일링이 3' UTR 다음에 3' 아데닐레이트 잔기를 독점적으로 함유하지 않은 레플리콘 RNA에 이점이 없음을 시사한다. 폴리(A) 꼬리에 25개 초과의 아데닐레이트 잔기를 갖는 RNA 주형에 대한 마이너스-가닥 합성의 향상은 없는 것으로 이전에 보고되었다. 복제의 두 번째 단계에서, 음성 가닥은 각각 2개의 RNA의 생산을 위한 주형으로서 사용된다: (1) 번역에 의해 다른 nsP를 생산하고 바이러스에 대한 유전체로서 작용하는 이차 바이러스의 유전체에 상응하는 양성 유전체 RNA; 및 (2) 감염성 입자를 형성하는 바이러스의 구조적 단백질을 인코딩하는 sgRNA. 양성 유전체 RNA/sgRNA 비는 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4에 대한 폴리단백질의 단백질분해성 자가절단에 의해 조절된다. 실제로, 바이러스 유전자 발현은 2단계로 일어난다. 제1 단계에서, 양성 유전체 가닥 및 음성 가닥의 주요 합성이 있다. 제2 단계 동안, sgRNA의 합성은 사실상 독점적이며, 이에 따라 다량의 구조적 단백질이 생산된다.
[0079] 상기 설명된 바와 같이, 알파바이러스 사이에는 종종 상당한 차이가 있을 수 있다. 상이하거나 동일한 기능을 갖는 성분을 함유하는 유전체의 부분이 또한 알파바이러스마다 다르다. 개별 알파바이러스 사이의 변이 외에도, 독성과 같은 특성의 변화를 설명할 수 있는 알파바이러스의 균주 내에 차이가 또한 종종 존재한다. 예를 들어, EEEV의 북미 및 남미 균주 사이의 서열 변이는 STAT1 경로를 조절하는 능력을 변화시켜 유형 I 인터페론의 차등 유도 및 결과적으로 독성의 변화를 초래한다. 하기 설명되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 EEEV에 기반한 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA에 관한 것이다. 추가 예로서, SINV 균주 S.A.AR86 (AR86)은 IFN-γ 및/또는 IFN-β에 반응하여 STAT1 및 STAT2의 티로신 인산화를 빠르고 강력하게 억제하지만, 관련 SINV 균주 Girdwood는 STAT1/2 활성화의 비효율적인 억제제이다. AR86의 비-구조 단백질에서 위치 538에서의 독특한 트레오닌은 관련된 SINV 균주 Girdwood로부터의 더 느린 비-구조 단백질 프로세싱 및 지연된 하위유전체 RNA 합성을 초래하며, 이는 성체 마우스 신경독성 표현형에 기여하고, 이종성 단백질 발현의 동역학 및 수율에 유리할 수 있고, AR86-기반 레플리콘 벡터로부터 발현된 백신 항원에 대한 보다 강력한 면역 반응에 기여한다. 보고된 유전체 서열(Genbank U38305)을 사용하는 기능적 AR86 레플리콘은 생성되지 않았으며, 이는 아마도 상기 설명된 T538 표현형으로 인해, 기존의 AR86-기반 레플리콘이 약독화 T538I 돌연변이를 포함하는 많은 변경을 함유하는 이유일 것이다. 그러나, 본원에 제시된 실험 결과는 Girdwood로부터의 nsP 유전자로 특정 키메라를 생성함으로써 T538을 여전히 보유하는 기능성 AR86 레플리콘을 생성할 수 있음을 입증하였다. 하기에 추가로 설명되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 SINV 균주 AR86에 기반한 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA에 관한 것이다.
본 발명의 개시의 조성물
[0080] 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 일 양태는 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 인코딩하는 핵산 서열의 핵산 작제물에 관한 것으로, 여기서 상응하는 비변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 하나 이상의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부는 제거되었다. 본 발명의 개시의 일부 구현예는 비-구조 단백질 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4에 대한 코딩 서열이 존재하지만, 하나 이상의 구조 단백질을 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 적어도 일부가 부재하는 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 제공한다. 본 발명의 개시의 일부 구현예는 비-구조 단백질 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4에 대한 코딩 서열이 존재하지만, 구조 단백질을 인코딩하는 서열의 상당 부분은 부재하는 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 제공한다. 또한, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하도록 조작된 재조합 세포 및 세포 배양물이 제공된다.
A. 핵산 작제물
[0081] 하기에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 일 양태는 알파바이러스, 예를 들어, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV), 치쿤구니야 바이러스(CHIKV) 또는 신드비스 바이러스(SINV)의 변형된 유전체 또는 레플리콘 RNA를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 신규한 핵산 작제물에 관한 것이다. 예를 들어, 변형된 알파바이러스 유전체는 모 알파바이러스 유전체의 하나 이상의 유전체 영역에서 결실(들), 치환(들), 및/또는 삽입(들)을 포함할 수 있다.
[0082] 본 발명의 개시의 핵산 작제물의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 포함하고, 여기서 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 상당 부분은 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA로의 이종성 서열의 삽입을 용이하게 하도록 구성된 합성 어댑터 분자에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자는 하기 화학식 I을 갖는다:
[5' 플랭킹 도메인]- [제한 부위]n -[3' 플랭킹 도메인] 화학식 I
[0083] 상기 식에서, a) n은 1 내지 6의 정수이고;
[0084] b) 제한 부위는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단 가능하고;
[0085] c) 5' 플랭킹 도메인 및 3' 플랭킹 도메인은 각각 최소 이차 구조를 갖는 것으로 예측되는 핵산 서열을 포함한다.
[0086] 일부 구현예에서, n은 1 내지 6, 예를 들어, 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6, 또는 5 내지 6의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 1이다.
[0087] 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 하나 이상의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 상당 부분은 제거되었고, 예를 들어, 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA는 알파바이러스 구조 단백질 CP, E1, E2, E3, 및 6K 중 하나 이상에 대한 코딩 서열의 적어도 일부를 포함하지 않는다.
[0088] 본 발명의 개시의 핵산 작제물의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비변형된 바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 바이러스 구조 단백질 CP, E1, E2, E3, 및 6K 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부가 제거되었다. 일부 구현예에서, CP를 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 일부가 제거되었다. 일부 구현예에서, E1을 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 일부가 제거되었다. 일부 구현예에서, E2를 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 일부가 제거되었다. 일부 구현예에서, E3를 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 일부가 제거되었다. 일부 구현예에서, 6K를 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 일부가 제거되었다. 일부 구현예에서, CP, E1, E2, E3, 및 6K의 조합을 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 일부가 제거되었다. 본 발명의 개시의 일부 구현예는 변형되지 않은 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 비-구조 단백질 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4에 대한 코딩 서열이 존재하지만, 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 하나 이상의 구조 단백질(예를 들어, CP, E1, E2, E3, 및 6K)을 인코딩하는 전체 서열 또는 적어도 이의 일부가 부재하는 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 제공한다. 본 발명의 개시의 일부 구현예는 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 상당 부분이 제거된 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 제공한다.
[0089] 일부 구현예에서, 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 상당 부분이 제거되었다. 당업자는 바이러스 구조 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 상당 부분이 당업자에 의한 서열의 수동 평가에 의해 또는 BLAST와 같은 알고리즘을 사용한 컴퓨터-자동화된 서열 비교 및 확인에 의해 상기 폴리펩티드의 추정적 식별을 제공하기에 충분한 바이러스 구조 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있음을 이해할 것이다(예를 들어, 문헌["Basic Local Alignment Search Tool"; Altschul SF et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1993] 참조). 따라서, 뉴클레오티드 서열의 상당 부분은 서열을 포함하는 핵산 단편의 특이적 확인 및/또는 분리를 제공하기에 충분한 서열을 포함한다. 예를 들어, 핵산 서열의 상당 부분은 전장 핵산 서열의 적어도 약 20%, 예를 들어, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%를 포함할 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 개시는 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 부분적 또는 완전한 핵산 서열이 없는 핵산 분자 및 작제물을 제공한다. 본원에 개시된 바와 같은 서열의 이점을 갖는 당업자는 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 대해 개시된 서열의 전부 또는 상당 부분을 용이하게 사용할 수 있다. 따라서, 본 출원은 본원에 개시된 바와 같은 완전한 서열, 예를 들어, 첨부된 서열 목록에 기재된 것들 뿐만 아니라 상기 정의된 바와 같은 이러한 서열의 상당 부분을 포함한다.
[0090] 일부 구현예에서, 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 전체 서열은 제거되었고, 예를 들어, 변형된 바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA는 바이러스 비변형 유전체 또는 레플리콘 RNA의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다.
[0091] 본 발명의 개시의 srRNA 작제물은 일반적으로 적어도 약 2 kb의 길이를 갖는다. 예를 들어, srRNA는 적어도 약 2 kb, 적어도 약 3 kb, 적어도 약 4 kb, 적어도 약 5 kb, 적어도 약 6 kb, 적어도 약 7 kb, 적어도 약 8 kb, 적어도 약 9 kb, 적어도 약 10 kb, 적어도 약 11 kb, 적어도 약 12 kb 또는 12 kb 초과의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, srRNA는 약 4 kb 내지 약 20 kb, 약 4 kb 내지 약 18 kb, 약 5 kb 내지 약 16 kb, 약 6 kb 내지 약 14 kb, 약 7 kb 내지 약 12 kb, 약 8 kb 내지 약 16 kb, 약 9 kb 내지 약 14 kb, 약 10 kb 내지 약 18 kb, 약 11 kb 내지 약 16 kb, 약 5 kb 내지 약 18 kb, 약 6 kb 내지 약 20 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 5 kb 내지 약 8 kb, 약 5 kb 내지 약 7 kb, 약 5 kb 내지 약 6 kb, 약 6 kb 내지 약 12 kb, 약 6 kb 내지 약 11 kb, 약 6 kb 약 10 kb, 약 6 kb 내지 약 9 kb, 약 6 kb 내지 약 8 kb, 약 6 kb 내지 약 7 kb, 약 7 kb 내지 약 11 kb, 약 7 kb 내지 약 10 kb, 약 7 kb 내지 약 9 kb, 약 7 kb 내지 약 8 kb, 약 8 kb 내지 약 11 kb, 약 8 kb 내지 약 10 kb, 약 8 kb 내지 약 9 kb, 약 9 kb 내지 약 11 kb, 약 9 kb 내지 약 10 kb, 또는 약 10 kb 내지 약 11 kb의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, srRNA는 약 6 kb 내지 약 14 kb의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, srRNA는 약 6 kb 내지 약 16 kb의 길이를 가질 수 있다.
합성 어댑터 분자
[0092] 상기 설명된 바와 같이, 합성 어댑터 분자의 5' 플랭킹 도메인 및 3' 플랭킹 도메인은 각각 중합효소 종료 신호로서 잠재적으로 기능하고, 차례로 조기 종료를 야기할 수 있는 스템-루프 구조 또는 헤어핀 구조와 같은 최소 이차 구조를 갖는 것으로 예측되는 핵산 서열을 포함한다. 당업자는 핵산 서열의 이차 구조가 주어진 핵산 서열의 폴딩 ΔG 값을 결정 또는 예측하거나 핵산 서열의 최소 자유 에너지(MFE) 구조를 결정하기 위해 개발된 것을 포함하는 다양한 방법론에 의해 평가될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자의 5' 플랭킹 도메인의 서열은 미리 정의된 임계값보다 높은 MFE 구조의 폴딩 ΔG 값을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산 서열의 MFE 구조는, 예를 들어, 문헌[Zuker M. Nucleic Acids Research, Volume 31, Issue 13, 1 July 2003]에 이전에 설명된 바와 같은 상기 구조에 기초하여 MFE RNA 구조 예측 및 ΔG 계산을 위한 Mfold 도구를 사용함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, RNA 서열의 폴딩, 설계 및 분석을 위해 일반적으로 사용되는 프로그램의 모음과 함께 http://rna.tbi.univie.ac.at/에서 공개적으로 이용 가능한 Vienna RNA Package가 또한 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자의 5' 플랭킹 도메인의 서열은 국소 헤어핀/스템-루프 구조에 대해 약 >-9.6 kcal/mol 초과의 MFE 구조의 폴딩 ΔG 값을 갖는다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 서열을 인코딩하는 서열을 포함하지 않는다.
[0093] 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 자가단백질분해 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하며, 이는 N-말단 선도 서열 없이 관심 단백질의 원활한 및/또는 인슐레이트된(insulated) 발현을 촉진하는데 유용할 수 있다. 적합한 자가단백질분해 펩티드는 칼슘-의존성 세린 엔도프로테아제(푸린), 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A), 구제역 바이러스(FMDV) 2A(F2A), 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A(E2A), 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 2A(T2A), 세포질 다면체증 바이러스 2A(BmCPV2A), 플래쉐리(Flacherie) 바이러스 2A(BmIFV2A)로부터 유래된 자가단백질분해 절단 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 자가단백질분해 펩티드에 대한 코딩 서열은 제한 부위(들)의 상류에 혼입된다. 본 출원의 목적을 위해, 핵산 서열과 관련하여 용어 "상류"는 해당 핵산 서열의 5' 말단에 위치한 영역을 지정하고, 용어 "하류"는 상기 핵산 서열의 3' 말단에 위치한 영역을 지정한다. 따라서, 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자의 5' 플랭킹 도메인은 칼슘-의존성 세린 엔도프로테아제(푸린), 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A), 구제역 바이러스(FMDV) 2A(F2A), 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A(E2A), 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 2A(T2A), 세포질 다면체증 바이러스 2A(BmCPV2A), 플래쉐리(Flacherie) 바이러스 2A(BmIFV2A), 또는 이들의 조합으로부터 유래된 하나 이상의 자가단백질분해 절단 서열에 대한 코딩 서열을 포함한다.
[0094] 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 관심 단백질의 인슐레이트된 발현을 촉진하는데 유용할 수 있는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함한다. 일부 구현예에서, IRES 요소는 제한 부위(들)의 상류에 혼입된다. 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 IRES 서열은 바이러스 IRES 서열, 세포 IRES 서열, 및 인공 IRES 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. IRES 서열의 비제한적인 예는 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스(KSHV) IRES, 간염 바이러스 IRES, 페스티바이러스 IRES, 크리파바이러스 IRES, 로팔로시품 파디(Rhopalosiphum padi) 바이러스 IRES, 섬유모세포 성장 인자 IRES, 혈소판-유래 성장 인자 IRES, 혈관 내피 성장 인자 IRES, 인슐린-유사 성장 인자 IRES, 피코르나바이러스 IRES, 뇌심근염 바이러스(EMCV) IRES, Pim-1 IRES, p53 IRES, Apaf-1 IRES, TDP2 IRES, L-myc IRES, 및 c-myc IRES를 포함한다.
[0095] 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 임의의 리딩 프레임에 번역 시작 부위를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 5' 어댑터 서열의 마지막 뉴클레오티드로서 번역 시작 부위 또는 이의 일부(예를 들어, "A" 또는 "AT" 또는 "ATG"로 종료됨)를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 5' 어댑터 서열의 마지막 3개의 뉴클레오티드로서 메티오닌 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 약 15개 뉴클레오티드 내지 약 35개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 약 30개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 SEQ ID NO: 1과 적어도 70%, 예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 SEQ ID NO: 1과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 플랭킹 도메인은 SEQ ID NO: 1과 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 1' 플랭킹 도메인은 SEQ ID NO: 1과 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고, 추가로 여기서 핵산 서열에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드는 상이한 뉴클레오티드에 의해 치환된다.
[0096] 상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자의 3' 플랭킹 도메인은 스템-루프 구조와 같은 최소 이차 구조를 갖는 것으로 예측되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인의 서열은 미리 정의된 임계값보다 높은 최소 자유 에너지(MFE) 구조의 폴딩 ΔG 값을 갖는다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 서열을 인코딩하는 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 3' 어댑터 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드로서 번역 정지 코돈을 포함한다. 적합한 정지 코돈은 TAG, TAA, 및 TGA를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 3' 어댑터 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드로서 TAG 정지 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 3' 어댑터 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드로서 TAA 정지 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 3' 어댑터 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드로서 TAG 정지 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 70%, 예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 SEQ ID NO: 2와 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 플랭킹 도메인은 SEQ ID NO: 2와 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고, 추가로 여기서 핵산 서열에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드는 상이한 뉴클레오티드에 의해 치환된다.
[0097] 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자는 SEQ ID NO: 20과 적어도 70%, 예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자는 SEQ ID NO: 20과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자는 SEQ ID NO: 20과 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자는 SEQ ID NO: 20과 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고, 추가로 여기서 핵산 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드는 상이한 뉴클레오티드에 의해 치환된다.
제한 부위
[0098] 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자에서 제한 부위는 유형 I 제한 효소, 유형 II 제한 효소, 유형 III 제한 효소, 유형 IV 제한 효소, 유형 V 제한 효소, 및 귀소 엔도뉴클레아제로부터 선택된 제한 효소에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자에서 제한 부위, 예를 들어, 전체 핵산 작제물에서 독특한 제한 부위는 독특하게 절단될 수 있다. 제한 부위를 독특하게 하기 위해, 침묵 돌연변이는 선택적으로 핵산 작제물의 레플리콘-코딩 서열에서 제한 부위로 조작될 수 있다.
[0099] 일부 구현예에서, 제한 부위는 상이하고 이들의 인식 부위로부터 무작위 거리(적어도 1000 bp)로 떨어진 부위의 DNA를 절단하는 복잡한, 다중-서브유닛, 조합 제한-및-변형 효소인 유형 I 제한 효소로부터 선택된 제한 효소에 의해 절단될 수 있다. 이러한 무작위 부위에서의 절단은 DNA 전위의 과정을 따르며, 이는 이러한 효소가 또한 분자 모터임을 나타낸다. 인식 부위는 비대칭이고, 약 6-8개 뉴클레오티드의 비-특이적 스페이서에 의해 분리된, 하나는 3-4개 뉴클레오티드를 함유하고 다른 하나는 4-5개 뉴클레오티드를 함유하는 2개의 특정 부분으로 구성된다. 이러한 효소는 다기능이고 표적 DNA의 메틸화 상태에 따라 제한 절단 및 변형 활성 둘 모두가 가능하다. 보조인자 S-아데노실 메티오닌(AdoMet), 가수분해된 아데노신 트리포스페이트(ATP), 및 마그네슘(Mg2+) 이온은 이들의 완전한 활성에 필요하다.
[0100] 일부 구현예에서, 제한 부위는 전형적으로 회문인 특정 4 내지 8개의 뉴클레오티드 서열을 인식하고, 인식 서열 내의 정의된 위치에서 절단하여 점착성(5' 또는 3' 오버행) 또는 블런트 말단을 남기는 유형 II 제한 효소로부터 선택된 제한 효소에 의해 절단될 수 있다(예를 들어, 도 7 참조). 이들은 별개의 제한 단편 및 별개의 겔 밴딩 패턴을 생성하며, 이들은 일상적인 DNA 분석 및 유전자 클로닝을 위해 실험실에서 종종 사용된다. 예시적인 유형 II 효소는 이들의 인식 서열 내에서 DNA를 절단하는 HhaI, HindIII, 및 NotI를 포함한다. 많은 유형 II 효소가 상업적으로 이용 가능하다. 대부분은 동종이량체로서 DNA에 결합하기 때문에 대칭인 DNA 서열을 인식하지만, 소수(예를 들어, BbvCI)는 이종이량체로서 결합하기 때문에 비대칭 DNA 서열을 인식한다. 일부 유형 II 효소는 인식 서열의 2개의 절반-부위가 인접한 연속 서열을 인식(예를 들어, EcoRI)하는 반면, 다른 것은 절반-부위가 분리된 불연속 서열을 인식(예를 들어, BglI)한다. 절단은 각 절단의 한 면에 3'-하이드록실을 남기고 다른 면에 5'-포스페이트를 남긴다. 유형 II 효소는 활성을 위해 마그네슘을 필요로 하고 상응하는 변형 효소는 S-아데노실메티오닌을 필요로 한다. 유형 II 효소는 200-350개 아미노산 범위의 서브유닛을 갖는 소형인 경향이 있다. 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자에서 제한 부위는 SpeI 또는 이의 이소스키조머에 의해 절단될 수 있다. SpeI의 적합한 이소키조머는 AhII, BcuI, 및 SpeI-HF를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0101] 일부 구현예에서, 합성 어댑터 분자에서 제한 부위는 유형 IIS 제한 효소에 의해 절단될 수 있다. 유형 IIS 제한 효소는 인식 서열의 하류 또는 상류에서 정의된 거리에서 DNA를 절단하는 효소 그룹을 포함한다. 이는 촉매 및 인식 도메인이 폴리펩티드 링커에 의해 분리되는 효소 구조 때문이다. 절단 부위에서 염기의 동일성에 대한 서열 요건은 없고; 따라서, 인식 부위를 넘어선 서열은 뉴클레오티드의 임의의 조합일 수 있다(예를 들어, 도 7 참조). 유형 IIS 제한 효소는 이들의 인식 서열 외부를 한쪽으로 절단하는 FokI 및 AlwI와 같은 것들을 포함한다. 이러한 효소는 크기가 중간이고, 길이가 400-650개 아미노산이며, 연속적이고 비대칭인 서열을 인식한다. 이들은 2개의 별개의 도메인을 포함하는데, 하나는 DNA 결합을 위한 것이고, 다른 하나는 DNA 절단을 위한 것이다. 이들은 대부분 단량체로서 DNA에 결합하지만, 인접한 효소 분자의 절단 도메인의 이량체화를 통해 DNA를 협력적으로 절단하는 것으로 여겨진다. 이러한 이유로, 일부 유형 IIS 효소는 다중 인식 부위를 함유하는 DNA 분자에서 훨씬 더 활성이다.
[0102] 일부 구현예에서, 제한 부위는 유형 III 제한 효소(예를 들어, EcoP15)로부터 선택되는 제한 효소에 의해 절단될 수 있으며, 이는 큰 조합 제한-및-변형 효소이다. 유형 III 제한 효소는 역으로 배향된 2개의 개별 비-회문 서열을 인식한다. 이들은 인식 부위 이후 약 20-30개의 염기쌍으로 DNA를 절단한다. 이러한 효소는 하나 초과의 서브유닛을 함유하고, DNA 메틸화 및 제한 절단에서 이들의 역할을 위해 각각 AdoMet 및 ATP 보조인자를 필요로 한다. 유형 III 제한 효소는 외래 DNA의 침입으로부터 유기체를 보호하는 원핵생물 DNA 제한-변형 메커니즘의 성분이다. 유형 III 효소는 2개의 서브유닛, Res(P08764) 및 Mod(P08763)로 구성된 헤테로-올리고머, 다기능성 단백질이다. Mod 서브유닛은 시스템에 특이적인 DNA 서열을 인식하고 변형 메틸트랜스퍼라제이고; 그 자체로, 이는 유형 I 제한 엔도뉴클레아제의 M 및 S 서브유닛과 기능적으로 동등하다. Res는 제한 절단에 필요하지만, 자체적으로는 효소 활성이 없다. 유형 III 효소는 짧은 5-6 bp-길이의 비대칭 DNA 서열을 인식하고, 25-27 bp 하류를 절단하여 짧은 단일-가닥 5' 돌출부를 남긴다. 이들은 제한 절단이 일어나기 위해 2개의 역방향으로 배향된 비메틸화된 인식 부위의 존재를 필요로 한다. 이러한 효소는 아데노실 잔기의 N-6 위치에서 DNA의 한 가닥만을 메틸화하므로, 새로 복제된 DNA는 단 하나의 가닥이 메틸화될 것이며, 이는 제한 절단으로부터 보호하기에 충분하다. 유형 III 효소는 N6 아데닌 메틸트랜스퍼라제의 베타-서브패밀리에 속하며, 이는 모티프 I, AdoMet 결합 포켓(FXGXG), 및 모티프 IV, 촉매 영역(S/D/N (PP) Y/F)를 포함하는 이러한 패밀리에 특징적인 9개의 모티프를 함유한다. 유형 I, II, III, 및 IV V DNA 제한 시스템에 관한 추가 정보는, 예를 들어, 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Leonen et al., Nucleic Acids Res (2014) 42(1):3-19]에서 발견될 수 있다.
[0103] 일부 구현예에서, 제한 부위는 변형된, 선택적으로 메틸화된 DNA를 인식하고 이. 콜라이(E. coli)의 McrBC 및 Mrr 시스템에 의해 예시되는 유형 IV 제한 효소로부터 선택된 제한 효소에 의해 절단될 수 있다.
[0104] 일부 구현예에서, 제한 부위는 침입 유기체에서 발견되는 특정 비-회문 서열을 표적화하기 위해 가이드 RNA(gRNA)를 이용하는 유형 V 제한 효소로부터 선택된 제한 효소에 의해 절단될 수 있다. 유형 V 제한 효소는 적합한 가이드 RNA가 제공된다면, 가변 길이의 DNA를 절단할 수 있다. 유형 V 제한 효소의 비제한적인 예는 CRISPR로부터의 cas9-gRNA 복합체를 포함한다.
[0105] 일부 구현예에서, 제한 부위는 귀소 엔도뉴클레아제(예를 들어, I-SceI)에 의해 절단될 수 있다. 귀소 엔도뉴클레아제는 일반적으로 인트론 또는 인테인에 내장된 큰 비대칭 인식 부위(12-40개 염기쌍) 및 코딩 서열을 갖는 이중 가닥 DNase이다. 일반적으로, 귀소 엔도뉴클레아제는 이들의 큰 비대칭 인식 서열의 하류 또는 상류에서 정의된 거리(12-40개 염기쌍)에서 DNA를 절단한다. 많은 양의 생화학적 및 구조적 데이터가 지난 수십 년 동안 이러한 효소에 대해 보고되었으며, 예를 들어, 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Chevalier and Stoddard, Nucleic Acids Res (2001) 29(18): 3757-3774]에서 발견될 수 있다. 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 귀소 엔도뉴클레아제의 예는 I-CeuI, I-SceI, PI-PspI, 및 PI-SceI를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0106] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열의 바로 하류에 혼입된 추가 제한 부위를 추가로 포함한다. 핵산 작제물이 원형 형태인 경우, 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열의 바로 하류에 혼입된 추가 제한 부위는 원형 핵산 작제물의 선형화를 촉진하여 "클린(clean)" 폴리(A) 주형 말단 및/또는 동일한 말단 동일성을 갖는 핵산 생성물을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 제한 부위는 탈-콘카테머화된(de-concatemerized) 롤링 원 증폭(RCA) 생성물의 생성 또는 동일한 말단 동일성을 남기는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 생성물의 가공을 가능하게 할 수 있다. 당업자는 "클린" 폴리(A) 주형 말단이 일반적으로 런-오프(run-off) 전사에 의해 종료되는 RNA IVT 생성물에 대한 주형으로 작용하여 3' 비-A 잔기가 없는 폴리(A) 서열을 함유하는 RNA 생성물을 생성시키는 동종중합체 서열을 갖는 DNA 서열 말단을 나타낸다는 것을 이해할 것이다. 일 양태에서, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 폴리(A) 꼬리를 포함하는 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 포함하는 핵산 작제물에 관한 것이며, 여기서 추가 제한 부위는 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열의 바로 하류에서 조작된다. 일부 구현예에서, 추가 제한 부위는 유형 IIS 제한 효소에 의해 절단될 수 있다. 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 유형 IIS 제한 효소의 예는 AcuI, AlwI, Alw26I, BaeI, BbiI, BbsI, BbsI-HF, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BsaI-HF, BsaI-HFv2, BsaXI, BseGI, BseRI, BsgI, BsmAI, BsmBI-v2, BsmFI, BsmI, BspCNI, BspMI, BspQI, BsrDI, BsrI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, 및 BtsIMutI을 포함한다. 추가의 적합한 유형 IIS 제한 효소는 CspCI, EarI, EciI, Eco31I, Esp3I, FauI, FokI, HgaI, HphI, HpyAV, LpuI, MboII, MlyI, MmeI, MnlI, NmeAIII, PaqCI, PleI, SapI, 및 SfaNI를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 추가의 제한 부위는 SapI, BpiI, BmsI, Mva1269I 또는 이들의 임의의 이소스키조머에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 제한 부위는 SapI 또는 이의 이소스키조머에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, SapI의 이소스키조머는 LguI, PciSI, 또는 BspQI이다.
[0107] 본원에 개시된 바와 같은 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA), 예를 들어, 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열의 하류에 혼입된 제한 부위를 포함하는 것들이 3' 말단에 비-아데닐레이트 잔기가 없는 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)를 발생시킨다는 입증은 최신 기술의 레플리콘이 가장 일반적으로 3' 말단에 비-아데닐레이트 잔기를 함유하기 때문에 놀랍게도 향상된 생물학적 활성을 입증한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 변형된 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)의 복제, 발현, 및/또는 번역 향상 활성의 수준은 상응하는 비변형된 레플리콘(예를 들어, srRNA), 예를 들어, 3' 말단에 비-아데닐레이트 잔기를 갖는 레플리콘(예를 들어, srRNA)으로부터 검출된 복제, 발현 또는 번역 수준에 비해 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2(2배), 3, 4, 5, 6, 7, 8배, 또는 그 초과이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 변형된 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)의 복제, 발현, 및/또는 번역 향상 활성의 수준은 상응하는 비변형된 레플리콘(예를 들어, srRNA), 예를 들어, 3' 말단에 비-아데닐레이트 잔기를 갖는 레플리콘(예를 들어, srRNA)로부터 검출된 복제, 발현, 또는 번역 수준에 비해 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100%만큼 증가된다. 향상 활성의 수준은 전사체 수준, 단백질의 양, 단백질 활성 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 당 분야에 공지된 임의의 편리한 방법 및 기술에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 향상 활성의 수준은 조직 배양물에서 세포로 형질전환된 RNA의 주어진 질량(용량)에서 이중-가닥 RNA를 함유하는 세포의 더 높은 백분율에 의해 입증될 수 있다. 일부 구현예에서, 향상 활성의 수준은 조직 배양물에서 세포로 형질전환된 RNA의 주어진 질량(용량)에서 단백질을 발현하는 세포의 더 높은 백분율에 의해 입증될 수 있다.
[0108] 임의의 특정 이론으로 제한됨이 없이, 향상된 복제, 발현 또는 번역 수준은 정상 알파바이러스 생물학에서 표준적으로 나타나지 않는 재조합 RNA 분자의 3' 말단에서 비-A 뉴클레오티드의 부재로 인한 것일 수 있다. 본원에 설명된 변형된 알파바이러스 설계는 SP6 또는 T7 RNA 중합효소가 종종 "종료자"로서 공지된 특징부에서 폴리(A)의 하류에 있는 서열(비-As 포함)을 전사하는 동안 종료되는 RNA 생성물을 전사하는 데 사용되거나, 제한 효소가 런-오프 전사에 의해 종료되지만 RNA의 3' 말단에 혼입될 비-아데닐레이트 잔기를 생성시키는 RNA 생성물을 인코딩하는 주형을 선형화하는 데 사용되는 기존 알파바이러스 벡터와 완전히 대조적이다.
[0109] 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 선형 DNA 주형을 생성하기 위해 후속적으로 절단되는 폴리(A) 꼬리의 하류로의 유형 IIS 제한 효소의 혼입은 RNA 중합효소 종료자 서열의 존재 없이 런-오프 전사에 의해 전사를 종료시킨다. 하기 설명되는 실험에서, 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제 부위는 SapI 인식 서열의 상류를 절단하여, 선형화된 DNA의 3' 말단에 폴리(A) 주형만을 남기는(즉, 비-A 뉴클레오티드는 DNA 주형 또는 전사된 RNA 생성물에 있을 것임) SapI 부위이다. 이러한 접근법은 레플리콘에 대해 설명되지 않았으며, 폴리(A) 꼬리에서 독점적인 아데닐레이트 잔기의 존재는 레플리콘에 생물학적 활성의 임의의 향상을 부여하는 것으로 설명되지 않았으며, 여기서 가장 일반적인 방법은 둘 모두가 전형적으로 전사 생성물의 말단에 비-아데닐레이트 뉴클레오티드를 남기는 전사 종료자 또는 런-오프 전사, 또는 3' UTR 후에 여전히 비-아데닐레이트 잔기를 함유하는 시험관내 전사된 생성물의 효소적 폴리(A) 테일링을 사용하는 것이다.
[0110] 상기 논의된 바와 같이, 알파바이러스 유전체가 복제되기 위해서는, 3' UTR 다음의 폴리(A) 꼬리에서 11개의 잔기가 마이너스-가닥 합성을 효율적으로 개시하고, 따라서 복제가 일어나는데 필요하다는 것이 이전에 보고되었다. 또한, 폴리(A)에서 내부 비-A 잔기는 가장 흔히 복제에 유해하며, 이는 효소적 폴리(A) 테일링이 3' UTR 이후에 3' 아데닐레이트 잔기를 독점적으로 함유하지 않은 레플리콘 RNA에 이점이 없음을 시사한다. 폴리(A) 꼬리에 25개 초과의 아데닐레이트 잔기, 예를 들어, 폴리(A) 꼬리에 34개의 아데닐레이트 잔기를 갖는 RNA 주형에 대한 마이너스-가닥 합성의 향상은 없는 것으로 이전에 보고되었다. 이와 관련하여 추가 정보는, 예를 들어, 문헌[Hardy & Rice, J. Virol. Pp. 4630-4639, April 2005]에서 발견될 수 있다.
[0111] 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)의 폴리(A) 꼬리는 보고된 알파바이러스 생물학 또는 알파바이러스 레플리콘에 기반하여 예상치 못한 복제, 발현 또는 번역 수준을 향상시키기 위해 DNA 주형 상의 폴리(A)의 길이를 증가시킴으로써 연장된다. 특히, 본원에 제시된 실험 데이터는 폴리(A) 꼬리의 길이를 증가시킴으로써 RNA 복제 및 단백질 발현의 형태로 생물학적 활성 수준의 놀라운 변화(예를 들어, 증가)를 입증하였다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 연장된 서열은 약 30 내지 약 120개의 아데닐레이트 잔기, 예를 들어, 약 30 내지 약 60, 약 40 내지 약 70, 약 50 내지 약 80, 약 60 내지 약 90, 약 70 내지 약 100, 약 40 내지 약 80, 약 50 내지 약 70, 약 60 내지 약 90, 또는 약 40 내지 약 90개의 아데닐레이트 잔기 범위의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 연장된 폴리(A) 꼬리는 약 34개 잔기보다 길다. 일부 구현예에서, 연장된 폴리(A) 꼬리는 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 및 약 100개의 아데닐레이트 잔기의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 연장된 폴리(A) 꼬리는 30개의 아데닐레이트 잔기의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 연장된 폴리(A) 꼬리는 49개의 아데닐레이트 잔기의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 연장된 폴리(A) 꼬리는 91개의 아데닐레이트 잔기의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 연장된 폴리(A) 꼬리는 90개의 아데닐레이트 잔기의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 연장된 폴리(A) 꼬리는 64개의 아데닐레이트 잔기의 길이를 갖는다.
[0112] 향상된 활성의 수준은 전사체 수준, 단백질의 양, 및/또는 단백질 활성 등을 측정하는 방법 및 기술을 포함하나 이에 제한되지 않는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법 및 기술에 의해 측정될 수 있다.
[0113] 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 토가바이러스과 과의 알파바이러스 속에 속하는 바이러스의 변형된 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)를 포함하는 변형된 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)를 포함한다. 독성 및 무독성 알파바이러스 균주 둘 모두가 적합하다. 일부 구현예에서, 변형된 유전체 또는 레플리콘 RNA는 VEEV/EEEV 그룹, 또는 SFV 그룹, 또는 SINV 그룹에 속하는 알파바이러스의 것이다. 일부 구현예에서, 알파바이러스는 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 에버글레이즈 바이러스(EVEV), 무캄보 바이러스(MUCV), 픽수나 바이러스(PIXV), 미들버그 바이러스(MIDV), 치쿤구니야 바이러스(CHIKV), 오녕-뇽 바이러스(O'Nyong-Nyong virus; ONNV), 로스 리버 바이러스(RRV), 바르마 포레스트 바이러스(BF), 게타 바이러스(GET), 사기야마 바이러스(SAGV), 베바루 바이러스(BEBV), 마야로 바이러스(MAYV), 우나 바이러스(UNAV), 신드비스 바이러스(SINV), 아우라 바이러스(AURAV), 와타로아 바이러스(WHAV), 바반키 바이러스(BABV), 키질라가흐 바이러스(KYZV), 서부 말 뇌염 바이러스(WEEV), 하이랜드 J 바이러스(HJV), 포트 모르간 바이러스(FMV), 은두무(NDUV), 및 버기 크릭 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 알파바이러스는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV)이다. 일부 구현예에서, 알파바이러스는 치쿤구니야 바이러스(CHIKV)이다. 일부 구현예에서, 알파바이러스는 신드비스 바이러스(SINV)이다. 일부 구현예에서, 알파바이러스는 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV)이다.
[0114] 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 CHIKV 균주의 비제한적인 예는 CHIKV S27, CHIKV LR2006-OPY-1, CHIKV YO123223, CHIKV DRDE, CHIKV 37997, CHIKV 99653, CHIKV Ag41855, 및 Nagpur(India) 653496 균주를 포함한다. 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 CHIKV 균주의 추가 예는 문헌[Afreen et al. Microbiol. Immunol. 2014, 58:688-696, Lanciotti and Lambert ASTMH 2016, 94(4):800-803 및 Langsjoen et al. mBio. 2018, 9(2):e02449-17]에 설명된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 CHIKV 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)는 CHIKV 균주 S27로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 변형된 CHIKV 유전체 또는 레플리콘 RNA는 CHIKV 균주 DRDE로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 변형된 CHIKV 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)는 CHIKV 균주 DRDE-06로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 변형된 CHIKV 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)는 CHIKV 균주 DRDE-07로부터 유래된다.
[0115] 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 SINV 균주의 비제한적인 예는 SINV 균주 AR339, AR86, 및 Girdwood를 포함한다. 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 SINV 균주의 추가 예는 문헌[Sammels et al. J. Gen. Virol. 1999, 80(3):739-748, and Pfeffer Vector Borne Zoonotic Dis. 2010, 10(9):889-907, Sigei et al. Arch. of Virol. 2018, 163:2465-2469 및 Ling et al. J. Virol. 2019, 93:e00620-19]에 설명된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 SINV 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)는 SINV 균주 Girdwood로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 변형된 SINV 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)는 SINV 균주 Girdwood 및 SINV 균주 AR86의 키메라이다.
[0116] 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 VEEV 균주의 비제한적인 예는 204381, 306425, 3880, 3908, 6119, 66637, 68U201, 69Z1, 83U434, 93-42124, 96-32863, AB66640, An9004, C-84, CPA-201, FSL0201, INH-6803, INH-9813, Pan36080, P676, SH3, TC-83, TRD, V178, V198, V209A, V3526, 및 ZPC738을 포함한다.
[0117] 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 EEEV 균주의 비제한적인 예는 300851, 436087, 783372, 792138, AR36, AR38, AR59, BG60, BR56, BR60, BR65, BR67, BR75, BR76, BR77, BR78, BR83, BR85, C-49, CO92, CT90, EC74, FL02a-b, FL82, FL91, FL93-1637, FL93-939, FL93-969, FL96, GA01, GA91, GA97, GML, GML903836, GU68, LA02, LA47, LA50, MA06, MA38, MA77, MD85, MD90A, MP-9, MS83, MX97, NJ03a-b, NJ60, NY03a-d, NY04a-k, NY05a-f, NY69, NY71a-c, NY73, NY74a-h, NY75, PA62, PA84, PA86, PE-0.0155-96, PE-16.0050-98, PE-18.0140-99, PE-18.0172-99, PE-3.0815-96, PE6, PE70, PE75, TN08, TR59, TVP8512, TX03, TX91, TX95, VA03, VA33, VA33, VE76, VE80, 및 W180을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 EEEV 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)는 EEEV 균주 FL93-939로부터 유래된다.
[0118] 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 WEEV 균주의 비제한적인 예는 WEEV California, McMillan, IMP181, Imperial, Imperial181, IMPR441, 71V-1658, AG80-646, BFS932, COA592, EP-6, E1416, BFS1703, BFS2005, BSF3060, BSF09997, CHLV53, KERN5547, 85452NM, Montana-64, S8-122, 및 TBT-235를 포함한다. 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 WEEV 균주의 추가 예는 5614, 93A27, 93A30, 93A38, 93A79, B628(Cl 15), CBA87, CNTR34, CO921356, Fleming, Lake43, PV012357A, PV02808A, PV72102, R02PV001807A, R02PV002957B, R02PV003422B, R05PV003422B, R0PV003814A 및 R0PV00384A를 포함한다. 추가적인 적합한 WEEV 균주는 문헌[Bergren NA et al., J. Virol. 88(16): 9260-9267, Aug 2014], 및 바이러스 병원체 자원(Virus Pathogen Resource) 웹사이트(ViPR; www.viprbrc.org/brc/vipr_gemone_search.spg?method=SubmitForm&blockId=868&decorator=toga에서 공개적으로 이용 가능함)에 설명된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 WEEV 유전체 또는 srRNA는 WEEV 균주 Imperial로부터 유래된다.
[0119] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 하나 이상의 발현 카세트를 추가로 포함한다. 원칙적으로, 본원에 개시된 핵산 작제물은 일반적으로 임의의 수의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 당업자는 용어 "발현 카세트"가 생체내 및/또는 생체외에서 세포에서 코딩 서열의 적절한 전사 및/또는 번역을 지시하기에 충분한 조절 정보 및 코딩 서열을 함유하는 유전 물질의 작제물을 지칭한다는 것을 이해할 것이다. 발현 카세트는 원하는 숙주 세포 및/또는 대상체로의 표적화를 위해 벡터에 삽입될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 용어 발현 카세트는 용어 "발현 작제물"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "발현 카세트"는, 예를 들어, 프로모터 및/또는 종료 신호와 같은 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩하는 유전자, 및 선택적으로 유전자의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 임의의 다른 핵산 서열 또는 이의 조합을 포함하는 핵산 작제물을 지칭한다.
[0120] 일부 구현예에서, 발현 카세트 중 적어도 하나는 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 따라서, 본원에 제공된 바와 같은 핵산 작제물은, 예를 들어, 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소(예를 들어, 프로모터)를 포함하는 경우, 이종성 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 벡터로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트 중 적어도 하나는 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 하위유전체(sg) 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, sg 프로모터는 26S 하위유전체 프로모터이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 분자는 하나 이상의 비번역 영역(UTR)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, UTR 중 적어도 하나는 이종성 UTR이다. 일부 구현예에서, 이종성 UTR 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 16의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 UTR 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 17의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[0121] 일부 구현예에서, 발현 카세트 중 적어도 하나는 관심 유전자(GOI)에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, GOI 코딩 서열은 합성 어댑터 분자의 3' 플랭킹 도메인의 상류에 위치한 정지 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 요망되는 특성에 대해 최적화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 참조 코딩 서열의 발현 수준보다 높은 수준에서의 발현을 위해 최적화된다. 뉴클레오티드 서열의 서열-최적화와 관련하여, 유전 코드의 축퇴성은 유전자로부터 생산된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시키지 않으면서 유전자의 단백질 인코딩 서열의 적어도 하나의 염기를 상이한 염기로 치환시킬 가능성을 제공한다. 따라서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 또한 유전자 코드의 축퇴성에 따른 치환에 의해 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 변경된 임의의 염기 서열을 가질 수 있다. 코돈 사용을 설명하는 참고문헌은 쉽게 공개적으로 이용 가능하다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열 변이체는 다양한 이유로, 예를 들어, 특정 숙주에 대한 발현을 최적화하기 위해(예를 들어, 알파바이러스 mRNA에서 코돈 사용을 인간, 비-인간 영장류, 햄스터, 마우스, 또는 원숭이와 같은 다른 유기체에 의해 선호되는 것들로 변경함) 생산될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 발현을 위해 최적화된 코돈의 사용을 통해 표적 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된다. 숙주 세포 발현에 최적인 바람직한 코돈을 사용하여 GOI를 인코딩하는 합성 핵산 서열의 작제를 위한 기술은 당 분야에 널리 공지된 기술에 의해 숙주 세포 유전체의 고유 단백질을 인코딩하기 위한 코돈 사용의 공통성 및 이들의 상대적 풍부도를 분석하는 컴퓨터 방법에 의해 결정될 수 있다. 코돈 사용 데이터베이스(http://www.kazusa.or.jp/codon)는 포유동물 세포 환경에서 코돈 최적화된 서열의 생성에 사용될 수 있다. 또한, JCat Codon Optimization Tool(www.jcat.de), Integrated DNA Technologies(IDT) Codon Optimization Tool(https://www.idtdna.com/CodonOpt) 또는 Optimizer 온라인 코돈 최적화 도구(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER)와 같은 다양한 소프트웨어 도구가 하나의 유기체로부터의 서열을 상이한 숙주 유기체에 대한 최적 코돈 사용으로 전환시키는 데 이용 가능하다. 이러한 합성 서열은 합성 핵산 분자의 작제를 위해 당 분야에 공지된 기술에 의해 작제될 수 있고, 다양한 상업적 벤더로부터 획득될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 참조 코딩 서열, 예를 들어, 코돈-최적화되지 않은 코딩 서열의 발현 수준보다 높은 수준에서의 발현을 위해 최적화된다. 일부 구현예에서, GOI의 코돈-최적화된 서열은 발현 수준을 코돈-최적화되지 않은 참조 코딩 서열에 비해 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%만큼 증가시킨다. 일부 구현예에서, GOI의 코돈-최적화된 서열은 발현 수준을 코돈-최적화되지 않은 참조 코딩 서열에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 또는 적어도 5배만큼 증가시킨다.
[0122] GOI에 의해 인코딩되는 폴리펩티드는 일반적으로 임의의 폴리펩티드일 수 있고, 예를 들어, 치료용 폴리펩티드, 예방용 폴리펩티드, 진단용 폴리펩티드, 기능식품용 폴리펩티드, 산업용 효소, 및 리포터 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 항체, 항원, 면역 조절제, 효소, 신호전달 단백질, 또는 사이토카인일 수 있는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, GOI는 미생물 단백질, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 진균 단백질, 포유동물 단백질, 및 이들의 임의의 조합을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 헤마글루티닌 전구체(HA)를 인코딩한다. GOI의 비제한적인 예는 G-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-10, IL-10-유사, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-18BP, IL-1-유사, IL-1RA, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-20, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6-유사, IL-7, IL-9, IL-21, IL-22, IL-33, IL-37, IL-38, LIF, 및 OSM을 포함하는 인터루킨 및 상호작용 단백질을 포함한다. 추가의 적합한 GOI는 인터페론(예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ), TNF(예를 들어, CD154, LT-β, TNF-α, TNF-β, 4-1BBL, APRIL, CD70, CD153, CD178, GITRL, LIGHT, OX40L, TALL-1, TRAIL, TWEAK, 및 TRANCE), TGF-β(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2, 및 TGF-β3), 헤마토포이에틴(예를 들어, Epo, Tpo, Flt-3L, SCF, M-CSF, MSP), 케모카인 및 이들의 수용체(예를 들어, XCL1, XCL2, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, 및 CX3CL1), 면역억제성 유전자 생성물 및 관련 전사 인자(예를 들어, PECAM1, FCGR3A, FOS, NFKB1, JUN, HIF1A, PD-L1, mTOR, STAT5B, 및 STAT4)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 추가의 GOI는 면역자극성 유전자 생성물(예를 들어, CD27/CD70, CD40, CD40L, B7.1, BTLA, MAVS, OX40, OX40L, RIG-I, 및 STING), 유전자의 약물 내성 돌연변이체/변이체, 예를 들어, ABCB1, ABCC1, ABCG2, AKT1, ALK, BAFF, BCR-ABL, BRAF, CCND1, cMET, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERK2, ESR1, GRB2, KRAS, MDR1, MRP1, NTRK1, PDC4, P-gp, PI3K, PTEN, RET, ROS1, RSK1, RSK2, SHIP, 및 STK11을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 것은 바이러스 단백질, 특히 스파이크 단백질, 섬유 단백질, 구조 단백질, 및 부착 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다.
[0123] 일부 구현예에서, GOI는 항체 또는 항체 변이체(예를 들어, 단일 사슬 Fv, 이중특이적, 카멜리드, Fab, 및 HCAb)를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 암과 관련되거나 암으로 상향조절된 표면 분자, 또는 감염성 질병과 관련된 표면 분자를 표적화한다. 일부 구현예에서, 항체는 면역자극 기능을 갖거나 면역억제 기능을 갖는 표면 분자를 표적화한다.
[0124] 일부 구현예에서, GOI는 결핍 또는 돌연변이가 질병 또는 건강 질환과 관련된 효소, 예를 들어, 아갈시다제 베타, 아갈시다제 알파, 이미글루세라제, 탈리글루세라제 알파, 벨라글루세라제 알파, 알글루세라제, 세벨리파제 알파, 라로니다제, 이두르설파제, 엘로설파제 알파, 갈설파제, 알글루코시다제 알파, 및 CTFR을 인코딩할 수 있다.
[0125] 일부 구현예에서, GOI는 항원 분자, 생물치료 분자, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 종양-관련 항원, 종양-특이적 항원, 신생항원, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 에스트로겐 수용체, 세포내 신호 변환기 효소, 및 인간 상피 성장 수용체로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 면역조절제, 혈관신생의 조절제, 세포외 기질의 조절제, 대사의 조절제, 신경학적 조절제, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 생물치료용 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인, 및 종양 괴사 인자로부터 선택된 사이토카인을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-15, IL-17, IL-23, IL-27, IL-35, IFNγ 및 이들의 임의의 서브유닛으로부터 선택된 인터루킨을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 IL-12A, IL-12B, IL-1RA, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 생물치료용 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
[0126] 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA)를 인코딩하는 핵산 작제물을 선형화하는데 사용되는 제한 효소 부위(들)를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 벡터 내에 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 벡터는 단일-가닥 벡터, 예를 들어, ssDNA 벡터 또는 ssRNA 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 벡터는 이중-가닥 벡터, 예를 들어, dsDNA 벡터 또는 dsRNA 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 벡터는 플라스미드일 수 있다. 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 벡터는 재조합 DNA 기술, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 롤링 서클 증폭(RCA), 분자 클로닝 등, 또는 화학적 합성을 이용하여 생산될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 벡터는 완전 합성 벡터, 예를 들어, 완전 합성 ssDNA 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 벡터는 완전 합성 dsDNA 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 벡터는 PCR 반응의 생성물일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 벡터는 RCA 반응의 생성물일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자 전달 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달 비히클로서 사용될 수 있다.
[0127] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 3-27로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 알파바이러스를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 알파바이러스를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 알파바이러스를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 알파바이러스를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 알파바이러스를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 22의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 알파바이러스를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 23의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 알파바이러스를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 24의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 알파바이러스를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 25의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 알파바이러스를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 알파바이러스를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
[0128] 관심 변형 알파바이러스의 서열과 높은 정도의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)을 갖는 핵산 서열은 유전체 서열 분석, 하이브리드화, 및/또는 각각의 알파바이러스 유전체에서 확인된 서열로부터의 유전자-특이적 프라이머 또는 축퇴성 프라이머를 이용한 PCR에 의해 본원에서 확인된 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 3-27) 또는 당 분야에 공지된 임의의 다른 서열을 사용하여 확인 및/또는 분리될 수 있다.
[0129] 이러한 새로운 핵산 작제물을 조립하고 특성규명하는 분자 기술 및 방법은 본 출원의 실시예에 더욱 완전하게 설명되어 있다. 실시예 섹션에서, 치쿤구니야 바이러스(CHIKV), 신드비스 바이러스(SINV), 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV), 및 베네수엘라 말 뇌염(VEE) 바이러스가 본원에 개시된 조성물 및 방법을 예시하기 위해 사용되었다.
[0130] 일부 구현예에서, 핵산 분자는 재조합 핵산 분자이다. 본원에서 사용되는 용어 재조합은 간접적이지만 인간 조작의 결과인 임의의 분자(예를 들어, DNA, RNA, 폴리펩티드)를 의미한다. 비제한적인 예로서, cDNA는 시험관내 중합효소 반응(들)에 의해 생성되거나 링커가 부착되거나 벡터, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 통합된 임의의 핵산 분자와 마찬가지로 재조합 DNA 분자이다. 비제한적인 예로서, 재조합 핵산 분자는 1) 예를 들어, 화학적 또는 효소적 기술을 사용하거나(예를 들어, 화학적 핵산 합성의 사용에 의함) 복제, 중합, 외핵분해성 분해, 내핵분해성 분해, 라이게이션, 역전사, 전사, 염기 변형(예를 들어, 메틸화 포함), 또는 핵산 분자의 재조합(상동성 및 부위-특이적 재조합 포함)을 위한 효소의 사용에 의해 시험관 내에서 합성 또는 변형되었고/되었거나; 2) 자연에서는 결합되지 않은 결합된 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 3) 자연 발생 뉴클레오티드 서열과 관련하여 하나 이상의 뉴클레오티드가 결여되도록 분자 클로닝 기술을 사용하여 조작되었고/되었거나; 4) 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 대해 하나 이상의 서열 변화 또는 재배열을 갖도록 분자 클로닝 기술을 사용하여 조작되었다.
[0131] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 분자는 재조합 DNA 기술(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 클로닝 등) 또는 화학적 합성을 사용하여 생산된다. 본원에 개시된 바와 같은 핵산 분자는 자연 대립유전자 변이체 및 변형이 본원에 설명된 바와 같은 생물학적 활성을 달성하는데 있어서 요망되는 특성을 제공하는 방식으로 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기가 삽입, 결실 및/또는 치환된 변형된 핵산 분자를 포함하나 이에 제한되지 않는 자연 핵산 분자 및 이의 상동체를 포함한다.
[0132] 자연 발생 핵산 서열의 변이체를 포함하는 핵산 분자는 당업자에게 공지된 다수의 방법을 사용하여 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 참조). 핵산 분자의 서열은 자연 발생 서열과 관련하여 변형될 수 있으며, 이는 고전적인 돌연변이유발 기술 및 재조합 DNA 기술, 예를 들어, 비제한적으로, 부위-지시된 돌연변이유발, 돌연변이를 유도하기 위한 핵산 분자의 화학적 처리, 핵산 단편의 제한 효소 절단, 핵산 단편의 라이게이션, 핵산 서열의 선택된 영역의 PCR 증폭 및/또는 돌연변이유발, 재조합 클로닝, 및 올리고뉴클레오티드 혼합물의 화학적 합성 및 핵산 분자의 혼합물을 "구축"하기 위한 혼합물 그룹의 라이게이션을 포함하는 화학적 합성, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술을 사용하여 자연 발생 서열로부터 유래된다. 핵산 분자 상동체는 핵산 분자에 의해 인코딩된 단백질 또는 레플리콘(예를 들어, srRNA)의 기능에 대한 스크리닝 및/또는 야생형 유전자 또는 이의 단편과의 하이브리드화, 또는 표적 또는 야생형 핵산 분자 또는 서열과 상동성을 갖는 프라이머를 사용한 PCR에 의해 변형된 핵산 분자의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
B. 재조합 세포 및 세포 배양물
[0133] 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 일 양태는 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하고/하거나 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 포함(예를 들어, 발현)하도록 조작된 재조합 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA)은 숙주 세포 내로 도입되어 핵산 작제물 및/또는 srRNA 작제물을 함유하는 재조합 세포를 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 개시의 핵산 작제물은, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 숙주 세포에 도입되어 핵산 분자를 함유하는 재조합 세포를 생산할 수 있다. 따라서, 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 함유하는 원핵 또는 진핵 세포가 또한 본 발명의 개시의 특징이다. 관련된 양태에서, 본원에 개시된 일부 구현예는 숙주 세포, 예를 들어, 동물 세포에 본원에 제공된 바와 같은 핵산 작제물을 도입한 다음, 형질전환된 세포를 선택 또는 스크리닝하는 것을 포함하는 세포를 형질전환시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 개시의 핵산 작제물(예를 들어, DNA 또는 mRNA를 포함하는 RNA) 또는 벡터의 세포 내로의 도입은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 바이러스 감염, 형질감염, 컨쥬게이션, 원형질체 융합, 리포펙션, 전기천공, 뉴클레오펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개 형질감염, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포솜-매개 형질감염, 입자 총 기술, 직접 미세주입, 나노입자-매개 핵산 전달 등에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 이종성 핵산 분자를 포유동물 세포로 도입하는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜 내의 핵산 분자(들)의 캡슐화, 지질 나노입자 기술, 바이오리스틱 주입(biolistic injection) 및 DNA의 핵으로의 직접 미세주입을 포함한다.
[0134] 일 양태에서, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 재조합 세포, 예를 들어, 재조합 진핵 세포, 예를 들어, 본원에 설명된 핵산 작제물을 포함하는 동물 세포에 관한 것이다. 핵산 작제물은 숙주 유전체에 안정적으로 통합될 수 있거나, 에피솜으로 복제할 수 있거나, 안정하거나 일시적인 발현을 위해 미니-서클 발현 벡터로서 재조합 숙주 세포에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 에피솜 단위로서 재조합 숙주 세포에서 유지되고 복제된다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 재조합 세포의 유전체에 안정적으로 통합된다. 안정적인 통합은 고전적인 무작위 유전체 재조합 기술 또는 가이드 RNA 지시된 CRISPR/Cas9 또는 TALEN 유전체 편집을 사용하는 것과 같은 보다 정확한 유전체 편집 기술을 사용하여 완료될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 안정한 또는 일시적인 발현을 위한 미니-서클 발현 벡터로서 재조합 숙주 세포에 존재한다.
[0135] 숙주 세포는 형질전환되지 않은 세포 또는 적어도 하나의 핵산 분자로 이미 형질감염된 세포일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 적어도 하나의 핵산 분자로 유전적으로 조작(예를 들어, 형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염)될 수 있다.
[0136] 본원에 설명된 바와 같은 관심 단백질의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 설명된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 재조합 세포는 원핵 세포, 예를 들어, 박테리아 E. 콜라이, 또는 진핵 세포, 예를 들어, 곤충 세포(예를 들어, 모기 세포 또는 Sf21 세포), 또는 포유동물 세포(예를 들어, COS 세포, NIH 3T3 세포, 또는 HeLa 세포)이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 원핵 세포이다. 일부 구현예에서, 원핵 세포는 E. 콜라이 세포이다. 예를 들어, 관심 단백질은 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 생산될 수 있다. 발현 후, 관심 단백질은 가용성 분획으로 박테리아 세포 페이스트로부터 분리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
[0137] 일부 구현예에서, 세포는 생체내, 예를 들어, 생체 내의 재조합 세포, 예를 들어, 트랜스제닉 대상체의 세포이다. 일부 구현예에서, 대상체는 척추동물 또는 무척추동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 곤충이다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물 대상체이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 생체내 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 생체외 세포이고, 예를 들어, 치료 또는 절차를 위해 개별 세포로서 또는 기관 또는 조직의 일부로서, 생체 또는 유기체로부터 추출된 후, 생체 또는 유기체로 복귀된다. 일부 구현예에서, 세포는 시험관내 세포이고, 예를 들어, 저장소로부터 획득된다.
[0138] 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 재조합 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 척추동물 세포 또는 무척추 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 동물 세포는 포유동물 세포이다. 글리코실화된 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예는 곤충 세포를 포함한다.
[0139] 척추동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 척추동물 세포 또는 무척추 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 비-인간 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 비-인간 영장류 세포이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 추가 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7), 인간 배아 신장 세포주(예를 들어, 293 또는 293 세포), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부 암종 세포(HELA), 개과 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양(MMT 060562), TRI 세포, MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 및 Y0, NS0 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주를 포함한다.
[0140] 일부 구현예에서, 재조합 세포는 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(Vero 세포), 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 인간 A549 세포, 인간 자궁경부 세포, 인간 CHME5 세포, 인간 표피 후두 세포, 인간 섬유모세포, 인간 HEK-293 세포, 인간 HeLa 세포, 인간 HepG2 세포, 인간 HUH-7 세포, 인간 MRC-5 세포, 인간 근육 세포, 마우스 3T3 세포, 마우스 결합 조직 세포, 마우스 근육 세포, 및 토끼 신장 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0141] 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, 재조합 세포는 곤충 세포, 예를 들어, 곤충 세포주의 세포이다. 일부 구현예에서, 곤충 세포는 Sf21 세포이다. 추가의 적합한 곤충 세포주는 곤충 목 디프테라(Diptera), 나비목(Lepidoptera) 및 노린재목(Hemiptera)으로부터 확립된 세포주를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 상이한 조직 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 재조합 세포는 나비목 곤충 세포주의 세포이다. 지난 수십 년 동안, 나비목 곤충 세포주의 이용가능성은 10년 당 약 50 세포주로 증가하였다. 이용 가능한 나비목 곤충 세포주에 관한 더 많은 정보는, 예를 들어, 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Lynn D.E., Available lepidopteran insect cell lines. Methods Mol. Biol. 2007;388:117-38]에서 발견될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 모기 세포, 예를 들어, 얼룩날개모기(Anopheles; An.), 빨간집모기(Culex; Cx.) 및 흰줄숲모기(Aedes)(Stegomyia)(Ae.) 속 내의 모기 종의 세포이다. 본원에 설명된 조성물 및 방법에 적합한 예시적인 모기 세포주는 하기 모기 종으로부터의 세포주를 포함한다: 아에데스 아에기프티(Aedes aegypti), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus), 아에데스 슈도스쿠텔라리스(Aedes pseudoscutellaris), 아에데스 트리세리아투스(Aedes triseriatus), 아에데스 벡산스(Aedes vexans), 아노펠레스 감비아에(Anopheles gambiae), 아노펠레스 스테펜시(Anopheles stephensi), 아노펠레스 알비마누스(Anopheles albimanus), 쿨렉스 퀸퀘파시아투스(Culex quinquefasciatus), 쿨렉스 테일레리(Culex theileri), 쿨렉스 트리타에니오린쿠스(Culex tritaeniorhynchus), 쿨렉스 바이타에니오린쿠스(Culex bitaeniorhynchus), 및 톡소린키테스 암보이넨시스(Toxorhynchites amboinensis). 적합한 모기 세포주는 CCL-125, Aag-2, RML-12, C6/26, C6/36, C7-10, AP-61, A.t. GRIP-1, A.t. GRIP-2, UM-AVE1, Mos.55, Sua1B, 4a-3B, Mos.43, MSQ43, 및 LSB-AA695BB를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 모기 세포는 C6/26 세포주의 세포이다.
[0142] 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 본원에 제공된다. 일반적으로, 배양 배지는 본원에 설명된 세포를 배양하기 위한 임의의 적합한 배양 배지일 수 있다. 광범위한 상기 언급된 숙주 세포 및 종을 형질전환시키는 기술은 당 분야에 공지되어 있으며 기술 및 과학 문헌에 설명되어 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포를 포함하는 세포 배양물도 또한 본 출원의 범위 내에 있다. 세포 배양물을 생성하고 유지하는데 적합한 방법 및 시스템은 당 분야에 공지되어 있다.
B. 트랜스제닉 동물
[0143] 또한, 또 다른 양태에서, 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 트랜스제닉 동물이 제공된다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 척추동물 또는 무척추동물이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 포유동물이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 포유동물은 비-인간 포유동물이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 본원에 설명된 바와 같은 재조합 RNA 분자를 생산한다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 본원에 설명된 바와 같은 관심 단백질을 생산한다.
[0144] 본 발명의 개시의 트랜스제닉 비-인간 숙주 동물은 외인성 핵산을 비-인간 동물의 유전체로 도입하기 위해 당 분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 제조된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 비-인간 동물은 비-인간 영장류이다. 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 다른 동물 종은 (i) 형질전환에 적합하고, (ii) 면역글로불린 유전자 절편을 재배열하여 항체 반응을 생성할 수 있는 동물을 포함한다. 이러한 종의 예는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 닭, 염소, 돼지, 양 및 소를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 트랜스제닉 비-인간 동물을 제조하기 위한 접근법 및 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예시적인 방법은 전핵 미세주사, DNA 미세주사, 초기 배아로의 렌티바이러스 벡터 매개된 DNA 전달 및 정자-매개된 형질전환, 동물 정자(예를 들어, 돼지에서)로의 DNA의 아데노바이러스 매개 도입, 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 조류 종), 체세포 핵 전이(예를 들어, 염소에서)를 포함한다. 트랜스제닉 가축의 제조에서의 최신 기술은 문헌[Niemann, H. et al. (2005) Rev. Sci. Tech. 24:285-298]에서 검토된다.
[0145] 일부 구현예에서, 동물은 척추동물 또는 무척추동물이다. 일부 구현예에서, 동물은 포유동물 대상체이다. 일부 구현예에서, 포유동물은 비-인간 동물이다. 일부 구현예에서, 포유동물은 비-인간 영장류이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 트랜스제닉 동물은 고전적인 무작위 유전체 재조합 기술 또는 가이드 RNA-지시 CRISPR/Cas 유전체 편집, 또는 NgAgo(나트로노박테리움 그레고리이 아르고나우트(Natronobacterium gregoryi Argonaute))를 사용한 DNA-가이드 엔도뉴클레아제 유전체 편집, 또는 TALEN 유전체 편집(전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제)와 같은 보다 정확한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 트랜스제닉 동물은 트랜스제닉 미세주사 기술을 사용하여 제조될 수 있고, 상동성 재조합 기술의 사용을 필요로 하지 않으며, 따라서 상동성 재조합을 사용하는 접근법보다 제조 및 선택이 더 용이한 것으로 간주된다.
[0146] 또 다른 양태에서, 재조합 RNA 분자를 생산하기 위한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 (i) 본원에 설명된 바와 같은 트랜스제닉 동물을 사육하는 단계, 또는 (ii) 본원에 설명된 바와 같은 재조합 세포를 트랜스제닉 동물에 의해 또는 재조합 세포에서 재조합 RNA 분자가 생산되도록 하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함한다.
[0147] 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물 또는 재조합 세포는 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하며, 여기서 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 서열은 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열의 말단 뒤에 조작된 제한 부위를 절단할 수 있는 제한 효소에 의해 선택적으로 절단되어 폴리(A) 꼬리 및 3' 말단에 아데닐레이트 잔기만을 갖는 RNA를 인코딩하는 주형을 생성한다. 따라서, 본원에 설명된 방법에 따라 생산된 재조합 RNA 분자가 또한 본 발명의 개시에 의해 제공된다.
[0148] 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물 또는 재조합 세포는 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하고, 여기서 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 서열은 연장된 폴리(A) 꼬리를 함유한다. 따라서, 본원에 설명된 방법에 따라 생산된 재조합 RNA 분자가 또한 본 발명의 개시에 의해 제공된다.
[0149] 또 다른 양태에서, 관심 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (i) 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 트랜스제닉 동물을 사육하는 단계, 또는 (ii) 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 재조합 세포를 GOI에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 트랜스제닉 동물에 의해 또는 재조합 세포에서 생산되는 조건 하에 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 관심 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 본원에 설명된 핵산 작제물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 개시의 방법의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 척추동물 또는 무척추동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물 대상체이다. 일부 구현예에서, 포유동물 대상체는 인간 대상체이다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 재조합 폴리펩티드는 또한 본 발명의 개시의 범위 내에 있다.
[0150] 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위한 개시된 방법의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법은 생산된 폴리펩티드를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법은 반감기를 증가시키기 위해 생산된 폴리펩티드를 구조적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 설명된 바와 같은 재조합 폴리펩티드를 생산하는 방법의 일부 구현예에서, 생산된 폴리펩티드의 N-말단은 반감기를 증가시키기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 추가로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 생산된 폴리펩티드의 C-말단은 반감기를 증가시키기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형된다. 본원에 설명된 방법에 적합한 화학적 및 효소적 변형의 비제한적인 예는 PEG화, XTEN화, PASylation®, ELP화, 및 HAP화를 포함한다. 이러한 변형에 적합한 기술, 시스템, 및 시약은 당 분야에 공지되어 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 설명된 방법에 의해 생산된 폴리펩티드는 반감기를 증가시키기 위해 PEG화, XTEN화, PAS화, ELP화, 및/또는 HAP화될 수 있다. 일부 구현예에서, 생산된 폴리펩티드는 반감기를 증가시키기 위해 또 다른 단백질 또는 펩티드(예를 들어, 혈청 알부민, 항체 Fc 도메인, 트랜스페린, GLK, 또는 CTP 펩티드)에 컨쥬게이션된다.
D. 약학적 조성물
[0151] 본 발명의 개시의 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드는 약학적 조성물을 포함하는 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 본원에 설명되고 제공되는 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드 중 하나 이상, 및 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 담체 또는 희석제를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 조성물은 면역 질병 또는 미생물 감염과 같은 건강 질환의 예방, 치료 또는 관리를 위해 제형화된다. 예를 들어, 본 발명의 개시의 조성물은 예방학적 조성물, 치료학적 조성물, 또는 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물, 또는 이들의 혼합물로서 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 조성물은 백신으로서 사용하기 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 본 출원의 조성물은 애쥬번트로서 사용하기 위해 제형화된다.
[0152] 따라서, 일 양태에서, 약학적으로 허용되는 부형제 및 a) 본 발명의 개시의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자); b) 본 발명의 개시의 재조합 세포; 및/또는 c) 본 발명의 개시의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
[0153] 본 발명의 개시의 약학적 조성물의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자) 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 재조합 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 재조합 RNA 분자 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자)은 네이키드 형태로 사용되거나 전달 비히클과 함께 제형화될 수 있다. 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 예시적인 전달 비히클은 리포솜(예를 들어, 중성 또는 음이온성 리포솜), 미소구체, 면역 자극 복합체(ISCOMS), 지질-기반 나노입자(LNP), 고체 지질 나노입자(SLN), 폴리플렉스, 중합체 나노입자, 바이러스 레플리콘 입자(VRP), 또는 생물활성 리간드와의 컨쥬게이션을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이는 전달을 촉진하고/하거나 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 이러한 화합물은 당업자에게 용이하게 이용 가능하며; 예를 들어, 문헌[Liposomes: A Practical Approach, RCP New Ed, IRL press (1990)]을 참조한다. 리포솜 이외의 애쥬번트 등이 또한 사용되며 당 분야에 공지되어 있다. 애쥬번트는 항원(예를 들어, 핵산 작제물, 벡터, srRNA 분자)을 국소 침착물에 격리시킴으로써 이를 빠른 분산으로부터 보호할 수 있거나, 이들은 숙주가 대식세포 및 면역계의 다른 성분에 대해 화학주성인 인자를 분비하도록 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 하기 설명되는 것들로부터 적절한 선택을 할 수 있다.
[0154] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 조성물은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 생리학적 완충제, 리포솜, 지질-기반 나노입자(LNP), 고체 지질 나노입자(SLN), 폴리플렉스, 중합체 나노입자, 바이러스 레플리콘 입자(VRP), 미소구체, 면역 자극 복합체(ISCOM), 생물활성 리간드의 컨쥬게이트, 또는 이들의 임의의 조합.
[0155] 본 발명의 개시의 조성물은 리포솜, 지질-기반 나노입자(LNP), 또는 중합체 나노입자와 같은 이의 의도된 투여 경로와 양립할 수 있는 포맷으로 제형화될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 조성물은 리포솜으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 조성물은 지질-기반 나노입자(LNP)로 제형화된다. LNP는 일반적으로 바이러스 입자보다 덜 면역원성이다. 많은 인간이 바이러스 입자에 대한 기존의 면역성을 갖지만, LNP에 대한 기존의 면역성은 존재하지 않는다. 또한, LNP의 반복 투여를 가능하게 하는 LNP에 대한 적응 면역 반응은 일어날 가능성이 낮다.
[0156] 본원에 설명된 조성물 및 방법에 적합한 지질은 양이온성 지질, 이온화 가능한 양이온성 지질, 음이온성 지질, 또는 중성 지질일 수 있다.
[0157] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 LNP는 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "이온화 가능한 지질"은 양이온성이거나 pH가 지질의 이온화 가능한 기의 pKa 미만으로 낮아짐에 따라 이온화될 수 있지만(양성자화), 더 높은 pH 값에서 더 중성인 지질을 지칭한다. pKa 미만의 pH 값에서, 지질은 이후 음으로 하전된 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 회합할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "이온화 가능한 지질"은 생리학적 pH로부터 pH 감소에 대해 양전하를 나타내는 지질, 및 생리학적 pH와 같은 선택적 pH에서 순 양전하를 운반하는 임의의 다수의 지질 종을 포함한다. DOTMA와 같은 영구적인 양이온성 지질은 임상 사용에 너무 독성이 있는 것으로 입증되었다. 이온화 가능한 지질은 바람직하게는 일부 구현예에서, 약 30 내지 약 70 Mol%, 다른 구현예에서, 약 30 Mol%, 다른 구현예에서, 약 40 Mol%, 다른 구현예에서, 45 Mol%, 다른 구현예에서, 약 47.5 Mol%, 또 다른 구현예에서, 약 50 Mol%, 및 또 다른 구현예에서, 약 60 Mol%("Mol%"는 특정 성분의 전체 몰에 대한 백분율을 의미함)의 비로 다른 구현예에 따른 지질 제형에 존재할 수 있다. 이 단락에서 용어 "약"은 5 Mol%의 플러스 또는 마이너스 범위를 의미한다. DODMA, 또는 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노프로판은 DLin-MC3-DMA 또는 0-(Z,Z,Z,Z-헵타트리아콘타-6,9,26,29-테트라엔-19-일)-4-(N,N-디메틸아미노)("MC3")와 같은 이온화 가능한 지질이다.
[0158] 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 예시적인 이온화 가능한 지질은 PCT 공보 WO2020252589A1호 및 WO2021000041A1호, 미국 특허 번호 8,450,298호 및 10,844,028호, 및 문헌[Love K.T. et al., Proc Natl Acad Sci USA, Feb. 2, 2010 107 (5) 1864-1869]에 설명된 것들을 포함하며, 이들 모두는 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 LNP는 문헌[Love K.T. et al. (2010 상기)]에 설명된 하나 이상의 지질 화합물, 예를 들어, C16-96, C14-110 및 C12-200을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 ALC-0315, C12-200, LN16, MC3, MD1, SM-102, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 LNP는 C12-200 지질을 포함한다. C12-200 지질의 구조는 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,450,298호 및 10,844,028호에 설명되어 있다. 일부 구현예에서, C12-200은 콜레스테롤, C14-PEG2000, 및 DOPE와 조합된다. 일부 구현예에서, C12-200은 DSPC 및 DMG-PEG2000과 조합된다.
[0159] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 LNP는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. LNP에 사용하기 위해 여러 상이한 이온화 가능한 양이온성 지질이 개발되었다. 적합한 양이온성 지질은 98N12-5, C12-200, C14-PEG2000, DLin-KC2-DMA (KC2), DLin-MC3-DMA (MC3), XTC, MD1 및 7C1을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 유형의 LNP에서, GalNAc 모이어티는 LNP의 외부에 부착되고, 아시알릴로당단백질 수용체를 통해 간으로의 흡수를 위한 리간드로서 작용한다. 임의의 이러한 양이온성 지질은 본 발명의 개시의 srRNA 작제물 및 핵산 작제물의 전달을 위해 LNP를 제형화하는데 사용될 수 있다.
[0160] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 LNP는 하나 이상의 중성 지질을 포함한다. 본 발명의 개시의 조성물 및 방법에 적합한 비제한적인 중성 지질은 DPSC, DPPC, POPC, DOPE 및 SM을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 LNP는 PCT 공보 WO2020252589A1호 및 WO2021000041A1호에 설명된 하나 이상의 이온화 가능한 지질 화합물을 포함한다.
[0161] 당 분야에 공지된 다수의 다른 지질 또는 지질의 조합이 LNP를 생산하는데 사용될 수 있다. LNP를 생산하는데 사용하기에 적합한 지질의 비제한적인 예는 DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE, DC-콜레스테롤, DOTAP-콜레스테롤, GAP-DMORIE-DPyPE, 및 GL67A-DOPE-DMPE-폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 양이온성 지질의 추가의 비제한적인 예는 98N12-5, C12-200, C14-PEG2000, DLin-KC2-DMA (KC2), DLin-MC3-DMA (MC3), XTC, MD1, 7C1, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 중성 지질의 추가의 비제한적인 예는 DPSC, DPPC, POPC, DOPE, 및 SM을 포함한다. PEG-변형된 지질의 비제한적인 예는 PEG-DMG, PEG-CerC14, 및 PEG-CerC20을 포함한다.
[0162] 일부 구현예에서, LNP 전달 시스템에서 지질 대 핵산의 질량비는 약 100:1 내지 약 3:1, 약 70:1 내지 10:1, 또는 16:1 내지 4:1이다. 일부 구현예에서, LNP 전달 시스템에서 지질 대 핵산의 질량비는 약 16:1 내지 4:1이다. 일부 구현예에서, LNP 전달 시스템에서 지질 대 핵산의 질량비는 약 20:1이다. 일부 구현예에서, LNP 전달 시스템에서 지질 대 핵산의 질량비는 약 8:1이다. 일부 구현예에서, 지질-기반 나노입자는 약 1000 nm, 약 500 nm, 약 250 nm, 약 200 nm, 약 150 nm, 약 100 nm, 약 75 nm, 약 50 nm, 또는 약 25 nm 미만의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 70 nm 내지 100 nm 범위의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 88 nm 내지 약 92 nm, 82 nm 내지 약 86 nm, 또는 약 80 nm 내지 약 95 nm 범위의 평균 직경을 갖는다.
[0163] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 조성물은 중합체 나노입자로 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 면역원성 조성물, 예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 자극할 수 있는 조성물이다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 백신으로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 애쥬번트로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 생물치료제, 예를 들어, 생물활성을 갖는 상이한 분자의 유전자 전달을 위한 비히클로서 제형화된다. 생물치료제의 비제한적인 예는 사이토카인, 케모카인, 및 다른 가용성 면역조절제, 효소, 펩티드 및 단백질 효능제, 펩티드 및 단백질 길항제, 호르몬, 수용체, 항체 및 항체-유도체, 성장 인자, 전사 인자, 및 유전자 침묵/편집 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 애쥬번트로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 비-면역원성 또는 최소 면역원성이다(예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 최소로 자극하는 조성물). 일부 구현예에서, 비-면역원성 또는 최소 면역원성 조성물은 생물치료제로서 제형화된다.
[0164] 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 대상체에 대해 실질적으로 비-면역원성이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 비강내 투여, 경피 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 기관내 투여, 결절내 투여, 종양내 투여, 관절내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 질내 투여, 안구내, 직장, 및 경구 투여 중 하나 이상을 위해 제형화된다.
[0165] 주사용 사용에 적합한 약학적 조성물은 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, NJ), 또는 포스페이트 완충 염수(PBS)를 포함한다. 이러한 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정할 수 있고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제, 예를 들어, 소듐 도데실 설페이트의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 일반적으로 등장화제, 예를 들어, 당, 다가알콜, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 및/또는 소듐 클로라이드를 조성물에 포함할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
[0166] 멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이의 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조되며, 이는 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유한다.
[0167] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 약학적 조성물은 에어로졸, 스프레이, 미스트, 액체, 또는 분말과 같이 흡입용으로 제형화된다. 흡입에 의한 투여는 건조 분말 또는 에어로졸 제형의 형태일 수 있고, 이는 흡입 장치, 예를 들어, 마이크로스프레이, 가압 계량 용량 흡입기, 또는 분무기의 사용을 통해 대상체(예를 들어, 환자)에 의해 흡입된다.
[0168] 일부 구현예에서, 조성물은 비강내 투여, 경피 투여, 근육내 투여, 결절내 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 경구 투여, 질내, 종양내 투여, 피하 투여, 관절내 투여, 또는 두개내 투여 중 하나 이상을 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 대상체에서 인터페론의 조절된(예를 들어, 증가 또는 감소된) 생산을 초래한다.
본 발명의 개시의 방법
[0169] 본원에 설명된 치료 조성물 중 어느 하나, 예를 들어, 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물의 투여는 관련 건강 질환, 예를 들어, 증식성 장애(예를 들어, 암), 감염성 질병(예를 들어, 급성 감염, 만성 감염, 또는 바이러스 감염), 희귀 질병, 및/또는 자가면역 질병, 및/또는 염증성 질병의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 작제물), 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물은 면역 반응의 조절, 예를 들어, 유도 또는 억제를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절, 예를 들어, 유도 또는 억제하는데 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물은 하나 이상의 관련 건강 질환 또는 질병을 갖거나, 이를 가질 것으로 의심되거나, 이의 발병 위험이 높을 수 있는 대상체를 치료하는 방법에서 사용하기 위해 치료제에 혼입될 수 있다. 예시적인 건강 질환 또는 질병은 암, 면역 질병, 자가면역 질병, 염증성 질병, 유전자 요법, 유전자 대체, 심혈관 질병, 연령-관련 병리, 희귀 질병, 급성 감염, 및 만성 감염을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 의사의 관리 하에 있는 환자이다.
[0170] 본 발명의 개시의 방법에 적합한 자가면역 질병의 예는 류마티스 관절염, 골관절염, 스틸병, 가족성 지중해열, 전신 경화증, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 하시모토 갑상선염, 전신 홍반 루푸스, 쇼그렌 증후군, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 혈관병증, 당뇨병성 신경통, 췌도염, 건선, 원형 탈모증, 온냉식 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 악성 빈혈, 급성 염증성 질병, 자가면역 부신염, 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP), 램버트-이튼 증후군, 경화 태선, 라임병, 그레이브스병, 베체트병, 메니에르병, 반응성 관절염(라이터 증후군), 처그-스트라우스 증후군, 코간 증후군, CREST 증후군, 보통천포창 및 낙엽천포창, 수포성 유사천포창, 류마티스성 다발근육통, 다발근육염, 원발성 담즙성 경화, 췌장염, 복막염, 건선성 관절염, 류마티스 열, 사르코이드증, 쇼르겐센 증후군, 경피증, 체강 질환, 스티프맨 증후군, 타카야수 동맥염, 일과성 글루텐 불내증, 자가면역 포도막염, 백반증, 다발연골염, 포진 피부염(DH) 또는 뒤링병, 섬유근육통, 굿파스쳐 증후군, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 자가면역 간염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 면역 복합체 장애, 사구체신염, 결절 다발동맥염, 항-인지질 증후군, 다선 자가면역 증후군, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반증(ITP), 두드러기, 자가면역 불임, 청소년 류마티스 관절염, 사르코이드증, 및 자가면역 심근병증을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0171] 본 발명의 개시의 방법에 적합한 감염의 비제한적인 예는 바이러스, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스(HBV), B형 간염 바이러스(HCV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 인가 유두종바이러스(HPV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV2), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군(MERS), 인플루엔자 바이러스, 및 에볼라 바이러스에 의한 감염을 포함한다. 본 발명의 개시의 방법에 적합한 추가적인 감염은 세포내 기생충, 예를 들어, 리슈마니아(Leishmania), 리케차(Rickettsia), 클라미디아(Chlamydia), 콕시엘라(Coxiella), 플라스모디움(Plasmodium), 브루셀라(Brucella), 마이코박테리아, 리스테리아(Listeria), 톡소플라스마(Toxoplasma) 및 트리파노소마(Trypanosoma)에 의한 감염을 포함한다.
[0172] 일부 구현예에서, 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물은 면역 질병, 자가면역 질병, 또는 염증성 질병, 예를 들어, 사구체신염, 염증성 장 질환, 신염, 복막염, 건선성 관절염, 골관절염, 스틸병, 가족성 지중해열, 전신 경피증 및 경화증, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 급성 폐 손상, 수막염, 뇌염, 포도막염, 다발성 골수종, 사구체신염, 신염, 천식, 죽상동맥경화증, 백혈구 부착 결핍, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 소아 발병 당뇨병, 라이터병, 베체트병, 면역 복합체 신증, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 면역-매개 혈소판감소증, 용혈성 빈혈, 중증근무력증, 루푸스 신염, 홍반 루푸스, 류마티스 관절염(RA), 강직성 척추염, 천포창, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 소혈관 혈관염, 오멘 증후군, 만성 신부전, 자가면역 갑상선 질병, 급성 감염성 단핵구증, HIV, 헤르페스 바이러스 관련 질병, 인간 바이러스 감염, 코로나바이러스, 다른 엔테로바이러스, 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 또는 아데노바이러스 감염, 박테리아 폐렴, 상처, 패혈증, 뇌졸중/뇌부종, 허혈-재관류 손상, 및 C형 간염의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있다.
[0173] 본 발명의 개시의 방법에 적합한 염증성 질병의 비제한적인 예는 염증성 질병, 예를 들어, 천식, 염증성 장 질환(IBD), 만성 대장염, 비장비대, 및 류마티스 관절염을 포함한다.
[0174] 따라서, 본 발명의 개시의 일 양태에서, 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 a) 본 발명의 개시의 핵산 작제물; b) 본 발명의 개시의 재조합 RNA 분자; c) 본 발명의 개시의 재조합 세포; d) 본 발명의 개시의 재조합 폴리펩티드; 및 e) 본 발명의 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
[0175] 또 다른 양태에서, 건강 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 건강 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 a) 본 발명의 개시의 핵산 작제물; b) 본 발명의 개시의 재조합 RNA 분자; c) 본 발명의 개시의 재조합 세포; d) 본 발명의 개시의 재조합 폴리펩티드; 및 e) 본 발명의 개시 중 어느 하나의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여하는 단계를 포함한다.
[0176] 일부 구현예에서, 건강 질환은 증식성 장애 또는 미생물 감염(예를 들어, 박테리아 감염, 미세진균 감염, 또는 바이러스 감염)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 증식성 장애 또는 미생물 감염(예를 들어, 박테리아 감염, 미세진균 감염, 또는 바이러스 감염)과 관련된 질환을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심된다.
[0177] 일부 구현예에서, 건강 질환은 희귀 질병, 예를 들어, The Orphan Drug Act(www.fda.gov/patients/rare-diseases-fda)에 의해 정의된 바와 같은 미국에서 200,000명 미만의 사람들에게 영향을 미치는 질병 또는 질환 및/또는 염증성 및/또는 자가면역 장애이다. 일부 구현예에서, 대상체는 염증성 및/또는 자가면역 장애 및/또는 희귀 질병(예를 들어, 가족성 지중해열 또는 성인 발병 스틸병을 포함하나 이에 제한되지 않음)과 관련된 질환을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심된다.
[0178] 일부 구현예에서, 개시된 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 예를 들어, 본 발명의 개시의 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물은 경구 또는 흡입에 의해 제공될 수 있지만, 비경구 경로를 통해 투여될 가능성이 더 크다. 비경구 투여 경로의 예는, 예를 들어, 정맥내, 결절내, 피내, 종양내, 관절내, 피하, 경피(국소), 경점막, 질내, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 주사용 물, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 산화방지제; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조절용 제제, 예를 들어, 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스와 같은 완충제. pH는 일- 및/또는 이-염기성 소듐 포스페이트, 염산 또는 소듐 하이드록사이드와 같은 산 또는 염기로 조정(예를 들어, 약 7.2-7.8, 예를 들어, 7.5의 pH로)될 수 있다. 비경구 제조물은 앰풀, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 포함될 수 있다.
[0179] 본 발명의 개시의 이러한 대상체 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물의 투여량, 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, 이는 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 일반적으로 적합하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위해 이러한 화합물을 감염된 조직의 부위에 표적화하는 전달 시스템을 설계하는데 주의를 기울여야 한다.
[0180] 예를 들어, 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 일반적으로 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 개시의 방법에서 사용되는 임의의 화합물의 경우, 치료적 유효 용량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정되는 바와 같이 IC50(예를 들어, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 혈장 중 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
[0181] 본원에 설명된 치료 조성물, 예를 들어, 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물은 격일로 1회를 포함하여 1일 1회 이상 내지 1주 1회 이상 투여될 수 있다. 당업자는 질병의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 발명의 개시의 대상체 다가 폴리펩티드 및 다가 항체의 치료적 유효량으로 대상체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있거나, 일련의 치료를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 5일 동안 8시간마다 투여된 후, 2 내지 14일, 예를 들어, 9일의 휴식 기간이 지난 후, 추가로 5일 동안 8시간마다 투여된다. 핵산 작제물, 재조합 RNA 분자, 및 재조합 폴리펩티드와 관련하여, 본 발명의 개시의 핵산 작제물, 재조합 RNA 분자 또는 재조합 폴리펩티드의 치료적 유효량(예를 들어, 유효 투여량)은 선택된 핵산 작제물, 재조합 RNA 분자, 또는 재조합 폴리펩티드에 좌우된다. 예를 들어, 대략 0.001 내지 0.1 mg/환자 체중 kg 범위의 단일 용량 양이 투여될 수 있고; 일부 구현예에서, 약 0.005, 0.01, 0.05 mg/kg이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 1, 2, 3, 4개 이상의 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 또는 재조합 폴리펩티드가 조합되어 사용될 수 있다.
[0182] 상기 논의된 바와 같이, 일부 구현예에서 치료적 유효량은 대상체, 예를 들어, 건강 질환, 예를 들어, 질병 또는 감염을 갖거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 이의 위험이 있는 대상체에 투여될 때 특정 효과를 촉진하기에 충분한 치료 조성물의 양일 수 있다. 일부 구현예에서, 유효량은 질병 또는 감염의 증상의 발달을 예방 또는 지연시키거나, 질병 또는 감염의 증상의 경과를 변경시키거나(예를 들어, 비제한적으로, 질병 또는 감염의 증상의 진행을 늦춤), 질병 또는 감염의 증상을 역전시키기에 충분한 양을 포함한다. 임의의 주어진 경우에, 적절한 유효량은 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있는 것으로 이해된다.
[0183] 질병 또는 감염의 치료를 위한 개시된 치료 조성물을 포함하는 치료의 효능은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 질병 또는 감염의 징후 또는 증상 중 적어도 어느 하나 또는 모두가 개선되거나 개량되는 경우 치료는 효과적인 치료로 간주된다. 효능은 또한 입원 또는 의학적 개입의 필요성에 의해 평가된 바와 같이 개인의 악화 실패(예를 들어, 질병 또는 감염의 진행이 중단되거나 적어도 느려짐)에 의해 측정될 수 있다. 이러한 지표를 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고/있거나 본원에 설명되어 있다. 치료는 대상체 또는 동물(일부 비제한적인 예는 인간 또는 포유동물을 포함함)에서 질병 또는 감염의 임의의 치료를 포함하고, (1) 질병 또는 감염의 억제, 예를 들어, 증상 진행의 정지 또는 늦춤; 또는 (2) 질병 또는 감염의 완화, 예를 들어, 증상의 퇴행 유발; 및 (3) 증상의 발달 가능성의 예방 또는 감소를 포함한다.
[0184] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 갖는 조성물로 면역 반응을 자극하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 대상체는 초기 일련의 주사(또는 하기 설명되는 다른 경로 중 하나를 통한 투여)를 통해 면역화되고 후속하여 원래 일련의 투여에 의해 제공되는 보호를 증가시키기 위해 부스터가 제공될 수 있다. 초기 일련의 주사 및 후속 부스터는 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 필요한 이러한 용량 및 이러한 기간에 걸쳐 투여된다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 대상체에서 인터페론의 생산을 조성물이 투여되지 않은 대상체에서의 인터페론 생산과 비교하여 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%만큼 증가시킨다. 개시된 방법의 일부 구현예에서, 대상체는 척추동물 또는 무척추동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물 대상체이다. 일부 구현예에서, 포유동물 대상체는 인간 대상체이다.
[0185] 상기 설명된 바와 같이, 주사 사용에 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 이러한 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건 하에서 추가로 안정해야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다.
[0186] 멸균 주사용 용액은 필요한 양의 핵산 작제물, 재조합 세포, 및/또는 재조합 폴리펩티드를 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다.
[0187] 본원에 설명된 바와 같은 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물이 상기 설명된 바와 같이 적합하게 보호되는 경우, 이들은, 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화 가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물 및 다른 성분은 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입되거나, 정제로 압축되거나, 개인의 식이에 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되고 섭취 가능한 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
[0188] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 작제물, 재조합 RNA 분자, 및 재조합 폴리펩티드는 지질-기반 나노입자(LNP)에 의해 세포 또는 대상체에 전달될 수 있다. 많은 인간이 바이러스 입자에 대한 기존의 면역성을 갖지만, LNP에 대한 기존의 면역성은 존재하지 않는다. 또한, LNP의 반복 투여를 가능하게 하는 LNP에 대한 적응 면역 반응은 일어날 가능성이 낮다.
[0189] LNP에 사용하기 위해 여러 상이한 이온화 가능한 양이온성 지질이 개발되었다. 이온화 가능한 양이온성 지질의 비제한적인 예는 특히 C12-200, MC3, LN16, 및 MD1을 포함한다. 예를 들어, 한 유형의 LNP에서, GalNAc 모이어티는 LNP의 외부에 부착되고, 아시알릴로당단백질 수용체를 통해 간으로의 흡수를 위한 리간드로서 작용한다. 임의의 이러한 양이온성 지질은 본 발명의 개시의 핵산 작제물 및 재조합 폴리펩티드를 간에 전달하기 위해 LNP를 제형화하는데 사용될 수 있다.
[0190] 일부 구현예에서, LNP는 1000 nm, 500 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 또는 25 nm 미만의 직경을 갖는 임의의 입자를 지칭한다. 대안적으로, 나노입자는 1-1000 nm, 1-500 nm, 1-250 nm, 25-200 nm, 25-100 nm, 35-75 nm, 또는 25-60 nm의 크기 범위일 수 있다.
[0191] LNP는 양이온성, 음이온성, 또는 중성 지질로부터 제조될 수 있다. 융합형성 인지질 DOPE 또는 막 성분 콜레스테롤과 같은 중성 지질은 형질감염 활성 및 나노입자 안정성을 향상시키기 위해 '헬퍼 지질'로서 LNP에 포함될 수 있다. 양이온성 지질의 한계는 불량한 안정성 및 빠른 제거 뿐만 아니라 염증 또는 항염증 반응의 발생으로 인한 낮은 효능을 포함한다. LNP는 또한 소수성 지질, 친수성 지질, 또는 소수성 및 친수성 지질 둘 모두를 가질 수 있다.
[0192] 당 분야에 공지된 임의의 지질 또는 지질의 조합이 LNP를 생산하는데 사용될 수 있다. LNP를 생산하는데 사용되는 지질의 예는 DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE, DC-콜레스테롤, DOTAP-콜레스테롤, GAP-DMORIE-DPyPE, 및 GL67A-DOPE-DMPE-폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 양이온성 지질의 예는 98N12-5, C12-200, DLin-KC2-DMA (KC2), DLin-MC3-DMA (MC3), XTC, MD1, 및 7C1이다. 중성 지질의 예는 DPSC, DPPC, POPC, DOPE, 및 SM이다. PEG-변형된 지질의 예는 PEG-DMG, PEG-CerC14, 및 PEG-CerC20이다.
[0193] 일부 구현예에서, 지질은 LNP를 생산하기 위해 임의의 수의 몰비로 조합될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드(들)는 LNP를 생산하기 위해 광범위한 몰비로 지질(들)과 조합될 수 있다.
[0194] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 치료 조성물, 예를 들어, 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물은 암, 자가면역 질병, 및/또는 감염을 갖거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 이의 발병 위험이 높을 수 있는 대상체를 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위해 치료 조성물에 혼입된다.
[0195] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 치료 조성물, 예를 들어, 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물은 미생물 감염을 갖거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 이의 발병 위험이 높을 수 있는 대상체를 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위해 치료 조성물에 혼입된다. 일부 구현예에서, 미생물 감염은 박테리아 감염이다. 일부 구현예에서, 미생물 감염은 진균 감염이다. 일부 구현예에서, 미생물 감염은 바이러스 감염이다.
추가 요법
[0196] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시에 따른 조성물은 단일 요법(단일요법)으로서 또는 적어도 하나의 추가 요법(예를 들어, 제2 요법)과 조합된 제1 요법으로서 대상체에게 개별적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 요법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 표적화 요법, 및 수술로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 요법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법 또는 수술로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 동반 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법과 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 전 및/또는 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 교대로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 단일 제형으로 함께 투여된다.
키트
[0197] 또한, 본원에 설명된 방법의 실시를 위한 다양한 키트 뿐만 아니라 이를 제조하고 사용하기 위한 서면 설명서가 본원에 제공된다. 특히, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 대상체에서 면역 반응을 조절하기 위한 키트를 제공한다. 일부 다른 구현예는 건강 질환의 예방을 필요로 하는 대상체에서 건강 질환의 예방을 위한 키트에 관한 것이다. 일부 다른 구현예는 건강 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 건강 질환을 치료하는 방법을 위한 키트에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 제공되고 설명된 바와 같은 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 및 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물 중 하나 이상뿐만 아니라 이를 제조하고 사용하기 위한 서면 설명서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
[0198] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 키트는 제공된 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 및 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 대상체로의 투여에 유용한 하나 이상의 수단을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 키트는 제공된 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 및 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물 중 어느 하나를 대상체에 투여하는 데 사용되는 하나 이상의 주사기(미리 충전된 주사기 포함) 및/또는 카테터(미리 충전된 주사기 포함)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 요망되는 목적, 예를 들어, 질환의 진단, 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 진단, 예방 또는 치료하기 위해 다른 키트 성분과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있는 하나 이상의 추가 치료제를 가질 수 있다.
[0199] 임의의 상기 설명된 키트는 하나 이상의 추가 시약을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 이러한 추가 시약은 희석 완충제; 재구성 용액, 세척 완충제, 대조군 시약, 대조군 발현 벡터, 음성 대조군, 양성 대조군, 본 발명의 개시의 제공된 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물의 시험관내 생산에 적합한 시약으로부터 선택될 수 있다.
[0200] 일부 구현예에서, 키트의 성분은 별도의 용기에 있을 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 키트의 성분은 단일 용기에서 조합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, 키트는 하나의 용기(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알 내)에 본원에 제공되고 설명된 바와 같은 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 및 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물 중 하나 이상 및 또 다른 용기(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알 내)에 추가의 치료제를 포함한다.
[0201] 또 다른 구현예에서, 키트는 선택적으로 약학적 조성물에서 단일의 공통 용기에서 함께 제형화된 하나 이상의 추가 치료제와 함께 본 발명의 개시의 하나 이상의 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 및/또는 재조합 폴리펩티드를 포함하는 본원에 설명된 조성물의 조합물을 포함한다.
[0202] 키트가 대상체로의 비경구 투여를 위한 약학적 조성물을 포함하는 경우, 키트는 이러한 투여를 수행하기 위한 장치(예를 들어, 주사 장치 또는 카테터)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 본 발명의 개시의 하나 이상의 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 RNA 분자, 및/또는 재조합 폴리펩티드를 함유하는 상기 논의된 바와 같은 하나 이상의 피하 바늘 또는 다른 주사 장치를 포함할 수 있다.
[0203] 일부 구현예에서, 키트는 본원에 개시된 방법을 실시하기 위해 키트의 성분을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 약학적 조성물 및 투여 형태에 관한 정보를 포함하는 패키지 삽입물을 키트에 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 정보는 동봉된 약학적 조성물 및 투여 형태를 효과적이고 안전하게 사용하는 데 있어서 환자 및 의사를 돕는다. 예를 들어, 본 발명의 개시의 조합에 관한 하기 정보가 삽입물에 제공될 수 있다: 약동학, 약력학, 임상 연구, 효능 파라미터, 적응증 및 사용법, 금기, 경고, 주의사항, 부작용, 과다투여, 적절한 투여량 및 투여, 공급되는 방법, 적절한 보관 조건, 참조, 제조업체/유통자 정보 및 지적 재산권 정보.
[0204] 방법을 실시하기 위한 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기재 상에 인쇄될 수 있다. 설명서는 패키지 삽입물로서 키트에, 키트의 용기 또는 이의 성분의 라벨링(예를 들어, 패키징 또는 서브-패키징과 관련됨) 등에 존재할 수 있다. 설명서는 적합한 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체, 예를 들어, CD-ROM, 디스켓, 플래시 드라이브 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재할 수 있다. 일부 예에서, 실제 설명서는 키트에 존재하지 않지만, 원격 소스로부터(예를 들어, 인터넷을 통해) 설명서를 획득하기 위한 수단이 제공될 수 있다. 이러한 구현예의 예는 설명서가 보여질 수 있고/있거나 설명서가 다운로드될 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 설명서에서와 같이, 설명서를 획득하기 위한 이러한 수단은 적합한 기개에 기록될 수 있다.
[0205] 본 발명의 개시에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
[0206] 본원에 인용된 임의의 참고문헌이 종래 기술을 구성한다는 것은 인정되지 않는다. 참고문헌의 논의는 이들의 저자가 주장하는 바를 기술하고, 출원인은 인용된 문헌의 정확성 및 적절성에 이의를 제기할 권리를 보유한다. 과학 저널 기사, 특허 문헌, 및 교과서를 포함하는 다수의 정보 출처가 본원에서 언급되지만; 이 참고문헌은 이러한 문헌들 중 어느 것이 당 분야의 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것을 구성하지 않음이 명백히 이해될 것이다.
[0207] 본원에 제공된 일반적인 방법의 논의는 단지 예시 목적으로 의도된 것이다. 다른 대안적인 방법 및 대안은 본 발명의 개시의 검토시 당업자에게 명백할 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 내에 포함되어야 한다.
[0208] 추가 구현예는 하기 실시예에서 추가로 상세히 개시되며, 이는 예시로서 제공되며 어떠한 방식으로도 본 발명의 개시 또는 청구범위의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예
[0209] 본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업자에게 널리 공지된 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학, 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예를 들어, 문헌[Sambrook, J., & Russell, D. W. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory (본원에서 공동으로 "Sambrook"으로 지칭됨); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Wiley (2014년까지의 보충물 포함); Bollag, D. M. et al. (1996). Protein Methods. New York, NY: Wiley-Liss; Huang, L. et al. (2005). Nonviral Vectors for Gene Therapy. San Diego: Academic Press; Kaplitt, M. G. et al. (1995). Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications. San Diego, CA: Academic Press; Lefkovits, I. (1997). The Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques. San Diego, CA: Academic Press; Doyle, A. et al. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York, NY: Wiley; Mullis, K. B., , F. & Gibbs, R. (1994). PCR: The Polymerase Chain Reaction. Boston: Birkhauser Publisher; Greenfield, E. A. (2014). Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.). New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Beaucage, S. L. et al. (2000). Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. New York, NY: Wiley, (2014년까지의 보충물 포함); 및 Makrides, S. C. (2003). Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Amsterdam, NL: Elsevier Sciences B.V.](이의 개시는 본원에 참조로서 포함됨)에 충분히 설명되어 있다.
[0210] 추가 구현예는 하기 실시예에서 추가로 상세히 개시되며, 이는 예시로서 제공되며 어떠한 방식으로도 본 발명의 개시 또는 청구범위의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
변형된 알파바이러스 벡터의 작제
[0211] 본 실시예는 관심 유전자(예를 들어, 인플루엔자로부터의 헤마글루티닌(HA) 유전자)의 발현을 위해 후속적으로 사용된 다수의 기본 알파바이러스 벡터(예를 들어, 이종성 유전자 없이)를 작제하기 위해 수행된 실험의 결과를 설명한다.
[0212] 말단에 30 bp의 상동성을 갖는 PCR 생성물을 생성시키기 위해 SpeI 부위를 함유하는 범용 어댑터 서열(5'-CTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTACTAGTGACCGCTACGCCCCAATGACCCGACCAGC-3')을 함유하는 합성 정방향 프라이머 및 합성 역방향 프라이머를 사용하여 pYL 플라스미드 백본에서 5' 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 프로모터(5'-TAATACGACTCACTATAG-3'; SEQ ID NO: 28) 및 3' 38 잔기 폴리(A), 이어서 T7 종료자 서열(5'-AACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT-3'; SEQ ID NO: 29), 이어서 하류 NotI 부위가 플랭킹된 VEE TC-83 레플리콘(Genbank L01443)으로부터의 PCR 증폭에 의해 범용 어댑터를 갖는 VEE 빈 벡터(도 2a)를 작제하고, Gibson Assembly® 절차에 의해 원형화시켰다. nsP2에서 SpeI 부위를 제거하기 위해 침묵 돌연변이 A2087G를 만들었다. 이 생성물은 구조적 유전자 대신에 범용 어댑터를 갖는다. 30 bp 상동성 말단을 갖는 폴리(A)의 하류에 SapI 부위를 함유하는 30 bp 상동성 플랭크를 갖는 합성 DNA 단편을 SpeI 및 NotI을 이용한 절단에 의해 선형화된 생성물에 삽입하여 최종 벡터를 생성하였다.
[0213] 말단에 30 bp의 상동성을 갖는 PCR 생성물을 생성시키기 위해 SpeI 부위를 함유하는 범용 어댑터 서열(5'-CTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTACTAGTGACCGCTACGCCCCAATGACCCGACCAGC-3'; SEQ ID NO: 20)을 함유하는 합성 정방향 프라이머 및 합성 역방향 프라이머를 사용하여 pYL 플라스미드 백본에서 5' 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 프로모터(5'-TAATACGACTCACTATAG-3'; SEQ ID NO: 28) 및 3' 37 잔기 폴리(A), 이어서 T7 종료자 서열(5'-AACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT-3'; SEQ ID NO: 29), 이어서 하류 NotI 부위가 플랭킹된 CHIKV S27 레플리콘(Genbank AF369024)으로부터의 PCR 증폭에 의해 범용 어댑터를 갖는 CHIKV S27 빈 벡터(도 2b)를 작제하고, Gibson Assembly® 절차에 의해 원형화시켰다. 이 생성물은 구조적 유전자 대신에 범용 어댑터를 갖는다. 30 bp 상동성 말단을 갖는 폴리(A)의 하류에 SapI 부위를 함유하는 30 bp 상동성 플랭크를 갖는 합성 DNA 단편을 SpeI 및 NotI를 이용한 절단에 의해 선형화된 생성물에 삽입하여 최종 벡터를 생성하였다.
[0214] 말단에 30 bp의 상동성을 갖는 PCR 생성물을 생성시키기 위해 SpeI 부위를 함유하는 범용 어댑터 서열(5'-CTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTACTAGTGACCGCTACGCCCCAATGACCCGACCAGC-3'; SEQ ID NO: 20)을 함유하는 합성 정방향 프라이머 및 합성 역방향 프라이머를 사용하여 pYL 플라스미드 백본에서 5' 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 프로모터(5'-TAATACGACTCACTATAG-3'; SEQ ID NO: 28) 및 3' 37 잔기 폴리(A), 이어서 T7 종료자 서열(5'-AACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT-3'; SEQ ID NO: 29), 이어서 하류 NotI 부위가 플랭킹된 CHIKV S27 3' UTR (Genbank AF369024)을 갖는 CHIKV DRDE 레플리콘(Genbank EF210157)으로부터의 PCR 증폭에 의해 범용 어댑터를 갖는 CHIKV DRDE 빈 벡터(도 2c)를 작제하고, Gibson Assembly® 절차에 의해 원형화시켰다. 이 생성물은 구조적 유전자 대신에 범용 어댑터를 갖는다. 30 bp 상동성을 갖는 폴리(A)의 하류에 SapI 부위를 함유하는 30 bp 상동성 말단을 갖는 합성 DNA 단편을 SpeI 및 NotI를 이용한 절단에 의해 선형화된 생성물에 삽입하여 최종 벡터를 생성하였다.
[0215] 말단에 30 bp의 상동성을 갖는 PCR 생성물을 생성시키기 위해 SpeI 부위를 함유하는 범용 어댑터 서열(5'-CTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTACTAGTGACCGCTACGCCCCAATGACCCGACCAGC-3'; SEQ ID NO: 20)을 함유하는 합성 정방향 프라이머 및 합성 역방향 프라이머를 사용하여 pYL 플라스미드 백본에서 5' 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 프로모터(5'-TAATACGACTCACTATAG-3'; SEQ ID NO: 28) 및 3' 37 잔기 폴리(A), 이어서 T7 종료자 서열(5'-AACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT-3'; SEQ ID NO: 29), 이어서 하류 NotI 부위가 플랭킹된 EEEV FL93-939 레플리콘(Genbank EF151502)으로부터의 PCR 증폭에 의해 범용 어댑터를 갖는 EEEV FL93-939 빈 벡터(도 2d)를 작제하고, Gibson Assembly® 절차에 의해 원형화시켰다. nsP2에서 SpeI 부위를 제거하기 위해 침묵 돌연변이 A3550C를 만들었다. 침묵 돌연변이 G301A, G4516A, 및 G7399를 각각 nsP1, nsP3, 및 nsP4에서 SapI 부위를 제거하기 위해 만들었다. 이 생성물은 구조적 유전자 대신에 범용 어댑터를 갖는다. 30 bp 상동성을 갖는 폴리(A)의 하류에 SapI 부위를 함유하는 30 bp 상동성 말단을 갖는 합성 DNA 단편을 SpeI 및 NotI를 이용한 절단에 의해 선형화된 생성물에 삽입하여 최종 벡터를 생성하였다.
[0216] 말단에 30 bp의 상동성을 갖는 PCR 생성물을 생성시키기 위해 SpeI 부위를 함유하는 범용 어댑터 서열(5'-CTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTACTAGTGACCGCTACGCCCCAATGACCCGACCAGC-3'; SEQ ID NO: 20)을 함유하는 합성 정방향 프라이머 및 합성 역방향 프라이머를 사용하여 pYL 플라스미드 백본에서 5' 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 프로모터(5'-TAATACGACTCACTATAG-3'; SEQ ID NO: 28) 및 3' 37 잔기 폴리(A), 이어서 T7 종료자 서열(5'-AACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT-3'; SEQ ID NO: 29), 이어서 하류 NotI 부위가 플랭킹된 SINV Girdwood 레플리콘(Genbank MF459683)으로부터의 PCR 증폭에 의해 범용 어댑터를 갖는 SINV Girdwood 빈 벡터(SEQ ID NO: 27)(도 2e)를 작제하고, Gibson Assembly® 절차에 의해 원형화시켰다. 이 생성물은 구조적 유전자 대신에 범용 어댑터를 갖는다. Girdwood nsP3에서 SapI 부위를 제거하기 위해 침묵 돌연변이 A5420G를 만들었다. 30 bp 상동성을 갖는 폴리(A)의 하류에 SapI 부위를 함유하는 30 bp 상동성 말단을 갖는 합성 DNA 단편을 SpeI 및 NotI를 이용한 절단에 의해 선형화된 생성물에 삽입하여 최종 벡터를 생성하였다.
[0217] 범용 어댑터를 갖는 SINV AR86-Girdwood 키메라 빈 벡터(도 2f-i)를 SINV Girdwood 빈 벡터(도 2e)의 PCR 증폭에 의해 작제하여 AR86 서열(Genbank U38305)로부터 증폭된 PCR 생성물에 대한 30bp 상동성 말단을 갖는 생성물을 생성하였다. 단편을 Gibson Assembly® 절차에 의해 조합하여 최종 벡터를 생성하였다. 키메라 1(도 2f)의 경우, Girdwood nsP1, nsP3, 및 nsP4는 각각 AR86 nsP1, nsP3, 및 nsP4로 대체되었다. AR86 nsP3에서 SapI 부위를 제거하기 위해 침묵 돌연변이 A5366G를 만들었다. 키메라 2(도 2g)의 경우, Girdwood nsP4는 AR86 nsP4로 대체되었다. 키메라 3(도 2h)의 경우, Girdwood nsP3는 AR86 nsP3로 대체되었다. AR86 nsP3에서 SapI 부위를 제거하기 위해 침묵 돌연변이 A5366G를 만들었다. 키메라 4(도 2i)의 경우, Girdwood nsP1는 AR86 nsP1로 대체되었다. 키메라 1-4의 서열은 SEQ ID NO: 22-25에 제공된다.
실시예 2
관심 유전자를 갖는 변형된 알파바이러스 벡터의 작제
[0218] 도 3a의 알파바이러스 벡터는 SpeI 절단에 의해 도 2의 빈 EEEV 범용 벡터의 선형화에 의해 작제되었다. 인플루엔자로부터의 헤마글루티닌(HA) 유전자(Genbank AY651334)를 인 실리코에서 인간 발현을 위해 코돈 리팩토링(codon refactored)하고 합성하였다(IDT). 합성 생성물을 PCR 생성물에 30 bp 상동성 말단으로서 범용 어댑터를 첨가하는 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.
[0219] 정방향 프라이머 (5'- GCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTG -3'; SEQ ID NO: 30).
[0220] 역방향 프라이머 (5'- GCTGGTCGGGTCATTGGGGCGTAGCGGTCAAATGCAAATTCTGCATTGTAACG-3'; SEQ ID NO: 31),
[0221] 절단 생성물 및 PCR 생성물을 Gibson Assembly® 절차에 의해 조합하여 최종 벡터를 생성하였다.
[0222] 도 3b-e의 알파바이러스 벡터는 HA 유전자를 인코딩하는 SINV Girdwood(Genbank MF459683) 레플리콘을 함유하는 플라스미드로부터 작제되었다. 키메라 1(도 3b)의 경우, nsp1, nsP3, nsP4 유전자는 AR86 nsp1, nsp3, 및 nsP4 유전자(Genbank U38305)로 대체되었다. 키메라 2(도 3c)의 경우, nsP4 유전자는 AR86 nsP4 유전자로 대체되었다. 키메라 3(도 3d)의 경우, nsP3 유전자는 AR86 nsP3 유전자로 대체되었다. 키메라 4(도 3e)의 경우, nsP1 유전자는 AR86 nsP1 유전자로 대체되었다. 30 bp 상동성 말단을 갖는 PCR 생성물의 증폭에 의해 대체를 수행하고 Gibson Assembly® 절차에 의해 조합하였다. AR86 nsP2 유전자를 함유하는 어떠한 작제물도 복제할 수 없는 것으로 관찰되었다.
실시예 3
연장된 폴리(A)를 갖는 변형된 알파바이러스 벡터의 작제
[0223] VEE 빈 벡터(도 2a)를 SapI 및 NotI로 선형화시키고, 170 A 잔기를 갖는 폴리(A) 서열, 이어서 SapI 부위, T7 종료자, 및 선형화된 빈 벡터에 대한 30 bp 상동성을 함유하는 합성 DNA 단편을 Gibson Assembly® 절차에 의해 조합하였다. 생거(Sanger) 시퀀싱에 의해 결정된, 대략 120개의 A를 갖는 생성물을 분리하였다.
실시예 4
5' 플랭킹 도메인 및 3' 플랭킹 도메인의 최소 자유 에너지(MFE) 평가
[0224] 5' 및 3' 플랭킹 도메인의 최소 자유 에너지(MFE) 구조 및 이들의 ΔG 값은 MFE RNA 구조 예측 및 ΔG 계산을 위한 Mfold 도구를 사용하여 인 실리코(in silico)로 생성되었다(www.unafold.org/, https://doi.org/10.1093/nar/gkg595).
실시예 5
변형된 알파바이러스 벡터의 시험관내 평가
[0225] 본 실시예는 상기 실시예 1 및 2 및 3에 설명된 변형된 알파바이러스 벡터 작제물의 발현 수준을 평가하고, 이의 임의의 차등 거동(예를 들어, 복제 및 단백질 발현)을 조사하기 위해 수행된 시험관내 실험의 결과를 설명한다.
[0226] 벡터 목록: 범용 어댑터를 갖는 VEE 레플리콘, 범용 어댑터를 갖는 CHIKV S27 레플리콘, 범용 어댑터를 갖는 CHIKV DRDE 레플리콘, 범용 어댑터를 갖는 EEEV FL93-939 레플리콘, SINV Girdwood, SINV AR86/Girdwood 키메라 레플리콘, 범용 어댑터 및 폴리(A)에서 독점적인 아데닐레이트 잔기를 갖는 VEE 레플리콘, 및 범용 어댑터 및 긴 폴리(A)에서 독점적인 아데닐레이트 잔기를 갖는 VEE 레플리콘.
[0227] 검정:
[0228] 시험관내 전사 : RNA는 효소 절단에 의해 선형화된 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 제조된다. 이러한 실시예에서, DNA는 T7 종료자의 하류를 절단하는 NotI로 선형화되거나, 폴리(A)의 말단에서 절단하는 SapI로 선형화된다. 박테리오파지 T7 중합효소는 5' ARCA 캡(HiScribe™ T7 ARCA mRNA Kit, NEB) 또는 캡핑되지 않은 전사(HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB)에 이어 5' 캡 1(Vaccinia Capping System, mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase, NEB)의 첨가에 의한 시험관 내 전사에 사용된다. RNA는 페놀/클로로포름 추출 또는 컬럼 정제(Monarch® RNA Cleanup Kit, NEB)를 사용하여 정제된다. RNA 농도는 260 nm에서의 흡광도에 의해 결정된다(Nanodrop, Thermo Fisher Scientific).
[0229] 복제 : RNA는 BHK-21 또는 Vero 세포로의 전기천공(예를 들어, 4D-Nucleofector™, Lonza)에 의해 형질전환된다. 형질전환 17-20시간 후에, 세포를 고정하고 투과시키고(eBioscience™ Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set, Invitrogen), PE-컨쥬게이션된 항-dsRNA 마우스 모노콜로날 항체(J2, Scicons)를 사용하여 염색하여 dsRNA+ 세포의 빈도 및 형광 흐름세포측정법에 의한 개별 세포에서의 dsRNA의 평균 형광 강도(MFI)를 정량화하였다.
[0230] 단백질 발현 : RNA는 BHK-21 또는 Vero 세포로의 전기천공(예를 들어, 4D-Nucleofector™, Lonza)에 의해 형질전환된다. 형질전환 18-20시간 후에, 세포를 고정하고 투과시키고(eBioscience™ Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set, Invitrogen), APC-컨쥬게이션된 항-HA 마우스 모노콜로날 항체(2B7, Abcam)를 사용하여 염색하여 HA 단백질+ 세포의 빈도 및 형광 흐름세포측정법에 의한 개별 세포에서의 HA 단백질의 평균 형광 강도(MFI)를 정량화하였다.
[0231] 추가 실험 : BHK-21 또는 Vero 세포는 RNA의 전기천공 전에 재조합 IFN의 적정 곡선으로 전처리되고, 각 벡터에 대한 복제 및 단백질 발현에 대한 영향은 상기 검정을 사용하여 측정된다.
실시예 6
변형된 알파바이러스 벡터의 생체내 평가
[0232] 본 실시예는 상기 실시예 1 및 2 및 3에 설명된 변형된 알파바이러스 벡터 작제물(예를 들어, 제형화되지 않은 및 LNP 제형화된 벡터 둘 모두)로 백신접종 후 임의의 차등 면역 반응을 평가하기 위해 수행된 생체내 실험의 결과를 설명한다.
[0233] 벡터 목록: 범용 어댑터를 갖는 VEE 레플리콘, 범용 어댑터를 갖는 CHIKV S27 레플리콘, 범용 어댑터를 갖는 CHIKV DRDE 레플리콘, 범용 어댑터를 갖는 EEEV FL93-939 레플리콘, SINV Girdwood, SINV AR86/Girdwood 키메라 레플리콘, 범용 어댑터 및 폴리(A)에서 독점적인 아데닐레이트 잔기를 갖는 VEE 레플리콘, 및 범용 어댑터 및 긴 폴리(A)에서 독점적인 아데닐레이트 잔기를 갖는 VEE 레플리콘.
[0234] 검정:
[0235] 마우스 및 주사. 암컷 C57BL/6 또는 BALB/c 마우스를 Charles River Labs 또는 Jackson Laboratories에서 구입한다. 투여일에, 0.1 내지 10 ㎍의 물질을 둘 모두의 대퇴사두근으로 분할되어 근육내 주사한다. 벡터는 식염수에서 제형화되지 않거나 LNP-제형화되어 투여된다. 연구 과정 전반에 걸쳐 체중 및 다른 일반적인 관찰에 대해 동물을 모니터링한다. 면역원성 연구를 위해, 동물에게 0일 및 21일에 투여한다. 35일에 비장을 수집하고, 0, 14, 및 35일에 혈청을 분리하였다. 단백질 발현 연구를 위해, 동물에게 0일에 투여하고, 생물발광을 1, 3, 및 7일에 평가한다. 루시페라제 활성의 생체내 영상화는 지시된 시점에 IVIS 시스템을 사용하여 수행된다.
[0236] LNP 제형. 레플리콘 RNA는 미세유체 믹서를 사용하여 지질 나노입자로 제형화되고, 입자 크기, 동적 광 산란을 이용한 다분산성 및 캡슐화 효율에 대해 분석된다. LNP 입자를 제형화하는데 사용되는 지질의 몰비는 30% C12-200, 46.5% 콜레스테롤, 2.5% PEG-2K 및 16% DOPE이다.
[0237] ELISpot . 인플루엔자-특이적 T 세포 반응의 크기를 측정하기 위해, 제조업체의 설명서에 따라 마우스 IFNγ ELISpot PLUS Kit(HRP)(MabTech)를 사용하여 IFNγ ELISpot 분석을 수행한다. 요약하면, 비장세포를 분리하고 HPV에 대한 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 에피토프를 나타내는 펩티드, 양성 대조군으로서 PMA/이오노마이신, 또는 모의 자극으로서 DMSO를 함유하는 배지에서 5 x 106개 세포/mL의 농도로 재현탁시킨다.
[0238] 세포내 사이토카인 염색. 비장을 ELISpot에 대해 약술된 방법에 따라 분리하고, 1 x 106개 세포를 웰 당 200 μL의 총 부피로 세포 함유 배지에 첨가한다. 각 웰은 HPV에 대한 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 에피토프를 나타내는 펩티드, 양성 대조군으로서 PMA/이오노마이신, 또는 모의 자극으로서 DMSO를 함유한다. 1시간 후, GolgiPlug™ 단백질 수송 억제제(BD Biosciences)를 각 웰에 첨가한다. 세포를 또 다른 5시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 표준 방법을 사용하여 세포를 CD8+ (53-6.7), CD4+ (GK1.5), B220 (B238128), Gr-1 (RB6-8C5), CD16/32 (M93)에 대해 표면 염색한다. 표면 염색 후, IFNγ(RPA-T8), IL-2 (JES6-5H4), 및 TNF (MP6-XT22)에 대한 표준 방법에 따라 세포를 고정하고 세포내 단백질에 대해 염색한다. 이어서, 세포를 흐름세포측정기에서 분석하고, 획득된 FCS 파일을 FlowJo 소프트웨어 버전 10.4.1을 사용하여 분석하였다.
[0239] 항체. 총 HPV E6/E7-특이적 IgG를 측정하기 위한 항체 반응은 제조사의 설명서에 따라 Alpha Diagnostic International의 ELISA 키트를 사용하여 측정한다.
실시예 7
연장된 폴리(A)를 갖는 변형된 알파바이러스 벡터의 평가
[0240] 본 실시예는 다양한 길이의 폴리(A)를 갖는 변형된 알파바이러스 srRNA 작제물의 RNA 복제 활성을 평가하기 위해 수행된 시험관내 실험의 결과를 설명한다.
[0241] VEE 빈 벡터를 SpeI 및 NotI로 선형화하고(단편 1), 단편 1 및 단편 3에 대해 30 bp 상동성 말단을 갖는 인플루엔자로부터의 헤마글루티닌(HA) 유전자(Genbank AY651334)를 함유하는 PCR 생성물(단편 2)을 생성시키고, 다양한 길이를 갖는(예를 들어, 30, 49, 64, 81, 또는 90개의 아데닐레이트 잔기를 갖는) 폴리(A) 서열, 이어서 SapI 부위, T7 종료자, 및 단편 2 및 선형화된 빈 벡터(단편 1)에 대해 30 bp 상동성을 함유하는 합성 DNA 단편(단편 3)을 3-단편 Gibson Assembly® 절차에 의해 조합하였다. 생성된 플라스미드에서 폴리(A) 서열의 길이는 생거 시퀀싱에 의해 확인되었다. 이어서, 상기 실시예 5에 설명된 바와 같이 SapI 효소 절단에 의해 선형화된 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 RNA를 제조하였다. RNA를 LiCl 침전에 의해 정제하였다. 이어서, 아가로스 겔에서 전기영동 분석에 의해 RNA 온전성을 평가하였고, 결과는 도 8에 요약되어 있다.
[0242] RNA 복제 활성을 정량화하기 위해, srRNA 작제물을 각 샘플에 대해 8E5 BHK-21 세포로의 전기천공(예를 들어, 4D-Nucleofector™, Lonza)에 의해 형질전환시켰다. 각각의 srRNA 작제물을 3, 10, 20, 30, 40, 및 50 ng의 용량으로 삼중으로 형질전환시켰다. 형질전환 20시간 후에, 세포를 고정하고 투과시키고(eBioscience™ Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set, Invitrogen), PE-컨쥬게이션된 항-dsRNA 마우스 모노콜로날 항체(J2, Scicons)를 사용하여 염색하여 형광 흐름세포측정법에 의해 dsRNA+ 세포(RNA 복제가 검출 가능한 세포)의 빈도를 정량화하였다. 각 srRNA 작제물에 대한 각각의 로그-형질전환된 RNA 용량에서 각 샘플에서 dsRNA+ 세포의 빈도는 도 9에 제시되어 있다.
[0243] Prism(GraphPad Software)을 사용하여, 데이터를 바닥 제약(bottom constraint) > 0으로 4PL 곡선에 피팅함으로써 각각의 srRNA 작제물에 대해 log(EC50) 값을 계산하였다. Log(EC50) 값 및 역변환된 EC50 값은 표 1에 제시되어 있다. EC50 값은 최대 RNA 복제 빈도의 절반에 필요한 RNA의 용량을 나타낸다.
표 1: 도 9에 제시된 데이터를 4PL 곡선에 피팅함으로써 계산된 EC50(최대 활성의 절반에 대한 RNA 용량)의 요약.
[0244] 결과를 더 잘 시각화하기 위해, 가장 낮은 EC50 값은 기능적으로 질량 RNA 당 가장 높은 복제 활성과 동일하기 때문에, EC50의 역이 도 10에 제시된다. 실험 EC50 값 사이의 통계적 유의성을 결정하기 위해 Prism(GraphPad Software)을 사용하여 일원 ANOVA 통계 분석을 수행하였고, 이는 도 10에 예시되고 표 2에 제시된다. 이러한 실험에서, 30개의 아데닐레이트(A) 잔기로 구성된 가장 짧은 폴리(A) 꼬리를 갖는 srRNA 작제물은 가장 낮은 RNA 복제 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, 64 A 잔기로 구성된 중간 길이의 폴리(A)를 갖는 srRNA 작제물이 가장 높은 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 도 10에 제시된 바와 같이, 활성의 순서는 다음과 같았다: 30A<49A<81A<90A<64A.
[0245] 30A 초과의 폴리(A) 길이를 갖는 모든 srRNA 작제물은 30A 잔기를 갖는 폴리(A) 서열을 함유하는 참조 srRNA 작제물보다 유의하게 더 높은 활성을 나타내었다. 64 A 잔기를 갖는 srRNA 작제물은 49 A 잔기를 갖는 srRNA 작제물보다 유의하게 더 높은 활성을 나타내었지만, 더 긴 폴리(A) 서열(예를 들어, 81A, 90A)을 갖는 srRNA 작제물은 49A보다 유의하게 더 높은 활성을 나타내지 않았다.
[0246] 이러한 실험에서, 시험된 가장 긴 폴리(A) 서열(예를 들어, 81A, 90A)을 갖는 srRNA 작제물은 중앙값 64A 길이를 갖는 srRNA 작제물보다 더 낮은 활성으로 향하는 경향이 있었지만, 활성은 64A로부터의 활성보다 유의하게 낮은 것으로 밝혀지지 않았다. 이러한 데이터는 64A 또는 적어도 64A의 폴리(A)가 srRNA 작제물에 대해 유의하게 더 많은 활성을 초래함을 시사한다.
표 2: 도 9에 제시된 데이터로부터 계산된 Log(EC50) 값 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해 수행된 일원 ANOVA 통계 시험의 결과. ns = 유의하지 않음.
[0247] 본 발명의 개시의 특정 대안이 개시되었지만, 다양한 변형 및 조합이 가능하고 첨부된 청구범위의 진정한 사상 및 범위 내에서 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본원에 제시된 정확한 개요 및 개시내용을 제한하려는 의도는 없다.
SEQUENCE LISTING <110> Replicate Bioscience, Inc. <120> Alphavirus Vectors Containing Universal Cloning Adaptors <130> 058462-503001WO <140> Herewith <141> Herewith <150> US 63/177,656 <151> 2021-04-21 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> Exemplary 5' flanking domain <400> 1 ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> Exemplary 3' flanking domain <400> 2 tgaccgctac gccccaatga cccgaccagc 30 <210> 3 <211> 7793 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> DNA template sequence within a VEE empty vector with universal adaptors <400> 3 gataggcggc gcatgagaga agcccagacc aattacctac ccaaaatgga gaaagttcac 60 gttgacatcg aggaagacag cccattcctc agagctttgc agcggagctt cccgcagttt 120 gaggtagaag ccaagcaggt cactgataat gaccatgcta 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caaacctaag 2700 caggacgatc tcattctcac ttgtttcaga gggtgggtga agcagttgca aatagattac 2760 aaaggcaacg aaataatgac ggcagctgcc tctcaagggc tgacccgtaa aggtgtgtat 2820 gccgttcggt acaaggtgaa tgaaaatcct ctgtacgcac ccacctctga acatgtgaac 2880 gtcctactga cccgcacgga ggaccgcatc gtgtggaaaa cactagccgg cgacccatgg 2940 ataaaaacac tgactgccaa gtaccctggg aatttcactg ccacgataga ggagtggcaa 3000 gcagagcatg atgccatcat gaggcacatc ttggagagac cggaccctac cgacgtcttc 3060 cagaataagg caaacgtgtg ttgggccaag gctttagtgc cggtgctgaa gaccgctggc 3120 atagacatga ccactgaaca atggaacact gtggattatt ttgaaacgga caaagctcac 3180 tcagcagaga tagtattgaa ccaactatgc gtgaggttct ttggactcga tctggactcc 3240 ggtctatttt ctgcacccac tgttccgtta tccattagga ataatcactg ggataactcc 3300 ccgtcgccta acatgtacgg gctgaataaa gaagtggtcc gtcagctctc tcgcaggtac 3360 ccacaactgc ctcgggcagt tgccactgga agagtctatg acatgaacac tggtacactg 3420 cgcaattatg atccgcgcat aaacctagta cctgtaaaca gaagactgcc tcatgcttta 3480 gtcctccacc ataatgaaca cccacagagt gacttttctt cattcgtcag 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tgacacaacc ccgttcatgt acaatgccat ggcgggtgcc tacccctcat 660 actcgacaaa ttgggcagat gagcaggtac tgaaggctaa gaacatagga ttatgttcaa 720 cagacctgac ggaaggtaga cgaggcaaat tgtctattat gagaggaaaa aagctagaac 780 cgtgcgaccg tgtgctgttc tcagtagggt caacgctcta cccggaaagc cgtaagctac 840 ttaagagctg gcacctacca tcggtgttcc atttaaaggg caagctcagc ttcacatgcc 900 gctgtgatac agtggtttcg tgcgaaggct acgtcgttaa gagaataacg atgagcccag 960 gcctttacgg aaaaaccaca gggtatgcgg taacccacca cgcagacgga ttcctgatgt 1020 gcaagaccac cgacacggtt gacggcgaaa gagtgtcatt ctcggtgtgc acgtacgtgc 1080 cggcgaccat ttgtgatcaa atgaccggca tccttgctac agaagtcacg ccggaggatg 1140 cacagaagct gttggtgggg ctgaaccaga gaatagtggt taacggcaga acgcaacgga 1200 atacgaacac catgaaaaac tatatgattc ccgtggtcgc ccaagccttc agtaagtggg 1260 caaaggagtg ccggaaagac atggaagatg aaaaactcct gggggtcaga gaaagaacac 1320 tgacctgctg ctgtctatgg gcatttaaga agcagaaaac acacacggtc tacaagaggc 1380 ctgataccca gtcaattcag aaggttcagg ccgagtttga cagctttgtg gtaccgagcc 1440 tgtggtcgtc cgggttgtca 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actagcggaa agaaagaaaa ctgccaagaa atcaccaccg 2340 acgtgatgag acagagaggt ctagagatat ctgcacgtac ggttgactcg ctgctcttga 2400 atggatgtaa cagaccagtc gacgtgttgt acgtagacga ggcgtttgcg tgccactctg 2460 gaacgttact tgcattgatc gccttggtga gaccaagaca gaaagttgta ctttgtggtg 2520 acccgaagca gtgcggcttc ttcaatatga tgcagatgaa agtcaactat aatcacaaca 2580 tctgcaccca agtgtaccac aaaagtatct ccaggcggtg tacactgcct gtgactgcca 2640 ttgtgtcatc gttgcattac gaaggcaaaa tgcgcactac gaatgagtac aacaagccga 2700 ttgtagtgga cactacaggc tcaacaaaac ctgaccctgg agatctcgtg ttaacgtgct 2760 tcagaggatg ggttaaacaa ctgcaaattg actatcgtgg acacgaggtc atgacagcag 2820 ccgcatccca agggttaacc agaaaaggag tttacgcagt taggcaaaaa gttaacgaaa 2880 acccgcttta tgcatcaacg tcagagcacg tcaacgtact cctaacgcgt acggaaggta 2940 aactggtatg gaagacactc tccggtgacc cgtggataaa gacgctgcag aacccaccga 3000 aaggaaactt caaagcaact attaaggagt gggaggtgga gcatgcatca ataatggcgg 3060 gcatctgcag tcaccaaatg acctttgata cattccaaaa caaagccaac gtttgttggg 3120 ctaagagttt ggtccctatc ctcgaaacag cggggataaa actaaacgac aggcagtggt 3180 cccagataat tcaagccttc aaagaagaca aagcatattc acccgaagta gccctgaatg 3240 aaatatgcac gcgcatgtat ggggtggatc tagacagcgg gctattttct aaaccgttgg 3300 tgtctgtgta ttacgcggat aaccactggg ataataggcc tggagggaag atgttcggat 3360 tcaaccccga ggcagcatcc attctagaaa gaaagtatcc atttacaaaa gggaagtgga 3420 acatcaacaa gcagatctgc gtgactacca ggaggataga agacttcaac cctaccacca 3480 acattatacc ggccaacagg agactaccac actcattagt ggccgaacac cgcccagtaa 3540 aaggggaaag aatggaatgg ctggttaaca agataaacgg ccaccacgtg ctcctggtca 3600 gtggctgtag ccttgcactg cctactaaga gagtcacttg ggtagcgcca ctaggtgtcc 3660 gcggagcgga ctatacatac aacctagagt tgggtctgcc agcaacgctt ggtaggtatg 3720 acctagtggt cataaacatc cacacacctt ttcgcataca ccattatcaa cagtgcgtag 3780 accacgcaat gaaactgcaa atgctcgggg gtgactcatt gagactgctc aaaccgggtg 3840 gctctctatt gatcagagca tatggttacg cagatagaac cagtgaacga gtcatctgcg 3900 tattgggacg caagtttaga tcatctagag cgttgaaacc accatgtgtc accagcaaca 3960 ctgagatgtt ttttctattc 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ttattatttc ttttattaat caacaaaatt ttgtttttaa 9840 catttcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 9886 <210> 12 <211> 9241 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> Partial sequence of VEE srRNA plasmid, containing GOI flanked by universal adaptors <400> 12 ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat gtgcggaaga 60 tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg aaataactga 120 taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct cgccgccgtc atgagcgacc ctgacctgga 180 aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc aagtcgctgt 240 ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag ccaataaggg 300 agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta agaacttggc 360 tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa cggctcgtaa 420 cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt ccattcttag 480 aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga ccatctacca 540 cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact 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1440 ctacgatggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg ctgtactcaa 1500 gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga taacacactc 1560 tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg tgccagaggg 1620 acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca ttgtgtacaa 1680 cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag gagcgctgaa 1740 cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg aatacctgta 1800 cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactggtc actgggctag ggctcacagg 1860 cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa cacgaccagc 1920 cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag gcaagtctgg 1980 catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga aagaaaactg 2040 tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg ccagaactgt 2100 ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata ttgacgaagc 2160 ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac ctaaaaaggc 2220 agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc tgaaagtgca 2280 ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc gttgcactaa 2340 atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa cgacgaatcc 2400 gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc aggacgatct 2460 cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca aaggcaacga 2520 aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg ccgttcggta 2580 caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctctgaa catgtgaacg tcctactgac 2640 ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga taaaaacact 2700 gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag cagagcatga 2760 tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc agaataaggc 2820 aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca tagacatgac 2880 cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact cagcagagat 2940 agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg gtctattttc 3000 tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc cgtcgcctaa 3060 catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc cacaactgcc 3120 tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc gcaattatga 3180 tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag tcctccacca 3240 taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg gcagaactgt 3300 cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt tgtcagaccg 3360 gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg tgcccaaata 3420 tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc agcagtgtga 3480 agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc tgaatcccgg 3540 cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa gcatcattgg 3600 tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct cacttgaaga 3660 gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc acaatcctta 3720 caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg aagccggatg 3780 tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag gagtgattat 3840 aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc tgtataagaa 3900 attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac tggtcaaagg 3960 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cttatggatg tgctccaatg ggtcgttaca atgcagaatt tgcatttgac cgctacgccc 9060 caatgacccg accagctaag taacgataca gcagcaattg gcaagctgct tacatagaac 9120 tcgcggcgat tggcatgccg ctttaaaatt tttattttat ttttcttttc ttttccgaat 9180 cggattttgt ttttaatatt tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9240 a 9241 <210> 13 <211> 9878 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> Partial sequence of the plasmid encoding the CHIKV S27 srRNA construct, containing GOI flanked byuniversal adaptors <400> 13 gatggctgcg tgagacacac gtagcctacc agtttcttac tgctctactc tgcaaagcaa 60 gagattaaga acccatcatg gatcctgtgt acgtggacat agacgctgac agcgcctttt 120 tgaaggccct gcaacgtgcg taccccatgt ttgaggtgga acctaggcag gtcacaccga 180 atgaccatgc taatgctaga gcgttctcgc atctagctat aaaactaata gagcaggaaa 240 ttgatcccga ctcaaccatc ctggatattg gtagtgcgcc agcaaggagg atgatgtcgg 300 acaggaagta ccactgcgtt tgcccgatgc gcagtgcaga agatcccgag agactcgcca 360 attatgcgag aaagctagca tctgccgcag gaaaagtcct 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gtcacacaga 6300 tgagggaatt acccactttg gactcagcag tattcaacgt ggagtgtttc aaaaaattcg 6360 catgcaacca agaatactgg gaagaatttg ctgccagccc tatcaggata acaactgaga 6420 atttaacaac ctatgttact aaactaaagg ggccaaaagc agcagcgcta tttgcaaaaa 6480 cccataatct gctgccactg caggaagtgc caatggatag gttcacagta gacatgaaaa 6540 gggatgtgaa ggtgactcct ggtacaaagc acacagagga aagacctaag gtacaggtta 6600 tacaggcggc tgaacccttg gcaacagcat acctatgtgg gattcacaga gagctggtta 6660 ggaggctgaa cgccgtcctc ctacccaatg tacatacact atttgacatg tctgccgagg 6720 atttcgatgc catcatagcc gcacacttta agccaggaga cactgtttta gaaacggaca 6780 tagcctcctt tgataagagc caagatgatt cacttgcgct tactgcttta atgctgttag 6840 aggatttagg ggtggatcac tccctgttgg acttgataga ggctgctttc ggagagattt 6900 ccagctgtca tctaccgaca ggtacgcgct tcaagttcgg cgccatgatg aaatctggta 6960 tgttcctaac tctgttcgtc aacacactgc taaatatcac catcgccagc cgagtgctgg 7020 aagatcgtct gacaaaatcc gcgtgcgcag ccttcatcgg cgacgacaac ataatacatg 7080 gagtcgtctc cgatgaattg atggcagcca gatgcgccac ttggatgaac 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gaatagtaac 9660 aaaacataaa actaataaaa atcaaatgaa taccataatt ggcaaacgga agagatgtag 9720 gtacttaagc ttcctaaaag cagccgaact cactttgaga tgtaggcata gcataccgaa 9780 ctcttccacg attctccgaa cccacaggga cgtaggagat gttattttgt ttttaatatt 9840 tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 9878 <210> 14 <211> 9878 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> Partial sequence of the plasmid encoding the CHIKV DRDE srRNA construct, containing GOI flanked byuniversal adaptor <400> 14 gatggctgcg tgagacacac gtagcctacc agtttcttac tgctctactc tgcaaagcaa 60 gagattaata acccatcatg gatcctgtgt acgtggacat agacgctgac agcgcctttt 120 tgaaggccct gcaacgtgcg taccccatgt ttgaggtgga accaaggcag gtcacaccga 180 atgaccatgc taatgctaga gcgttctcgc atctagctat aaaactaata gagcaggaaa 240 ttgaccccga ctcaaccatc ctggatatcg gcagtgcgcc agcaaggagg atgatgtcgg 300 acaggaagta ccactgcgtc tgcccgatgc gcagtgcgga agatcccgag agactcgcta 360 attatgcgag aaagctagca tctgccgcag gaaaagtcct ggacagaaac atctctggaa 420 agatcgggga cttacaagca gtaatggccg tgccagacaa ggagacgcca acattctgct 480 tacacacaga cgtctcatgt agacagagag cagacgtcgc tatataccaa gacgtctatg 540 ctgtacacgc acccacgtcg ctataccacc aggcgattaa aggggtccga gtggcgtact 600 gggttgggtt cgacacaacc ccgttcatgt acaatgccat ggcgggtgcc tacccctcat 660 actcgacaaa ctgggcagat gagcaggtac tgaaggctaa gaacatagga ttatgttcaa 720 cagacctgac ggaaggtaga cgaggcaagt tgtctattat gagagggaaa aagctaaaac 780 cgtgcgaccg tgtgctgttc tcagtagggt caacgctcta cccggaaagc cgcaagctac 840 ttaagagctg gcacctgcca tcggtgttcc atttaaaggg caaactcagc ttcacatgcc 900 gctgtgatac agtggtttcg tgtgagggct acgtcgttaa gagaataacg atgagcccag 960 gcctttatgg aaaaaccaca gggtatgcgg taacccacca cgcagacgga ttcctgctgt 1020 gcaagactac cgacacggtt gacggcgaaa gagtgtcatt ctcggtgtgc acatacgtgc 1080 cggcgaccat ttgtgatcaa atgaccggca tccttgctac agaagtcacg ccggaggatg 1140 cacagaagct gttggtgggg ctgaaccaga gaatagtggt taacggcaga acgcaacgga 1200 atatgaacac catgaaaaat tatctgcttc ccgtggtcgc ccaagccttc agtaagtggg 1260 caaaggagtg ccggaaagac atggaagatg aaaaactcct gggggtcaga gaaagaacac 1320 tgacctgctg ctgtctatgg gcattcaaga agcagaaaac acacacggtc tacaagaggc 1380 ctgataccca gtcaattcag aaggttcagg ccgagtttga cagctttgtg gtaccgagtc 1440 tgtggtcgtc cgggttgtca atccctttga ggactagaat caaatggttg ttaagcaagg 1500 tgccaaaaac cgacctgatc ccatacagcg gagacgcccg agaagcccgg gacgcagaaa 1560 aagaagcaga ggaagaacga gaagcagaac tgactcgcga agccctacca cctctacagg 1620 cagcacagga agatgttcag gtcgaaatcg acgtggaaca gcttgaggac agagcgggcg 1680 caggaataat agagactccg agaggagcta tcaaagttac tgcccaacca acagaccacg 1740 tcgtgggaga gtacctggta ctctccccgc agaccgtact acgtagccag aagctcagtc 1800 tgattcacgc tttggcggag caagtgaaga cgtgcacgca caacggacga gcagggaggt 1860 atgcggtcga agcgtacgac ggccgagtcc tagtgccctc aggctatgca atctcgcctg 1920 aagacttcca gagtctaagc gaaagcgcga cgatggtgta taacgaaaga gagttcgtaa 1980 acagaaagct acaccatatt gcgatgcacg gaccagccct gaacaccgac gaagagtcgt 2040 atgagctggt gagggcagag aggacagaac acgagtacgt ctacgacgtg gatcagagaa 2100 gatgctgtaa gaaggaagaa gccgcaggac tggtactggt gggcgacttg actaatccgc 2160 cctaccacga attcgcatat gaagggctaa aaatccgccc tgcctgccca tacaaaattg 2220 cagtcatagg agtcttcgga gtaccgggat ctggcaagtc agctattatc aagaacctag 2280 ttaccaggca ggacctggtg actagcggaa agaaagaaaa ctgccaagaa atcaccaccg 2340 acgtgatgag acagagaggt ctagagatat ctgcacgtac ggttgactcg ctgctcttga 2400 atggatgcaa cagaccagtc gacgtgttgt acgtagacga ggcgtttgcg tgccactctg 2460 gaacgctact tgctttgatc gccttggtga gaccaaggca gaaagttgta ctttgtggtg 2520 acccgaagca gtgcggcttc ttcaatatga tgcagatgaa agtcaactat aatcacaaca 2580 tctgcaccca agtgtaccac aaaagtatct ccaggcggtg tacactgcct gtgaccgcca 2640 ttgtgtcatc gttgcattac gaaggcaaaa tgcgcactac gaatgagtac aacaagccga 2700 tcgtagtgga cactacaggc tcaacaaaac ctgaccctgg agacctcgtg ttaacgtgct 2760 tcagagggtg ggttaaacaa ctgcaaattg actatcgtgg atacgaggtc atgacagcag 2820 ccgcatccca agggttaacc agaaaaggag tttacgcagt tagacaaaaa gttaatgaaa 2880 acccgctcta tgcatcaacg tcagagcacg tcaacgtact cctaacgcgt acggaaggta 2940 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gcagcttggc aggcagaaaa ggatacagca ccacggaagg cgcactgtac tcatatctag 4680 aagggacccg ttttcatcag acggctgtgg atatggcgga gatacatact atgtggccaa 4740 agcaaacaga ggccaatgag caagtctgcc tatatgccct gggggaaagt attgaatcga 4800 tcaggcagaa atgcccggtg gatgatgcag acgcatcatc tccccccaaa actgtcccgt 4860 gcctttgccg ttacgctatg actccagaac gcgtcacccg gcttcgcatg aaccacgtca 4920 caagcataat tgtgtgttct tcgtttcccc tcccaaagta caaaatagaa ggagtgcaaa 4980 aagtcaaatg ctctaaggta atgctatttg accacaacgt gccatcgcgc gtaagtccaa 5040 gggaatatag atcttcccag gagtctgcac aggaggcgag tacaatcacg tcactgacgc 5100 atagtcaatt cgacctaagc gttgatggcg agatactgcc cgtcccgtca gacctggatg 5160 ctgacgcccc agccctagaa ccagcactag acgacggggc gacacacacg ctgccatcca 5220 caaccggaaa ccttgcggcc gtgtctgact gggtaatgag caccgtacct gtcgcgccgc 5280 ccagaagaag gcgagggaga aacctgactg tgacatgtga cgagagagaa gggaatataa 5340 cacccatggc tagcgtccga ttctttaggg cagagctgtg tccggtcgta caagaaacag 5400 cggagacgcg tgacacagca atgtctcttc aggcaccacc gagtaccgcc acggaaccga 5460 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tgagggaatt acccactttg gactcagcag tattcaacgt ggagtgtttc aaaaagttcg 6360 catgcaacca agaatactgg gaagaatttg ctgccagccc tattaggata acaactgaga 6420 atttagcaac ctatgttact aaactaaaag ggccaaaagc agcagcgcta ttcgcaaaaa 6480 cccataatct actgccacta caggaagtac caatggatag gttcacagta gatatgaaaa 6540 gggacgtgaa ggtgactcct ggtacaaagc atacagagga aagacctaag gtgcaggtta 6600 tacaggcggc tgaacccttg gcgacagcat acctatgtgg gattcacaga gagctggtta 6660 ggaggctgaa cgccgtcctc ctacccaatg tacatacact atttgacatg tctgccgagg 6720 atttcgatgc catcatagcc gcacacttta agccaggaga cactgttttg gaaacggaca 6780 tagcctcctt tgataagagc caagatgatt cacttgcgct tactgctttg atgctgttag 6840 aggatttagg ggtggatcac tccctgctgg acttgataga ggctgctttc ggagagattt 6900 ccagctgtca cctaccgaca ggtacgcgct tcaagttcgg cgccatgatg aaatcaggta 6960 tgttcctaac tctgttcgtc aacacattgt taaacatcac catcgccagc cgagtgctgg 7020 aagatcgtct gacaaaatcc gcgtgcgcgg ccttcatcgg cgacgacaac ataatacatg 7080 gagtcgtctc cgatgaattg atggcagcca gatgtgccac ttggatgaac atggaagtga 7140 agatcataga tgcagttgta tccttgaaag ccccttactt ttgtggaggg tttatactgc 7200 acgatactgt gacaggaaca gcttgcagag tggcagaccc gctaaaaagg ctttttaaac 7260 tgggcaaacc gctagcggca ggtgacgaac aagatgaaga tagaagacga gcgctggctg 7320 acgaagtgat cagatggcaa cgaacagggc taattgatga gctggagaaa gcggtatact 7380 ctaggtacga agtgcagggt atatcagttg tggtaatgtc catggccacc tttgcaagct 7440 ccagatccaa cttcgagaag ctcagaggac ccgtcataac tttgtacggc ggtcctaaat 7500 aggtacgcac tacagctacc tattttgcag aagccgacag caagtatcta aacactaatc 7560 agctacactg gagacgtgga ggagaaccct ggacctatgg agaaaatagt gcttcttttt 7620 gcaatagtca gtcttgttaa aagtgatcag atttgcattg gttaccatgc aaacaactcg 7680 acagagcagg ttgacacaat aatggaaaag aacgttactg ttacacatgc ccaagacata 7740 ctggaaaaga aacacaacgg gaagctctgc gatctagatg gagtgaagcc tctaattttg 7800 agagattgta gcgtagctgg atggctcctc ggaaacccaa tgtgtgacga attcatcaat 7860 gtgccggaat ggtcttacat agtggagaag gccaatccag tcaatgacct ctgttaccca 7920 ggggatttca atgactatga agaattgaaa cacctattga gcagaataaa ccattttgag 7980 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aaaacataaa actaataaaa atcaaatgaa taccataatt ggcaaacgga agagatgtag 9720 gtacttaagc ttcctaaaag cagccgaact cactttgaga tgtaggcata gcataccgaa 9780 ctcttccacg attctccgaa cccacaggga cgtaggagat gttattttgt ttttaatatt 9840 tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 9878 <210> 15 <211> 9886 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> Partial sequence of the plasmid encoding the SINV Girdwood srRNA construct, containing GOI flanked byuniversal adaptors <400> 15 gattggcggc gtagtacaca ctattgaatc aaacagccga ccaattgcac taccatcaca 60 atggagaagc cagtagttaa cgtagacgta gacccgcaga gtccgtttgt cgtgcaactg 120 caaaagagct tcccgcaatt tgaggtagta gcacagcagg tcactccaaa tgaccatgct 180 aatgccagag cattttcgca tctggccagt aaactaatcg agctggaggt tcctaccaca 240 gcgacgattt tggacatagg cagcgcaccg gctcgtagaa tgttttccga gcaccagtac 300 cattgcgttt gccccatgcg tagtccagaa gacccggacc gcatgatgaa atatgccagc 360 aaactggcgg aaaaagcatg caagattacg aataagaact tgcatgagaa gatcaaggac 420 ctccggaccg tacttgatac accggatgct gaaacgccat cactctgctt ccacaacgat 480 gttacctgca acacgcgtgc cgagtactcc gtcatgcagg acgtgtacat caacgcaccc 540 ggaactattt accatcaggc tatgaaaggc gtgcggaccc tgtactggat tggcttcgat 600 accacccagt tcatgttctc ggctatggca ggttcgtacc ctgcgtacaa caccaactgg 660 gccgacgaaa aagtcctcga agcgcgtaac atcggactct gcagcacaaa gctgagtgaa 720 ggcaggacag gaaagttgtc gataatgagg aagaaggagt tgaagcccgg gtcacgggtt 780 tatttctccg ttggatcgac actttaccca gaacacagag ccagcttgca gagctggcat 840 cttccatcgg tgttccacct gaaaggaaag cagtcgtaca cttgccgctg tgatacagtg 900 gtgagctgcg aaggctacgt agtgaagaaa atcaccatca gtcccgggat cacgggagaa 960 accgtgggat acgcggttac aaacaatagc gagggcttct tgctatgcaa agttaccgat 1020 acagtaaaag gagaacgggt atcgttcccc gtgtgcacgt atatcccggc caccatatgc 1080 gatcagatga ccggcataat ggccacggat atctcacctg acgatgcaca aaaacttctg 1140 gttgggctca accagcgaat cgtcattaac ggtaagacta acaggaacac caataccatg 1200 caaaattacc ttctgccaat cattgcacaa gggttcagca aatgggccaa ggagcgcaaa 1260 gaagaccttg acaatgaaaa aatgctgggt accagagagc gcaagcttac atatggctgc 1320 ttgtgggcgt ttcgcactaa gaaagtgcac tcgttctatc gcccacctgg aacgcagacc 1380 atcgtaaaag tcccagcctc ttttagcgct ttccccatgt catccgtatg gactacctct 1440 ttgcccatgt cgctgaggca gaagataaaa ttggcattac aaccaaagaa ggaggaaaaa 1500 ctgctgcaag tcccggagga attagtcatg gaggccaagg ctgctttcga ggatgctcag 1560 gaggaatcca gagcggagaa gctccgagaa gcactcccac cattagtggc agacaaaggt 1620 atcgaggcag ccgcggaagt tgtctgcgaa gtggaggggc tccaggcgga catcggagca 1680 gcactcgtcg aaaccccgcg cggtcatgta aggataatac ctcaagcaaa tgaccgtatg 1740 atcggacagt acatcgttgt ctcgccaacc tctgtgctga agaacgctaa actcgcacca 1800 gcacacccgc tagcagacca ggttaagatc ataacgcact ccggaagatc aggaaggtat 1860 gcagtcgaac catacgacgc taaagtactg atgccagcag gaagtgccgt accatggcca 1920 gaattcttag cactgagtga gagcgccacg ctagtgtaca acgaaagaga gtttgtgaac 1980 cgcaagctgt accatattgc catgcacggt cccgctaaga atacagaaga ggagcagtac 2040 aaggttacaa aggcagagct cgcagaaaca gagtacgtgt ttgacgtgga caagaagcga 2100 tgcgtcaaga 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tagtatggaa aactttacag ggcgacccat ggattaagca gctcactaac 3000 gtaccaaaag gaaattttca agccaccatc gaggactggg aagctgaaca caagggaata 3060 attgctgcga taaacagtcc cgctccccgt accaatccgt tcagctgcaa gactaacgtt 3120 tgctgggcga aagcactgga accgatactg gccacggccg gtatcgtact taccggttgc 3180 cagtggagcg agctgttccc acagtttgca gatgacaaac cacactcggc catctacgcc 3240 ctggacgtaa tctgcattaa gtttttcggc atggacttga caagcggact gttttccaaa 3300 cagagcatcc cgttaacgta ccatcctgcc gattcagcga ggccagtagc tcattgggac 3360 aacagcccag gaacccgcaa gtatgggtac gatcacgccg ttgccgccga actctcccgt 3420 agatttccgg tgttccagct agctgggaaa ggcacacagc ttgatttgca gacgggcaga 3480 actagagtta tctccgcaca gcataacttg gtcccagtga accgcaatct cccgcacgcc 3540 ttagtccccg agcacaagga gaaacaaccc ggcccggtca aaaaattctt gagccagttc 3600 aaacaccact ccgtacttgt ggtctcagag gaaaaaattg aagctcccca caagagaatc 3660 gaatggatcg ccccgattgg catagccggc gctgataaga actacaacct ggctttcggg 3720 tttccgccgc aggcacggta cgacctggtg tttatcaata ttggaactaa atacagaaac 3780 catcactttc agcagtgcga agaccatgcg gcgaccttga aaaccctctc gcgttcggcc 3840 ctgaactgcc ttaaccccgg aggcaccctc gtggtgaagt cctacggtta cgccgaccgc 3900 aatagtgagg acgtagtcac cgctcttgcc agaaaatttg tcagagtgtc tgcagcgagg 3960 ccagagtgcg tctcaagcaa tacagaaatg tacctgatct tccgacaact agacaacagc 4020 cgcacacgac aattcacccc gcatcatctg aattgtgtga tttcgtccgt gtacgagggt 4080 acaagagacg gagttggagc cgcaccgtca taccgcacta aaagggagaa cattgctgat 4140 tgtcaagagg aagcagttgt caatgcagcc aatccgctgg gcagaccagg cgaaggagtc 4200 tgccgtgcca tctataaacg ttggccgaac agtttcaccg attcagccac agagaccggc 4260 accgcaaaac tgactgtgtg ccaaggaaag aaagtgatcc acgcggttgg ccctgatttc 4320 cggaaacacc cagaggcaga agccctgaaa ttgctgcaaa acgcctacca tgcagtggca 4380 gacttagtaa atgaacataa tatcaagtct gtcgccatcc cactgctatc tacaggcatt 4440 tacgcagccg gaaaagaccg ccttgaagta tcacttaact gcttgacaac cgcgctagat 4500 agaactgatg cggacgtaac catctactgc ctggataaga agtggaagga aagaatcgac 4560 gcggtgctcc aacttaagga gtctgtaaca gagctgaagg atgaggatat ggagatcgac 4620 gacgagttag tatggatcca tccggacagt tgcctgaagg gaagaaaggg attcagtact 4680 acaaaaggaa agttgtattc gtactttgaa ggcaccaaat tccatcaagc agcaaaagat 4740 atggcggaga taaaggtcct gttcccaaat gaccaggaaa gcaacgagca actgtgtgcc 4800 tacatattgg gggagaccat ggaagcaatc cgcgaaaaat gcccggtcga ccacaacccg 4860 tcgtctagcc cgccaaaaac gctgccgtgc ctctgcatgt atgccatgac gccagaaagg 4920 gtccacagac tcagaagcaa caacgtcaaa gaagttacag tatgctcctc cacccccctt 4980 ccaaagtaca aaatcaagaa cgttcagaag gttcagtgca caaaagtagt cctgtttaac 5040 ccgcataccc ctgcattcgt tcccgcccgt aagtacatag aagcgccaga acagcctgca 5100 gctccgcctg cacaggccga ggaggccccc gaagttgcag caacaccaac accacctgca 5160 gctgataaca cctcgcttga tgtcacggac atctcactgg acatggaaga cagtagcgaa 5220 ggctcactct tttcgagctt tagcggatcg gacaactcta ttaccagtat ggacagttgg 5280 tcgtcaggac ctagttcact agagatagta gaccgaaggc aggtggtggt ggctgacgtc 5340 catgccgtcc aagagcctgc ccctgttcca ccgccaaggc taaagaagat ggcccgcctg 5400 gcagcggcaa gaatgcagga agagccaact ccaccggcaa gcaccagctc tgcggacgag 5460 tcccttcacc 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cgtccaaatg tgcagcattt atcggcgacg acaacatcat acacggagta 7200 gtatctgaca aagaaatggc tgagaggtgt gccacctggc tcaacatgga ggttaagatc 7260 attgacgcag tcatcggcga gagaccgcct tacttctgcg gtggattcat cttgcaagat 7320 tcggttacct ccacagcgtg tcgcgtggcg gaccccttga aaaggctgtt taagttgggt 7380 aaaccgctcc cagccgacga cgagcaagac gaagacagaa gacgcgctct gctagatgaa 7440 acaaaggcgt ggtttagagt aggtataaca gacaccttag cagtggccgt ggcaactcgg 7500 tatgaggtag acaacatcac acctgtcctg ctggcattga gaacttttgc ccagagcaaa 7560 agagcatttc aagccatcag aggggaaata aagcatctct acggtggtcc taaatagtca 7620 gcatagcaca tttcatctga ctaataccac aacaccacca ccatgaatag aggattcttt 7680 aacatgctcg gccgccgccc cttcccggcc cccactgcca tgtggaggcc gcggagaagg 7740 aggcaggcgg ccccgggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac 7800 gtggaggaga accctggacc tatggagaaa atagtgcttc tttttgcaat agtcagtctt 7860 gttaaaagtg atcagatttg cattggttac catgcaaaca actcgacaga gcaggttgac 7920 acaataatgg aaaagaacgt tactgttaca catgcccaag acatactgga aaagaaacac 7980 aacgggaagc tctgcgatct agatggagtg aagcctctaa ttttgagaga ttgtagcgta 8040 gctggatggc tcctcggaaa cccaatgtgt gacgaattca tcaatgtgcc ggaatggtct 8100 tacatagtgg agaaggccaa tccagtcaat gacctctgtt acccagggga tttcaatgac 8160 tatgaagaat tgaaacacct attgagcaga ataaaccatt ttgagaaaat tcagatcatc 8220 cccaaaagtt cttggtccag tcatgaagcc tcattagggg tgagctcagc atgtccatac 8280 cagggaaagt cctccttttt cagaaatgtg gtatggctta tcaaaaagaa cagtacatac 8340 ccaacaataa agaggagcta caataatacc aaccaagaag atcttttggt actgtggggg 8400 attcaccatc ctaatgatgc ggcagagcag acaaagctct atcaaaaccc aaccacctat 8460 atttccgttg ggacatcaac actaaaccag agattggtac caagaatagc tactagatcc 8520 aaagtaaacg ggcaaagtgg aaggatggag ttcttctgga caattttaaa gccgaatgat 8580 gcaatcaact tcgagagtaa tggaaatttc attgctccag aatatgcata caaaattgtc 8640 aagaaagggg actcaacaat tatgaaaagt gaattggaat atggtaactg caacaccaag 8700 tgtcaaactc caatgggggc gataaactct agcatgccat tccacaatat acaccctctc 8760 accattgggg aatgccccaa atatgtgaaa tcaaacagat tagtccttgc gactgggctc 8820 agaaatagcc ctcaaagaga gagaagaaga aaaaagagag gattatttgg agctatagca 8880 ggttttatag agggaggatg gcagggaatg gtagatggtt ggtatgggta ccaccatagc 8940 aatgagcagg ggagtgggta cgctgcagac aaagaatcca ctcaaaaggc aatagatgga 9000 gtcaccaata aggtcaactc gatcattgac aaaatgaaca ctcagtttga ggccgttgga 9060 agggaattta acaacttaga aaggagaata gagaatttaa acaagaagat ggaagacggg 9120 ttcctagatg tctggactta taatgctgaa cttctggttc tcatggaaaa tgagagaact 9180 ctagactttc atgactcaaa tgtcaagaac ctttacgaca aggtccgact acagcttagg 9240 gataatgcaa aggagctggg taacggttgt ttcgagttct atcataaatg tgataatgaa 9300 tgtatggaaa gtgtaagaaa tggaacgtat gactacccgc agtattcaga agaagcgaga 9360 ctaaaaagag aggaaataag tggagtaaaa ttggaatcaa taggaattta ccaaatactg 9420 tcaatttatt ctacagtggc gagttcccta gcactggcaa tcatggtagc tggtctatcc 9480 ttatggatgt gctccaatgg gtcgttacaa tgcagaattt gcatttgacc gctacgcccc 9540 aatgacccga ccagcaaaac tcgatgtact tccgaggaac tgatgtgcat aatgcatcag 9600 gctggtatat tagatccccg cttaccgcgg gcaatatagc aacaccaaaa ctcgacgtat 9660 ttccgaggaa gcgcagtgca taatgctgcg cagtgttgcc aaataatcac tatattaacc 9720 atttattcag cggacgccaa aactcaatgt atttctgagg aagcatggtg cataatgcca 9780 tgcagcgtct gcataacttt ttattatttc ttttattaat caacaaaatt ttgtttttaa 9840 catttcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 9886 <210> 16 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> DNA sequence encoding the CHIKV DRDE 5' UTR <400> 16 atggctgcgt gagacacacg tagcctacca gtttcttact gctctactct gcaaagcaag 60 agattaataa cccatc 76 <210> 17 <211> 513 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> DNA sequence encoding the CHIKV S27 3' UTR <400> 17 cttgacgact aagcatgaag gtatatgtgt cccctaagag acacaccgta tatagctaat 60 aatctgtaga tcaaagggct atataacccc tgaatagtaa caaaatacaa aatcactaaa 120 aattataaaa aaaaaaaaaa aaaaacagaa aaatatataa ataggtatac gtgtccccta 180 agagacacat tgtatgtagg tgataagtat agatcaaagg gccgaacaac ccctgaatag 240 taacaaaata taaaaattaa taaaaatcat aaaatagaaa aaccataaac agaagtagtt 300 caaagggcta taaaaacccc tgaatagtaa caaaacataa aactaataaa aatcaaatga 360 ataccataat tggcaaacgg aagagatgta ggtacttaag cttcctaaaa gcagccgaac 420 tcactttgag atgtaggcat agcataccga actcttccac gattctccga acccacaggg 480 acgtaggaga tgttattttg tttttaatat ttc 513 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> bacteriophage T7 RNA polymerase promoter <400> 18 taatacgact cactatag 18 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> T7 terminator sequence <400> 19 aacccctctc taaacggagg ggttttttt 29 <210> 20 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> Exemplary synthetic adaptor molecule <400> 20 ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta ctagtgaccg ctacgcccca atgacccgac 60 cagc 64 <210> 21 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> exemplary Type IIS restriction site at the end of the poly(A) sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(120) <223> A residue can be absent or present <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> n is a, c, g, or t <400> 21 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaan 120 gaagagc 127 <210> 22 <211> 8066 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> DNA template sequence for a srRNA construct within SINV AR86/Girdwood chimera 1 empty vectorwith universal adaptors <400> 22 atggagaagc cagtagttaa cgtagacgta gaccctcaga gtccgtttgt cgtgcaactg 60 caaaagagct tcccgcaatt tgaggtagta gcacagcagg tcactccaaa tgaccatgct 120 aatgccagag cattttcgca tctggccagt aaactaatcg agctggaggt tcctaccaca 180 gcgacgattt tggacatagg cagcgcaccg gctcgtagaa tgttttccga gcaccagtac 240 cattgcgttt gccccatgcg tagtccagaa gacccggacc gcatgatgaa atatgccagc 300 aaactggcgg aaaaagcatg taagattaca aacaagaact tgcatgagaa gatcaaggac 360 ctccggaccg tacttgatac accggatgct gaaacgccat cactctgctt ccacaacgat 420 gttacctgca acacgcgtgc cgagtactcc gtcatgcagg acgtgtacat caacgctccc 480 ggaactattt accaccaggc tatgaaaggc gtgcggaccc tgtactggat tggcttcgac 540 accacccagt tcatgttctc ggctatggca ggttcgtacc ctgcatacaa caccaactgg 600 gccgacgaaa aagtccttga agcgcgtaac atcggactct gcagcacaaa gctgagtgaa 660 ggcaggacag gaaagttgtc gataatgagg aagaaggagt tgaagcccgg gtcacgggtt 720 tatttctccg ttggatcgac actttaccca gaacacagag ccagcttgca gagctggcat 780 cttccatcgg tgttccactt gaaaggaaag cagtcgtaca cttgccgctg tgatacagtg 840 gtgagctgcg aaggctacgt agtgaagaaa atcaccatca gtcccgggat cacgggagaa 900 accgtgggat acgcggttac aaacaatagc gagggcttct tgctatgcaa agttaccgat 960 acagtaaaag gagaacgggt atcgttcccc gtgtgcacgt atatcccggc caccatatgc 1020 gatcagatga ccggcataat ggccacggat atctcacctg acgatgcaca aaaacttctg 1080 gttgggctca accagcgaat cgtcattaac ggtaagacta acaggaacac caataccatg 1140 caaaattacc ttctgccaat cattgcacaa gggttcagca aatgggccaa ggagcgcaaa 1200 gaagatcttg acaatgaaaa aatgctgggc accagagagc gcaagcttac atatggctgc 1260 ttgtgggcgt ttcgcactaa gaaagtgcac tcgttctatc gcccacctgg aacgcagacc 1320 atcgtaaaag tcccagcctc ttttagcgct ttccccatgt catccgtatg gactacctct 1380 ttgcccatgt cgctgaggca gaagatgaaa ttggcattac aaccaaagaa ggaggaaaaa 1440 ctgctgcaag tcccggagga attagttatg gaggccaagg ctgctttcga ggatgctcag 1500 gaggaatcca gagcggagaa gctccgagaa gcactcccac cattagtggc agacaaaggt 1560 atcgaggcag ctgcggaagt tgtctgcgaa gtggaggggc tccaggcgga caccggagca 1620 gcactcgtcg aaaccccgcg cggtcatgta aggataatac ctcaagcaaa tgaccgtatg 1680 atcggacagt acatcgttgt ctcgccaacc tctgtgctga agaacgctaa actcgcacca 1740 gcacacccgc tagcagacca ggttaagatc ataacgcact ccggaagatc aggaaggtat 1800 gcagtcgaac catacgacgc taaagtactg atgccagcag gaagtgccgt accatggcca 1860 gaattcttag cactgagtga gagcgccacg ctagtgtaca acgaaagaga gtttgtgaac 1920 cgcaagctgt accatattgc catgcacggt cccgctaaga atacagaaga ggagcagtac 1980 aaggttacaa aggcagagct cgcagaaaca gagtacgtgt ttgacgtgga caagaagcga 2040 tgcgtcaaga aggaagaagc ctcaggactt gtcctctcgg gagaactgac caacccgccc 2100 tatcacgaac tagctcttga gggactgaag actcgacccg cggtcccgta caaggttgaa 2160 acaataggag tgataggcac accaggatcg ggcaagtcgg ctatcatcaa gtcaactgtc 2220 acggcacgtg atcttgttac cagcggaaag aaagaaaact gccgcgaaat tgaggccgat 2280 gtgctacggc tgaggggcat gcagatcacg tcgaagacag tggattcggt tatgctcaac 2340 ggatgccaca aagccgtaga agtgctgtat gttgacgaag cgttcgcgtg ccacgcagga 2400 gcactacttg ccttgattgc aatcgtcaga ccccgtaaga aggtagtgct atgcggagac 2460 cctaagcaat gcggattctt caacatgatg caactaaagg tatatttcaa ccacccggaa 2520 aaagacatat gtaccaagac attctacaag tttatctccc gacgttgcac acagccagtc 2580 acggctattg tatcgacact gcattacgat ggaaaaatga aaaccacaaa cccgtgcaag 2640 aagaacatcg aaatcgacat tacaggggcc acgaagccga agccagggga catcatcctg 2700 acatgcttcc gcgggtgggt taagcaactg caaatcgact atcccggaca tgaggtaatg 2760 acagccgcgg cctcacaagg gctaaccaga aaaggagtat atgccgtccg gcaaaaagtc 2820 aatgaaaacc cgctgtacgc gatcacatca gagcatgtga acgtgctgct cacccgcact 2880 gaggacaggc tagtatggaa aactttacag ggcgacccat ggattaagca gctcactaac 2940 gtaccaaaag gaaattttca agccaccatc gaggactggg aagctgaaca caagggaata 3000 attgctgcga taaacagtcc cgctccccgt accaatccgt tcagctgcaa gactaacgtt 3060 tgctgggcga aagcactgga accgatactg gccacggccg gtatcgtact taccggttgc 3120 cagtggagcg agctgttccc acagtttgca gatgacaaac cacactcggc catctacgcc 3180 ctggacgtaa tctgcattaa gtttttcggc atggacttga caagcggact gttttccaaa 3240 cagagcatcc cgttaacgta ccatcctgcc gattcagcga ggccagtagc tcattgggac 3300 aacagcccag gaacccgcaa gtatgggtac gatcacgccg ttgccgccga actctcccgt 3360 agatttccgg tgttccagct agctgggaaa ggcacacagc ttgatttgca gacgggcaga 3420 actagagtta tctccgcaca gcataacttg gtcccagtga accgcaatct cccgcacgcc 3480 ttagtccccg agcacaagga gaaacaaccc ggcccggtca aaaaattctt gagccagttc 3540 aaacaccact ccgtacttgt ggtctcagag gaaaaaattg aagctcccca caagagaatc 3600 gaatggatcg ccccgattgg catagccggc gctgataaga actacaacct ggctttcggg 3660 tttccgccgc 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aacttaagga gtctgtaact gagctgaagg atgaggatat ggagatcgac 4560 gacgagttag tatggatcca tccggacagt tgcctgaagg gaagaaaggg attcagtact 4620 acaaaaggaa agttgtattc gtactttgaa ggcaccaaat tccatcaagc agcaaaagat 4680 atggcggaga taaaggtcct gttcccaaat gaccaggaaa gcaacgaaca actgtgtgcc 4740 tacatattgg gggagaccat ggaagcaatc cgcgaaaaat gcccggtcga ccacaacccg 4800 tcgtctagcc cgccaaaaac gctgccgtgc ctctgtatgt atgccatgac gccagaaagg 4860 gtccacagac tcagaagcaa taacgtcaaa gaagttacag tatgctcctc cacccccctt 4920 ccaaagtaca aaatcaagaa tgttcagaag gttcagtgca caaaagtagt cctgtttaac 4980 ccgcataccc ccgcattcgt tcccgcccgt aagtacatag aagcaccaga acagcctgca 5040 gctccgcctg cacaggccga ggaggccccc ggagttgtag cgacaccaac accacctgca 5100 gctgataaca cctcgcttga tgtcacggac atctcactgg acatggaaga cagtagcgaa 5160 ggctcactct tttcgagctt tagcggatcg gacaactacc gaaggcaggt ggtggtggct 5220 gacgtccatg ccgtccaaga gcctgcccct gttccaccgc caaggctaaa gaagatggcc 5280 cgcctggcag cggcaagaat gcaggaggag ccaactccac cggcaagcac cagctctgcg 5340 gacgagtccc ttcacctttc ttttgatggg gtatctatat ccttcggatc ccttttcgac 5400 ggagagatgg cccgcttggc agcggcacaa cccccggcaa gtacatgccc tacggatgtg 5460 cctatgtctt tcggatcgtt ttccgacgga gagattgagg agttgagccg cagagtaacc 5520 gagtcggagc ccgtcctgtt tgggtcattt gaaccgggcg aagtgaactc aattatatcg 5580 tcccgatcag ccgtatcttt tccaccacgc aagcagagac gtagacgcag gagcaggagg 5640 accgaatact gtctaaccgg ggtaggtggg tacatatttt cgacggacac aggccctggg 5700 cacttgcaaa agaagtccgt tctgcagaac cagcttacag aaccgacctt ggagcgcaat 5760 gttctggaaa gaatctacgc cccggtgctc gacacgtcga aagaggaaca gctcaaactc 5820 aggtaccaga tgatgcccac cgaagccaac aaaagcaggt accagtctcg aaaagtagaa 5880 aaccagaaag ccataaccac tgagcgactg ctttcagggc tacgactgta taactctgcc 5940 acagatcagc cagaatgcta taagatcacc tacccgaaac catcgtattc cagcagtgta 6000 ccagcgaact actctgaccc aaagtttgct gtagctgttt gtaacaacta tctgcatgag 6060 aattacccga cggtagcatc ttatcagatc accgacgagt acgatgctta cttggatatg 6120 gtagacggga cagtcgcttg cctagatact gcaacttttt gccccgccaa gcttagaagt 6180 tacccgaaaa gacacgagta tagagcccca aacatccgca gtgcggttcc atcagcgatg 6240 cagaacacgt tgcaaaacgt gctcattgcc gcgactaaaa gaaactgcaa cgtcacacaa 6300 atgcgtgaac tgccaacact ggactcagcg acattcaacg ttgaatgctt tcgaaaatat 6360 gcatgcaatg acgagtattg ggaggagttt gcccgaaagc caattaggat cactactgag 6420 ttcgttaccg catacgtggc cagactgaaa ggccctaagg ccgccgcact gttcgcaaag 6480 acgcataatt tggtcccatt gcaagaagtg cctatggata gattcgtcat ggacatgaaa 6540 agagacgtga aagttacacc tggcacgaaa cacacagaag aaagaccgaa agtacaagtg 6600 atacaagccg cagaacccct ggcgaccgct tacctatgcg ggatccaccg ggagttagtg 6660 cgcaggctta cagccgtttt gctacccaac attcacacgc tctttgacat gtcggcggag 6720 gactttgatg caatcatagc agaacacttc aagcaaggtg acccggtact ggagacggat 6780 atcgcctcgt tcgacaaaag ccaagacgac gctatggcgt taaccggcct gatgatcttg 6840 gaagacctgg gtgtggacca accactactc gacttgatcg agtgcgcctt tggagaaata 6900 tcatccaccc atctgcccac gggtacccgt ttcaaattcg gggcgatgat gaaatccgga 6960 atgttcctca cgctctttgt caacacagtt ctgaatgtcg ttatcgccag cagagtattg 7020 gaggagcggc ttaaaacgtc caaatgtgca gcatttatcg gcgacgacaa cattatacac 7080 ggagtagtat ctgacaaaga aatggctgag aggtgtgcca cctggctcaa catggaggtt 7140 aagatcattg acgcagtcat cggcgagaga ccaccttact tctgcggtgg attcatcttg 7200 caagattcgg ttacctccac agcgtgtcgc gtggcggacc ccttgaaaag gctgtttaag 7260 ttgggtaaac cgctcccagc cgacgatgag caagacgaag acagaagacg cgctctgcta 7320 gatgaaacaa aggcgtggtt tagagtaggt ataacagaca ccttagcagt ggccgtggca 7380 actcggtatg aggtagacaa catcacacct gtcctgctgg cattgagaac ttttgcccag 7440 agcaaaagag catttcaagc catcagaggg gaaataaagc atctctacgg tggtcctaaa 7500 tagtcagcat agtacatttc atctgactaa taccacaaca ccaccaccat gaatagagga 7560 ttctttaaca tgctcggccg ccgccccttc ccagccccca ctgccatgtg gaggccgcgg 7620 agaaggaggc aggcggcccc gggaagcgga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct 7680 ggagacgtgg aggagaaccc tggacctact agtgaccgct acgccccaat gacccgacca 7740 gcaaaactcg atgtacttcc gaggaactga tgtgcataat gcatcaggct ggtatattag 7800 atccccgctt accgcgggca atatagcaac accaaaactc gacgtatttc cgaggaagcg 7860 cagtgcataa tgctgcgcag tgttgccaaa taatcactat attaaccatt tattcagcgg 7920 acgccaaaac tcaatgtatt tctgaggaag catggtgcat aatgccatgc agcgtctgca 7980 taacttttta ttatttcttt tattaatcaa caaaattttg tttttaacat ttcaaaaaaa 8040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 8066 <210> 23 <211> 8120 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> DNA template sequence for a srRNA construct within SINV AR86/Girdwood chimera 2 empty vectorwith universal adaptors <400> 23 atggagaagc cagtagttaa cgtagacgta gacccgcaga gtccgtttgt cgtgcaactg 60 caaaagagct tcccgcaatt tgaggtagta gcacagcagg tcactccaaa tgaccatgct 120 aatgccagag cattttcgca tctggccagt aaactaatcg agctggaggt tcctaccaca 180 gcgacgattt tggacatagg cagcgcaccg gctcgtagaa tgttttccga gcaccagtac 240 cattgcgttt gccccatgcg tagtccagaa gacccggacc gcatgatgaa atatgccagc 300 aaactggcgg aaaaagcatg caagattacg aataagaact tgcatgagaa gatcaaggac 360 ctccggaccg tacttgatac accggatgct gaaacgccat cactctgctt ccacaacgat 420 gttacctgca acacgcgtgc 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Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> DNA template sequence for a srRNA construct within SINV AR86/Girdwood chimera 4 empty vectorwith universal adaptors <400> 25 atggagaagc cagtagttaa cgtagacgta gaccctcaga gtccgtttgt cgtgcaactg 60 caaaagagct tcccgcaatt tgaggtagta gcacagcagg tcactccaaa tgaccatgct 120 aatgccagag cattttcgca tctggccagt aaactaatcg agctggaggt tcctaccaca 180 gcgacgattt tggacatagg cagcgcaccg gctcgtagaa tgttttccga gcaccagtac 240 cattgcgttt gccccatgcg tagtccagaa gacccggacc gcatgatgaa atatgccagc 300 aaactggcgg aaaaagcatg taagattaca aacaagaact tgcatgagaa gatcaaggac 360 ctccggaccg tacttgatac accggatgct gaaacgccat cactctgctt ccacaacgat 420 gttacctgca acacgcgtgc cgagtactcc gtcatgcagg acgtgtacat caacgctccc 480 ggaactattt accaccaggc tatgaaaggc gtgcggaccc tgtactggat tggcttcgac 540 accacccagt tcatgttctc ggctatggca ggttcgtacc ctgcatacaa caccaactgg 600 gccgacgaaa aagtccttga agcgcgtaac atcggactct gcagcacaaa gctgagtgaa 660 ggcaggacag gaaagttgtc 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gttgacgaag cgttcgcgtg ccacgcagga 2400 gcactacttg ccttgattgc aatcgtcaga ccccgtaaga aggtagtgct atgcggagac 2460 cctaagcaat gcggattctt caacatgatg caactaaagg tatatttcaa ccacccggaa 2520 aaagacatat gtaccaagac attctacaag tttatctccc gacgttgcac acagccagtc 2580 acggctattg tatcgacact gcattacgat ggaaaaatga aaaccacaaa cccgtgcaag 2640 aagaacatcg aaatcgacat tacaggggcc acgaagccga agccagggga catcatcctg 2700 acatgcttcc gcgggtgggt taagcaactg caaatcgact atcccggaca tgaggtaatg 2760 acagccgcgg cctcacaagg gctaaccaga aaaggagtat atgccgtccg gcaaaaagtc 2820 aatgaaaacc cgctgtacgc gatcacatca gagcatgtga acgtgctgct cacccgcact 2880 gaggacaggc tagtatggaa aactttacag ggcgacccat ggattaagca gctcactaac 2940 gtaccaaaag gaaattttca agccaccatc gaggactggg aagctgaaca caagggaata 3000 attgctgcga taaacagtcc cgctccccgt accaatccgt tcagctgcaa gactaacgtt 3060 tgctgggcga aagcactgga accgatactg gccacggccg gtatcgtact taccggttgc 3120 cagtggagcg agctgttccc acagtttgca gatgacaaac cacactcggc catctacgcc 3180 ctggacgtaa tctgcattaa gtttttcggc 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construct within VEE vector containing a GOI, universal adaptors, and longer poly(A) <400> 26 ataggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60 ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120 aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180 tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240 gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat 300 gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg 360 aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct cgccgccgtc atgagcgacc 420 ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc 480 aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag 540 ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta 600 agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa 660 cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt 720 ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga 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gctacgcccc aatgacccga ccagcaaaac 7860 tcgatgtact tccgaggaac tgatgtgcat aatgcatcag gctggtatat tagatccccg 7920 cttaccgcgg gcaatatagc aacaccaaaa ctcgacgtat ttccgaggaa gcgcagtgca 7980 taatgctgcg cagtgttgcc aaataatcac tatattaacc atttattcag cggacgccaa 8040 aactcaatgt atttctgagg aagcatggtg cataatgcca tgcagcgtct gcataacttt 8100 ttattatttc ttttattaat caacaaaatt ttgtttttaa catttcaaaa aaaaaaaaaa 8160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 8179 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> T7 RNA polymerase promoter <400> 28 taatacgact cactatag 18 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> T7 terminator sequence <400> 29 aacccctctc taaacggagg ggttttttt 29 <210> 30 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> Forward primer <400> 30 gctggagacg tggaggagaa ccctggacct atggagaaaa tagtgcttct ttttg 55 <210> 31 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> Reverse primer <400> 31 gctggtcggg tcattggggc gtagcggtca aatgcaaatt ctgcattgta acg 53

Claims (95)

  1. 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 포함하는 핵산 작제물로서, 상기 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 상당 부분이 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA로의 이종성 서열의 삽입을 용이하게 하도록 구성된 합성 어댑터 분자에 의해 대체되고, 상기 합성 어댑터 분자가 하기 화학식 I을 갖고:
    [5' 플랭킹 도메인]- [제한 부위] n -[3' 플랭킹 도메인] 화학식 I
    상기 식에서,
    a) n이 1 내지 6의 정수이고;
    b) 제한 부위가 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단 가능하고;
    c) 5' 플랭킹 도메인 및 3' 플랭킹 도메인이 각각 최소 이차 구조를 갖는 것으로 예측되는 핵산 서열을 포함하는,
    핵산 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인의 서열이 미리 정의된 임계값보다 높은 최소 자유 에너지(MFE) 구조의 폴딩 ΔG 값을 갖는 핵산 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인이 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 서열을 인코딩하는 서열을 포함하지 않는 핵산 작제물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인이 자가단백질분해 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물.
  5. 제4항에 있어서, 자가단백질분해 펩티드가 칼슘-의존성 세린 엔도프로테아제(푸린), 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A), 구제역 바이러스(FMDV) 2A(F2A), 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A(E2A), 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 2A(T2A), 세포질 다면체증 바이러스 2A(BmCPV2A), 플래쉐리(Flacherie) 바이러스 2A(BmIFV2A), 또는 이들의 조합으로부터 유래된 하나 이상의 자가단백질분해 절단 서열을 포함하는 핵산 작제물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 자가단백질분해 펩티드에 대한 코딩 서열이 제한 부위(들)의 상류에 혼입되는 핵산 작제물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인이 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는 핵산 작제물.
  8. 제7항에 있어서, IRES 요소가 제한 부위(들)의 상류에 혼입되는 핵산 작제물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인이 임의의 리딩 프레임에 번역 시작 부위를 포함하지 않는 핵산 작제물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인이 5' 어댑터 서열의 마지막 뉴클레오티드로서 번역 시작 부위 또는 이의 일부를 포함하는 핵산 작제물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인이 5' 어댑터 서열의 마지막 3개의 뉴클레오티드로서 메티오닌 코돈을 포함하는 핵산 작제물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인이 약 15개 뉴클레오티드 내지 약 35개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 핵산 작제물.
  13. 제12항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인이 약 30개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 핵산 작제물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인이 SEQ ID NO: 1과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 플랭킹 도메인의 서열이 미리 정의된 임계값보다 높은 최소 자유 에너지(MFE) 구조의 폴딩 ΔG 값을 갖는 핵산 작제물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인이 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 서열을 인코딩하는 서열을 포함하지 않는 핵산 작제물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 플랭킹 도메인이 3' 어댑터 서열의 처음 3개의 뉴클레오티드로서 번역 정지 코돈을 포함하는 핵산 작제물.
  18. 제17항에 있어서, 정지 코돈이 TAG, TAA, 또는 TGA로부터 선택되는 핵산 작제물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 플랭킹 도메인이 SEQ ID NO: 2와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 어댑터 분자가 SEQ ID NO: 20과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제한 부위가 유형 I 제한 효소, 유형 II 제한 효소, 유형 III 제한 효소, 유형 IV 제한 효소, 및 유형 V 제한 효소로부터 선택된 제한 효소에 의해 절단될 수 있는 핵산 작제물.
  22. 제21항에 있어서, 제한 부위가 유형 II 제한 효소에 의해 절단 가능한 핵산 작제물.
  23. 제22항에 있어서, 제한 부위가 SpeI 또는 이의 이소스키조머(isoschizomer)에 의해 절단 가능한 핵산 작제물.
  24. 폴리(A) 꼬리를 포함하는 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 포함하는 핵산 작제물로서, 상기 폴리(A) 꼬리가 3' 비-A 잔기를 포함하지 않는, 핵산 작제물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열로 조작된 추가 제한 부위를 추가로 포함하는 핵산 작제물.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA의 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열의 말단에 혼입된 추가 제한 부위를 추가로 포함하는 핵산 작제물.
  27. 제26항에 있어서, 추가 제한 부위가 유형 IIS 제한 효소 또는 귀소 엔도뉴클레아제에 의해 절단 가능한 핵산 작제물.
  28. 제27항에 있어서, 유형 IIS 제한 효소가 AcuI, AlwI, Alw26I, BaeI, BbiI, BbsI, BbsI-HF, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BsaI-HF, BsaI-HFv2, BsaXI, BseGI, BseRI, BsgI, BsmAI, BsmBI-v2, BsmFI, BsmI, BspCNI, BspMI, BspQI, BsrDI, BsrI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsIMutI, CspCI, EarI, EciI, Eco31I, Esp3I, FauI, FokI, HgaI, HphI, HpyAV, LpuI, MboII, MlyI, MmeI, MnlI, NmeAIII, PaqCI, PleI, SapI, 또는 SfaNI인 핵산 작제물.
  29. 제27항에 있어서, 귀소 엔도뉴클레아제가 I-CeuI, I-SceI, PI-PspI, 또는 PI-SceI인 핵산 작제물.
  30. 폴리(A) 꼬리를 포함하는 변형된 알파바이러스 유전체 또는 레플리콘 RNA를 포함하는 핵산 작제물로서, 상기 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 연장된 서열이 34개 잔기보다 긴, 핵산 작제물.
  31. 제30항에 있어서, 연장된 폴리(A) 꼬리가 약 30 내지 약 120개의 아데닐레이트 잔기 범위의 길이를 갖는 핵산 작제물.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 연장된 폴리(A) 꼬리가 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 및 약 100개의 아데닐레이트 잔기의 길이를 갖는 핵산 작제물.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 유전체 또는 레플리콘 RNA가 토가바이러스과 과의 알파바이러스 속에 속하는 바이러스의 것인 핵산 작제물.
  34. 제33항에 있어서, 변형된 유전체 또는 레플리콘 RNA가 VEEV/EEEV 그룹, 또는 SFV 그룹, 또는 SINV 그룹에 속하는 알파바이러스의 것인 핵산 작제물.
  35. 제34항에 있어서, 알파바이러스가 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 에버글레이즈 바이러스(EVEV), 무캄보 바이러스(MUCV), 픽수나 바이러스(PIXV), 미들버그 바이러스(MIDV), 치쿤구니야 바이러스(CHIKV), 오녕-뇽 바이러스(O'Nyong-Nyong virus; ONNV), 로스 리버 바이러스(RRV), 바르마 포레스트 바이러스(BF), 게타 바이러스(GET), 사기야마 바이러스(SAGV), 베바루 바이러스(BEBV), 마야로 바이러스(MAYV), 우나 바이러스(UNAV), 신드비스 바이러스(SINV), 아우라 바이러스(AURAV), 와타로아 바이러스(WHAV), 바반키 바이러스(BABV), 키질라가흐 바이러스(KYZV), 서부 말 뇌염 바이러스(WEEV), 하이랜드 J 바이러스(HJV), 포트 모르간 바이러스(FMV), 은두무(NDUV), 또는 버기 크릭 바이러스인 핵산 작제물.
  36. 제35항에 있어서, 알파바이러스가 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV), 치쿤구니야 바이러스(CHIKV), 또는 신드비스 바이러스(SINV)인 핵산 작제물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 발현 카세트를 추가로 포함하고, 상기 발현 카세트 각각이 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 핵산 작제물.
  38. 제37항에 있어서, 발현 카세트 중 적어도 하나가 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 하위유전체(subgenomic)(sg) 프로모터를 포함하는 핵산 작제물.
  39. 제38항에 있어서, sg 프로모터가 26S 하위유전체 프로모터인 핵산 작제물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 비번역 영역(UTR)을 추가로 포함하는 핵산 작제물.
  41. 제40항에 있어서, UTR 중 적어도 하나가 이종성 UTR인 핵산 작제물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인이 바로 상류에(예를 들어, sgRNA 5' UTR에) 위치한 서열 또는 바로 하류에(예를 들어, GOI의 코딩 서열 내에) 위치한 서열과 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 서열을 인코딩하지 않는 핵산 작제물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 플랭킹 도메인이 바로 상류에(예를 들어, GOI의 코딩 서열 내에) 위치한 서열 또는 바로 하류에(예를 들어, 3' UTR에) 위치한 서열과 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 RNA 서열을 인코딩하지 않는 핵산 작제물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인 및/또는 3' 플랭킹 도메인이 3' UTR 내에 위치한 서열과 상보성을 갖는 서열을 포함하지 않는 핵산 작제물.
  45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랭킹 도메인 및/또는 3' 플랭킹 도메인이 3' UTR의 3' 말단과 상보성을 갖는 서열을 포함하지 않는 핵산 작제물.
  46. 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트 중 적어도 하나가 관심 유전자(GOI)에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물.
  47. 제46항에 있어서, GOI 코딩 서열이 합성 어댑터 분자의 3' 플랭킹 도메인의 상류에 위치한 정지 코돈을 포함하는 핵산 작제물.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, GOI가 치료용 폴리펩티드, 예방용 폴리펩티드, 진단용 폴리펩티드, 기능식품용 폴리펩티드, 산업용 효소, 및 리포터 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 작제물.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, GOI가 항체, 항원, 면역 조절제, 효소, 신호전달 단백질, 및 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 작제물.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, GOI의 코딩 서열이 참조 코딩 서열의 발현 수준보다 높은 수준에서의 발현을 위해 최적화되는 핵산 작제물.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물이 벡터 내에 혼입되는 핵산 작제물.
  52. 제51항에 있어서, 벡터가 자가-복제 RNA(srRNA) 벡터인 핵산 작제물.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 SEQ ID NO: 3-27로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 작제물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 재조합 세포.
  55. 제54항에 있어서, 재조합 세포가 진핵 세포인 재조합 세포.
  56. 제55항에 있어서, 재조합 세포가 동물 세포인 재조합 세포.
  57. 제56항에 있어서, 동물 세포가 척추동물 세포 또는 무척추동물 세포인 재조합 세포.
  58. 제57항에 있어서, 재조합 세포가 포유동물 세포인 재조합 세포.
  59. 제58항에 있어서, 재조합 세포가 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(Vero 세포), 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 인간 A549 세포, 인간 자궁경부 세포, 인간 CHME5 세포, 인간 표피 후두 세포, 인간 섬유모세포, 인간 HEK-293 세포, 인간 HeLa 세포, 인간 HepG2 세포, 인간 HUH-7 세포, 인간 MRC-5 세포, 인간 근육 세포, 마우스 3T3 세포, 마우스 결합 조직 세포, 마우스 근육 세포, 및 토끼 신장 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 재조합 세포.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 재조합 세포, 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물.
  61. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 트랜스제닉 동물.
  62. 제61항에 있어서, 동물이 척추동물 또는 무척추동물인 트랜스제닉 동물.
  63. 제62항에 있어서, 동물이 포유동물인 트랜스제닉 동물.
  64. 제63항에 있어서, 포유동물이 비-인간 포유동물인 트랜스제닉 동물.
  65. 재조합 RNA 분자를 생산하기 위한 방법으로서, (i) 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 트랜스제닉 동물을 사육하는 단계, 또는 (ii) 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포를 재조합 RNA 분자가 생산되도록 하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 트랜스제닉 동물 또는 재조합 세포가 제24항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하고, 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 서열이 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열의 말단 뒤에 조작된 제한 부위를 절단할 수 있는 제한 효소에 의해 선택적으로 절단되는, 방법.
  67. 제65항 또는 제66항의 방법에 의해 생산된 재조합 RNA 분자.
  68. 제67항에 있어서, 재조합 RNA 분자가 향상된 생물학적 활성을 나타내는 재조합 RNA 분자.
  69. 관심 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법으로서, (i) 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 트랜스제닉 동물을 사육하는 단계, 또는 (ii) 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 재조합 세포를 GOI에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 생산되는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  70. 대상체에게 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 관심 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법.
  71. 제70항에 있어서, 대상체가 척추동물 또는 무척추동물인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 대상체가 포유동물 대상체인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 포유동물 대상체가 인간 대상체인 방법.
  74. 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 재조합 폴리펩티드.
  75. 약학적으로 허용되는 부형제 및,
    a) 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 핵산 작제물;
    b) 제67항의 재조합 RNA 분자;
    c) 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항의 재조합 세포; 및/또는
    d) 제74항의 재조합 폴리펩티드를 포함하는,
    약학적 조성물.
  76. 제75항에 있어서, 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 핵산 작제물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  77. 제75항에 있어서, 제67항의 재조합 RNA 분자 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  78. 제75항에 있어서, 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항의 재조합 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  79. 제75항에 있어서, 제74항의 재조합 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  80. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 리포솜, 지질-기반 나노입자(LNP), 또는 중합체 나노입자로 제형화되는 약학적 조성물.
  81. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 면역원성 조성물인 약학적 조성물.
  82. 제81항에 있어서, 면역원성 조성물이 생물치료제로서 제형화되는 약학적 조성물.
  83. 제81항에 있어서, 면역원성 조성물이 백신으로서 제형화되는 약학적 조성물.
  84. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 대상체에 대해 실질적으로 비-면역원성인 약학적 조성물.
  85. 제84항에 있어서, 비-면역원성 조성물이 생물치료제로서 제형화되는 약학적 조성물.
  86. 제84항에 있어서, 비-면역원성 조성물이 백신으로서 제형화되는 약학적 조성물.
  87. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물이 애쥬번트로서 제형화되는 약학적 조성물.
  88. 제75항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물이 비강내 투여, 경피 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 결절내 투여, 종양내 투여, 관절내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 질내, 및 경구 투여 중 하나 이상을 위해 제형화되는 약학적 조성물.
  89. 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 대상체에게,
    a) 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 핵산 작제물;
    b) 제67항의 재조합 RNA 분자;
    c) 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항의 재조합 세포;
    d) 제74항의 재조합 폴리펩티드; 및/또는
    e) 제75항 내지 제88항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는,
    방법.
  90. 건강 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 건강 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 대상체에게,
    a) 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 핵산 작제물;
    b) 제67항의 재조합 RNA 분자;
    c) 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항의 재조합 세포;
    d) 제74항의 재조합 폴리펩티드; 및/또는
    e) 제75항 내지 제88항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 예방적 또는 치료적으로 투여하는 단계를 포함하는,
    방법.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 건강 질환이 증식성 장애, 염증성 장애, 자가면역 장애, 또는 미생물 감염인 방법.
  92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 증식성 장애, 염증성 장애, 자가면역 장애, 또는 미생물 감염과 관련된 건강 질환을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 방법.
  93. 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 단일 요법(단일요법)으로서 또는 적어도 하나의 추가 요법과 조합된 제1 요법으로서 대상체에게 개별적으로 투여되는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 적어도 하나의 추가 요법이 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 표적화 요법, 및 수술로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  95. 건강 질환 또는 미생물 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 면역 반응을 조절하기 위한 키트로서, 상기 키트가,
    a) 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 핵산 작제물;
    b) 제67항의 재조합 RNA 분자;
    c) 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항의 재조합 세포;
    d) 제74항의 재조합 폴리펩티드; 및/또는
    e) 제75항 내지 제88항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는,
    키트.
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