KR20190031266A - 알파바이러스 백신접종을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20190031266A
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프랭크 알 존스
조셉 벨린트
애드리안 라이스
이베트 레치먼
엘리자베스 가비치
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이투빅스 코포레이션
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Abstract

하나 이상의 알파바이러스 항원 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스 기반 벡터 백신의 조성물이 본원에 개시되어 있다. 그러한 백신의 구축 및 생산 방법 및 이들 백신을 사용하여 알파바이러스에 대해 광범위한 면역 반응을 생성하는 방법이 또한 기재되어 있다. 본원에 기재된 조성물은 아데노바이러스에 대해 기존 면역성을 갖는 개체에서 백신접종을 허용한다.

Description

알파바이러스 백신접종을 위한 조성물 및 방법
교차 참조
본 출원은 2016 년 7 월 15 일에 제출된 미국 가 특허 출원 제 62/363,136 호의 유익을 주장하며, 상기의 공개는 그것의 전문이 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되며 그 전체가 참조로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2017 년 7 월 7 일에 생성된 상기 ASCII 카피는 39891-725_601_SL.txt 의 명칭을 가지며 크기가 460,196 바이트이다.
백신은 유해한 물질 및 질환에 걸린 세포를 인식하고 파괴하도록 면역계를 훈련시켜 신체가 질환과 싸우는 것을 돕는다.
현재 바이러스 백신은 감염성 질환을 예방하고 기존 암을 치료하도록 개발되고 있다. 이들 바이러스 백신은 숙주 세포 내에서 질환과 연관된 유전자의 소부분 또는 완전한 유전자의 발현을 유도시켜 작용하며, 이는 그 다음으로 질환에 걸린 세포를 식별하고 파괴하도록 숙주의 면역계를 증강시킨다. 이와 같이, 바이러스 백신으로 인한 임상 반응은 고수준 면역원성을 유도하고 장기간 발현을 지속하는 백신의 능력에 따라 좌우될 수 있다.
따라서, 복합 질환 및 특히 새로이 생겨나는 질환의 위협에 대한 증강된 보호적 또는 암 치료적 반응을 위한 신규 조성물 및 방법을 발견하려는 요구가 남아 있다.
발명의 개요
다양한 양태에서, 본 개시물은 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열을 포함하는 복제 결함성 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열은 복수의 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 복수의 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열은 표적 항원에 각각 상응하는 복수의 유전자 삽입물을 포함하고, 각각의 유전자 삽입물은 자가-절단 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 의해 분리되어 있다. 일부 양태에서, 자가-절단 2A 펩티드는 돼지 테스코바이러스-1 (Porcine teschovirus-1) 또는 토세아 아시그나 바이러스 (Thosea asigna virus) 에서 유래한다.
일부 양태에서, 복제 결함성 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 추가의 양태에서, 복제 결함성 바이러스 벡터는 아데노바이러스 5 (Ad5) 벡터이다. 일부 양태에서, 복제 결함성 바이러스 벡터는 E1 유전자 부위, E2b 유전자 부위, E3 유전자 부위, E4 유전자 부위, 또는 그의 임의의 조합에서 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 추가의 양태에서, E2b 유전자 부위에서의 결실은 E2b 부위에서의 복수의 결실을 포함한다. 일부 양태에서, E1 유전자 부위, E2b 유전자 부위, E3 유전자 부위, E4 유전자 부위, 또는 그의 임의의 조합에서의 결실은 각각 적어도 하나의 염기쌍을 포함한다.
다른 양태에서, E1 유전자 부위, E2b 유전자 부위, E3 유전자 부위, E4 유전자 부위, 또는 그의 임의의 조합에서의 결실은 둘 이상의 염기쌍의 전좌로 인한 것이다. 일부 양태에서, E1 유전자 부위, E2b 유전자 부위, E3 유전자 부위, E4 유전자 부위, 또는 그의 임의의 조합에서의 결실은 각각 적어도 20 개, 적어도 30 개, 적어도 40 개, 적어도 50 개, 적어도 60 개, 적어도 70 개, 적어도 80 개, 적어도 90 개, 적어도 100 개, 적어도 110 개, 적어도 120 개, 적어도 130 개, 적어도 140 개, 또는 적어도 150 개의 염기쌍을 포함한다.
다른 양태에서, E1 유전자 부위, E2b 유전자 부위, E3 유전자 부위, E4 유전자 부위, 또는 그의 임의의 조합에서의 결실은 각각 150 개 초과, 160 개 초과, 170 개 초과, 180 개 초과, 190 개 초과, 200 개 초과, 250 개 초과, 또는 300 개 초과의 염기쌍을 포함한다.
일부 양태에서, 알파바이러스 표적 항원은 치쿤구니아 바이러스 (CHIKV), 오니옹니옹 바이러스 (ONNV), 로스 리버 바이러스 (RRV), 마야로 열 바이러스 (MAYV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV), 서부 말 뇌척수염 바이러스 (WEEV), 및 동부 말 뇌염 바이러스 (EEEV), 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스의 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 알파바이러스 표적 항원은 CHIKV, ONNV, RRV, 및 MAYV, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스의 항원을 포함한다. 추가의 양태에서, 알파바이러스 표적 항원은 CHIKV 의 항원을 포함한다.
일부 양태에서, 알파바이러스 표적 항원은 C, E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, E1ALPHA, nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 알파바이러스 표적 항원은 C, E3ALPHA, E2ALPHA, 및 6K, E1ALPHA, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 알파바이러스 표적 항원은 E1ALPHA 및 E2ALPHA, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원을 포함한다.
일부 양태에서, 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 21, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 포함한다.
다른 양태에서, 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열은 아미노산 서열이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 21 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 포함한다.
일부 양태에서, 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열은 뉴클레오티드 서열이고, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 19, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 포함한다. 일부 양태에서, 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 및 SEQ ID NO: 3, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 포함한다.
일부 양태에서, 복제 결함성 바이러스 벡터는 알파바이러스 표적 항원의 발현을 증가시키기 위한 요소를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 요소는 적어도 1 개의 요소, 적어도 2 개의 요소, 적어도 3 개의 요소, 적어도 4 개의 요소, 또는 적어도 5 개의 요소를 포함한다.
다른 양태에서, 요소는 내부 리보솜 결합 부위를 포함한다. 다른 양태에서, 요소는 구성적 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 요소는 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 요소는 전사 인핸서를 포함한다. 추가의 양태에서, 전사 인핸서는 라우스 육종 바이러스 (RSV) 인핸서이다. 일부 양태에서, 요소는 팔린드롬성 (palindromic) 서열을 함유하지 않는다.
일부 양태에서, 복제 결함성 바이러스 벡터는 알파바이러스 표적 항원 면역원성을 증가시키는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 복제 결함성 바이러스 벡터는 거트 (gutted) 벡터가 아니다. 일부 양태에서, 조성물 또는 복제 결함성 바이러스 벡터는 공동자극 분자 또는 면역학적 융합 파트너를 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 공동자극 분자는 B7, ICAM-1, LFA-3, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
다양한 양태에서, 본 개시물은 청구항 1 내지 34 중 어느 한 항의 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다양한 양태에서, 본 개시물은 상기 조성물 중 어느 하나를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 세포는 숙주 세포이다. 추가의 양태에서, 세포는 수지상 세포 (DC) 이다.
다양한 양태에서, 본 개시물은 상기 조성물 또는 상기 기재된 약학 조성물 중 어느 하나를 제조하는 것을 포함하는 백신의 제조 방법을 제공한다.
다양한 양태에서, 본 개시물은 하기 단계를 포함하는, 대상에서 알파바이러스 표적 항원에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다: 상기 조성물 또는 상기 기재된 약학 조성물 중 어느 하나를 대상에게 투여하는 단계. 일부 양태에서, 대상은 알파바이러스로 감염되지 않았다.
일부 양태에서, 알파바이러스 표적 항원은 알파바이러스로부터의 것이며, 알파바이러스는 치쿤구니아 바이러스 (CHIKV), 오니옹니옹 바이러스 (ONNV), 로스 리버 바이러스 (RRV), 마야로 열 바이러스 (MAYV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV), 서부 말 뇌척수염 바이러스 (WEEV), 동부 말 뇌염 바이러스 (EEEV), 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
다양한 양태에서, 본 개시물은 대상에서 치쿤구니아 바이러스 감염을 예방하는 방법으로서, 하기를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다: E2b 유전자 부위에서의 결실을 포함하는 복제 결함성 바이러스 벡터; 및 적어도 하나의 치쿤구니아 표적 항원을 인코딩하는 핵산 서열.
일부 양태에서, 대상은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에 대해 기존 면역성을 갖는다. 일부 양태에서, 대상은 인간 또는 비-인간 동물이다. 일부 양태에서, 투여는 정맥내, 피하, 림프선내, 종양내, 피부내, 근육내, 복강내, 직장내, 질내, 비강내, 경구, 방광 점적주입, 또는 난절법 (scarification) 을 통한 것이다.
일부 양태에서, 대상에게 조성물을 투여하는 것은 적어도 1 회이거나, 적어도 2 회 반복되거나, 또는 적어도 3 회 반복된다. 일부 양태에서, 대상에게 투여하는 것은 용량 당 1x109 내지 5x1012 바이러스 입자를 포함한다. 일부 양태에서, 대상에게 투여하는 것은 용량 당 적어도 109 바이러스 입자, 적어도 1010 바이러스 입자, 또는 적어도 1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 양태에서, 복제 결함성 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 추가의 양태에서, 복제 결함성 바이러스 벡터는 아데노바이러스 5 (Ad5) 벡터이다.
참고문헌의 포함
본 명세서에 언급된 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별적 공개물, 특허 또는 특허 출원이 본원에 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
도 1 은 알파바이러스 게놈의 하나의 구조를 예시한다.
도 2 는 생성된 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 위치 7567 내지 11313 에서 유래하는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKVstr 백신을 예시한다.
도 3 은 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKVstr 백신으로 감염된 HEK 293, 또는 모의 감염에서의 CHIKV 구조 단백질 발현을 예시한다. CHIKV 단백질 발현은 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다.
도 4 는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKVstr 백신을 사용하여 수행된 챌린지 연구의 결과를 예시한다. 마우스를 제 -14 일 및 제 -7 일에 2 회 백신접종하고, 그 후 제 0 일에 발바닥 내에 주입된 치사량의 CHIKV 으로 챌린지했다.
도 4A 는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKVstr 백신으로 백신접종된 마우스가 CHIKV 감염에서 살아남는 것을 예시한다.
도 4B 는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKVstr 백신으로 백신접종된 마우스가 그들의 챌린지 전 중량을 유지하는 것을 예시한다.
도 4C 는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKVstr 백신으로 백신접종된 마우스가 백신접종되지 않은 대조군 마우스보다 더 빠르게 CHIKV-유도 발바닥 염증을 해결한 것을 예시한다.
도 5 는 본 개시물의 치쿤구니아 백신에 관한 예시적 유전자 구축물을 나타낸다.
도 5A 는 Ad5 [E1-, E2b-] 내로의 삽입에 사용될 3 개의 치쿤구니아 유전자 (C, E3, E2, 6K, 및 E1 유전자 (SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 767-11313); NS 유전자 1; NS 유전자 2) 를 함유하는 다중 유전자 구축물의 도식 표현을 나타낸다.
도 5B 는 도 5A 의 유전자 구축물의 번역 산물 및 각각의 산물의 화학량론적 풍도를 나타낸다.
도 6 은 ELISpot 어세이를 사용하는 면역화된 또는 대조군 마우스로부터의 비장세포에서의 세포-매개 면역 (CMI) 반응 (IFN-γ) 및 세포용해 T 림프구 (CTL) 반응 및 그랜자임 B 반응을 나타낸다. C57BL/6 마우스를 1x1010 바이러스 입자 (virus particles) (VP) 의 SEQ ID NO: 1 을 포함하는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 백신으로 또는 1x1010 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-null (빈 (empty) 벡터 대조군) 으로 2-주 간격으로 2 회 면역화했다. 마지막 면역화 후 1 주에, 개별 마우스로부터의 비장세포를 치쿤구니아 바이러스 펩티드에 세포를 노출시킨 후의 면역 반응의 유도에 관해 시험했다. 데이타는 치쿤구니아 바이러스 펩티드의 3 개의 별개의 풀에 노출시킨 후의 106 개 비장세포 당 스팟 형성 세포 (SFC) 의 누적수를 보여준다 (치쿤구니아에 관한 펩티드 수는 어세이에서 사용하는 3 개의 별개의 풀로 분배할 수 있을 정도로 충분히 컸다 - CHIKV 펩티드 풀 1 은 펩티드 1-103 을 포함하고, CHIKV 펩티드 풀 2 는 펩티드 104-207 을 포함하고, 펩티드 풀 3 은 펩티드 208-310 을 포함한다). 부가적 비장세포를 어세이 측정 전에 음성 대조군으로서의 SIV-nef 펩티드 풀에 별개로 노출시켰다.
도 6A 는 ELISpot 어세이를 사용하여 IFN-γ 분비 SFC 에 의해 측정되는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 면역화된 및 대조군 C57BL/6 마우스에서의 CMI 반응을 나타낸다.
도 6B 는 ELISpot 어세이를 사용하여 그랜자임 B (GR-B) 분비 SFC 에 의해 측정되는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 면역화된 및 대조군 C57BL/6 마우스에서의 CTL 반응을 나타낸다.
도 7 은 흐름 세포측정법에 의해 분석되는 IFN-γ 또는 IFN-γ/TNF-α 의 세포내 발현에 의해 측정되는 면역화된 또는 대조군 C57BL/6 마우스로부터의 비장세포에서의 림프구 활성화를 나타낸다. C57BL/6 마우스를 1x1010 VP 의 SEQ ID NO: 1 을 포함하는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 백신으로 또는 1x1010 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-null (빈 벡터 대조군) 으로 2-주 간격으로 2 회 면역화했다. 마지막 면역화 후 1 주에, 개별 마우스로부터의 비장세포를 치쿤구니아 바이러스 펩티드의 3 개의 별개의 풀에 노출시켰고 (치쿤구니아에 관한 펩티드 수는 어세이에서 사용하는 3 개의 별개의 풀로 분배할 수 있을 정도로 충분히 컸다 - CHIKV 펩티드 풀 1 은 펩티드 1-103 을 포함하고, CHIKV 펩티드 풀 2 는 펩티드 104-207 을 포함하고, 펩티드 풀 3 은 펩티드 208-310 을 포함한다), 세포내 사이토카인 발현의 유도에 관해 흐름 세포측정법에 의해 분석했다.
도 7A 는 면역화된 마우스 및 대조군 마우스로부터의 비장세포를 치쿤구니아 바이러스 펩티드의 3 개의 별개의 풀 및 대조군 (배지 및 SIV-nef 펩티드 풀) 에 노출시킨 후에 CD8+ 비장세포에서의 IFN-γ 의 세포내 발현의 흐름 세포측정법 분석에 의해 측정되는 림프구 활성화를 나타낸다.
도 7B 는 면역화된 마우스 및 대조군 마우스로부터의 비장세포를 치쿤구니아 바이러스 펩티드의 3 개의 별개의 풀 및 대조군 (배지 및 SIV-nef 펩티드 풀) 에 노출시킨 후에 CD4+ 비장세포에서의 IFN-γ 의 세포내 발현의 흐름 세포측정법 분석에 의해 측정되는 림프구 활성화를 나타낸다.
도 7C 는 면역화된 마우스 및 대조군 마우스로부터의 비장세포를 치쿤구니아 바이러스 펩티드의 3 개의 별개의 풀 및 대조군 (배지 및 SIV-nef 펩티드 풀) 에 노출시킨 후에 CD8+ 비장세포에서의 IFN-γ 및 TNF-α 의 세포내 발현의 흐름 세포측정법 분석에 의해 측정되는 림프구 활성화를 나타낸다.
도 7D 는 면역화된 마우스 및 대조군 마우스로부터의 비장세포를 치쿤구니아 바이러스 펩티드의 3 개의 별개의 풀 및 대조군 (배지 및 SIV-nef 펩티드 풀) 에 노출시킨 후에 CD4+ 비장세포에서의 IFN-γ 및 TNF-α 의 세포내 발현의 흐름 세포측정법 분석에 의해 측정되는 림프구 활성화를 나타낸다.
도 8 은 정량적 효소 결합 면역흡착 어세이 (ELISA) 에 의해 측정되는 대조군 마우스와 비교하여 면역화된 마우스에서의 항-치쿤구니아 외피 단백질-2 항체 반응을 나타낸다. C57BL/6 마우스를 1x1010 VP 의 SEQ ID NO: 1 을 포함하는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 백신으로 또는 1x1010 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-null (빈 벡터 대조군) 으로 2-주 간격으로 2 회 면역화했다. 마지막 면역화 후 1 주에, 마우스로부터의 혈청을 항체 반응의 유도에 관해 평가했다. 혈액을 마취 하에 볼살 열상에 의해 수집했다.
상세한 설명
하기 구절은 상이한 양태를 보다 상세히 설명한다. 반대로 명백히 나타내지 않는 한, 각각의 양태는 임의의 다른 양태(들) 와 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 나타내는 임의의 특질은 바람직하거나 유리한 것으로 나타내는 임의의 다른 특질과 조합될 수 있다.
특정 구현예에서, 알파바이러스 항원 예컨대 캡시드, E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, 및 E1ALPHA 및 비구조 단백질 예컨대, nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4 가, 예를 들어, 백신 조성물 또는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 사용될 수 있다.
예를 들어, E2ALPHA 및 E1ALPHA 항원이 사용될 수 있다. 보호의 임상 상관관계가 알파바이러스 백신에 관해 확립되지 않았지만, 중화 항체 역가와 보호 사이의 상관관계를 지지하는 데이타가 존재한다. (Smalley, L., et al. Vaccine. (2016): 34(26): 2976-2981; Garc
Figure pct00001
a-Arriaza, J. et al. Journal of Virology (2014): 88(6):3527-47).
비-구조 알파바이러스 항원이 특정 양태에서 또한 사용될 수 있다. 연구는 게놈의 복제에 관여되는 비-구조 단백질이 보존된 부위를 함유하여, Ad5 벡터를 이용하는 것을 포함하는, 실험 백신에서 사용될 때 더 넓은 범위의 알파바이러스 보호를 제공할 수 있다는 것을 밝혔다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 다르게 나타내지 않는 한, 단수형 관사는 명백히 다르게 제공되지 않는 한 하나 이상의 것을 의미한다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 다르게 나타내지 않는 한, "함유하다", "함유하는", "비롯하다", "비롯하는" 등과 같은 용어는 "포함하는" 을 의미한다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 다르게 나타내지 않는 한, 용어 "또는" 은 접속사 (conjunctive) 또는 이접적 접속사 (disjunctive) 일 수 있다.
본원에서 이용하는 바와 같이, 다르게 나타내지 않는 한, 임의의 구현예는 임의의 다른 구현예와 조합될 수 있다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 다르게 나타내지 않는 한, 본원의 일부 발명 구현예는 수치 범위를 고려한다. 본 발명의 양태의 다양성은 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것이며 본 발명의 범주에 대한 확고한 제한으로 해석해서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 명확하게 기재된 바와 같이 그 범위 내 개별 수치 값 뿐만 아니라 모든 가능한 하위범위를 특별히 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6 과 같은 범위의 설명은 그 범위 내 개별 수치, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 및 6 뿐만 아니라 특별히 개시된 하위범위 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭과 무관하게 적용된다. 범위가 존재할 때, 그 범위는 범위 종결점을 포함한다.
용어 "아데노바이러스" 또는 "Ad" 는 아데노바이러스과 (family Adenoviridae) 로부터의 비-외피 DNA 바이러스의 군을 나타낼 수 있다. 인간 숙주에 추가로, 이러한 바이러스는 비제한적으로, 조류, 소, 돼지 및 개 종에서 발견될 수 있다. 아데노바이러스과의 4 개 속 (예를 들어, 아비아데노바이러스, 매스트아데노바이러스, 앳아데노바이러스 및 시아데노바이러스) 중 임의의 것으로부터의 임의의 아데노바이러스의 사용은 E2b 결실된 바이러스 벡터, 또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 결실을 함유하는 벡터를 기반으로 고려될 수 있다. 추가로, 여러 혈청형 (serotype) 이 각각의 종에서 발견된다. Ad 는 또한 상동 또는 이종 DNA 서열의 유전적 돌연변이, 결실 또는 전위를 비제한적으로 포함하는 이러한 바이러스 혈청형 중 임의의 것의 유전적 유도체와 관련된다.
"헬퍼 아데노바이러스" 또는 "헬퍼 바이러스" 는 특정 숙주 세포가 할 수 없는 (상기 숙주는 Ad 유전자 산물, 예컨대 E1 단백질을 제공할 수 있음) 바이러스 기능을 공급할 수 있는 Ad 를 나타낸다. 이러한 바이러스는 두 번째 바이러스, 또는 헬퍼 의존적 바이러스 (예를 들어, 거트 (gutted) 또는 거트리스 (gutless) 바이러스, 또는 특정 부위 예컨대 E2b 또는 본원에 기재된 다른 부위가 결실된 바이러스) 에서 결여되는 기능 (예를 들어, 단백질) 을 도중에 공급하는데 사용될 수 있고; 첫 번째 복제-무능 바이러스는 두 번째, 헬퍼 의존적 바이러스를 "도와", 그로써 세포에서 두 번째 바이러스 게놈의 생산이 허용되는 것으로 언급될 수 있다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "아데노바이러스5 null (Ad5null)" 은 발현을 위해 임의의 이종 핵산 서열을 함유하지 않는 비-복제 Ad 를 나타낼 수 있다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "제 1 세대 아데노바이러스" 는 초기 부위 1 (E1) 이 결실된 Ad 를 나타낼 수 있다. 추가적인 경우, 비필수 초기 부위 3 (E3) 이 또한 결실될 수 있다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "거트 (gutted)" 또는 "거트리스 (gutless)" 는 모든 바이러스 코딩 부위가 결실된 아데노바이러스 벡터를 나타낼 수 있다.
본원에서 사용하는 바와 같이 용어 "트랜스펙션" 은 외래 핵산의 진핵세포 내로의 도입을 나타낼 수 있다. 트랜스펙션은 인산칼슘-DNA 공-침전, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, 폴리브렌-매개 트랜스펙션, 전기천공, 마이크로주사, 리포좀 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염 및 유전자총법 (biolistics) 을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
용어 "안정한 트랜스펙션" 또는 "안정하게 트랜스펙션된" 은 외래 핵산, DNA 또는 RNA 의, 트랜스펙션된 세포의 게놈 내로의 도입 및 통합을 나타낼 수 있다. 용어 "안정한 트랜스펙션체" 는 게놈 DNA 내로 안정하게 통합된 외래 DNA 를 갖는 세포를 나타낼 수 있다.
용어 "리포터 유전자" 는 리포터 분자 (효소 포함) 를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다. "리포터 분자" 는 비제한적으로, 효소-기반 검출 검정 (예를 들어, ELISA 뿐만 아니라 효소-기반 조직화학 검정), 형광, 방사능 및 발광 시스템을 포함하는, 다양한 검출 시스템 중 임의의 것에서 검출가능할 수 있다.
한 구현예에서, 대장균 (E. coli) β-갈락토시다아제 유전자 (Pharmacia Biotech, Pistacataway, N.J. 에서 이용가능), 녹색 형광 단백질 (GFP) (Clontech, Palo Alto, Calif. 에서 시판), 인간 태반 알칼리 포스파타아제 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (CAT) 유전자 또는 당업계에 공지되는 기타 리포터 유전자가 이용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "~를 인코딩하는 핵산 분자", "~를 인코딩하는 DNA 서열" 및 "~를 인코딩하는 DNA" 는 데옥시리보핵산의 가닥을 따르는 데옥시리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 나타낼 수 있다. 이러한 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드 (단백질) 사슬을 따르는 아미노산의 순서를 결정할 수 있다. 따라서 핵산 서열은 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "이종 핵산 서열" 은 자연에서 라이게이션되지 않는, 또는 자연에서 상이한 위치에서 라이게이션되는 핵산 서열에, 라이게이션되는, 또는 라이게이션되도록 조작되는 뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다. 이종 핵산은 그것이 도입되는 세포 내에서 자연적으로 발견되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있거나, 이종 핵산은 자연 발생 서열에 관하여 일부 변형을 함유할 수 있다.
용어 "이식유전자" 는 시험 대상의 세포 또는 게놈 내로 도입되는, 천연 또는 이종 핵산 서열 또는 융합된 상동 또는 이종 핵산 서열인, 임의의 유전자 코딩 부위를 나타낼 수 있다. 본 발명에서, 이식유전자는 이식유전자를 대상의 세포에 도입하는데 사용되는 임의의 바이러스 벡터에 탑재될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "제 2 세대 아데노바이러스" 는 바이러스로부터 결실된 (제거된) E1, E2, E3, 및 특정 구현예에서 E4 DNA 유전자 서열의 전부 또는 일부를 갖는 Ad 를 나타낼 수 있다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "대상" 또는 "개체" 는 임의의 동물, 예를 들어, 포유동물 또는 유대동물을 나타낼 수 있다. 대상은 비제한적으로, 인간, 비-인간 영장류 (예를 들어, 레수스 (rhesus) 또는 기타 유형의 마카크 (macaques)), 마우스, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 랫트 및 가금류의 임의의 종류를 포함한다.
특정 양태에서, 알파바이러스에 대한 광범위한 반응성의 면역 반응이 생성되도록 백신접종을 허용하는, 아데노바이러스 벡터를 사용하여 다양한 알파바이러스에 대한 면역 반응을 생성시키는 백신의 제조 방법 및 조성물을 제공할 수 있다.
하나의 양태는 개체에서 하나 이상의 알파바이러스 표적 항원에 대한 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법을 제공한다: 개체에게 a) 복제 결함성 아데노바이러스 벡터로서, E2b 부위에 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터, 및 b) 하나 이상의 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것; 및 아데노바이러스 벡터를 적어도 1 회 이상 개체에게 재투여하는 것; 그에 의해 알파바이러스 표적 항원에 대해 면역 반응을 생성하는 것.
또다른 양태는 아데노바이러스에 대해 기존 면역성을 갖는 개체에서 여러 알파바이러스 표적 항원에 대해 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법을 제공한다: 개체에게 a) 복제 결함성 아데노바이러스 벡터로서, E2b 부위에 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터, 및 b) 다중 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것; 및 아데노바이러스 벡터를 적어도 1 회 이상 개체에게 재투여하는 것; 그에 의해 알파바이러스 표적 항원에 대해 면역 반응을 생성하는 것.
I. 표적 항원
특정 양태에서, 표적 항원은 다양한 알파바이러스 단백질에서 유래하는 항원으로 구성된다. 이와 관련하여, 알파바이러스 단백질은 치쿤구니아 바이러스 (CHIKV), 오니옹니옹 바이러스 (ONNV), 로스 리버 바이러스 (RRV), 마야로 열 바이러스 (MAYV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV), 서부 말 뇌척수염 바이러스 (WEEV), 및 동부 말 뇌염 바이러스 (EEEV) 를 포함하나 그에 제한되지 않는 임의의 알파바이러스에서 유래할 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 알파바이러스 바이러스 단백질은 E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, E1ALPHA, nsP1, nsP2, nsP3, 또는 nsP4 를 포함하는 알파바이러스 단백질, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 알파바이러스 바이러스 단백질은 E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, 또는 E1ALPHA 를 포함하는 군으로부터의 구조 단백질, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 알파바이러스 바이러스 단백질은 nsP1, nsP2, nsP3, 또는 nsP4 를 포함하는 군으로부터의 비-구조 단백질, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 알파바이러스 바이러스 단백질은 E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, 또는 E1ALPHA 를 포함하는 군으로부터의 구조 단백질, nsP1, nsP2, nsP3, 또는 nsP4 를 포함하는 군으로부터의 비-구조 단백질, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 알파바이러스 바이러스 단백질은 E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, E1ALPHA, nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알파바이러스 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 알파바이러스 바이러스 단백질은 E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, 및 E1ALPHA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 구조 단백질을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 알파바이러스 바이러스 단백질은 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비-구조 단백질을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 알파바이러스 바이러스 단백질은 E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, 또는 E1ALPHA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 구조 단백질, nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비-구조 단백질, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
외피 당단백질 E1ALPHA 및 E2ALPHA 는 이질이량체를 형성할 수 있으며, 이러한 이질이량체는 연관되어 비리온의 표면 상에서 삼량체 스파이크를 형성한다. 알파바이러스 복제 주기는 삼량체 스파이크가 숙주 세포 수용체에 결합할 때 시작할 수 있고, 비리온의 세포내섭취를 야기할 수 있다. 엔도솜의 낮은 pH 는 바이러스의 융합을 유도할 수 있고, 엔도솜 막은 그에 의해 바이러스 게놈을 세포의 시토졸 내로 방출시킨다.
알파바이러스의 게놈 RNA 는, 세포성 mRNA 처럼, 7-메틸구아노신으로 캡핑될 수 있고 폴리아데닐화될 수 있는 mRNA 로서의 역할을 할 수 있다. 첫번째 대략 7 kB 의 게놈은 바이러스 레플리카아제 및 전사효소를 포함하는 비-구조 단백질을 인코딩할 수 있다. 마지막 대략 5 kB 의 게놈은 구조 단백질을 인코딩할 수 있다. 바이러스 레플리카아제 단백질, nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4 는 안티-게놈을 생산하고, 안티-게놈은 그 후 게놈 및 2 개의 mRNA (비-구조 단백질에 대한 하나 및 구조 단백질에 대한 하나) 의 생산을 위한 주형으로서의 역할을 할 수 있다.
비-구조 단백질은 다단백질로서 번역될 수 있고, 다단백질은 후속적으로 nsP2 에 의해 가공될 수 있다. 다단백질의 분화 가공은 안티-게놈과 게놈 합성/서브게놈 mRNA 합성 사이의 스위칭에 필수적일 수 있다고 여겨진다.
구조 단백질은 다단백질로서 번역될 수 있고, 다단백질은 캡시드 단백질에 대한 세린 프로테아제 활성과 분비계에서의 세포성 효소 (예를 들어, 신호 펩티다아제 및 푸린) 의 조합에 의해 가공될 수 있다. 외피 당단백질, E1ALPHA 및 E2ALPHA 는 분비계로부터 원형질막으로 수송될 수 있으며, 원형질막에서 그들은 완전히 가공된, 성숙한 형태로 발견될 수 있다. E1ALPHA 및 E2ALPHA 는 뉴클레오캡시드 (내부에 게놈 RNA 가 있는 캡시드 단백질 껍질) 를 동원하고, 원형질막으로부터의 출아에 의해 비리온이 형성될 수 있다.
표적 항원은 C, E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, E1ALPHA, nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4 와 같은 알파바이러스와 연관되는 단백질, 또는 변이체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 알파바이러스의 구조 및/또는 비-구조 항원이다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 알파바이러스의 다단백질 또는 단백질의 임의의 단편이다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 2 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CHIKV 구조 항원, SEQ ID NO: 3 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CHIKV 비-구조 항원, 또는 그의 조합이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 1 에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 CHIKV 항원이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 내의 핵산 서열은 유전자 기호 CHIKVgp2 를 갖고 C, E3, E2, 6K, 및 E1 단백질을 함유하는 다단백질을 인코딩하는 유전자 ID 956308 을 갖는 CHIKV 유전자 (SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 7567-11313) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 내의 핵산 서열은 유전자 기호 CHIKVgp1 를 갖는 (nsp1, nsp2, nsp3, 및 nsp4 단백질을 함유하는 다단백질을 인코딩하는) 유전자 ID 953609 을 갖는 CHIKV 유전자 (SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 77-7501) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 내의 핵산 서열은 치쿤구니아 바이러스 구조 다단백질 (예를 들어, NP_690589) 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 내의 핵산 서열은 치쿤구니아 바이러스 비구조 다단백질 (예를 들어, NP_690588) 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 1 에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 CHIKV 항원이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 그의 임의의 조합에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 CHIKV 항원이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 4 에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 ONNV 항원이다. 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 5 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 ONNV 구조 항원, SEQ ID NO: 6 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 ONNV 비-구조 항원, 또는 그의 조합이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 4 에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 ONNV 항원이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 또는 그의 임의의 조합에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 ONNV 항원이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 7 에 제시된 서열에 의해 인코딩되는 MAYV 항원이다. 기타 구현예에서, 본원에서 사용되는 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 8 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 MAYV 구조 항원, SEQ ID NO: 9 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 MAYV 비-구조 항원, 또는 그의 조합이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 7 에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 MAYV 항원이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 그의 임의의 조합에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 MAYV 항원이다. 기타 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 10 에 제시된 서열에 의해 인코딩되는 RRV 항원이다. 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 11 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 RRV 구조 항원, SEQ ID NO: 12 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 RRV 비-구조 항원, 또는 그의 조합이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 10 에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 RRV 항원이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 또는 그의 임의의 조합에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 RRV 항원이다. 기타 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 13 에 제시된 서열에 의해 인코딩되는 VEEV 항원이다. 기타 구현예에서, 본원에서 사용되는 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 14 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VEEV 구조 항원, SEQ ID NO: 15 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VEEV 비-구조 항원, 또는 그의 조합이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 13 에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 VEEV 항원이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 또는 그의 임의의 조합에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 VEEV 항원이다. 기타 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 16 에 제시된 서열에 의해 인코딩되는 EEEV 항원이다. 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 17 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 EEEV 구조 항원, SEQ ID NO: 18 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 EEEV 비-구조 항원, 또는 그의 조합이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 16 에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 EEEV 항원이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, 또는 그의 임의의 조합에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 EEEV 항원이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 19 에 제시된 서열에 의해 인코딩되는 WEEV 항원이다. 기타 구현예에서, 본원에서 사용되는 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 20 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 WEEV 구조 항원, SEQ ID NO: 21 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 WEEV 비-구조 항원, 또는 그의 조합이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 19 에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 WEEV 항원이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 항원은 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 또는 그의 임의의 조합에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 WEEV 항원이다.
II. 아데노바이러스 벡터
특정 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 알파바이러스 항원의 전달을 위한 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다.
재조합 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 백신 플랫폼은, 바이러스 DNA 폴리머라아제 (pol) 및/또는 pre-말단 단백질 (pTP) 유전자를 제거하는 초기 유전자 2b (E2b) 부위에서 추가적인 결실을 가질 수 있고, E.C7 인간 세포주에서 전파될 수 있다 (Amalfitano A, Begy CR, Chamberlain JS Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 93:3352-6; Amalfitano A, Chamberlain JS Gene Ther. 1997 4:258-63; Amalfitano A et al. J Virol. 1998 72:926-33; Seregin SS and Amalfitano A Expert Opin Biol Ther. 2009 9:1521-31). 벡터는 다수 유전자의 포함을 허용하기에 충분할 수 있는, 현재 Ad5 [E1-] 벡터의 7 kb 능력에 비해 12 kb 까지의 확장된 유전자-운반/클로닝 능력을 가질 수 있다 (Amalfitano A et al. J Virol. 1998 72:926-33; Seregin SS and Amalfitano A Expert Opin Biol Ther. 2009 9:1521-31). E2b 부위의 추가적인 결실은, Ad5 바이러스 단백질에 대한 면역 반응을 최소화하면서 특정 항원에 대한 강력한 면역 반응을 이끌어내는 것과 같은 유리한 면역 특성을 부여할 수 있다.
동물에서의 전임상 연구 및 암에서의 임상 연구는, Ad5 면역력의 존재 하에서도 Ad5 [E1-, E2b-]-기반 벡터가 벡터형 항원에 대한 강력한 CMI 및 항체 (Ab) 반응을 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
진보된 재조합 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 벡터 플랫폼은 알파바이러스에 대한 신규한 광범위하게 교차 반응성인 백신을 개발하는 기회를 제공할 수 있다. 이러한 벡터는 강력한 면역 반응을 유도하는 항원-제시 세포 (APC) 에 규정된 알파바이러스 항원을 노출시키기 위한 피하 주사에 의해 직접 전달될 수 있다. 중요하게, Ad5 재조합 벡터는 에피솜 복제할 수 있으며 게놈을 숙주 세포 게놈에 삽입하지 않을 수 있어, 그에 따라 필수적 세포 유전자 기능의 파괴 또는 유전자 통합이 없음을 보장한다 (Imler JL Vaccine. 1995 13:1143-51; Ertl HC, Xiang Z J Immunol. 1996 156:3579-82; Amalfitano, A Curr Opin Mol Ther. 2003 5:362-6).
불행히도, 현재 Ad5-기반 벡터에 대면하는 주요 도전과제는 Ad5 에 대한 기존 면역력의 존재이다. 대부분의 사람들은 Ad5 에 대해 중화 Ab 를 나타내는데, 이는 인간 백신에 대해 가장 광범위하게 사용되는 하위유형이며, 연구된 사람들의 ⅔ 가 Ad5 에 대한 림프-증식성 반응을 갖는다 (Chirmule N et al. Gene Ther. 1999 6:1574-83). 이러한 면역력은 알파바이러스 백신에 대한 플랫폼으로서 현재 초기 유전자 1 (E1) 부위-결실 Ad5 벡터 (Ad5 [E1-]) 의 사용을 방지할 수 있다. Ad5 면역력은 면역화, 특히 재조합 Ad5 벡터로의 재면역화를 저해하며, 제 2 질환 항원에 대한 백신의 면역화 역시 불가능하게 할 수 있다. 기존 Ad5 벡터 면역력의 문제점을 극복하는 것은 강도높은 조사의 주제가 되어 왔다. 그러나, 다른 Ad 혈청형 또는 심지어 Ad 의 비-인간 형태의 사용은 중요한 케모카인 및 사이토카인의 변형된 생산, 유전자 조절장애를 직접적으로 일으킬 수 있으며, 상당히 상이한 생물학적 분배 (biodistribution) 및 조직 독성을 가질 수 있다 (Appledorn DM et al. Gene Ther. 2008 15:885-901; Hartman ZC et al. Virus Res. 2008 132:1-14). 이러한 접근방식이 초기 면역화에서 성공한다 해도, 후속 백신화는 Ad 하위유형에 대한 유도된 면역 반응으로 인해 문제가 있을 수 있다. Ad 면역화 장벽을 막고 현재 Ad5 [E1-] 벡터에 대한 불리한 조건을 피하는 것을 돕기 위해, 상기 기재한 개선된 Ad5 벡터 플랫폼을 구축하였다.
또한, Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 현재 Ad5 [E1-] 벡터와 비교하여 주사 후 첫 24 내지 72 시간 동안 감소된 염증을 나타낼 수 있다 (Nazir SA, Metcalf JP J Investig Med. 2005 53:292-304; Schaack J Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 101:3124-9; Schaack J Viral Immunol. 2005 18:79-88). Ad5 [E1-, E2b-] 후기 유전자 발현의 결여는 감염된 세포가 항-Ad5 활성에 덜 취약하게 만들 수 있으며, 이들이 연장된 시간 동안 이식유전자를 생산하고 발현하는 것을 가능하게 할 수 있다 (Gabitzsch ES, Jones FR J Clin Cell Immunol. 2011 S4:001. doi:10.4172/2155-9899. S4-001; Hodges BL J Gene Med. 2000 2:250-9). Ad5 [E1-, E2b-] 바이러스 단백질에 대한 감소한 염증 반응 및 그로 인한 기존 Ad5 면역력의 회피는 APC 세포를 감염시키는 Ad5 [E1-, E2b-] 의 능력을 증가시켜, 접종자의 더 큰 면역화를 초래할 수 있다. 추가로, 다른 세포 유형의 증가한 감염은 강력한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응에 필요한 높은 수준의 항원 제시를 제공하여, 기억 T 세포 발달을 일으킬 수 있다. 따라서 E2b 부위의 결실이, 기존 Ad5 면역력의 존재 하에서도 Ad5 단백질에 대한 면역 반응을 최소화하면서 특정 항원에 대한 강력한 면역 반응을 이끌어내는 것과 같은 유리한 면역 특성을 부여할 수 있다는 것이 나타난다.
결과는, 기존 및/또는 Ad5 벡터-유도 면역력을 극복하고 유의한 보호성 면역 반응을 유도하는 재조합 Ad5 [E1-, E2b-] 플랫폼-기반 백신의 능력을 입증하였다. 이러한 연구는 새로운 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터-기반 백신이 1) 현재 Ad5 [E1-] 벡터에 비교하여 상당히 더 높은 CMI 반응을 유도할 수 있고, 2) 강력한 CMI 반응을 유도하도록 설계된 다수 면역화 용법에 이용될 수 있고, 3) 기존 Ad5 면역력을 갖는 동물에서 유의한 항원-특이적 CMI 반응을 유도할 수 있고, 4) 높은 수준의 기존 Ad5 면역력을 갖는 동물에서 감염성 질환에 대해 유의한 항-종양 반응 또는 보호를 유도할 수 있다는 것을 확립하였다.
특정 양태는 알파바이러스 표적 항원에 대한 면역 반응을 생성시키기 위한 방법 및 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 특히, 특정 양태는 개선된 Ad-기반 백신을 제공할 수 있어, 하나 초과의 항원성 표적 독립체에 대한 다수 백신화가 달성될 수 있다. 중요하게는, 백신화는 Ad 에 대한 기존 면역력의 존재 하에 수행될 수 있고/있거나 본원에 기재된 바와 같은 아데노바이러스 벡터 또는 다른 아데노바이러스 벡터로 이전에 다수회 면역화된 대상에게 투여될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는, 다발관절염 또는 뇌염을 일으키는 알파바이러스에 대한 광범위한 항체 및 세포-매개 면역 반응의 생산을 비제한적으로 포함하는 다양한 알파바이러스 항원에 대한 면역 반응이 유도되도록 대상에게 다수회 투여될 수 있다.
특정 양태는 미국 특허 번호 6,063,622; 6,451,596; 6,057,158 및 6,083,750 (모두 그 전체가 본원에 참조로 포함됨) 에서 기재된 것들과 같은 E2b 결실 아데노바이러스 벡터의 용도를 제공한다. '622 특허에서 기재된 바와 같이, 바이러스 단백질 발현을 더 손상시키기 위해, 그리고 또한 복제 적격 Ad (RCA) 의 생성 빈도를 감소시키기 위해, E2b 부위에서 결실을 함유하는 아데노바이러스 벡터를 특정 양태에서 제공할 수 있다. 이러한 E2b 결실 아데노바이러스 벡터의 전파는 결실된 E2b 유전자 산물을 발현할 수 있는 세포주를 필요로 한다.
추가 양태에서, 패키징 세포주가 제공될 수 있다; 예를 들어 HEK-203 세포주에서 유래한 E.C7 (공식적으로 C-7 로 지칭) (Amalfitano A et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996 93:3352-56; Amalfitano A et al. Gene Ther 1997 4:258-63).
또한, E2b 유전자 산물, DNA 폴리머라아제 및 말단전 (preterminal) 단백질은 E.C7, 또는 유사한 세포에서 E1 유전자 산물과 함께 구성적으로 발현될 수 있다. Ad 게놈으로부터 생산 세포주로의 유전자 세그먼트의 전달은 즉각적인 이득을 가질 수 있다: (1) 이론적으로 결실될 수 있는 DNA 폴리머라아제 및 말단전 단백질의 조합된 코딩 서열이 4.6 kb 에 이르므로, 재조합 DNA 폴리머라아제 및 말단전 단백질-결실 아데노바이러스 벡터의 증가한 운반 능력; 및, (2) 둘 이상의 독립적 재조합 이벤트가 RCA 를 생성시키는데 필요하므로, RCA 생성의 감소한 가능성.
따라서, E1, Ad DNA 폴리머라아제 및 말단전 단백질 발현 세포주는 오손 헬퍼 바이러스에 대한 필요성 없이 13 kb 에 이르는 운반 능력을 갖는 아데노바이러스 벡터를 전파시킬 수 있다 (Mitani et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995 92:3854; Hodges et al. J Gene Med 2000 2:250-259; Amalfitano and Parks Curr Gene Ther 2002 2:111-133).
또한, 바이러스 생활 주기에 중요한 유전자가 결실되는 경우 (예를 들어, E2b 유전자), 다른 바이러스 유전자 단백질을 복제 또는 발현하기 위한 Ad 의 추가 손상이 발생할 수 있다. 이는 바이러스로 감염된 세포의 면역 인지를 감소시킬 수 있고, 외래 이식유전자 발현의 연장된 지속기간을 가능하게 할 수 있다.
그러나 E1, DNA 폴리머라아제 및 말단전 단백질 결실된 벡터의 중요한 속성은 그의 E1 및 E2b 부위로부터 각각의 단백질의 발현 불능 뿐만 아니라 대부분의 바이러스 구조 단백질의 예측된 발현 결여를 포함한다. 예를 들어, Ad 의 주요 후기 프로모터 (MLP) 는 후기 구조 단백질 L1 ~ L5 의 전사를 담당한다 (Doerfler, In Adenovirus DNA, The Viral Genome and Its Expression (Martinus Nijhoff Publishing Boston, 1986)). MLP 가 Ad 게놈 복제 전에 최소한으로 활성이지만, 고도로 독성인 Ad 후기 유전자는 바이러스 게놈 복제가 발생한 후에만 MLP 로부터 주로 전사 및 번역된다 (Thomas and Mathews Cell 1980 22:523). 이러한 후기 유전자 전사의 시스 (cis)-의존적 활성화는 일반적으로, 폴리오마 및 SV-40 의 성장에 있어서와 같이, DNA 바이러스의 특질이다. DNA 폴리머라아제 및 말단전 단백질은 Ad 복제에 완전히 필요하며 (E4 단백질 또는 IX 단백질과는 달리), 따라서 그의 결실은 아데노바이러스 벡터 후기 유전자 발현에 극히 해로우며 APC 와 같은 세포에서의 발현의 독성 효과가 있다.
특정 구현예에서, 사용을 위해 고려되는 아데노바이러스 벡터는, E1 부위 및 Ad 게놈의 E2b 부위에서의 결실을 갖지만 결실된 Ad 게놈의 임의의 다른 부위는 갖지 않는 E2b 결실 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 사용을 위해 고려되는 아데노바이러스 벡터는, Ad 게놈의 E2b 부위에서의 결실 및 E1 과 E3 부위에서의 결실을 갖지만 다른 부위는 결실되지 않는 E2b 결실 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 사용을 위해 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 부위에서의 결실 및 E1, E3 에서의 결실 및 E4 부위의 부분적 또는 완전 제거를 갖지만 다른 결실은 갖지 않는 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 사용을 위해 고려되는 아데노바이러스 벡터는, Ad 게놈의 E2b 부위에서의 결실 및 E1 과 E4 부위에서의 결실을 갖지만 다른 결실은 갖지 않는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 추가적인 구현예에서, 사용을 위해 고려되는 아데노바이러스 벡터는, Ad 게놈의 E2a, E2b 및 E4 부위에서의 결실을 갖지만 다른 결실은 갖지 않는 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 본원에서 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는, 결실된 E2b 부위의 DNA 폴리머라아제 기능 및 E1 을 갖지만 다른 결실은 갖지 않는 벡터를 포함한다. 추가 구현예에서, 본원에서 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는, 결실된 E2b 부위의 말단전 단백질 기능 및 E1 을 갖지만 다른 결실은 갖지 않는다.
또 다른 구현예에서, 본원에서 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는 결실된 말단전 단백질 기능, DNA 폴리머라아제 기능 및 E1 을 갖지만 다른 결실은 갖지 않는다. 한 특정 구현예에서, 본원에서의 사용을 위해 고려되는 아데노바이러스 벡터는 적어도 일부의 E2b 부위 및 E1 부위에 대해 결실되지만, "거트" 아데노바이러스 벡터는 그렇지 않다. 이와 관련하여, 벡터는 E2b 부위의 말단전 단백질 기능 및 DNA 폴리머라아제 기능 둘 모두에 대해 결실될 수 있다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "E2b 결실" 은 적어도 하나의 E2b 유전자 산물의 발현 및/또는 기능을 방지하도록 하는 방식으로 돌연변이되는 특정한 DNA 서열을 나타낼 수 있다. 따라서 특정 구현예에서, "E2b 결실" 은 Ad 게놈으로부터 결실 (제거) 되는 특정한 DNA 서열을 나타낼 수 있다. E2b 결실 또는 "E2b 부위 내에 결실을 함유하는" 은 Ad 게놈의 E2b 부위 내의 적어도 하나의 염기쌍의 결실을 나타낼 수 있다. 따라서 특정 구현예에서 하나 초과의 염기쌍이 결실되며, 추가 구현예에서 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150 개의 염기쌍이 결실된다. 또 다른 구현예에서, 결실은 Ad 게놈의 E2b 부위 내의 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250 또는 300 개 초과 염기쌍의 결실이다. E2b 결실은 적어도 하나의 E2b 유전자 산물의 발현 및/또는 기능을 방지하는 결실일 수 있으며, 따라서 E2b-특이적 단백질 일부분을 인코딩하는 엑손 내의 결실 뿐만 아니라 프로모터 및 리더 서열 내의 결실을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, E2b 결실은 E2b 부위의 말단전 단백질 및 DNA 폴리머라아제 중 하나 또는 둘 모두의 발현 및/또는 기능을 방지하는 결실이다. 추가 구현예에서 "E2b 결실" 은, 하나 이상의 인코딩된 단백질이 비-기능적이도록 Ad 게놈의 이 부위의 DNA 서열에서의 하나 이상의 점 돌연변이를 나타낼 수 있다. 이러한 돌연변이는 비-기능적 단백질을 초래하는 아미노산 서열에서의 변화를 일으키는 상이한 잔기로 대체되는 잔기를 포함할 수 있다.
본 개시물 판독시 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, Ad 게놈의 다른 부위가 결실될 수 있다. 따라서 본원에서 사용하는 바와 같이, Ad 게놈의 특정 부위에서 "결실되는" 것은, 그 부위에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 유전자 산물의 발현 및/또는 기능이 방지되도록 하는 방식으로 돌연변이되는 특정 DNA 서열을 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서 특정 부위에서 "결실되는" 것은, 그 부위에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 발현 및/또는 기능 (예를 들어, 말단전 단백질 기능 또는 DNA 폴리머라아제의 E2b 기능) 이 방지되도록 하는 방식으로 Ad 게놈으로부터 결실 (제거) 되는 특정 DNA 서열을 나타낼 수 있다. 특정 부위 내의 "결실" 또는 "결실을 함유하는" 은 Ad 게놈의 그 부위 내의 적어도 하나의 염기쌍의 결실을 나타낼 수 있다. 따라서 특정 구현예에서 하나 초과의 염기쌍이 결실되며, 추가 구현예에서 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150 개의 염기쌍이 특정 부위로부터 결실된다. 또 다른 구현예에서, 결실은 Ad 게놈의 특정 부위 내의 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250 또는 300 개 초과 염기쌍의 결실이다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 결실 중 임의의 하나는 또한 둘 이상의 염기쌍의 전좌의 결과일 수 있다.
이러한 결실은 그 부위에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 발현 및/또는 기능이 방지될 수 있도록 하는 것이다. 따라서 결실은 단백질 일부분을 인코딩하는 엑손 내의 결실 뿐만 아니라 프로모터 및 리더 서열 내의 결실을 포함할 수 있다. 추가 구현예에서 Ad 게놈의 특정 부위에서의 "결실" 은, 하나 이상의 인코딩된 단백질이 비-기능적이도록 Ad 게놈의 이 부위의 DNA 서열에서의 하나 이상의 점 돌연변이를 나타낼 수 있다. 이러한 돌연변이는 비-기능적 단백질을 초래하는 아미노산 서열에서의 변화를 일으키는 상이한 잔기로 대체되는 잔기를 포함할 수 있다.
하나 이상의 결실을 포함하는 아데노바이러스 벡터는 당업계에 공지된 재조합 기법을 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, Amalfitano et al. J. Virol. 1998 72:926-33; Hodges, et al., J Gene Med 2000 2:250-59 참조). 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터는 결실되었을 수 있는 임의의 필요 유전자의 산물 및 E2b 유전자 산물을 구성적으로 발현하는 적절한 패키징 세포주를 사용하여 높은 역가로 성공적으로 성장시킬 수 있다. 특정 구현예에서, E1 및 DNA 폴리머라아제 단백질 뿐만 아니라 Ad-말단전 단백질을 구성적으로 발현하는 HEK-293-유래 세포를 사용할 수 있다. 한 구현예에서, E.C7 세포는 아데노바이러스 벡터의 고역가 스톡 (stock) 을 성공적으로 성장시키는데 사용된다 (예를 들어, Amalfitano et al. J. Virol. 1998 72:926-33; Hodges et al. J Gene Med 2000 2:250-59 참조).
자가-전파 아데노바이러스로부터 중요한 유전자를 결실시키기 위해서, 표적화된 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 먼저 HEK-293 세포에서, 또는 유사하게, E1 단백질과 함께 동시발현되어야 한다. 따라서, 오직 구성적으로 동시발현시 비-독성인 단백질 (또는 유도적으로 발현되는 독성 단백질) 만이 이용될 수 있다. E1 및 E4 유전자의 HEK-293 세포에서의 동시발현이 입증되었다 (구성적 프로모터가 아닌 유도성 프로모터 이용) (Yeh et al. J. Virol. 1996 70:559; Wang et al. Gene Therapy 1995 2:775; 및 Gorziglia et al. J. Virol. 1996 70:4173). E1 및 단백질 IX 유전자 (비리온 구조 단백질) 가 동시발현되었으며 (Caravokyri and Leppard J. Virol. 1995 69:6627), E1, E4 및 단백질 IX 유전자의 동시발현이 또한 설명된 바 있다 (Krougliak and Graham Hum. Gene Ther. 1995 6:1575). E1 및 100k 유전자는 E1 및 프로테아제 유전자를 가지므로, 트랜스상보성 세포주에서 성공적으로 발현되었다 (Oualikene et al. Hum Gene Ther 2000 11:1341-53; Hodges et al. J. Virol 2001 75:5913-20).
E2b 결실 Ad 입자의 고역가 성장에 사용하기 위한 E1 및 E2b 유전자 산물을 동시발현하는 세포주가 미국 특허 번호 6,063,622 에 기재되어 있다. E2b 부위는 Ad 게놈 복제에 절대적으로 요구되는 바이러스 복제 단백질을 인코딩할 수 있다 (Doerfler (전술한 것), 및 Pronk et al. Chromosoma 1992 102:S39-S45). 유용한 세포주는 구성적으로 대략 140 kDa Ad-DNA 폴리머라아제 및/또는 대략 90 kDa 말단전 단백질을 발현한다. 특히, 독성 없이, E1, DNA 폴리머라아제 및 말단전 단백질의 고수준, 구성적 동시발현을 갖는 세포주 (예를 들어, E.C7) 가 다수 백신화에 사용하기 위한 Ad 의 전파에 사용하기에 바람직할 수 있다. 이들 세포주는 E1, DNA 폴리머라아제 및 말단전 단백질에 대해 결실된 아데노바이러스 벡터의 전파를 가능하게 할 수 있다.
재조합 Ad 는 당업계에서 공지된 기법을 사용하여 전파될 수 있다. 예를 들어 특정 구현예에서, E.C7 세포를 함유하는 세포 조직 플레이트를 적절한 MOI (예를 들어, 5) 에서 아데노바이러스 벡터 바이러스 스톡으로 감염시키고 37.0℃ 에서 40-96 시간 동안 인큐베이션한다. 감염된 세포를 수확하고, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 에 재현탁하고, 초음파처리할 수 있고, 바이러스를 2 회 염화세슘 밀도 원심분리를 통해 정제할 수 있다. 특정 기법에서, 바이러스 함유 밴드를 Sephadex CL-6B 컬럼 (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.) 상에서 탈염시키고, 수크로스 또는 글리세롤을 첨가하고, 분취액을 -80℃ 에서 저장한다. 일부 구현예에서, 바이러스는 이의 안정성을 증강시키기 위해 설계된 용액, 예컨대 A195 에 위치될 수 있다 (Evans et al. J Pharm Sci 2004 93:2458-75). 스톡의 역가를 평가할 수 있다 (예를 들어, SDS 용해 후 바이러스 분취액의 260 nm 에서의 광학 밀도 측정에 의함). 또 다른 구현예에서, 전체 재조합 E2b 결실 아데노바이러스 벡터를 포함하는 선형 또는 원형인 플라스미드 DNA 를 E.C7, 또는 유사한 세포에 트랜스펙션시킬 수 있고, 바이러스 생산 증거가 존재할 때까지 (예를 들어, 세포변성 효과) 37.0℃ 에서 인큐베이션할 수 있다. 그런 다음, 이들 세포로부터의 조건화 배지를 사용하여 더 많은 E.C7, 또는 유사한 세포를 감염시켜, 정제 전에 생산된 바이러스의 양을 확장시킬 수 있다.
정제는 2 회의 염화세슘 밀도 원심분리 또는 선택적 여과에 의해 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스는 시판 제품 (예를 들어, Puresyn, Inc., Malvem, PA 로부터의 Adenopure) 또는 주문제작 크로마토그래피 컬럼을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
특정 구현예에서, 재조합 Ad 는 감염될 세포가 일정 수의 바이러스와 마주하는 것을 보장하기 위해 충분한 바이러스를 포함할 수 있다. 따라서, 재조합 Ad 의 스톡, 특히 재조합 Ad 의 RCA-무함유 스톡을 제공할 수 있다. Ad 스톡의 제조 및 분석은 당업계에 널리 공지되어 있다. 바이러스 스톡은 대체로 그들을 제조하는데 사용된 바이러스 유전자형 및 프로토콜 및 세포주에 따라, 역가가 상당히 가변적일 수 있다. 바이러스 스톡은 적어도 약 106, 107 또는 108 바이러스 입자 (VP)/㎖ 의 역가를 가질 수 있고, 이러한 많은 스톡은 더 높은 역가, 예컨대 적어도 약 109, 1010, 1011 또는 1012 VP/㎖ 을 가질 수 있다.
III. 이종 핵산
특정 구현예에서, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터는 그에 대해 면역 반응을 생성시키는 것이 바람직한, 하나 이상의 관심 표적 항원 예컨대 알파바이러스 표적 항원, 이의 단편 또는 융합물을 인코딩하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 면역 반응을 조절할 수 있는, 여러 단백질, 이의 융합물 또는 단편을 인코딩하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 특정 양태는 이종 핵산 서열 예컨대 알파바이러스 표적 항원을 포함하는 제 2 세대 E2b 결실 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
이와 같이 특정 양태는, 여러 관심 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 본원에서 또한 나타낼 수 있는 핵산 서열을 제공한다. 이와 같이 특정 양태는, 본원에서 추가로 기재한 바와 같은 임의의 공급원으로부터의 표적 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 이러한 발현 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포를 제공한다. 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드" 는 본원에서 본질적으로 상호교환가능하게 사용된다. 또한 당업자에게 인식되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는, 인트론을 함유하며 1:1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 hnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 추가적인 코딩 또는 비-코딩 서열은 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있으나 존재하지 않아도 되고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있으나 연결되지 않아도 된다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 다른 코딩 서열로부터 실질적으로 떨어져 있다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용하는 바와 같은 단리된 DNA 분자는 큰 부분의 미관련 코딩 DNA, 예컨대 대형 염색체 단편 또는 다른 기능적 유전자 또는 폴리펩티드 코딩 부위를 함유하지 않는다. 물론, 이는 본래 단리된 바와 같은 DNA 분자를 나타낼 수 있으며, 실험실에서 재조합적으로 세그먼트에 이후 첨가되는 유전자 또는 코딩 부위를 배제하지 않는다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 표적 항원, 항원의 단편, 펩티드 등을 발현하거나, 발현하도록 조정될 수 있는 게놈 서열, 게놈외 및 플라스미드-인코딩된 서열 및 더 작은 조작된 유전자 세그먼트를 포함할 수 있다. 이러한 세그먼트는 자연적으로 단리되거나, 사람의 손에 의해 합성적으로 변형될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 고유 (native) 서열 (즉, 표적 항원 폴리펩티드/단백질/에피토프 또는 이의 일부분을 인코딩하는 내인성 서열) 을 포함할 수 있거나, 이러한 서열의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 기재한 바와 같은 표적 항원 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 고유의 뉴클레오티드 서열 또는 변이체로부터 실질적으로 가변적일 수 있으나 유사한 단백질 항원을 인코딩하는 특정 세포 유형 (즉, 인간 세포주) 에서의 발현에 최적화된 신규한 유전자 서열을 나타낸다.
다른 관련 구현예에서, 본원에 기재하는 바와 같은 단백질 (예를 들어, 관심 표적 항원) 을 인코딩하는 고유 서열에 대해 실질적 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 변이체, 예를 들어 본원에 기재한 방법 (예를 들어, 하기 기재한 바와 같은 표준 매개변수를 사용하는 BLAST 분석) 을 사용하여 폴리펩티드를 인코딩하는 고유 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 적어도 70% 서열 동일성, 특히 적어도 75% 에서 99% 까지, 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함하는 것들이 제공될 수 있다. 당업자는 이들 값이 코돈 퇴보성 (codon degeneracy), 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치선정 등을 고려하여 2 개의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 단백질의 상응하는 동일성을 측정하기 위해 적절하게 조정될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는, 특히 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 에피토프의 면역원성 또는 이종 표적 단백질의 면역원성이 고유 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드에 비해 실질적으로 약화되지 않을 수 있도록 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있다. 본원의 다른 곳에서 기재되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 변이체는 표적 항원 또는 이의 단편 (예를 들어, 에피토프) 의 변이체를 인코딩할 수 있으며, 여기서 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편 (예를 들어, 에피토프) 이 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 성향은 고유 폴리펩티드에 관하여 실질적으로 약화되지 않을 수 있다. 용어 "변이체" 는 또한 이종발생 기원의 상동 유전자를 포함할 수 있다.
특정 양태는, 본원에 기재하는 바와 같은, 표적 단백질 항원을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 약 5 에서 1000 개까지 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 그 사이의 모든 중간 길이를 포함하거나 이것으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 문맥에서 "중간 길이" 는 인용된 값 사이의 임의의 길이, 예컨대, 200-500; 500-1,000 등의 모든 정수를 비롯하여, 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등을 의미할 수 있다는 것이 용이하게 이해될 것이다. 본원에 기재하는 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 기재하는 바와 같은 폴리펩티드, 예컨대 에피토프 또는 이종 표적 단백질을 인코딩하는 고유 서열에서 발견되지 않는 추가적인 뉴클레오티드에 의해 하나 또는 양 말단에서 확장될 수 있다. 이러한 추가적인 서열은 개시된 서열의 하나의 말단에서 또는 개시된 서열의 양 말단에서, 1 에서 20 개까지의 뉴클레오티드 또는 그 이상으로 이루어질 수 있다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편은, 코딩 서열 그 자체의 길이와는 관계없이, 그들의 전체 길이가 상당히 가변적일 수 있도록, 다른 DNA 서열, 예컨대 프로모터, 발현 조절 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한 효소 위치, 다중 클로닝 위치, 기타 코딩 세그먼트 등과 조합될 수 있다. 따라서 거의 모든 길이의 핵산 단편이 이용될 수 있으며, 총 길이는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조 및 사용의 용이성에 의해 제한될 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들어, 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50 개 염기쌍 등의 총 길이 (모든 중간 길이 포함) 의 예시적 폴리뉴클레오티드 세그먼트가 많은 실행에 있어서 유용한 것으로 고려된다.
폴리뉴클레오티드 서열을 비교하는 경우, 2 개 서열 중의 뉴클레오티드의 서열이 하기 기재되는 바와 같이 최대 대응 (correspondence) 으로 정렬되었을 때 동일하다면, 2 개 서열은 "동일한" 것으로 언급될 수 있다. 2 개 서열 사이의 비교는 서열 유사성의 국부적 부위를 확인하고 비교하기 위해 비교 윈도우 (comparison window) 에 대해 서열을 비교함으로써 수행될 수 있다. 본원에서 사용하는 바와 같이, "비교 윈도우" 는 적어도 약 20 개의 인접 위치, 통상 30 내지 약 75, 40 내지 약 50 개의 세그먼트를 나타내며, 여기서 서열은 2 개 서열을 최적으로 정렬한 후 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열에 대해 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 디폴트 매개변수를 사용하여 생물정보학 소프트웨어 (DNASTAR, Inc., Madison, WI) 의 Lasergene suite 에서의 Megalign 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 하기 참고문헌에 기재된 여러 정렬 도식을 구현한다: Dayhoff MO (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff MO (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345- 358; Hein J Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 (1990); Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins DG and Sharp PM CABIOS 1989 5:151-53; Myers EW and Muller W CABIOS 1988 4:11-17; Robinson ED Comb. Theor 1971 11A 05; Saitou N, Nei M MoI. Biol. Evol. 1987 4:406-25; Sneath PHA and Sokal RR Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur WJ and Lipman DJ Proc. Natl. Acad., Sci. USA 1983 80:726-30.
대안적으로, 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 [Smith and Waterman, Add. APL. Math 1981 2:482] 의 국부적 동일성 알고리즘에 의해, [Needleman and Wunsch J. MoI. Biol. 1970 48:443] 의 동일성 정렬 알고리즘에 의해, [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988 85:2444] 의 유사성 방법 조사에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해 (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)), 또는 검사 (inspection) 에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 백분율 및 서열 유사성을 측정하는데 적합한 알고리즘의 한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 각각 [Altschul et al., Nucl. Acids Res. 1977 25:3389-3402] 및 [Altschul et al. J. MoI. Biol. 1990 215:403-10] 에 기재되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0 는, 예를 들어 폴리뉴클레오티드에 대한 서열 동일성 백분율을 측정하기 위해, 본원에 기재된 매개면수로, 사용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information) 를 통해 공개적으로 이용가능하다. 한 예시적 예에서, 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해, 매개변수 M (매칭 잔기 쌍에 대한 리워드 점수; 항상 >0 임) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 <0 임) 을 사용하여 계산될 수 있다. 각 방향에서의 단어 히트 (word hit) 의 확장은 다음과 같은 경우에 중단될 수 있다: 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성된 값으로부터 양 X 만큼 떨어지는 경우; 누적 점수가 하나 이상의 음 (negative)-득점 잔기 정렬의 축적으로 인해, 0 이하로 되는 경우; 또는 한쪽 서열의 말단에 도달하는 경우. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X 는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대한) 은 디폴트로서 11 의 단어 길이 (W) 및 10 의 예상값 I 를 사용하고, BLOSUM62 득점 매트릭스 (Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989 89:10915 참조) 정렬은, 50 의 (B), 10 의 예상값 I, M=5, N=-4 및 둘 모두의 가닥의 비교를 사용한다.
특정 양태에서, "서열 동일성의 백분율" 은 적어도 20 개 위치의 비교 윈도우에 대해 2 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 이때 비교 윈도우에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분은 2 개 서열의 최적 정렬을 위해, 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음) 과 비교하여, 20% 이하, 통상 5 내지 15%, 또는 10 내지 12% 의 부가 또는 결실 (즉, 갭) 을 포함할 수 있다. 백분율은, 동일한 핵산 염기가 둘 모두의 서열에서 발생하는 위치의 수를 측정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 참조 서열 중의 위치의 총 수로 나누고 (즉, 윈도우 크기), 결과에 100 을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다.
유전 코드의 퇴보성의 결과로서, 본원에 기재하는 바와 같은 관심 특정 항원 또는 이의 단편을 인코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 고유 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소의 상동성을 가질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용 빈도에서의 차이로 인해 가변적인 폴리뉴클레오티드가 특정 양태에서 구체적으로 고려된다. 또한, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자가 또한 고려된다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변형될 수 있는 내인성 유전자일 수 있다. 생성 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있으나 갖지 않을 수 있다. 대립유전자는 표준 기법 (예컨대 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교) 을 사용하여 확인될 수 있다.
따라서 또 다른 구현예에서, 돌연변이유발 접근방식, 예컨대 위치-특이적 돌연변이유발은, 본원에 기재되는 바와 같은 표적 항원 서열 또는 이의 단편의 변이체 및/또는 유도체의 제조에 이용된다. 이러한 접근방식에 의해, 폴리펩티드 서열에서의 특정 변형은 이들을 인코딩하는 근원 폴리뉴클레오티드의 돌연변이유발을 통해 이루어질 수 있다. 이들 기법은 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 변화를 폴리뉴클레오티드에 도입함으로써, 전술한 고려사항 중 하나 이상을 포함시키는, 서열 변이체를 제조 및 시험하는 간단한 접근방식을 제공할 수 있다.
위치-특이적 돌연변이유발은 횡단되는 결실 접합부의 양 측 상에 안정한 듀플렉스가 형성되도록 충분한 크기의 프라이머 서열 및 서열 복잡성을 제공하기 위한, 원하는 돌연변이의 DNA 서열을 인코딩할 수 있는 특정 올리고뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 충분한 수의 인접 뉴클레오티드의 사용을 통한 돌연변이체의 생산을 허용할 수 있다. 돌연변이는 폴리뉴클레오티드 그 자체의 특성을 개선, 변경, 감소, 변형 또는 다르게는 변화시키기 위해, 및/또는 인코딩된 폴리펩티드의 특성, 활성, 조성, 안정성 또는 일차 서열을 변경시키기 위해, 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에서 이용될 수 있다.
폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 세그먼트 또는 단편은 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 통상 실시되는 바와 같이, 예를 들어, 화학적 수단에 의해 단편을 직접 합성함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 또한, 단편은 핵산 재생산 기술, 예컨대 미국 특허 번호 4,683,202 의 PCR™ 기술의 적용에 의해, 재조합체 생산을 위해 재조합 벡터에 선택된 서열을 도입함으로써, 그리고 분자 생물학 분야의 당업자에게 일반적으로 공지된 다른 재조합 DNA 기술에 의해 수득될 수 있다 (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, NY 참조).
본원에 기재되는 바와 같은, 원하는 표적 항원 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 상기 임의의 것을 포함하는 융합 단백질을 발현하기 위해, 폴리펩티드, 또는 기능적 등가물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을, 당업계에 공지된 재조합 기법을 사용하여 본원의 다른 곳에서 기재되는 바와 같은 적절한 Ad 에 삽입할 수 있다. 적절한 아데노바이러스 벡터는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 필요 요소 및 임의의 원하는 링커를 함유할 수 있다. 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 요소를 함유하는 이러한 아데노바이러스 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 포함할 수 있다. 이러한 기법은 예를 들어, [Amalfitano et al. J. Virol. 1998 72:926-33; Hodges et al. J Gene Med 2000 2:250-259; Sambrook J et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 및 Ausubel FM et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y] 에 기재되어 있다.
다양한 벡터/숙주 시스템이 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하고 생산하는데 이용될 수 있다. 이들은 비제한적으로, 미생물 예컨대 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 벡터 (예를 들어, 배큘로바이러스) 로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 벡터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 박테리아 벡터 (예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드) 로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함할 수 있다.
아데노바이러스 벡터에 존재하는 "제어 요소" 또는 "조절 서열" 은, 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용할 수 있는 벡터의 이들 비-번역 부위 - 인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 미번역 부위 - 일 수 있다. 이러한 요소는 그들의 강도 및 특이성이 가변적일 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터를 포함하는 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 후기 프로모터 및 삼부 (tripartite) 리더 서열로 이루어지는 Ad 전사/번역 복합체에 라이게이션될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 E1 또는 E3 부위 내 삽입은 감염된 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 생존가능 바이러스를 수득하는데 사용될 수 있다 (Logan J and Shenk T (1984) Proc. Natl. Acad. Sci 1984 87:3655-59). 추가로, 전사 인핸서, 예컨대 라우스 육종 바이러스 (RSV) 인핸서가, 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다. 전사 인핸서는 1 개의 요소, 적어도 2 개의 요소, 적어도 3 개의 요소, 적어도 4 개의 요소, 적어도 5 개의 요소 또는 적어도 6 개의 요소를 포함할 수 있다.
특정 개시 신호는 또한 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 보다 효과적인 번역을 달성하는데 사용될 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 그의 개시 코돈 및 업스트림 서열이 적절한 발현 벡터에 삽입되는 경우, 추가적인 전사 또는 번역 제어 신호는 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 오직 코딩 서열 또는 이의 일부분만 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호가 제공될 수 있다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역이 보장되도록 올바른 판독 프레임 내에 있을 수 있다. 외인성 번역 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성 둘 모두의, 다양한 기원의 것일 수 있다. 발현 효율은 사용되는 특정 세포 시스템에 대해 적절한 인핸서, 예컨대 문헌에 기재된 것들 (Scharf D. et al. Results Probl. Cell Differ. 1994 20:125-62) 의 포함에 의해 증강될 수 있다. 전사 또는 번역에 대한 특정 종결 서열은 또한 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 효과적인 번역을 달성하기 위해 통합될 수 있다.
생성물에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하는, 폴리뉴클레오티드-인코딩된 생성물 (예를 들어, 관심 표적 항원) 의 발현을 검출 및 측정하기 위한 다양한 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다. 그 예는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사능면역검정 (RIA) 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 를 포함한다. 제공된 폴리펩티드 상의 2 개의 비-간섭 에피토프에 대해 반응성인 모노클로날 항체를 이용하는 2 개 위치, 모노클로날-기반 면역검정이 일부 적용에 사용될 수 있으나, 경쟁적 결합 검정이 또한 이용될 수 있다. 이들 검정 및 다른 검정은, 다른 곳 중에서도, [Hampton R et al. 1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.] 및 [Maddox DE et al. J. Exp. Med. 1983 758:1211-16] 에 기재되어 있다. 아데노바이러스 벡터는 여러 관심 알파바이러스 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 원하는 표적 항원의 발현을 증가시키는 요소가 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터의 핵산 서열에 통합된다. 이러한 요소는 내부 리보솜 결합 위치를 포함한다 (IRES; Wang and Siddiqui Curr. Top. Microbiol. Immunol 1995 203:99; Ehrenfeld and Semler Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995 203:65; Rees et al., Biotechniques 1996 20:102; Sugimoto et al. Biotechnology 1994 2:694). IRES 는 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 다른 서열은 또한 발현을 증강시킬 수 있다. 일부 유전자에 대해, 특히 5' 말단에 있는 서열은 전사 및/또는 번역을 저해할 수 있다. 이러한 서열은 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 팔린드롬 (palindrome) 일 수 있다. 전달되는 핵산 중 임의의 이러한 서열은 결실될 수 있거나 결실되지 않을 수 있다.
전사체 또는 전사된 산물의 발현 수준은 발현에 영향을 주는 서열을 확인하거나 알아내기 위해 검정될 수 있다. 전사체 수준은, 노던 블롯 하이브리드화, RNase 프로브 보호 등을 포함하는 임의의 공지된 방법에 의해 검정될 수 있다. 단백질 수준은, ELISA 를 포함하는 임의의 공지된 방법에 의해 검정될 수 있다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 이종 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터는 당업계에 공지된 재조합 기법, 예컨대 [Maione et al. Proc Natl Acad Sci USA 2001 98:5986-91; Maione et al. Hum Gene Ther 2000 1:859-68; Sandig et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2000 97:1002-07; Harui et al. Gene Therapy 2004 11:1617-26; Parks et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996 93:13565-570; Dello Russo et al. Proc Natl Acad Sci USA 2002 99:12979-984; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, NY] 에 기재된 기법을 사용하여 생성될 수 있다.
상기 주목한 바와 같이, 아데노바이러스 벡터는 여러 알파바이러스 표적 단백질 또는 관심 항원을 인코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 벡터는 1 내지 4 개 또는 그 이상의 상이한 관심 표적 항원을 인코딩하는 핵산을 함유할 수 있다. 표적 항원은 전장 단백질일 수 있거나, 이의 단편 (예를 들어, 에피토프) 일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 하나의 관심 표적 단백질로부터의 다수의 단편 또는 에피토프를 인코딩하는 핵산 서열을 함유할 수 있거나, 수많은 상이한 관심 표적 알파바이러스 항원 단백질로부터의 하나 이상의 단편 또는 에피토프를 함유할 수 있다.
일부 양태에서, 핵산 서열은 복수의 알파바이러스 표적 항원을 인코딩한다. 복수의 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 핵산 서열은 각각 표적 항원에 상응하는 복수의 유전자 삽입물을 포함할 수 있으며, 이때 각각의 유전자 삽입물은 자가-절단 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 의해 분리된다. 일부 양태에서, 자가-절단 2A 펩티드 (즉, 절단가능 링커) 는 돼지 테스코바이러스-1 또는 토세아 아시그나 바이러스 등에서 유래된다.
절단가능 링커의 예는 2A 링커 (예를 들어, T2A), 2A-유사 링커 또는 이의 기능적 등가물 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 피코르나바이러스 2A-유사 링커, 돼지 테스코바이러스 (P2A), 토세아 아시그나 바이러스 (T2A) 의 CHYSEL 서열, 또는 이의 조합, 변이체 및 기능적 등가물을 포함한다.
특정 구현예에서, 면역원성 단편은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합한다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 면역원성 단편은, 이러한 결합이 당업계에 공지된 임의의 검정을 사용하여 검출가능하다면, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 "결합" 할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드가 MHC 클래스 I 에 결합하는 능력은 125I 표지된 β2-마이크로글로불린 (β2m) 의 MHC 클래스 I/β2m/펩티드 이종삼량체성 복합체 내로의 통합을 촉진시키는 능력을 모니터링함으로써 간접적으로 평가될 수 있다 (Parker et al., J. Immunol. 752:163, 1994 참조). 대안적으로, 당업계에 공지되어 있는 기능적 펩티드 경쟁 검정을 이용할 수 있다. 폴리펩티드의 면역원성 단편은 일반적으로 널리 공지된 기법, 예컨대 [Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993)] 및 이에 인용된 참고문헌에 요약된 기법을 사용하여 확인될 수 있다. 면역원성 단편을 확인하기 위한 대표적 기법은, 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 대한 폴리펩티드의 스크리닝을 포함할 수 있다. 특정 표적 폴리펩티드의 면역원성 단편은 (예를 들어, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 검정에서) 전장 표적 폴리펩티드의 반응성보다 실질적으로 낮지 않은 수준에서 이러한 항혈청 및/또는 T-세포와 반응할 수 있는 단편일 수 있다. 즉, 면역원성 단편은 전장 폴리펩티드의 반응성과 유사하거나 더 큰 수준에서 이러한 검정 내에서 반응할 수 있다. 이러한 스크리닝은 일반적으로, 당업자에게 널리 공지된 방법, 예컨대 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 에서 기재된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
표적 항원은 임의의 알파바이러스에서 유래하는 항원을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 표적 항원은 본원에 기재된 임의의 감염성 알파바이러스에 의해 생산된 단백질, 예컨대 C, E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, E1ALPHA, nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4 를 포함할 수 있다. 본원에서 사용하는 바와 같이, "감염원" 은 숙주를 감염시킬 수 있는 임의의 종일 수 있다. 감염원은 예를 들어, 알파바이러스 속 내의 임의의 바이러스를 포함할 수 있다.
아데노바이러스 벡터는 또한 표적 항원의 면역원성을 증가시키는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 이러한 단백질을 함유하는 아데노바이러스 벡터로의 면역화 후 생산된 단백질은, 관심 표적 항원의 면역원성을 증가시키는 단백질에 융합된 관심 표적 항원을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
IV. 병용 요법
특정 구현예는 감염성 질환의 치료 및 예방을 위한 병용 면역요법 및 백신 조성물을 제공한다. 일부 구현예는 감염성 질환과 같은 복합 질환에 대한 증강된 치료 반응을 위한 병용 다중-표적화 백신, 면역요법 및 방법을 제공한다. 병용 요법의 각 성분은 치쿤구니아 감염 또는 임의의 알파바이러스에 의한 감염의 예방을 위한 백신 조성물에 독립적으로 포함될 수 있다.
"치료" 는 본 개시물의 백신의 치료학적 유효 용량을 대상에게 투여하는 것을 나타낼 수 있다. 치료는 약학 조성물로 대상에게 투여될 수 있다. 대상은 또한 치료시에 건강하거나 질환이 없을 수 있으며, 이 경우, 치료는 예방적 백신화로서 나타낼 수 있다. 대상은 치료시에 질환 상태로 고통을 겪을 수 있으며, 이 경우, 치료는 치료적 백신화로서 나타낼 수 있다.
"대상" 은 인간, 비-인간 영장류 (예를 들어, 레수스 또는 기타 유형의 마카크), 마우스, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 랫트 및 가금류를 비제한적으로 포함하는 임의의 동물을 나타낼 수 있다. "대상" 은 본원에서 "개체" 또는 "환자" 와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 벡터는 적어도 하나의 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 적어도 2 개의 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신 제형은 1:1 비의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 1:2 비의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 1:3 비의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 1:4 비의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 1:5 비의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 1:6 비의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 1:7 비의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 1:8 비의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 1:9 비의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 1:10 비의 벡터 대 항원을 포함한다.
일부 양태에서, 백신은 병용 백신이며, 여기서 백신은 적어도 단일한 항원을 각각 함유하는 적어도 2 개의 벡터를 포함한다.
상이한 항원의 혼합물이 대상에서 동일하거나 상이한 벡터로부터 동시에 투여 또는 발현되는 경우, 이들은 서로 경쟁할 수 있다. 그 결과, 병용 면역요법 또는 백신 중 상이한 농도 및 비의 발현된 항원을 포함하는 제형이 평가되고 대상 또는 대상의 군에 대해 맞추어져, 투여 후 발생하는 효과적이고 지속된 면역 반응이 보장되어야 한다.
다수의 항원을 포함하는 조성물은 다양한 비로 존재할 수 있다. 예를 들어, 하나 초과의 벡터를 갖는 제형은 다양한 비를 가질 수 있다. 예를 들어, 면역요법 또는 백신은 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, 2:1, 2:3, 2:4, 2:5, 2:6, 2:7, 2:8, 3:1, 3:3, 3:4, 3:5, 3:6, 3:7, 3:8, 3:1, 3:3, 3:4, 3:5, 3:6, 3:7, 3:8, 4:1, 4:3, 4:5, 4:6, 4:7, 4:8, 5:1, 5:3, 5:4, 5:6, 5:7, 5:8, 6:1, 6:3, 6:4, 6:5, 6:7, 6:8, 7:1, 7:3, 7:4, 7:5, 7:6, 7:8, 8:1, 8:3, 8:4, 8:5, 8:6 또는 8:7 의 화학량론으로 2 개의 상이한 벡터를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산 벡터 중 적어도 하나는 첫 번째 동일성 값을 포함하는 복제 결함성 아데노바이러스 5 벡터를 포함하는 복제 결함성 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스 벡터는 E2b 유전자 부위에서 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스 벡터는 E1 유전자 부위에서 결실을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스 벡터는 E1 유전자 부위, 및 E2b 유전자 부위, E3 유전자 부위, E4 유전자 부위, 또는 이의 임의의 조합에서 결실을 포함한다.
본 개시물의 임의의 Ad5 [E1-, E2b-] 백신과 병용으로 사용될 수 있는 특정 요법을 하기에 보다 상세히 기재한다.
A. 공동자극 분자
표적 항원 예컨대 알파바이러스 표적 항원, 특히 치쿤구니아 항원을 함유하는 재조합 아데노바이러스-기반 벡터 백신의 사용에 추가로, 공동자극 분자가 상기 백신에 통합되어 면역원성을 증가시킬 수 있다.
면역 반응의 개시는 APC에 의한 I T 세포의 활성화를 위해 적어도 2 가지 신호를 필요로 할 수 있다 (Damle, et al. J Immunol 148:1985-92 (1992); Guinan, et al. Blood 84:3261-82 (1994); Hellstrom, et al. Cancer Chemother Pharmacol 38:S40-44 (1996); Hodge, et al. Cancer Res 39:5800-07 (1999)). 항원 특이적 제 1 신호는 펩티드/주요 조직적합성 복합체 (MHC) 를 통해 T 세포 수용체 (TCR) 를 통하여 전달될 수 있으며 T 세포가 세포 주기에 진입하도록 할 수 있다. 제 2, 또는 공동자극 신호는 사이토카인 생산 및 증식을 위해 전달될 수 있다.
전문적인 항원 제시 세포 (APC) 의 표면 상에서 보통 발견되는 적어도 3 개의 별개 분자가 T 세포 활성화에 중요한 제 2 신호를 제공할 수 있다: B7-1 (CD80), ICAM-1 (CD54) 및 LFA-3 (인간 CD58) (Damle, et al. J Immunol 148:1985-92 (1992); Guinan, et al. Blood 84: 3261-82 (1994); Wingren, et al. Crit Rev Immunol 15: 235-53 (1995); Parra, et al. Scand. J Immunol 38: 508-14 (1993); Hellstrom, et al. Ann NY Acad Sci 690: 225-30 (1993); Parra, et al. J Immunol 158: 637-42 (1997); Sperling, et al. J Immunol 157: 3909-17 (1996); Dubey, et al. J Immunol 155: 45-57 (1995); Cavallo, et al. Eur J Immunol 25: 1154-62 (1995)).
이러한 공동자극 분자는 별개의 T 세포 리간드를 가질 수 있다. B7-1 은 CD28 및 CTLA-4 분자와 상호작용할 수 있고, ICAM-1 은 CD11a/CD18 (LFA-1/베타-2 인테그린) 복합체와 상호작용할 수 있고, LFA-3 은 CD2 (LFA-2) 분자와 상호작용할 수 있다. 따라서 특정 구현예에서, 각각 B7-1, ICAM-1 및 LFA-3 을 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 갖는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 표적 항원, 예컨대 알파바이러스 항원을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 함유하는 재조합 아데노바이러스-기반 벡터 백신과 병용시, 특정 표적 항원에 대해 유도된 항-알파바이러스 면역 반응을 더 증가/증강시킬 수 있다.
V. 면역학적 융합 파트너
본원에 기재된 바이러스 벡터 또는 조성물은 표적 항원, 예컨대 치쿤구니아 바이러스 항원, 또는 본 개시물의 임의의 표적 항원의 면역원성을 증가시킬 수 있는 단백질, 또는 "면역학적 융합 파트너" 를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 이러한 단백질을 함유하는 바이러스 벡터로의 면역화 후 생산되는 단백질은 관심 표적 항원의 면역원성을 증가시키는 단백질에 융합된 관심 표적 항원을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 또한, 치쿤구니아 바이러스 항원 및 면역학적 융합 파트너를 인코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터로의 병용 요법은, 면역 반응의 부스트 (boost) 를 초래할 수 있어, 두 치료 모이어티의 조합은 치쿤구니아 바이러스 항원 단독, 또는 면역학적 융합 파트너 단독을 인코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터보다 더 면역 반응을 상승작용적으로 부스트하는 작용을 한다. 예를 들어, 치쿤구니아 바이러스 항원 및 면역학적 융합 파트너를 인코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터로의 병용 요법은 항원-특이적 효과기 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 자극, 감염된 세포 살해에 대해 유도된 NK 세포 반응의 자극, 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체 의존적 세포 식균작용 (ADCP) 메커니즘을 통한 감염된 세포 살해에 대해 유도된 호중구 또는 단핵구 세포 반응의 자극, 또는 이의 임의의 조합의 상승작용적 증강을 초래할 수 있다. 이러한 상승작용적 부스트는 이를 필요로 하는 대상에 투여 후 생존 결과를 크게 개선시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 치쿤구니아 바이러스 항원 및 면역학적 융합 파트너를 인코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터로의 병용 요법은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상에서 약 1.5 내지 20 배, 또는 그 이상의 표적 항원-특이적 CTL 활성의 증가를 포함하는 면역 반응 생성을 초래할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 면역 반응 생성은 대조군과 비교하여 치쿤구니아 바이러스 항원 및 면역학적 융합 파트너를 인코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터가 투여된 대상에서 약 1.5 내지 20 배, 또는 그 이상의 표적-특이적 CTL 활성의 증가를 포함한다. 추가 구현예에서, 면역 반응 생성은 대조군과 비교하여 약 1.5 내지 20 배, 또는 그 이상의, 사이토카인 분비, 예컨대 인터페론-감마 (IFN-γ), 인터류킨-2 (IL-2), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 또는 기타 사이토카인을 측정하는 ELISpot 검정에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원-특이적 세포-매개 면역력 활성의 증가를 포함한다. 추가 구현예에서, 면역 반응 생성은 적절한 대조군과 비교하여 본원에 기재한 바와 같은 치쿤구니아 바이러스 항원 및 면역학적 융합 파트너를 인코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터를 투여한 대상에서 1.5 내지 5 배의 표적-특이적 항체 생산의 증가를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 면역 반응 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터를 투여한 대상에서 약 1.5 내지 20 배, 또는 그 이상, 표적-특이적 항체 생산의 증가를 포함한다.
추가적인 예로서, 표적 에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 인코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터로의 병용 요법은 항원-특이적 효과기 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 자극, 감염된 세포 살해에 대해 유도된 NK 세포 반응의 자극, 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체 의존적 세포 식균작용 (ADCP) 메커니즘을 통한 감염된 세포 살해에 대해 유도된 호중구 또는 단핵구 세포 반응의 자극, 또는 이의 임의의 조합의 상승작용적 증강을 초래할 수 있다. 이러한 상승작용적 부스트는 이를 필요로 하는 대상에 대한 투여 후 생존 결과를 크게 개선시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 인코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터와의 병용 요법은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상에서 약 1.5 내지 20 배, 또는 그 이상의 표적 항원-특이적 CTL 활성의 증가를 포함하는 면역 반응 생성을 초래할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 면역 반응 생성은 대조군과 비교하여 표적 에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 인코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터가 투여된 대상에서 약 1.5 내지 20 배, 또는 그 이상의 표적-특이적 CTL 활성의 증가를 포함한다. 추가 구현예에서, 면역 반응 생성은 대조군과 비교하여 약 1.5 내지 20 배, 또는 그 이상의, 사이토카인 분비, 예컨대 인터페론-감마 (IFN-γ), 인터류킨-2 (IL-2), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 또는 기타 사이토카인을 측정하는 ELISpot 검정에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원-특이적 세포-매개 면역력 활성의 증가를 포함한다. 추가 구현예에서, 면역 반응 생성은 적절한 대조군과 비교하여 본원에 기재한 바와 같은 아데노바이러스 벡터를 투여한 대상에서 1.5 내지 5 배의 표적-특이적 항체 생산의 증가를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 면역 반응 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터를 투여한 대상에서 약 1.5 내지 20 배, 또는 그 이상, 표적-특이적 항체 생산의 증가를 포함한다.
한 구현예에서, 이러한 면역학적 융합 파트너는 마이코박테리움 종 (Mycobacterium sp.) 으로부터 유래된다 (예컨대 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)-유래된 Ra12 단편). 마이코박테리움 종으로부터 유래된 면역학적 융합 파트너는 SEQ ID NO: 22 - SEQ ID NO: 30 및 SEQ ID NO: 93 - SEQ ID NO: 98 에서 나타내는 서열 중 임의의 하나일 수 있다. 올리고뉴클레오티드, Met-His 태그 및 엔테로키나아제 인식 위치 (이러한 마이코박테리움 종-유래 Ra12 서열을 구축하는데 사용될 수 있음) 를 SEQ ID NO: 99 - SEQ ID NO: 106 중 임의의 하나에서 나타낸다 (표 2 에 제시됨). 이종 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열의 발현 및/또는 면역원성을 증강시키는데 사용하기 위한 Ra12 조성물 및 방법이 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,009,042 에서 기재되어 있다. 간략하게, Ra12 는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 MTB32A 핵산의 하위서열인 폴리뉴클레오티드 부위를 나타낸다. MTB32A 는 M.투베르쿨로시스 (M. tuberculosis) 의 독성 및 무독성 균주에서의 유전자에 의해 인코딩된 32 kDa 의 세린 프로테아제이다. MTB32A 의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 기재되어 있다 (예를 들어, 본원에 그 전체가 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,009,042; Skeiky et al., Infection and Immun. 67:3998-4007 (1999) 참조). MTB32A 코딩 서열의 C-말단 단편은 높은 수준으로 발현될 수 있으며 정제 과정 전체에 걸쳐 가용성 폴리펩티드로서 남아 있다. 더욱이, Ra12 는 융합되는 이종 면역원성 폴리펩티드의 면역원성을 증강시킬 수 있다. Ra12 융합 폴리펩티드는 MTB32A 의 아미노산 잔기 192 ~ 323 에 상응하는 14 kDa C-말단 단편을 포함할 수 있다. 다른 Ra12 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, Ra12 폴리펩티드의 일부분을 인코딩하는 적어도 약 15, 30, 60, 100, 200, 300 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오티드는 고유 서열 (즉, Ra12 폴리펩티드 또는 그의 일부분을 인코딩하는 내인성 서열) 을 포함할 수 있거나, 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오티드 변이체는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있는데, 인코딩된 융합 폴리펩티드의 생물학적 활성은 고유 Ra12 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드에 관하여 실질적으로 약화되지 않는다. 변이체는 고유 Ra12 폴리펩티드 또는 그의 일부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 70%, 80% 또는 90% 동일성, 또는 그 이상의 동일성을 가질 수 있다.
특정 양태에서, 면역학적 융합 파트너는 그람-음성 박테리아 헤모필루스 인플루엔자 B (Haemophilus influenzae B) 의 표면 단백질인 단백질 D 로부터 유래될 수 있다. 단백질 D 로부터 유래되는 면역학적 융합 파트너는 SEQ ID NO: 47 에서 나타내는 서열일 수 있다. 일부 경우, 단백질 D 유도체는 대략 단백질의 첫 번째 3 분의 1 (예를 들어, 첫 번째 N-말단 100-110 아미노산) 을 포함한다. 단백질 D 유도체는 지질화될 수 있다. 특정 구현예에서, 지질단백질 D 융합 파트너의 첫 번째 109 개 잔기가 N-말단 상에 포함되어 추가적인 외인성 T-세포 에피토프를 가진 폴리펩티드가 제공되며, 이는 대장균에서의 발현 수준을 증가시킬 수 있고, 발현 인핸서로서 기능할 수 있다. 지질 꼬리는 항원 제시 세포에 대한 항원의 최적의 제시를 보장할 수 있다. 다른 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스로부터의 비-구조 단백질, NS1 (헤마글루티닌) 을 포함할 수 있다. 전형적으로, N-말단 81 개 아미노산이 사용되지만, T-헬퍼 에피토프를 포함하는 상이한 단편이 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 면역학적 융합 파트너는 LYTA 로서 공지된 단백질, 또는 이의 일부분 (특히 C-말단 부분) 일 수 있다. LYTA 로부터 유래된 면역학적 융합 파트너는 SEQ ID NO: 32 에서 나타내는 서열일 수 있다. LYTA 는 스트렙토코쿠스 뉴모니에 (Streptococcus pneumoniae) 로부터 유래되고, 이는 아미다아제 LYTA (LytA 유전자에 의해 인코딩됨) 로서 공지된 N-아세틸-L-알라닌 아미다아제를 합성한다. LYTA 는 펩티도글리칸 백본 중의 특정 결합을 특이적으로 분해하는 오토라이신이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 일부 콜린 유사체, 예컨대 DEAE 에 대한 친화성을 담당할 수 있다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 대장균 C-LYTA 발현 플라스미드의 개발에 이용될 수 있다. 아미노 말단에서 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 이용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, LYTA 의 반복 부분은 융합 폴리펩티드 내에 통합될 수 있다. 반복 부분은 예를 들어, 잔기 178 에서 출발하는 C-말단 부위에서 발견될 수 있다. 하나의 특정 반복 부분은 잔기 188-305 를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 항원은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,γ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1 및 MIF 의 군에서 선택되는 사이토카인을 포함하는, "면역원성 성분"으로서 본원에서 또한 나타낼 수 있는 면역학적 융합 파트너에 융합된다. 표적 항원 융합물은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,γ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1 및 MIF 중 하나 이상에 대해 실질적인 동일성을 갖는 단백질을 생산할 수 있다. 표적 항원 융합물은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,γ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1 및 MIF 중 하나 이상에 대해 실질적인 동일성을 갖는 단백질을 인코딩하는 핵산을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원 융합물은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,γ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1 및 MIF 의 군에서 선택되는 사이토카인을 포함하는, "면역원성 성분" 으로서 또한 본원에서 나타낼 수 있는, 하나 이상의 면역학적 융합 파트너를 추가로 포함한다. IFN-γ 의 서열은 SEQ ID NO: 33 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. TNFα 의 서열은 SEQ ID NO: 34 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-2 의 서열은 SEQ ID NO: 35 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-8 의 서열은 SEQ ID NO: 36 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-12 의 서열은 SEQ ID NO: 37 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-18 의 서열은 SEQ ID NO: 38 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-7 의 서열은 SEQ ID NO: 39 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-3 의 서열은 SEQ ID NO: 40 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-4 의 서열은 SEQ ID NO: 41 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-5 의 서열은 SEQ ID NO: 42 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-6 의 서열은 SEQ ID NO: 43 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-9 의 서열은 SEQ ID NO: 44 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-10 의 서열은 SEQ ID NO: 45 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-13 의 서열은 SEQ ID NO: 46 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-15 의 서열은 SEQ ID NO: 47 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-16 의 서열은 SEQ ID NO: 74 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-17 의 서열은 SEQ ID NO: 75 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-23 의 서열은 SEQ ID NO: 76 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. IL-32 의 서열은 SEQ ID NO: 77 에서 나타내는 바와 같은 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 표적 항원은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, , IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,γ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1 및 MIF 의 군에서 선택되는 사이토카인을 포함하는, "면역원성 성분" 으로서 또한 본원에서 나타내는 면역학적 융합 파트너에 융합되거나 연결된다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,γ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1 및 MIF 의 군에서 선택되는 사이토카인을 포함하는, "면역원성 성분" 으로서 또한 본원에서 나타내는 면역학적 융합 파트너와 세포 내에서 동시발현된다.
일부 구현예에서, 표적 항원은, CpG ODN (예를 들어, 클래스 A, B 또는 C CpG ODN; 비제한적 예시 서열을 SEQ ID NO: 108 - SEQ ID NO: 119 에 나타내며, 여기서 포스포디에스테르 염기는 대문자이고, 포스포로티오에이트 염기는 소문자이고, 팔린드롬은 밑줄그어지며 콜론은 반사점을 나타냄), 콜레라 독소 (비제한적 예시 서열은 SEQ ID NO: 49 에 제시되어 있다), 박테리아 ADP-리보실화 엑소톡신에서 유래된 절두형 A 서브유닛 코딩 부위 (비제한적 예시 서열은 SEQ ID NO: 50 에 제시되어 있다), 박테리아 ADP-리보실화 엑소톡신에서 유래된 절두형 B 서브유닛 코딩 부위 (비제한적 예시 서열은 SEQ ID NO: 51 에 제시되어 있다), Hp91 (비제한적 예시 서열은 SEQ ID NO: 52 에 제시되어 있다), CCL20 (비제한적 예시 서열은 SEQ ID NO: 53 및 SEQ ID NO: 107 에 제시되어 있다), CCL3 (비제한적 예시 서열은 SEQ ID NO: 54 에 제시되어 있다), GM-CSF (비제한적 예시 서열은 SEQ ID NO: 55 에 제시되어 있다), G-CSF (비제한적 예시 서열은 SEQ ID NO: 56 에 제시되어 있다), LPS 펩티드 모방체 (비제한적 예시 서열은 SEQ ID NO: 57 - SEQ ID NO: 68 에 제시되어 있다), 시가 독소 (비제한적 예시 서열은 SEQ ID NO: 69 에 제시되어 있다), 디프테리아 독소 (비제한적 예시 서열은 SEQ ID NO: 70 에 제시되어 있다) 또는 CRM197 (비제한적 예시 서열은 SEQ ID NO: 73 에 제시되어 있다) 을 포함하는 면역학적 융합 파트너에 융합되거나 연결된다.
일부 구현예에서, 표적 항원은 IL-15 과작동제를 포함하는, 면역학적 융합 파트너에 융합되거나 연결된다. 인터류킨 15 (IL-15) 는 바이러스 감염 후 분비되는 자연 발생 염증성 사이토카인이다. 분비된 IL-15 는 효과기 면역 세포 상의 이의 동족 (cognate) 수용체를 통해 신호를 전달함으로써 그의 기능을 수행할 수 있으며, 따라서 효과기 면역 세포 활성의 전반적인 증강을 초래할 수 있다.
세포 면역 반응을 자극하고 유지하는 IL-15 의 광범위한 능력을 기반으로, 이는 유망한 면역요법 약물인 것으로 여겨진다. 그러나, IL-15 의 임상적 개발에 있어서의 주요 한계는 표준 포유동물 세포 발현 시스템에서의 낮은 생산 수율 및 짧은 혈청 반감기를 포함할 수 있다. 게다가, 자유 IL-15 사이토카인보다는 동일한 세포에 의해 동시발현되는 단백질을 포함하는 IL-15:IL-15Rα 복합체는, IL-15 βγc 수용체를 가지고 있는 면역 효과기 세포를 자극하는 것을 담당할 수 있다.
이들 단점을 극복하기 위해, 신규한 IL-15 과작동제 돌연변이체 (IL-15N72D) 는 증가된 IL-15Rβγc 에 결합하는 능력 및 증강된 생물학적 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 마우스 또는 인간 IL-15Rα 및 Fc 융합 단백질 (면역글로불린의 Fc 부위) 의 등몰 농도의 IL-15N72D 에 대한 첨가는 IL-15 생물학적 활성에 있어서 추가 증가를 제공할 수 있어, IL-15N72D:IL-15Rα/Fc 과작동제 복합체가 자유 IL-15 사이토카인보다 10 배 초과로 더 낮은 IL-15-의존적 세포 성장을 지지하기 위한 중간 유효 농도 (EC50) 를 나타낸다.
일부 구현예에서, IL-15 과작동제는 신규한 IL-15 과작동제 돌연변이체 (IL-15N72D) 일 수 있다. 특정 구현예에서, 마우스 또는 인간 IL-15Rα 및 Fc 융합 단백질 (면역글로불린의 Fc 부위) 의 등몰 농도의 IL-15N72D 에 대한 첨가는 IL-15 생물학적 활성에 있어서 추가 증가를 제공할 수 있어, IL-15N72D:IL-15Rα/Fc 과작동제 복합체가 자유 IL-15 사이토카인보다 10 배 초과로 더 낮을 수 있는 IL-15-의존적 세포 성장을 지지하기 위한 중간 유효 농도 (EC50) 를 나타낸다.
따라서 일부 구현예에서, 본 개시물은 자유 IL-15 사이토카인보다 2-배 초과로 더 낮은, 3-배 초과로 더 낮은, 4-배 초과로 더 낮은, 5-배 초과로 더 낮은, 6-배 초과로 더 낮은, 7-배 초과로 더 낮은, 8-배 초과로 더 낮은, 9-배 초과로 더 낮은, 10-배 초과로 더 낮은, 15-배 초과로 더 낮은, 20-배 초과로 더 낮은, 25-배 초과로 더 낮은, 30-배 초과로 더 낮은, 35-배 초과로 더 낮은, 40-배 초과로 더 낮은, 45-배 초과로 더 낮은, 50-배 초과로 더 낮은, 55-배 초과로 더 낮은, 60-배 초과로 더 낮은, 65-배 초과로 더 낮은, 70-배 초과로 더 낮은, 75-배 초과로 더 낮은, 80-배 초과로 더 낮은, 85-배 초과로 더 낮은, 90-배 초과로 더 낮은, 95-배 초과로 더 낮은 또는 100-배 초과로 더 낮은 IL-15-의존적 세포 성장을 지지하기 위한 EC50 을 갖는 IL-15N72D:IL-15Rα/Fc 과작동제 복합체를 제공한다.
일부 구현예에서, IL-15 과작동제는 또한 ALT-803 으로서 알려진, 가용성 IL-15Rα/Fc 융합 단백질의 이량체 및 2 개의 IL-15N72D 분자의 생물학적 활성 단백질 복합체이다. ALT-803 의 조성물 및 ALT-803 의 생산 및 사용 방법은, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0374790 에 기재되어 있다. N 말단에 소위 "스시" 도메인 (Su) 을 함유하는 가용성 IL-15Rα 단편이, 높은 친화성 사이토카인 결합을 담당하는 구조 요소 대부분을 가질 수 있는 것으로 알려져 있다. 가용성 융합 단백질은 인간 IL-15RαSu 도메인 (성숙 인간 IL-15Rα 단백질의 아미노산 1-65) 을 Fc 도메인을 함유하는 인간 IgG1 CH2-CH3 부위 (232 개 아미노산) 과 연결시킴으로써 생성될 수 있다. 이러한 IL-15RαSu/IgG1 Fc 융합 단백질은 IgG1 도메인을 통한 디술피드 결합을 통한 이량체 형성 및 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하는 정제의 용이성의 장점을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, ALT-803 은 이량체성 IL-15Rα 스시 도메인/인간 IgG1 Fc 융합 단백질에 높은 친화성으로 연관되는 인간 IL-15 변이체의 2 개 단백질 서브유닛으로 이루어지는 가용성 복합체를 가질 수 있다. IL-15 변이체는 헬릭스 C 의 위치 72 에서의 Asn 에서 Asp 로의 치환 (N72D) 을 가진 성숙 인간 IL-15 사이토카인 서열을 포함하는 114 개 아미노산 폴리펩티드이다. 인간 IL-15R 스시 도메인/인간 IgG1 Fc 융합 단백질은 Fc 도메인을 함유하는 인간 IgG1 CH2-CH3 부위 (232 개 아미노산) 에 연결된 IL-15R 서브유닛의 스시 도메인 (성숙 인간 IL-15Rα 단백질의 아미노산 1-65) 을 포함한다. N72D 치환 이외에도, 모든 단백질 서열은 인간이다. 서브유닛의 아미노산 서열을 기반으로, 2 개 IL-15N72D 폴리펩티드 (예로서, IL-15N72D 서열은 SEQ ID NO: 71 에 표시된다) 및 디술피드 연결된 동종이량체 IL-l5RαSu/IgG1 Fc 단백질 (예로서, IL-15RαSu/Fc 도메인은 SEQ ID NO: 72 에 표시됨) 를 포함하는 복합체의 계산된 분자량은 92.4 kDa 이다. 일부 구현예에서, 표적 항원 및 ALT-803 을 인코딩하는 재조합 벡터는 표적 항원을 인코딩하는 본원에 기재된 임의 서열을 가질 수 있고, ALT-803 을 인코딩하기 위해 SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, 및 SEQ ID NO: 72 을 임의 순서로 가질 수 있다.
각각의 IL-15N720 폴리펩티드는 대략 12.8 kDa 의 계산된 분자량을 가질 수 있고, IL-15RαSu/IgG 1 Fc 융합 단백질은 대략 33.4 kDa 의 계산된 분자량을 가질 수 있다. IL-15N72D 및 IL-15RαSu/IgG 1 Fc 단백질 둘 모두는 당화되어서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 대략 114 kDa 의 ALT-803 의 겉보기 분자량을 초래할 수 있다. ALT-803 에 대해 측정된 등전점 (pI) 은 대략 5.6 내지 6.5 의 범위일 수 있다. 따라서, 융합 단백질은 pH 7 에서 음으로 하전될 수 있다.
치쿤구니아 바이러스 항원 및 ALT-803 을 인코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터의 병용 요법은 그 결과로 면역 반응을 부스팅시킬 수 있어서, 양쪽 치료적 모이어티의 조합이 요법 단독보다 더 많이 면역 반응을 상승적으로 부스팅시키는 작용을 한다. 예를 들어, 치쿤구니아 바이러스 항원 및 ALT-803 을 인코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터의 병용 요법은 항원-특이적 이펙터 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 자극, 감염된 세포를 살해하는 쪽으로 NK 세포 반응의 자극, 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 또는 항체 의존적 세포 식균작용 (ADCP) 기전을 통해 감염된 세포를 살해하는 쪽으로 호중구 또는 단핵구 세포 반응의 자극의 상승적 증강을 일으킬 수 있다. 치쿤구니아 바이러스 항원 및 ALT-803 을 인코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터의 병용 요법은 상기 반응 중 어느 하나, 또는 상기 반응의 조합을 상승적으로 부스팅하여, 이를 필요로 하는 대상에게 투여 이후에 생존 결과를 상당히 개선시킬 수 있다.
본원에 기재된 임의의 면역원성 증강제는 본원에 기재된 임의의 재조합 벡터를 사용하여, 동일한 재조합 벡터에서 면역원성 증강제 및 표적 항원을 발현시킴으로써 표적 항원과 융합되거나 또는 연결될 수 있다.
이러한 면역원성 증강제를 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 22 - SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 - SEQ ID NO: 77, 및 SEQ ID NO: 93 - SEQ ID NO: 119 중 어느 하나일 수 있고 표 1 에 요약한다.
표 1 - 면역학적 융합 파트너의 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
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표 2 - 마이코박테리아 종-유래 Ra12 서열을 구축하기 위한 도구
Figure pct00017
일부 구현예에서, 표적 항원 및 면역학적 융합 파트너를 위한 핵산 서열은 임의의 핵산에 의해 분리되지 않는다. 다른 구현예에서, 링커를 인코딩하는 핵산 서열이 본원에 기재된 임의의 표적 항원을 인코딩하는 핵산 서열 및 본원에 기재된 임의의 면역학적 융합 파트너를 인코딩하는 핵산 서열 사이에 삽입될 수 있다. 따라서, 일정 구현예에서, 표적 항원, 링커, 및 면역학적 융합 파트너를 함유하는 바이러스 벡터로 면역화 이후에 생산되는 단백질은 관심 표적 항원과 그에 후속된 링커를 포함하고 면역학적 융합 파트너로 종결되는 융합 단백질일 수 있고, 따라서 링커를 통해서 관심 표적 항원의 면역원성을 증가시키는 면역학적 융합 파트너에 표적 항원이 연결된다. 일부 구현예에서, 링커 핵산의 서열은 약 1 내지 약 150 개 핵산 길이, 약 5 내지 약 100 개 핵산 길이, 또는 약 10 내지 약 50 개 핵산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 하나 이상의 아미노산 잔기를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커의 아미노산 서열은 약 1 내지 약 50 개, 또는 약 5 내지 약 25 개 아미노산 잔기의 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커의 서열은 10 개 미만의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리알라닌 링커, 폴리글리신 링커, 또는 알라닌과 글리신 둘 모두를 갖는 링커일 수 있다.
이러한 링커를 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 78 - SEQ ID NO: 92 중 어느 하나일 수 있고 표 3 에 요약한다.
표 3 - 링커의 서열
Figure pct00018
VI. 사용 방법
아데노바이러스 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 알파바이러스 표적 항원, 특히 치쿤구니아 바이러스 표적 항원에 대한 면역 반응을 생성시키기 위해 다수의 백신 상황에서 사용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 그들이 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에 대해 기존 면역성을 갖는 대상에서 면역 반응을 생성시키는데 사용될 수 있고 이전 세대 아데노바이러스 벡터를 사용하는 용법으로는 불가능한, 아데노바이러스 벡터를 사용하는 다수회의 면역화를 포함하는 백신접종 용법에서 사용될 수 있다는 발견으로 인해 특히 중요하다.
일반적으로, 면역 반응의 생성은 체액성 반응 및/또는 세포-매개 반응의 유도를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 관심 표적 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 것이 바람직하다. 그와 같이 "면역 반응의 생성" 또는 "면역 반응의 유도" 는 임의의 통계적으로 유의한 변화, 예를 들어, 하나 이상의 면역 세포 (T 세포, B 세포, 항원-제시 세포, 수지상 세포, 호중구 등) 의 수 또는 이들 면역 세포 중 하나 이상의 활성 (CTL 활성, HTL 활성, 사이토카인 분비, 사이토카인 분비 프로파일의 변화 등) 의 증가를 포함할 수 있다.
당업자는 면역 반응의 변경이 일어났는지 여부를 확인하기 위한 다수의 방법이 이용가능하다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 면역 반응 (예를 들어, 세포 수, 사이토카인 발현, 세포 활성) 의 변경을 검출하기 위한 여러 가지 방법이 당해 기술분야에 알려져 있고 본 발명의 문맥에서 유용하다. 예시적인 방법이 Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001 John Wiley & Sons, NY, NY); Ausubel et al. (2001 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY) 및 다른 곳에 기재되어 있다. 이러한 문맥에서 유용한 예시적인 방법은 세포내 사이토카인 염색 (ICS), ELISpot, 증식 어세이, 크롬 방출을 포함하는 세포독성 T 세포 어세이 또는 균등한 어세이, 및 임의의 수의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 을 사용하는 유전자 발현 분석 또는 RT-PCR 기반 어세이를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상에서의 약 1.5 내지 20 배 또는 그 이상, 적어도, 약, 또는 최대 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 그로부터 유래하는 임의의 범위 또는 수의 표적 항원-특이적 CTL 활성의 증가를 포함한다. 또다른 구현예에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상에서의 약 1.5 내지 20 배, 또는 그 이상의 표적-특이적 CTL 활성의 증가를 포함한다. 추가 구현예에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 약 1.5 내지 20 배, 또는 그 이상의, 사이토카인 분비, 예컨대 인터페론-감마 (IFN-γ), 인터류킨-2 (IL-2), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 그랜자임, 또는 기타 사이토카인을 측정하는 ELISpot 어세이에 의해 측정되는 표적 항원-특이적 세포 매개 면역성 활성의 증가를 포함한다.
추가 구현예에서, 면역 반응의 생성은 적당한 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상에서 1.5 내지 5 배의 표적-특이적 항체 생산의 증가를 포함한다. 또다른 구현예에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상에서 약 1.5 내지 20 배, 또는 그 이상의 표적-특이적 항체 생산의 증가를 포함한다.
따라서, 특정 양태는 관심의 알파바이러스 표적 항원에 대한 면역 반응의 생성 방법으로서, a) 복제 결함성 아데노바이러스 벡터로서, E2b 부위에 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터, 및 b) 표적 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 대상에게 투여하는 것; 및 아데노바이러스 벡터를 적어도 1 회 대상에게 재투여하는 것; 그에 의해 표적 항원에 대한 면역 반응을 생성하는 것을 포함하는 방법을 제공할 수 있다. 특정 기타 양태는 관심의 알파바이러스 표적 항원들에 대한 면역 반응의 생성 방법으로서, a) 복제 결함성 아데노바이러스 벡터로서, E2b 부위에 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터, 및 b) 표적 항원들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 대상에게 투여하는 것; 및 아데노바이러스 벡터를 적어도 1 회 대상에게 재투여하는 것; 그에 의해 표적 항원들에 대한 면역 반응을 생성하는 것을 포함하는 방법을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 투여되는 벡터가 거트 벡터가 아닌 방법이 제공될 수 있다.
추가의 구현예에서, 대상에서 알파바이러스 바이러스 표적 항원에 대한 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 대상이 Ad 에 대해 기존 면역성을 갖고, 방법이 a) 복제 결함성 아데노바이러스 벡터로서, E2b 부위에 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터, 및 b) 표적 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 대상에게 투여하는 것; 및 아데노바이러스 벡터를 적어도 1 회 대상에게 재투여하는 것; 그에 의해 알파바이러스 바이러스 표적 항원에 대한 면역 반응을 생성하는 것에 의하는 방법이 제공될 수 있다. 추가 구현예에서, 대상에서 알파바이러스 바이러스 표적 항원들에 대한 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 개체가 Ad 에 대해 기존 면역성을 갖고, 방법이 a) 복제 결함성 아데노바이러스 벡터로서, E2b 부위에 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터, 및 b) 표적 항원들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 대상에게 투여하는 것; 및 아데노바이러스 벡터를 적어도 1 회 대상에게 재투여하는 것; 그에 의해 알파바이러스 바이러스 표적 항원들에 대한 면역 반응을 생성하는 것에 의하는 방법이 제공될 수 있다.
Ad 에 대해 기존 면역성에 관하여, 이는 당해 기술분야에 알려진 방법, 예컨대 Ad 항체의 존재에 대해 시험하는 항체-기반 어세이를 사용하여 확인될 수 있다. 또한, 특정 구현예에서, 상기 방법은 먼저 개체가 Ad 에 대해 기존 면역성을 갖는지 여부를 확인하고, 그 후 본원에 기재된 바와 같은 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본원의 다른 곳에 기술된 것들과 같은 알파바이러스 표적 항원에 대한 면역 반응의 생성 방법이 제공될 수 있다.
특정 양태에서, 본원의 다른 곳에 기술된 것들과 같은 알파바이러스에 대한 면역 반응의 생성 방법이 제공될 수 있다.
VII. 약학 조성물
본원의 다른 곳에 언급된 바와 같이, 아데노바이러스 벡터는 감염원 (이에 대해 면역 반응이 생성될 것임) 중 임의의 하나 또는 그 이상으로부터의 하나 이상의 관심의 표적 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 항원은 바이러스 항원 단백질, 예컨대 E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, E1ALPHA, nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4 를 포함할 수 있으나 그에 제한되지 않는다.
투여를 위해, 아데노바이러스 벡터 스톡 (stock) 이 적당한 완충제, 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제 등과 조합될 수 있다. 특정 구현예에서, 적당한 수의 아데노바이러스 벡터 입자가 적당한 완충제, 예컨대, 멸균 PBS 중에 투여된다.
특정 상황에서, 본원에 개시된 아데노바이러스 벡터 조성물을 비경구, 정맥내, 근육내, 또는 심지어는 복강내 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 자유 염기 또는 약물학적으로 허용가능한 염으로서의 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로오스와 적합하게 혼합된 물 중에 제조될 수 있다. 분산물은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 그의 혼합물 중에 및 오일 중에 제조될 수 있다. 기타 구현예에서, E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는 삼켜서 또는 좌제에 의해 전달되는 알약 형태로 전달될 수 있다.
주사용 용도에 적합한 예시적인 약학 형태는 멸균 주사용 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 및 멸균 수성 용액 또는 분산물을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,466,468 호 참조). 그 형태는 멸균될 수 있고, 용이한 시린지이용성이 존재하는 정도로 유동성일 수 있다. 그것은 제조 및 저장 조건 하에서 안정적일 수 있고, 미생물, 예컨대 박테리아, 곰팡이, 및 진균의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해서, 분산물의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해서 및/또는 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔브산, 티머로살 등에 의해 촉진될 수 있다. 많은 경우에서, 그것은 등장화제, 예를 들어 당류 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용을 통해 일어날 수 있다.
일 구현예에서, 수성 용액 중 비경구 투여를 위해서, 용액은 필요하면 적합하게 완충될 것이고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염류 또는 포도당으로 등장성이 될 수 있다. 이들 특정한 수성 용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합할 수 있다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질이 본 개시물의 관점에서 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1 투여량을 1 mL 의 등장성 NaCl 용액에 용해시킬 수 있고 1000 mL 의 피하주입 유체에 첨가하거나 또는 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 페이지 1035-1038 및 1570-1580] 참조). 투여량 중 일부 변동은 치료하려는 대상의 병태에 따라서 필수적으로 일어날 것이다. 게다가, 인간 투여의 경우, 조제물은 FDA 생물학 표준 사무국이 요구하는 멸균성, 발열원성, 및 일반 안정성 및 순도 표준을 충족시킬 필요가 있을 수 있다.
담체는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 추가로 포함할 수 있다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 통상의 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성이 아닌 경우를 제외하고, 치료적 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 성분이 또한 조성물에 도입될 수 있다. 어구 "약학적으로 허용가능한" 은 인간에게 투여될 때 알레르기 또는 유사하게 곤란한 반응을 일으키지 않는 분자 독립체 및 조성물을 의미할 수 있다.
본원에 기재된 치료적 조성물의 투여의 경로 및 빈도를 비롯하여 투여량은 개체 마다, 질환마다 다양할 것이고, 표준 기술을 사용해 쉽게 확립할 수 있다. 일반적으로, 약학 조성물 및 백신은 주사 (예를 들어, 피내, 복강내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내 (예를 들어, 흡입), 알약 형태 (예를 들어, 삼킴, 질 또는 직장 전달용 좌제) 로 투여될 수 있다. 일정 구현예에서, 1 내지 3 용량이 6주 기간 동안 투여될 수 있고 추가의 부스터 백신접종은 그 이후에 주기적으로 제공될 수 있다.
다양한 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 본원에 기재된 면역 반응을 생성하는데 적합한 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x108 바이러스 입자 내지 약 5x1013 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 경우에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x109 내지 약 5x1012 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x108 바이러스 입자 내지 약 5x108 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 5x108 바이러스 입자 내지 약 1x109 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x109 바이러스 입자 내지 약 5x109 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 5x109 바이러스 입자 내지 약 1x1010 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1010 바이러스 입자 내지 약 5x1010 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 5x1010 바이러스 입자 내지 약 1x1011 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1011 바이러스 입자 내지 약 5x1011 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 5x1011 바이러스 입자 내지 약 1x1012 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1012 바이러스 입자 내지 약 5x1012 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 5x1012 바이러스 입자 내지 약 1x1013 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1013 바이러스 입자 내지 약 5x1013 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x108 바이러스 입자 내지 약 5x1010 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1010 바이러스 입자 내지 약 5x1012 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1011 바이러스 입자 내지 약 5x1013 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x108 바이러스 입자 내지 약 1x1010 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1010 바이러스 입자 내지 약 1x1012 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 약 1x1011 바이러스 입자 내지 약 5x1013 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 일부 경우에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.5x1012, 2x1012, 3x1012, 또는 그 이상의 바이러스 입자 (VP) 와 동일하거나 또는 그를 초과하는 용량으로 투여된다. 일부 경우에서, 복제 결함성 아데노바이러스는 면역화 당 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.5x1012, 2x1012, 3x1012, 또는 그 이상의 바이러스 입자와 같거나 또는 그 미만인 용량으로 투여된다. 다양한 구현예에서, 본 명세서에서 바람직한 용량은 제제 완충액의 적합한 부피, 예를 들어 약 0.1-10 mL, 0.2-8mL, 0.3-7mL, 0.4-6 mL, 0.5-5 mL, 0.6-4 mL, 0.7-3 mL, 0.8-2 mL, 0.9-1.5 mL, 0.95-1.2 mL, 또는 1.0-1.1 mL 의 부피로 투여된다. 당업자는 부피가 임의의 이들 값에 의해 제한되는 임의 범위 내에 속할 수 있다는 것을 이해한다 (예를 들어, 약 0.5 mL 내지 약 1.1 mL)
적합한 용량은 상기 기술된 바와 같이 투여시, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 표적 항원 면역 반응을 촉진할 수 있는 아데노바이러스 벡터의 양일 수 있다. 일정 구현예에서, 면역 반응은 기준 (즉, 미처리) 수준보다 적어도 10-50% 초과이다. 이러한 반응은 환자에서 표적 항원 항체를 측정하거나 또는 시험관내에서 알파바이러스 감염된 세포를 사멸시킬 수 있는 세포용해성 이펙터 세포의 백신-의존적 생성에 의해서, 또는 면역 반응을 모니터링하기 위해 당분야에 공지된 다른 방법에 의해서 모니터링될 수 있다.
일반적으로, 적절한 투여량 용법은 예방적 이득을 제공하기에 충분한 양으로 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 보호성 면역 반응은 일반적으로 면역화 (백신접종) 이전 및 이후에 환자로부터 수득된 샘플을 사용하여 수행될 수 있는 표준 증식, 세포독성 또는 사이토카인 어세이를 사용하여 평가될 수 있다.
하나의 장점이 특히 Ad 에 대한 기존 면역성을 갖는 개체에서, 동일한 아데노바이러스 벡터로 다수의 백신접종을 투여하는 능력인 한편, 아데노바이러스 백신은 또한 프라임 및 부스트 용법의 일부로서 투여될 수도 있다. 혼합 양식 프라임 및 부스터 접종 계획은 증강된 면역 반응을 야기할 수 있다.
따라서, 일 양상은 관심의 표적 항원을 포함하는 플라스미드 벡터와 같은 플라스미드 백신을 사용하여, 적어도 1회 플라스미드 백신을 투여함으로써, 대상을 프라이밍시키고, 사전정해진 시간 길이가 지나게 하고 나서, 아데노바이러스 벡터를 투여하여 부스팅시키는 방법이다. 다중 프라이밍, 예를 들어, 1-3 회가 이용될 수 있지만, 그 이상이 사용될 수 있다. 프라이밍과 부스트 사이의 시간 길이는 약 6 개월 내지 1 년으로 다를 수 있지만, 다른 시간 기간이 사용될 수도 있다.
VIII. 키트
본원에 기재된 조성물, 면역요법 또는 백신은 키트의 형태로 공급될 수 있다. 본 개시물의 키트는 용량 및 또는 투여 용법 정보에 관한 지시서를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 백신을 제공하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서 키트는 키트 성분을 투여하는데 유용한 성분 및 성분을 제조하는 방법에 관한 지시서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 적절한 실험실 검사에 의한 백신접종 이전 및 이후에 환자의 모니터링을 수행하거나, 또는 결과 및 환자 데이타를 의료진과 통신하기 위한 소프트웨어를 추가로 포함할 수 있다.
키트의 성분은 건조 형태이거나 또는 액체 형태일 수 있다. 그들이 건조 형태인 경우, 키트는 건조된 재료를 용해시키기 위한 용액을 포함할 수 있다. 키트는 또한 액체 또는 건조 형태의 전달 인자를 포함할 수 있다. 전달 인자가 건조 형태인 경우에, 키트는 전달 인자를 용해시키기 위한 용액을 포함한다. 키트는 또한 성분을 혼합하고 제조하기 위한 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 예를 들어 바늘, 튜빙, 도포기, 흡입기, 시린지, 파이펫, 포셉, 계량 스푼, 점안기 또는 임의의 이러한 의학적으로 승인된 전달 비히클과 같은 투여의 보조를 위한 장비를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술되는 키트 또는 약물 전달 시스템은 또한 상업적 판매 및 유통을 위해 밀폐된 구획에 본 개시물의 조성물을 함유하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
상기에 기술된 다양한 구현예는 추가 구현예를 제공하도록 조합될 수 있다. 본 명세서에서 인용되고/되거나 출원 데이타 시트에서 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개물, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 공개물은 각각의 개별 공개물, 특허 또는 특허 출원이 특별히 개별적으로 참조로 편입된다고 표시된 바와 동일한 정도로 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
구현예의 양상은 필요하다면 추가의 구현예를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공개물의 개념을 적용하도록 변형될 수 있다.
이들 및 다른 변화는 상기 상술한 설명의 관점에서 구현예에 대해 이루어질 수 있다. 대체로, 하기 청구항에서, 사용된 용어는 명세서 및 청구항에 개시된 특별한 구현예로 청구항을 제한하는 것으로 해석되어서는 안되지만, 이러한 청구항이 부여하는 균등물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 구현예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구항은 본 개시물에 의해 한정되지 않는다.
실시예
하기 실시예는 본 개시물의 일부 양태를 추가로 설명하기 위해 포함되고, 본 개시물의 범위를 제한하기 위해 사용되어서는 안된다.
실시예 1
단일-표적화 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKV 백신의 생산
이 실시예는 CHIKV 항원을 함유하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 구축 및 발현의 결과를 설명한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKV 백신은 E1, E2b, 및 E3 유전자 부위의 제거, 및 CHIKV 유전자의 삽입에 의해 변형된 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 벡터이다.
이 실시예에서, 상동 재조합-기반 접근법을 사용하여 CHIKV 구조 단백질 C, E3, E2, 6K, 및 E1 을 포함하는 CHIKV 구조 다단백질을 인코딩하는 핵산 서열 (아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2 에 제시되어 있다) 을 Ad5 [E1-, E2b-]-기반 플랫폼 내로 클로닝하여 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKVstr 를 생산했다.
Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKVstr 를 E.C7 세포에서 생산했다 (도 2). 복제-결핍성 바이러스를 E.C7 패키징 세포주에서 증식시키고, 초원심분리 또는 이온 교환 칼럼 정제에 의해 정제하고, 적정했다. 바이러스 감염 역가를 E.C7 세포 단층 상에서 플라크-형성 단위 (PFU) 로서 확인했다. VP 농도를 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 파괴 및 260 nm 및 280 nm 에서의 분광광도측정법에 의해 확인했다.
Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKVstr 에 의한 E.C7 세포의 감염은 CHIKV 구조 단백질의 발현을 초래했다. CHIKV 구조 단백질 발현은 항-CHIKV 항체를 이용하는 웨스턴 블롯에 의해 검출가능했다 (도 3).
실시예 2
Ad5 [E1-, E2b-]- CHIKV str 의 다중 주입은 CHIKV-감염에 대해 보호성 면역성을 생성했다
이 실시예는 CHIKV 감염에 대해 보호성 면역성을 생성하기 위한 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKVstr 의 주입의 결과를 설명한다.
열 마리 (10) 마우스의 군을 각각 1 주 간격으로 2 회 109 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKVstr 의 용량으로 피하 면역화했다. 대조군 마우스에게 PBS 를 주입했다. 마우스를 그 후 발바닥 내로 바이러스의 주입에 의해 치사 용량의 CHIKV 로 챌린지했다. 대조군 마우스는 7 일 내에 감염에 굴복했고 (도 4A), 중량을 손실했고 (도 4B), 발바닥에서 지속된 염증을 보였다 (도 4C). 이와 대조적으로, 백신접종된 마우스는 CHIKV 감염에서 살아남았고 (도 4A), 중량을 손실하지 않았고 (도 4B), 발바닥 염증의 신속한 해결을 보였다 (도 4C).
실시예 3
다중-표적화 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIKV 항원 삽입물의 생산
이 실시예는 다중 CHIKV 항원을 함유하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 구축을 설명한다.
다중 CHIKV 유전자를 함유하는 Ad5 [E1-, E2b-] 를 생산하기 위해서, 3 개의 개별 알파바이러스 항원 유전자 서열 ((1) C, E3, E2, 6K, 및 E1 유전자 ((SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 7567-11313); (2) NS 유전자 1; (3) NS 유전자 2) 을 각각 돼지 테스코바이러스-1 및 토세아 아시그나 바이러스에서 유래하는 "자가-절단" 2A 펩티드에 의해 분리한다 (도 5A) (de Felipe P and Ryan M Traffic 2004 5(8), 616-26; Holst J et al. Nature Immunol. 2008 9 :658-66 ; Kim JH et al. PloS One, 2011 6(4), e18556. Doi :10.1371/journal.pone.0018556). 2A 펩티드는 리보솜에서 번역되므로, 2A 펩티드의 마지막 2 개의 잔기 사이의 펩티드 결합은 절대로 형성되지 않아서, 1 회의 리보솜 통과 (one ribosomal pass) 에서 구별되게 발현되는 단백질을 초래한다 (도 5B). 3 개의 유전자를 분리하는 2 개의 2A 펩티드 서열의 사용은 3 개의 단백질의 근사 화학량론적 발현에서 발견된다 (도 5B).
실시예 4
단일-표적화 Ad5 [E1-, E2b-]-ONNV 백신의 생산 및 시험
이 실시예는 ONNV 항원을 함유하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 구축, 및 벡터의 다중 주입에 의한 발현 및 보호성 면역성에 관한 시험을 설명한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-ONNVstr 백신은 E1, E2b, 및 E3 유전자 부위의 제거, 및 상동 재조합-기반 접근법을 사용하는 ONNV 구조 다단백질을 인코딩하는 핵산 서열 (아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5 에 제시되어 있다) 의 삽입에 의해 변형된 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 벡터이다.
Ad5 [E1-, E2b-]-ONNVstr 를 E.C7 세포에서 생산한다. 복제-결핍성 바이러스를 E.C7 패키징 세포주에서 증식시키고, 초원심분리 또는 이온 교환 칼럼 정제에 의해 정제하고, 적정한다. 바이러스 감염 역가를 E.C7 세포 단층 상에서 플라크-형성 단위 (PFU) 로서 확인한다. VP 농도를 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 파괴 및 260 nm 및 280 nm 에서의 분광광도측정법에 의해 확인한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-ONNVstr 에 의한 E.C7 세포의 감염의 결과로서 ONNV 구조 단백질이 발현된다. ONNV 구조 단백질 발현을 항-ONNV 항체를 이용하는 웨스턴 블롯에 의해 검출한다.
열 마리 (10) 마우스의 군을 각각 1 주 간격으로 2 회 109 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-ONNVstr 의 용량으로 피하 면역화한다. 대조군 마우스에게 PBS 또는 109 VP 의 Ad5-null 을 주입한다. 마우스를 그 후 바이러스의 주입에 의해 치사 용량의 ONNV 로 챌린지한다. 백신을 주입한 마우스와 대조군 사이에서 생존율, 면역 반응, 및 중량을 비교한다.
실시예 5
단일-표적화 Ad5 [E1-, E2b-]-MAYV 백신의 생산 및 시험
이 실시예는 MAYV 항원을 함유하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 구축 및 벡터의 다중 주입에 의한 발현 및 보호성 면역성에 관한 시험을 설명한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-MAYVstr 백신은 E1, E2b, 및 E3 유전자 부위의 제거, 및 상동 재조합-기반 접근법을 사용하는 MAYV 구조 다단백질을 인코딩하는 핵산 서열 (아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8 에 제시되어 있다) 의 삽입에 의해 변형된 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 벡터이다.
Ad5 [E1-, E2b-]-MAYVstr 를 E.C7 세포에서 생산한다. 복제-결핍성 바이러스를 E.C7 패키징 세포주에서 증식시키고, 초원심분리 또는 이온 교환 칼럼 정제에 의해 정제하고, 적정한다. 바이러스 감염 역가를 E.C7 세포 단층 상에서 플라크-형성 단위 (PFU) 로서 확인한다. VP 농도를 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 파괴 및 260 nm 및 280 nm 에서의 분광광도측정법에 의해 확인한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-MAYVstr 에 의한 E.C7 세포의 감염의 결과로서 MAYV 구조 단백질이 발현된다. MAYV 구조 단백질 발현을 항-MAYV 항체를 이용하는 웨스턴 블롯에 의해 검출한다.
열 마리 (10) 마우스의 군을 각각 1 주 간격으로 2 회 109 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-MAYVstr 의 용량으로 피하 면역화한다. 대조군 마우스에게 PBS 또는 109 VP 의 Ad5-null 을 주입한다. 마우스를 그 후 바이러스의 주입에 의해 치사 용량의 MAYV 로 챌린지한다. 백신을 주입한 마우스와 대조군 사이에서 생존율, 면역 반응, 및 중량을 비교한다.
실시예 6
단일-표적화 Ad5 [E1-, E2b-]-RRV 백신의 생산 및 시험
이 실시예는 RRV 항원을 함유하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 구축 및 벡터의 다중 주입에 의한 발현 및 보호성 면역성에 관한 시험을 설명한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-RRVstr 백신은 E1, E2b, 및 E3 유전자 부위의 제거, 및 상동 재조합-기반 접근법을 사용하는 RRV 구조 다단백질을 인코딩하는 핵산 서열 (아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11 에 제시되어 있다) 의 삽입에 의해 변형된 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 벡터이다.
Ad5 [E1-, E2b-]-RRVstr 를 E.C7 세포에서 생산한다. 복제-결핍성 바이러스를 E.C7 패키징 세포주에서 증식시키고, 초원심분리 또는 이온 교환 칼럼 정제에 의해 정제하고, 적정한다. 바이러스 감염 역가를 E.C7 세포 단층 상에서 플라크-형성 단위 (PFU) 로서 확인한다. VP 농도를 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 파괴 및 260 nm 및 280 nm 에서의 분광광도측정법에 의해 확인한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-RRVstr 에 의한 E.C7 세포의 감염의 결과로서 RRV 구조 단백질이 발현된다. RRV 구조 단백질 발현을 항-RRV 항체를 이용하는 웨스턴 블롯에 의해 검출한다.
열 마리 (10) 마우스의 군을 각각 1 주 간격으로 2 회 109 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-RRVstr 의 용량으로 피하 면역화한다. 대조군 마우스에게 PBS 또는 109 VP 의 Ad5-null 을 주입한다. 마우스를 그 후 바이러스의 주입에 의해 치사 용량의 RRV 로 챌린지한다. 백신을 주입한 마우스와 대조군 사이에서 생존율, 면역 반응, 및 중량을 비교한다.
실시예 7
단일-표적화 Ad5 [E1-, E2b-]-VEEV 백신의 생산 및 시험
이 실시예는 VEEV 항원을 함유하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 구축 및 벡터의 다중 주입에 의한 발현 및 보호성 면역성에 관한 시험을 설명한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-VEEVstr 백신은 E1, E2b, 및 E3 유전자 부위의 제거, 및 상동 재조합-기반 접근법을 사용하는 VEEV 구조 다단백질을 인코딩하는 핵산 서열 (아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14 에 제시되어 있다) 의 삽입에 의해 변형된 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 벡터이다.
Ad5 [E1-, E2b-]-VEEVstr 를 E.C7 세포에서 생산한다. 복제-결핍성 바이러스를 E.C7 패키징 세포주에서 증식시키고, 초원심분리 또는 이온 교환 칼럼 정제에 의해 정제하고, 적정한다. 바이러스 감염 역가를 E.C7 세포 단층 상에서 플라크-형성 단위 (PFU) 로서 확인한다. VP 농도를 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 파괴 및 260 nm 및 280 nm 에서의 분광광도측정법에 의해 확인한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-VEEVstr 에 의한 E.C7 세포의 감염의 결과로서 VEEV 구조 단백질이 발현된다. VEEV 구조 단백질 발현을 항-VEEV 항체를 이용하는 웨스턴 블롯에 의해 검출한다.
열 마리 (10) 마우스의 군을 각각 1 주 간격으로 2 회 109 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-VEEVstr 의 용량으로 피하 면역화한다. 대조군 마우스에게 PBS 또는 109 VP 의 Ad5-null 을 주입한다. 마우스를 그 후 바이러스의 주입에 의해 치사 용량의 VEEV 로 챌린지한다. 백신을 주입한 마우스와 대조군 사이에서 생존율, 면역 반응, 및 중량을 비교한다.
실시예 8
단일-표적화 Ad5 [E1-, E2b-]-EEEV 백신의 생산 및 시험
이 실시예는 EEEV 항원을 함유하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 구축 및 벡터의 다중 주입에 의한 발현 및 보호성 면역성에 관한 시험을 설명한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-EEEVstr 백신은 E1, E2b, 및 E3 유전자 부위의 제거, 및 상동 재조합-기반 접근법을 사용하는 EEEV 구조 다단백질을 인코딩하는 핵산 서열 (아미노산 서열은 SEQ ID NO: 17 에 제시되어 있다) 의 삽입에 의해 변형된 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 벡터이다.
Ad5 [E1-, E2b-]-EEEVstr 를 E.C7 세포에서 생산한다. 복제-결핍성 바이러스를 E.C7 패키징 세포주에서 증식시키고, 초원심분리 또는 이온 교환 칼럼 정제에 의해 정제하고, 적정한다. 바이러스 감염 역가를 E.C7 세포 단층 상에서 플라크-형성 단위 (PFU) 로서 확인한다. VP 농도를 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 파괴 및 260 nm 및 280 nm 에서의 분광광도측정법에 의해 확인한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-EEEVstr 에 의한 E.C7 세포의 감염의 결과로서 EEEV 구조 단백질이 발현된다. EEEV 구조 단백질 발현을 항-EEEV 항체를 이용하는 웨스턴 블롯에 의해 검출한다.
열 마리 (10) 마우스의 군을 각각 1 주 간격으로 2 회 109 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-EEEVstr 의 용량으로 피하 면역화한다. 대조군 마우스에게 PBS 또는 109 VP 의 Ad5-null 을 주입한다. 마우스를 그 후 바이러스의 주입에 의해 치사 용량의 EEEV 로 챌린지한다. 백신을 주입한 마우스와 대조군 사이에서 생존율, 면역 반응, 및 중량을 비교한다.
실시예 9
단일-표적화 Ad5 [E1-, E2b-]-WEEV 백신의 생산 및 시험
이 실시예는 WEEV 항원을 함유하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 구축 및 벡터의 다중 주입에 의한 발현 및 보호성 면역성에 관한 시험을 설명한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-WEEVstr 백신은 E1, E2b, 및 E3 유전자 부위의 제거, 및 상동 재조합-기반 접근법을 사용하는 WEEV 구조 다단백질을 인코딩하는 핵산 서열 (아미노산 서열은 SEQ ID NO: 20 에 제시되어 있다) 의 삽입에 의해 변형된 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 벡터이다.
Ad5 [E1-, E2b-]-WEEVstr 를 E.C7 세포에서 생산한다. 복제-결핍성 바이러스를 E.C7 패키징 세포주에서 증식시키고, 초원심분리 또는 이온 교환 칼럼 정제에 의해 정제하고, 적정한다. 바이러스 감염 역가를 E.C7 세포 단층 상에서 플라크-형성 단위 (PFU) 로서 확인한다. VP 농도를 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 파괴 및 260 nm 및 280 nm 에서의 분광광도측정법에 의해 확인한다.
Ad5 [E1-, E2b-]-WEEVstr 에 의한 E.C7 세포의 감염의 결과로서 WEEV 구조 단백질이 발현된다. WEEV 구조 단백질 발현을 항-WEEV 항체를 이용하는 웨스턴 블롯에 의해 검출한다.
열 마리 (10) 마우스의 군을 각각 1 주 간격으로 2 회 109 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-WEEVstr 의 용량으로 피하 면역화한다. 대조군 마우스에게 PBS 또는 109 VP 의 Ad5-null 을 주입한다. 마우스를 그 후 바이러스의 주입에 의해 치사 용량의 WEEV 로 챌린지한다. 백신을 주입한 마우스와 대조군 사이에서 생존율, 면역 반응, 및 중량을 비교한다.
실시예 10
마우스에서의 Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신의 전임상 연구
이 실시예는 세포 매개 면역 (CMI) 반응, 세포용해 T 림프구 (CTL) 반응, 세포내 사이토카인 발현, 및 항체 분비의 평가를 포함하는, 마우스에서의 Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신의 전임상 연구를 설명한다. 전임상 연구는 마우스에서의 Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신의 투여, 대조군과의 비교, 및 면역 반응의 평가를 포함했다.
Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신의 전임상 평가
CMI 및 CTL 반응. 마우스에서의 CMI 및 CTL 반응을 효소 결합 면역점 (ELISPOT) 어세이에 의해 평가했다. 도 6 은 ELISpot 어세이를 사용하는 면역화된 또는 대조군 마우스로부터의 비장세포에서의 CMI 반응 (IFN-γ) 및 CTL 반응 및 그랜자임 B 반응을 설명한다. C57BL/6 마우스를 1x1010 VP 의 SEQ ID NO: 1 을 포함하는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 백신으로 또는 1X1010 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-null (빈 벡터 대조군) 으로 2-주 간격으로 2 회 면역화했다. 마지막 면역화 후 1 주에, 개별 마우스로부터의 비장세포를 치쿤구니아 바이러스 펩티드에 세포를 노출시킨 후의 면역 반응의 유도에 관해 시험했다. 데이타는 치쿤구니아 바이러스 펩티드의 3 개의 별개의 풀에 노출시킨 후에 106 개 비장세포 당 스팟 형성 세포 (SFC) 의 누적수를 보여준다 (치쿤구니아에 관한 펩티드 수는 어세이에서 사용하는 3 개의 별개의 풀로 분배할 수 있을 정도로 충분히 컸다 - CHIKV 펩티드 풀 1 은 펩티드 1-103 을 포함하고, CHIKV 펩티드 풀 2 는 펩티드 104-207 을 포함하고, 펩티드 풀 3 은 펩티드 208-310 을 포함한다). 부가적 비장세포를 어세이 측정 전에 음성 대조군으로서의 SIV-nef 펩티드 풀에 별개로 노출시켰다. 도 6A 는 ELISpot 어세이를 사용하여 IFN-γ 분비 SFC 에 의해 측정되는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 면역화된 및 대조군 C57BL/6 마우스에서의 CMI 반응을 설명한다. 반응의 특이성은 음성 대조군 SIV-nef 펩티드 풀에 대한 비장세포의 반응성의 결여에 의해 입증된다. 대조군 마우스와 비교하여 많은 수의 IFN-γ 분비 SFC 가 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 면역화된 마우스에서 유도되었다. 도 6B 는 ELISpot 어세이를 사용하여 그랜자임 B (GR-B) 분비 SFC 에 의해 측정되는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 면역화된 및 대조군 C57BL/6 마우스에서의 CTL 반응을 설명한다. 반응의 특이성은 음성 대조군 SIV-nef 펩티드 풀에 대한 비장세포의 반응성의 결여에 의해 입증된다. 대조군 마우스와 비교하여 많은 수의 그랜자임 B 분비 SFC 가 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 면역화된 마우스에서 유도되었다.
세포내 사이토카인 발현. 흐름 세포측정법 분석은 세포내 사이토카인 발현을 평가하여 측정되는 림프구 활성화의 수준을 드러냈다. 도 7 은 흐름 세포측정법에 의해 분석되는 IFN-γ 또는 IFN-γ/TNF-α 의 세포내 발현에 의해 측정되는 면역화된 또는 대조군 C57BL/6 마우스로부터의 비장세포에서의 림프구 활성화를 설명한다. C57BL/6 마우스를 1x1010 VP 의 SEQ ID NO: 1 을 포함하는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 백신으로 또는 1x1010 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-null (빈 벡터 대조군) 으로 2-주 간격으로 2 회 면역화했다. 마지막 면역화 후 1 주에, 개별 마우스로부터의 비장세포를 치쿤구니아 바이러스 펩티드의 3 개의 별개의 풀에 노출시켰고 (치쿤구니아에 관한 펩티드 수는 어세이에서 사용하는 3 개의 별개의 풀로 분배할 수 있을 정도로 충분히 컸다 - CHIKV 펩티드 풀 1 은 펩티드 1-103 을 포함하고, CHIKV 펩티드 풀 2 는 펩티드 104-207 을 포함하고, 펩티드 풀 3 은 펩티드 208-310 을 포함한다), 세포내 사이토카인 발현의 유도에 관해 흐름 세포측정법에 의해 분석했다. 도 7A 는 면역화된 마우스 및 대조군 마우스로부터의 비장세포를 치쿤구니아 바이러스 펩티드의 3 개의 별개의 풀 및 대조군 (배지 및 SIV-nef 펩티드 풀) 에 노출시킨 후에 CD8+ 비장세포에서의 IFN-γ 의 세포내 발현의 흐름 세포측정법 분석에 의해 측정되는 림프구 활성화를 설명한다. 음성 대조군과 비교할 때 더 높은 백분율의 면역화된 마우스로부터의 CD8+ 비장세포가 IFN-γ 를 세포내 발현했다. 도 7B 는 면역화된 마우스 및 대조군 마우스로부터의 비장세포를 치쿤구니아 바이러스 펩티드의 3 개의 별개의 풀 및 대조군 (배지 및 SIV-nef 펩티드 풀) 에 노출시킨 후에 CD4+ 비장세포에서의 IFN-γ 의 세포내 발현의 흐름 세포측정법 분석에 의해 측정되는 림프구 활성화를 설명한다. 음성 대조군과 비교할 때 더 높은 백분율의 면역화된 마우스로부터의 CD4+ 비장세포가 IFN-γ 를 세포내 발현했다. 도 7C 는 면역화된 마우스 및 대조군 마우스로부터의 비장세포를 치쿤구니아 바이러스 펩티드의 3 개의 별개의 풀 및 대조군 (배지 및 SIV-nef 펩티드 풀) 에 노출시킨 후에 CD8+ 비장세포에서의 IFN-γ 및 TNF-α 의 세포내 발현의 흐름 세포측정법 분석에 의해 측정되는 림프구 활성화를 설명한다. 음성 대조군과 비교할 때 더 높은 백분율의 면역화된 마우스로부터의 CD8+ 비장세포가 IFN-γ 및 TNF-α 를 세포내 발현했다. 도 7D 는 면역화된 마우스 및 대조군 마우스로부터의 비장세포를 치쿤구니아 바이러스 펩티드의 3 개의 별개의 풀 및 대조군 (배지 및 SIV-nef 펩티드 풀) 에 노출시킨 후에 CD4+ 비장세포에서의 IFN-γ 및 TNF-α 의 세포내 발현의 흐름 세포측정법 분석에 의해 측정되는 림프구 활성화를 설명한다. 음성 대조군과 비교할 때 더 높은 백분율의 면역화된 마우스로부터의 CD4+ 비장세포가 IFN-γ 및 TNF-α 를 세포내 발현했다.
항원-특이적 항체 생산. 면역화된 마우스의 혈청에서 효소 결합 면역흡착 어세이 (ELISA) 에 의해 치쿤구니아-특이적 IgG 항체를 측정했다. 도 8 은 정량적 효소 결합 면역흡착 어세이 (ELISA) 에 의해 측정되는 대조군 마우스와 비교하여 면역화된 마우스에서의 항-치쿤구니아 외피 단백질-2 항체 반응을 설명한다. C57BL/6 마우스를 1x1010 VP 의 SEQ ID NO: 1 을 포함하는 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 백신으로 또는 1x1010 VP 의 Ad5 [E1-, E2b-]-null (빈 벡터 대조군) 으로 2-주 간격으로 2 회 면역화했다. 마지막 면역화 후 1 주에, 마우스로부터의 혈청을 항체 반응의 유도에 관해 평가했다. 혈액을 마취 하에 볼살 열상에 의해 수집했다. 대조군 마우스와 비교하여 면역화된 마우스에서 항-치쿤구니아 특이적 항체 반응이 더 높은 수준으로 유도되었다.
실시예 11
Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신에 의한 치쿤구니아 감염의 방지
이 실시예는 치쿤구니아 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 3) 중 어느 하나, 또는 그의 임의의 조합이 아데노바이러스 벡터 내에 삽입된 Ad5 [E1-, E2b-] 을 포함하는 본 개시물의 임의의 Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신에 의한 예방에 의하는 치쿤구니아 감염의 방지를 설명한다. Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신을 단일-표적화 치쿤구니아 백신의 경우에 실시예 1 에 기재된 바와 같이 구축하거나 또는 다중-표적화 치쿤구니아 백신의 경우에 실시예 3 에 기재된 바와 같이 구축한다. Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신을 대상에게 피하, 피부내, 또는 근육내 1 회 또는 2 주 마다 총 2 회 면역화로 투여한다. Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신에 의한 대상의 면역화 후에 치쿤구니아 바이러스에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 및 치쿤구니아 바이러스에 의한 감염에 대한 보호가 유도된다. 다시 말하면, Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신에 의한 예방에 의하는 면역성이 대상에게 부여된다. 대상은 인간, 비-인간 영장류, 또는 임의의 기타 비-인간 동물을 포함하는 임의의 동물이다.
실시예 12
Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신 및 공동자극 분자에 의한 치쿤구니아 감염의 방지
이 실시예는 본원에 기재된 임의의 공동자극 분자와의 조합으로 치쿤구니아 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 3) 중 어느 하나, 또는 그의 임의의 조합이 아데노바이러스 벡터 내에 삽입된 Ad5 [E1-, E2b-] 을 포함하는 본 개시물의 임의의 Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신에 의한 예방에 의하는 치쿤구니아 감염의 방지를 설명한다. Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신을 단일-표적화 치쿤구니아 백신의 경우에 실시예 1 에 기재된 바와 같이 구축하거나 또는 다중-표적화 치쿤구니아 백신의 경우에 실시예 3 에 기재된 바와 같이 구축한다. Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신을 대상에게 피하, 피부내, 또는 근육내 1 회 또는 2 주 마다 총 2 회 면역화로 투여한다. Ad 백신을 백신 제형과 혼합된 톨-유사 수용체 (TLR) 작동제와 같은 공동자극 분자와 동시투여한다. Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신 및 공동자극 분자의 조합에 의한 대상의 면역화 후에 치쿤구니아 바이러스에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 및 치쿤구니아 바이러스에 의한 감염에 대한 보호가 유도된다. 다시 말하면, Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신 및 공동자극 분자에 의한 예방에 의하는 면역성이 대상에게 부여된다.
실시예 13
Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신 및 면역학적 융합 파트너에 의한 치쿤구니아 감염의 방지
이 실시예는 치쿤구니아 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 3) 중 어느 하나, 또는 그의 임의의 조합이 아데노바이러스 벡터 내에 삽입된 뿐만 아니라 또한 본원에 기재된 임의의 면역학적 융합 파트너가 아데노바이러스 벡터에 의해 인코딩되는 Ad5 [E1-, E2b-] 을 포함하는 본 개시물의 임의의 Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 백신에 의한 예방에 의하는 치쿤구니아 감염의 방지를 설명한다. Ad5 [E1-, E2b-]-CHIK 백신을 단일-표적화 치쿤구니아 백신의 경우에 실시예 1 에 기재된 바와 같이 구축하거나 또는 다중-표적화 치쿤구니아 백신의 경우에 실시예 3 에 기재된 바와 같이 구축하며 Ad 벡터가 본원에 개시된 임의의 면역학적 융합 파트너에 대해 부가적으로 인코딩하도록 한다. Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신을 대상에게 피하, 피부내, 또는 근육내 1 회 또는 2 주 마다 총 2 회 면역화로 투여한다. 면역학적 융합 파트너를 포함하는 백신을 피하, 피부내, 또는 근육내 투여한다. Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신-면역학적 융합 파트너 및 공동자극 분자에 의한 대상의 면역화 후에 치쿤구니아 바이러스에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 및 치쿤구니아 바이러스에 의한 감염에 대한 보호가 유도된다. 다시 말하면, Ad5 [E1-, E2b-]-치쿤구니아 백신-면역학적 융합 파트너에 의한 예방에 의하는 면역성이 대상에게 부여된다. 대상은 인간, 비-인간 영장류, 또는 임의의 기타 비-인간 동물을 포함하는 임의의 동물이다.
실시예 14
Ad5 [E1-, E2b-]-오니옹니옹 바이러스 (ONNV) 백신에 의한 오니옹니옹 바이러스 감염의 방지
이 실시예는 ONNV 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 6) 중 어느 하나, 또는 그의 임의의 조합이 아데노바이러스 벡터 내에 삽입된 Ad5 [E1-, E2b-] 을 포함하는 본 개시물의 임의의 Ad5 [E1-, E2b-]- ONNV 백신에 의한 예방에 의하는 오니옹니옹 바이러스 (ONNV) 감염의 방지를 설명한다. Ad5 [E1-, E2b-]-ONNV 백신을 단일-표적화 ONNV 백신의 경우에 실시예 1 로부터 적합하게 조정하여 또는 실시예 4 에 기재된 바와 같이 구축하거나 또는 다중-표적화 ONNV 백신의 경우에 실시예 3 으로부터 적합하게 조정하여 구축한다. Ad5 [E1-, E2b-]-ONNV 백신을 대상에게 피하, 피부내, 또는 근육내 1 회 또는 2 주 마다 총 2 회 면역화로 투여한다. Ad5 [E1-, E2b-]-ONNV 백신에 의한 대상의 면역화 후에 ONNV 바이러스에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 및 ONNV 바이러스에 의한 감염에 대한 보호가 유도된다. 다시 말하면, Ad5 [E1-, E2b-]-ONNV 백신에 의한 예방에 의하는 면역성이 대상에게 부여된다. 대상은 인간, 비-인간 영장류, 또는 임의의 기타 비-인간 동물을 포함하는 임의의 동물이다.
실시예 15
Ad5 [E1-, E2b-]-로스 리버 바이러스 (RRV) 백신에 의한 로스 리버 바이러스 감염의 방지
이 실시예는 RRV 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 10 - SEQ ID NO: 12) 중 어느 하나, 또는 그의 임의의 조합이 아데노바이러스 벡터 내에 삽입된 Ad5 [E1-, E2b-] 을 포함하는 본 개시물의 임의의 Ad5 [E1-, E2b-]-RRV 백신에 의한 예방에 의하는 로스 리버 바이러스 (RRV) 감염의 방지를 설명한다. Ad5 [E1-, E2b-]-RRV 백신을 단일-표적화 RRV 백신의 경우에 실시예 1 로부터 적합하게 조정하여 또는 실시예 6 에 기재된 바와 같이 구축하거나 또는 다중-표적화 RRV 백신의 경우에 실시예 3 으로부터 적합하게 조정하여 구축한다. Ad5 [E1-, E2b-]-RRV 백신을 대상에게 피하, 피부내, 또는 근육내 1 회 또는 2 주 마다 총 2 회 면역화로 투여한다. Ad5 [E1-, E2b-]-RRV 백신에 의한 대상의 면역화 후에 RRV 바이러스에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 및 RRV 바이러스에 의한 감염에 대한 보호가 유도된다. 다시 말하면, Ad5 [E1-, E2b-]-RRV 백신에 의한 예방에 의하는 면역성이 대상에게 부여된다. 대상은 인간, 비-인간 영장류, 또는 임의의 기타 비-인간 동물을 포함하는 임의의 동물이다.
실시예 16
Ad5 [E1-, E2b-]-마야로 열 바이러스 (MAYV) 백신에 의한 마야로 열 바이러스 감염의 방지
이 실시예는 MAYV 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 9) 중 어느 하나, 또는 그의 임의의 조합이 아데노바이러스 벡터 내에 삽입된 Ad5 [E1-, E2b-] 을 포함하는 본 개시물의 임의의 Ad5 [E1-, E2b-]-MAYV 백신에 의한 예방에 의하는 마야로 열 바이러스 (MAYV) 감염의 방지를 설명한다. Ad5 [E1-, E2b-]-MAYV 백신을 단일-표적화 MAYV 백신의 경우에 실시예 1 로부터 적합하게 조정하여 또는 실시예 5 에 기재된 바와 같이 구축하거나 또는 다중-표적화 MAYV 백신의 경우에 실시예 3 으로부터 적합하게 조정하여 구축한다. Ad5 [E1-, E2b-]-MAYV 백신을 대상에게 피하, 피부내, 또는 근육내 1 회 또는 2 주 마다 총 2 회 면역화로 투여한다. Ad5 [E1-, E2b-]-MAYV 백신에 의한 대상의 면역화 후에 MAYV 바이러스에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 및 MAYV 바이러스에 의한 감염에 대한 보호가 유도된다. 다시 말하면, Ad5 [E1-, E2b-]-MAYV 백신에 의한 예방에 의하는 면역성이 대상에게 부여된다. 대상은 인간, 비-인간 영장류, 또는 임의의 기타 비-인간 동물을 포함하는 임의의 동물이다.
실시예 17
Ad5 [E1-, E2b-]-베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 백신에 의한 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 감염의 방지
이 실시예는 VEEV 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 15) 중 어느 하나, 또는 그의 임의의 조합이 아데노바이러스 벡터 내에 삽입된 Ad5 [E1-, E2b-] 을 포함하는 본 개시물의 임의의 Ad5 [E1-, E2b-]-VEEV 백신에 의한 예방에 의하는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 감염의 방지를 설명한다. Ad5 [E1-, E2b-]-VEEV 백신을 단일-표적화 VEEV 백신의 경우에 실시예 1 로부터 적합하게 조정하여 또는 실시예 7 에 기재된 바와 같이 구축하거나 또는 다중-표적화 VEEV 백신의 경우에 실시예 3 으로부터 적합하게 조정하여 구축한다. Ad5 [E1-, E2b-]-VEEV 백신을 대상에게 피하, 피부내, 또는 근육내 1 회 또는 2 주 마다 총 2 회 면역화로 투여한다. Ad5 [E1-, E2b-]-VEEV 백신에 의한 대상의 면역화 후에 VEEV 바이러스에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 및 VEEV 바이러스에 의한 감염에 대한 보호가 유도된다. 다시 말하면, Ad5 [E1-, E2b-]-VEEV 백신에 의한 예방에 의하는 면역성이 대상에게 부여된다. 대상은 인간, 비-인간 영장류, 또는 임의의 기타 비-인간 동물을 포함하는 임의의 동물이다.
실시예 18
Ad5 [E1-, E2b-]- 서부 말 뇌척수염 바이러스 (WEEV) 백신에 의한 서부 말 뇌척수염 바이러스 감염의 방지
이 실시예는 WEEV 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 19 - SEQ ID NO: 21) 중 어느 하나, 또는 그의 임의의 조합이 아데노바이러스 벡터 내에 삽입된 Ad5 [E1-, E2b-] 을 포함하는 본 개시물의 임의의 Ad5 [E1-, E2b-]-WEEV 백신에 의한 예방에 의하는 서부 말 뇌척수염 바이러스 (WEEV) 감염의 방지를 설명한다. Ad5 [E1-, E2b-]-WEEV 백신을 단일-표적화 WEEV 백신의 경우에 실시예 1 로부터 적합하게 조정하여 또는 실시예 9 에 기재된 바와 같이 구축하거나 또는 다중-표적화 WEEV 백신의 경우에 실시예 3 으로부터 적합하게 조정하여 구축한다. Ad5 [E1-, E2b-]-WEEV 백신을 대상에게 피하, 피부내, 또는 근육내 1 회 또는 2 주 마다 총 2 회 면역화로 투여한다. Ad5 [E1-, E2b-]-WEEV 백신에 의한 대상의 면역화 후에 WEEV 바이러스에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 및 WEEV 바이러스에 의한 감염에 대한 보호가 유도된다. 다시 말하면, Ad5 [E1-, E2b-]-WEEV 백신에 의한 예방에 의하는 면역성이 대상에게 부여된다. 대상은 인간, 비-인간 영장류, 또는 임의의 기타 비-인간 동물을 포함하는 임의의 동물이다.
실시예 19
Ad5 [E1-, E2b-]-동부 말 뇌염 바이러스 (EEEV) 백신에 의한 동부 말 뇌염 바이러스 감염의 방지
이 실시예는 EEEV 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 18) 중 어느 하나, 또는 그의 임의의 조합이 아데노바이러스 벡터 내에 삽입된 Ad5 [E1-, E2b-] 을 포함하는 본 개시물의 임의의 Ad5 [E1-, E2b-]-EEEV 백신에 의한 예방에 의하는 동부 말 뇌염 바이러스 (EEEV) 감염의 방지를 설명한다. Ad5 [E1-, E2b-]-EEEV 백신을 단일-표적화 EEEV 백신의 경우에 실시예 1 로부터 적합하게 조정하여 또는 실시예 8 에 기재된 바와 같이 구축하거나 또는 다중-표적화 EEEV 백신의 경우에 실시예 3 으로부터 적합하게 조정하여 구축한다. Ad5 [E1-, E2b-]-EEEV 백신을 대상에게 피하, 피부내, 또는 근육내 1 회 또는 2 주 마다 총 2 회 면역화로 투여한다. Ad5 [E1-, E2b-]- EEEV 백신에 의한 대상의 면역화 후에 EEEV 바이러스에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 및 EEEV 바이러스에 의한 감염에 대한 보호가 유도된다. 다시 말하면, Ad5 [E1-, E2b-]-EEEV 백신에 의한 예방에 의하는 면역성이 대상에게 부여된다. 대상은 인간, 비-인간 영장류, 또는 임의의 기타 비-인간 동물을 포함하는 임의의 동물이다.
실시예 20
Ad5 [E1-, E2b-]-알파바이러스 백신에 의한 알파바이러스 감염의 방지
이 실시예는 임의의 Ad5 [E1-, E2b-]-알파바이러스 백신에 의한 예방에 의하는 알파바이러스 감염의 방지를 설명한다. Ad5 [E1-, E2b-]-알파바이러스 백신은 하기의 임의의 조합으로 구성된다: 실시예 15 에 기재된 바와 같은 단일-표적화 또는 다중-표적화 Ad5 [E1, E2b]-ONNV 벡터, 실시예 11 에 기재된 바와 같은 단일-표적화 또는 다중-표적화 Ad5 [E1, E2b]-CHIK 벡터, 실시예 16 에 기재된 바와 같은 단일-표적화 또는 다중-표적화 Ad5 [E1, E2b]-RRV 벡터, 실시예 17 에 기재된 바와 같은 단일-표적화 또는 다중-표적화 Ad5 [E1, E2b]-MAYV 벡터, 실시예 18 에 기재된 바와 같은 단일-표적화 또는 다중-표적화 Ad5 [E1, E2b]-VEEV 벡터, 실시예 19 에 기재된 바와 같은 단일-표적화 또는 다중-표적화 Ad5 [E1, E2b]-WEEV 벡터, 실시예 20 에 기재된 바와 같은 단일-표적화 또는 다중-표적화 Ad5 [E1, E2b]-RRV 벡터. 대안적으로, Ad5 [E1-, E2b-]-알파바이러스 백신은 상이한 알파바이러스로부터의 적어도 2 개의 항원의 임의의 조합이 아데노바이러스 벡터 내에 삽입된 Ad5 [E1-, E2b-] 로 구성된다. 예를 들어, 적어도 2 개의 항원은 ONNV 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 6 중 어느 하나), CHIK 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 3 중 어느 하나), EEEV 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 18 중 어느 하나), WEEV 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 19 - SEQ ID NO: 21 중 어느 하나), VEEV 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 15 중 어느 하나), MAYV 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 9 중 어느 하나), 및/또는 RRV 항원 (예를 들어, SEQ ID NO: 10 - SEQ ID NO: 12 중 어느 하나) 의 임의의 조합으로 구성된다. Ad5 [E1-, E2b-]-알파바이러스 백신을 대상에게 피하, 피부내, 또는 근육내 1 회 또는 2 주 마다 총 2 회 면역화로 투여한다. Ad5 [E1-, E2b-]-알파바이러스 백신에 의한 대상의 면역화 후에 알파바이러스에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 및 알파바이러스에 의한 감염에 대한 보호가 유도된다. 다시 말하면, Ad5 [E1-, E2b-]-알파바이러스 백신에 의한 예방에 의하는 면역성이 대상에게 부여된다. 대상은 인간, 비-인간 영장류, 또는 임의의 기타 비-인간 동물을 포함하는 임의의 동물이다.
본 발명의 바람직한 구현예가 본 명세서에 표시되고 기술되었지만, 이러한 구현예는 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 수많은 변이, 변화, 및 교체가 이제 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 일어날 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 구현예의 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 적용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 하기 청구항은 본 발명의 범주를 정의하며 이들 청구항 및 그들 균등물의 범주 내인 방법 및 구조를 그에 의해 포괄하고자 한다.
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SEQUENCE LISTING <110> ETUBICS CORPORATION <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ALPHAVIRUS VACCINATION <130> 39891-725.601 <140> <141> <150> 62/363,136 <151> 2016-07-15 <160> 119 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11826 <212> DNA <213> Chikungunya virus <400> 1 atggctgcgt gagacacacg tagcctacca gtttcttact gctctactct gcaaagcaag 60 agattaagaa cccatcatgg atcctgtgta cgtggacata gacgctgaca gcgccttttt 120 gaaggccctg caacgtgcgt accccatgtt tgaggtggaa cctaggcagg tcacaccgaa 180 tgaccatgct aatgctagag cgttctcgca tctagctata aaactaatag agcaggaaat 240 tgatcccgac tcaaccatcc tggatattgg tagtgcgcca gcaaggagga tgatgtcgga 300 caggaagtac cactgcgttt gcccgatgcg cagtgcagaa gatcccgaga gactcgccaa 360 ttatgcgaga aagctagcat ctgccgcagg aaaagtcctg gacagaaaca tctctggaaa 420 gatcggggac ttacaagcag taatggccgt gccagacacg gagacgccaa cattctgctt 480 acacacagat gtatcatgta gacagagagc agacgtcgcg atataccaag acgtctatgc 540 tgtacacgca cccacgtcgc tataccacca ggcgattaaa ggggtccgat tggcgtactg 600 ggtagggttt gacacaaccc cgttcatgta 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aacccctgaa tagtaacaaa atataaaaat taataaaaat 11580 cataaaatag aaaaaccata aacagaagta gttcaaaggg ctataaaaac ccctgaatag 11640 taacaaaaca taaaactaat aaaaatcaaa tgaataccat aattggcaaa cggaagagat 11700 gtaggtactt aagcttccta aaagcagccg aactcacttt gagatgtagg catagcatac 11760 cgaactcttc cacgattctc cgaacccaca gggacgtagg agatgttatt ttgtttttaa 11820 tatttc 11826 <210> 2 <211> 1248 <212> PRT <213> Chikungunya virus <400> 2 Met Glu Phe Ile Pro Thr Gln Thr Phe Tyr Asn Arg Arg Tyr Gln Pro 1 5 10 15 Arg Pro Trp Thr Pro Arg Pro Thr Ile Gln Val Ile Arg Pro Arg Pro 20 25 30 Arg Pro Gln Arg Gln Ala Gly Gln Leu Ala Gln Leu Ile Ser Ala Val 35 40 45 Asn Lys Leu Thr Met Arg Ala Val Pro Gln Gln Lys Pro Arg Lys Asn 50 55 60 Arg Lys Asn Lys Lys Gln Lys Gln Lys Gln Gln Ala Pro Gln Asn Asn 65 70 75 80 Thr Asn Gln Lys Lys Gln Pro Pro Lys Lys Lys Pro Ala Gln Lys Lys 85 90 95 Lys Lys Pro Gly Arg Arg Glu Arg Met Cys Met Lys Ile Glu Asn Asp 100 105 110 Cys Ile Phe Glu Val Lys His Glu Gly Lys Val Thr Gly Tyr Ala Cys 115 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gacacaggag gttacgggat gagcaattcg cgccgccgct cactcaggtg 120 gtcatggttg ctgagcgtgc tggctgccgt cgggctgggc ctggccacgg cgccggccca 180 ggcggccccg ccggccttgt cgcaggaccg gttcgccgac ttccccgcgc tgcccctcga 240 cccgtccgcg atggtcgccc aagtggggcc acaggtggtc aacatcaaca ccaaactggg 300 ctacaacaac gccgtgggcg ccgggaccgg catcgtcatc gatcccaacg gtgtcgtgct 360 gaccaacaac cacgtgatcg cgggcgccac cgacatcaat gcgttcagcg tcggctccgg 420 ccaaacctac ggcgtcgatg tggtcgggta tgaccgcacc caggatgtcg cggtgctgca 480 gctgcgcggt gccggtggcc tgccgtcggc ggcgatcggt ggcggcgtcg cggttggtga 540 gcccgtcgtc gcgatgggca acagcggtgg gcagggcgga acgccccgtg cggtgcctgg 600 cagggtggtc gcgctcggcc aaaccgtgca ggcgtcggat tcgctgaccg gtgccgaaga 660 gacattgaac gggttgatcc agttcgatgc cgcgatccag cccggtgatt cgggcgggcc 720 cgtcgtcaac ggcctaggac aggtggtcgg tatgaacacg gccgcgtccg ataacttcca 780 gctgtcccag ggtgggcagg gattcgccat tccgatcggg caggcgatgg cgatcgcggg 840 ccagatccga tcgggtgggg ggtcacccac cgttcatatc gggcctaccg ccttcctcgg 900 cttgggtgtt gtcgacaaca acggcaacgg cgcacgagtc caacgcgtgg tcgggagcgc 960 tccggcggca agtctcggca tctccaccgg cgacgtgatc accgcggtcg acggcgctcc 1020 gatcaactcg gccaccgcga tggcggacgc gcttaacggg catcatcccg gtgacgtcat 1080 ctcggtgacc tggcaaacca agtcgggcgg cacgcgtaca gggaacgtga cattggccga 1140 gggacccccg gcctgatttc gtcgcggata ccacccgccg gccggccaat tggattggcg 1200 ccagccgtga ttgccgcgtg agcccccgag ttccgtctcc cgtgcgcgtg gcatcgtgga 1260 agcaatgaac gaggcagaac acagcgtcga gcaccctccc gtgcagggca gtcacgtcga 1320 aggcggtgtg gtcgagcatc cggatgccaa ggacttcggc agcgccgccg ccctgcccgc 1380 cgatccgacc tggtttaagc acgccgtctt ctacgaggtg ctggtccggg cgttcttcga 1440 cgccagcgcg gacggttccg gcgatctgcg tggactcatc gatcgcctcg actacctgca 1500 gtggcttggc atcgactgca tctggttgcc gccgttctac gactcgccgc tgcgcgacgg 1560 cggttacgac attcgcgact tctacaaggt gctgcccgaa ttcggcaccg tcgacgattt 1620 cgtcgccctg gtcgacgccg ctcaccggcg aggtatccgc atcatcaccg acctggtgat 1680 gaatcacacc tcggagtcgc acccctggtt tcaggagtcc cgccgcgacc cagacggacc 1740 gtacggtgac tattacgtgt ggagcgacac cagcgagcgc tacaccgacg cccggatcat 1800 cttcgtcgac accgaagagt cgaactggtc attcgatcct gtccgccgac agttctactg 1860 gcaccgattc tt 1872 <210> 94 <211> 396 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 94 acggccgcgt ccgataactt ccagctgtcc cagggtgggc agggattcgc cattccgatc 60 gggcaggcga tggcgatcgc gggccagatc cgatcgggtg gggggtcacc caccgttcat 120 atcgggccta ccgccttcct cggcttgggt gttgtcgaca acaacggcaa cggcgcacga 180 gtccaacgcg tggtcgggag cgctccggcg gcaagtctcg gcatctccac cggcgacgtg 240 atcaccgcgg tcgacggcgc tccgatcaac tcggccaccg cgatggcgga cgcgcttaac 300 gggcatcatc ccggtgacgt catctcggtg acctggcaaa ccaagtcggg cggcacgcgt 360 acagggaacg tgacattggc cgagggaccc ccggcc 396 <210> 95 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 95 catatgcatc accatcacca tcacacggcc gcgtccgata acttccagct gtcccagggt 60 gggcagggat tcgccattcc gatcgggcag gcgatggcga tcgcgggcca gatccgatcg 120 ggtggggggt cacccaccgt tcatatcggg cctaccgcct tcctcggctt gggtgttgtc 180 gacaacaacg gcaacggcgc acgagtccaa cgcgtggtcg ggagcgctcc ggcggcaagt 240 ctcggcatct ccaccggcga cgtgatcacc gcggtcgacg gcgctccgat caactcggcc 300 accgcgatgg cggacgcgct taacgggcat catcccggtg acgtcatctc ggtgacctgg 360 caaaccaagt cgggcggcac gcgtacaggg aacgtgacat tggccgaggg acccccggcc 420 gaattcgacg acgacgacaa ggatccacct gacccgcatc agccggacat gacgaaaggc 480 tattgcccgg gtggccgatg gggttttggc gacttggccg tgtgcgacgg cgagaagtac 540 cccgacggct cgttttggca ccagtggatg caaacgtggt ttaccggccc acagttttac 600 ttcgattgtg tcagcggcgg tgagcccctc cccggcccgc cgccaccggg tggttgcggt 660 ggggcaattc cgtccgagca gcccaacgct ccctgagaat tc 702 <210> 96 <211> 1746 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 96 catatgcatc accatcacca tcacacggcc gcgtccgata acttccagct gtcccagggt 60 gggcagggat tcgccattcc gatcgggcag gcgatggcga tcgcgggcca gatccgatcg 120 ggtggggggt cacccaccgt tcatatcggg cctaccgcct tcctcggctt gggtgttgtc 180 gacaacaacg gcaacggcgc acgagtccaa cgcgtggtcg ggagcgctcc ggcggcaagt 240 ctcggcatct ccaccggcga cgtgatcacc gcggtcgacg gcgctccgat caactcggcc 300 accgcgatgg cggacgcgct taacgggcat catcccggtg acgtcatctc ggtgacctgg 360 caaaccaagt cgggcggcac gcgtacaggg aacgtgacat tggccgaggg acccccggcc 420 gaattcccgc tggtgccgcg cggcagcccg atgggctccg acgttcggga cctgaacgca 480 ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtggt ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt 540 gcagcacagt gggctccggt tctggacttc gcaccgccgg gtgcatccgc atacggttcc 600 ctgggtggtc cggcaccgcc gccggcaccg ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc 660 ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc 720 gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc actggcacag ccggagcctg tcgctacggg 780 cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac 840 gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc 900 acggtcacct tcgacgggac gcccagctac ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag 960 ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag 1020 cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc 1080 ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca 1140 tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag atgaacttag gagccacctt aaagggccac 1200 agcacagggt acgagagcga taaccacaca acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga 1260 atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt caggatgtgc gacgtgtgcc tggagtagcc 1320 ccgactcttg tacggtcggc atctgagacc agtgagaaac gccccttcat gtgtgcttac 1380 tcaggctgca ataagagata ttttaagctg tcccacttac agatgcacag caggaagcac 1440 actggtgaga aaccatacca gtgtgacttc aaggactgtg aacgaaggtt ttttcgttca 1500 gaccagctca aaagacacca aaggagacat acaggtgtga aaccattcca gtgtaaaact 1560 tgtcagcgaa agttctcccg gtccgaccac ctgaagaccc acaccaggac tcatacaggt 1620 gaaaagccct tcagctgtcg gtggccaagt tgtcagaaaa agtttgcccg gtcagatgaa 1680 ttagtccgcc atcacaacat gcatcagaga aacatgacca aactccagct ggcgctttga 1740 gaattc 1746 <210> 97 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 97 catatgcatc accatcacca tcacacggcc gcgtccgata acttccagct gtcccagggt 60 gggcagggat tcgccattcc gatcgggcag gcgatggcga tcgcgggcca gatccgatcg 120 ggtggggggt cacccaccgt tcatatcggg cctaccgcct tcctcggctt gggtgttgtc 180 gacaacaacg gcaacggcgc acgagtccaa cgcgtggtcg ggagcgctcc ggcggcaagt 240 ctcggcatct ccaccggcga cgtgatcacc gcggtcgacg gcgctccgat caactcggcc 300 accgcgatgg cggacgcgct taacgggcat catcccggtg acgtcatctc ggtgacctgg 360 caaaccaagt cgggcggcac gcgtacaggg aacgtgacat tggccgaggg acccccggcc 420 gaattcatcg agggaagggg ctctggctgc cccttattgg agaatgtgat ttccaagaca 480 atcaatccac aagtgtctaa gactgaatac aaagaacttc ttcaagagtt catagacgac 540 aatgccacta caaatgccat agatgaattg aaggaatgtt ttcttaacca aacggatgaa 600 actctgagca atgttgaggt gtttatgcaa ttaatatatg acagcagtct ttgtgattta 660 ttttaagaat tc 672 <210> 98 <211> 2191 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 98 atgcatcacc atcaccatca cacggccgcg tccgataact tccagctgtc ccagggtggg 60 cagggattcg ccattccgat cgggcaggcg atggcgatcg cgggccagat ccgatcgggt 120 ggggggtcac ccaccgttca tatcgggcct accgccttcc tcggcttggg tgttgtcgac 180 aacaacggca acggcgcacg agtccaacgc gtggtcggga gcgctccggc ggcaagtctc 240 ggcatctcca ccggcgacgt gatcaccgcg gtcgacggcg ctccgatcaa ctcggccacc 300 gcgatggcgg acgcgcttaa cgggcatcat cccggtgacg tcatctcggt gacctggcaa 360 accaagtcgg gcggcacgcg tacagggaac gtgacattgg ccgagggacc cccggccgaa 420 ttcatggtgg atttcggggc gttaccaccg gagatcaact ccgcgaggat gtacgccggc 480 ccgggttcgg cctcgctggt ggccgcggct cagatgtggg acagcgtggc gagtgacctg 540 ttttcggccg cgtcggcgtt tcagtcggtg gtctggggtc tgacggtggg gtcgtggata 600 ggttcgtcgg cgggtctgat ggtggcggcg gcctcgccgt atgtggcgtg gatgagcgtc 660 accgcggggc aggccgagct gaccgccgcc caggtccggg ttgctgcggc ggcctacgag 720 acggcgtatg ggctgacggt gcccccgccg gtgatcgccg agaaccgtgc tgaactgatg 780 attctgatag cgaccaacct cttggggcaa aacaccccgg cgatcgcggt caacgaggcc 840 gaatacggcg agatgtgggc ccaagacgcc gccgcgatgt ttggctacgc cgcggcgacg 900 gcgacggcga cggcgacgtt gctgccgttc gaggaggcgc cggagatgac cagcgcgggt 960 gggctcctcg agcaggccgc cgcggtcgag gaggcctccg acaccgccgc ggcgaaccag 1020 ttgatgaaca atgtgcccca ggcgctgcaa cagctggccc agcccacgca gggcaccacg 1080 ccttcttcca agctgggtgg cctgtggaag acggtctcgc cgcatcggtc gccgatcagc 1140 aacatggtgt cgatggccaa caaccacatg tcgatgacca actcgggtgt gtcgatgacc 1200 aacaccttga gctcgatgtt gaagggcttt gctccggcgg cggccgccca ggccgtgcaa 1260 accgcggcgc aaaacggggt ccgggcgatg agctcgctgg gcagctcgct gggttcttcg 1320 ggtctgggcg gtggggtggc cgccaacttg ggtcgggcgg cctcggtcgg ttcgttgtcg 1380 gtgccgcagg cctgggccgc ggccaaccag gcagtcaccc cggcggcgcg ggcgctgccg 1440 ctgaccagcc tgaccagcgc cgcggaaaga gggcccgggc agatgctggg cgggctgccg 1500 gtggggcaga tgggcgccag ggccggtggt gggctcagtg gtgtgctgcg tgttccgccg 1560 cgaccctatg tgatgccgca ttctccggca gccggcgata tcgccccgcc ggccttgtcg 1620 caggaccggt tcgccgactt ccccgcgctg cccctcgacc cgtccgcgat ggtcgcccaa 1680 gtggggccac aggtggtcaa catcaacacc aaactgggct acaacaacgc cgtgggcgcc 1740 gggaccggca tcgtcatcga tcccaacggt 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oligonucleotide <400> 101 caattagaat tcgacgacga cgacaaggat ccacctgacc cgcatcag 48 <210> 102 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 caattagaat tctcagggag cgttgggctg ctc 33 <210> 103 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 gcgaagctta tgaagttgct gatggtcctc atgc 34 <210> 104 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 cggctcgagt taaaataaat cacaaagact gctgtc 36 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Met His His His His His His 1 5 <210> 106 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Asp Asp Asp Lys 1 <210> 107 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu 1 5 10 15 Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys 20 25 30 Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe Ile Val Gly Phe 35 40 45 Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe 50 55 60 His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr Trp 65 70 75 80 Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met 85 90 95 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 ggggtcaacg ttgagggggg 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 gggggacgat cgtcgggggg 20 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 ggggacgacg tcgtgggggg g 21 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 113 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 114 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22 <210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23 <210> 116 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26 <210> 117 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 118 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25 <210> 119 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29

Claims (51)

  1. 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열을 포함하는 복제 결함성 바이러스 벡터를 포함하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열이 복수의 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열을 포함하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 복수의 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열이 표적 항원에 각각 상응하는 복수의 유전자 삽입물을 포함하고, 각각의 유전자 삽입물이 자가-절단 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 의해 분리되어 있는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 자가-절단 2A 펩티드가 돼지 테스코바이러스-1 (Porcine teschovirus-1) 또는 토세아 아시그나 바이러스 (Thosea asigna virus) 에서 유래하는 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함성 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함성 바이러스 벡터가 아데노바이러스 5 (Ad5) 벡터인 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함성 바이러스 벡터가 E1 유전자 부위, E2b 유전자 부위, E3 유전자 부위, E4 유전자 부위, 또는 그의 임의의 조합에서 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, E2b 유전자 부위에서의 결실은 E2b 부위에서의 복수의 결실을 포함하는 조성물.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, E1 유전자 부위, E2b 유전자 부위, E3 유전자 부위, E4 유전자 부위, 또는 그의 임의의 조합에서의 결실이 각각 적어도 하나의 염기쌍을 포함하는 조성물.
  10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, E1 유전자 부위, E2b 유전자 부위, E3 유전자 부위, E4 유전자 부위, 또는 그의 임의의 조합에서의 결실이 둘 이상의 염기쌍의 전좌로 인한 것인 조성물.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, E1 유전자 부위, E2b 유전자 부위, E3 유전자 부위, E4 유전자 부위, 또는 그의 임의의 조합에서의 결실이 각각 적어도 20 개, 적어도 30 개, 적어도 40 개, 적어도 50 개, 적어도 60 개, 적어도 70 개, 적어도 80 개, 적어도 90 개, 적어도 100 개, 적어도 110 개, 적어도 120 개, 적어도 130 개, 적어도 140 개, 또는 적어도 150 개의 염기쌍을 포함하는 조성물.
  12. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, E1 유전자 부위, E2b 유전자 부위, E3 유전자 부위, E4 유전자 부위, 또는 그의 임의의 조합에서의 결실이 각각 150 개 초과, 160 개 초과, 170 개 초과, 180 개 초과, 190 개 초과, 200 개 초과, 250 개 초과, 또는 300 개 초과의 염기쌍을 포함하는 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 알파바이러스 표적 항원이 치쿤구니아 바이러스 (CHIKV), 오니옹니옹 바이러스 (ONNV), 로스 리버 바이러스 (RRV), 마야로 열 바이러스 (MAYV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV), 서부 말 뇌척수염 바이러스 (WEEV), 및 동부 말 뇌염 바이러스 (EEEV), 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스의 항원을 포함하는 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 알파바이러스 표적 항원이 CHIKV, ONNV, RRV, 및 MAYV, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스의 항원을 포함하는 조성물.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 알파바이러스 표적 항원이 CHIKV 의 항원을 포함하는 조성물.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 알파바이러스 표적 항원이 C, E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, E1ALPHA, nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원을 포함하는 조성물.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 알파바이러스 표적 항원이 C, E3ALPHA, E2ALPHA, 6K, 및 E1ALPHA, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원을 포함하는 조성물.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 알파바이러스 표적 항원이 E1ALPHA 및 E2ALPHA, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원을 포함하는 조성물.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열이 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 21, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 포함하는 조성물.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열이 아미노산 서열이고, 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 21, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 포함하는 조성물.
  21. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열이 뉴클레오티드 서열이고, 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 19, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 포함하는 조성물.
  22. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 알파바이러스 표적 항원을 인코딩하는 서열이 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 및 SEQ ID NO: 3, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% , 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 포함하는 조성물.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함성 바이러스 벡터가 알파바이러스 표적 항원의 발현을 증가시키는 요소를 추가로 포함하는 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서, 요소가 적어도 1 개의 요소, 적어도 2 개의 요소, 적어도 3 개의 요소, 적어도 4 개의 요소, 또는 적어도 5 개의 요소를 포함하는 조성물.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 요소가 내부 리보솜 결합 부위를 포함하는 조성물.
  26. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 요소가 구성적 프로모터를 포함하는 조성물.
  27. 제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 요소가 유도성 프로모터를 포함하는 조성물.
  28. 제 23 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 요소가 전사 인핸서를 포함하는 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서, 전사 인핸서가 라우스 육종 바이러스 (RSV) 인핸서인 조성물.
  30. 제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 요소가 팔린드롬성 (palindromic) 서열을 함유하지 않는 조성물.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함성 바이러스 벡터가 알파바이러스 표적 항원 면역원성을 증가시키는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함성 바이러스 벡터가 거트 (gutted) 벡터가 아닌 조성물.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 복제 결함성 바이러스 벡터가 공동자극 분자 또는 면역학적 융합 파트너를 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, 공동자극 분자가 B7, ICAM-1, LFA-3, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 조성물.
  35. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  36. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 35 항에 따른 약학 조성물을 포함하는 세포.
  37. 제 36 항에 있어서, 숙주 세포인 세포.
  38. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서, 수지상 세포 (DC) 인 세포.
  39. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 35 항에 따른 약학 조성물을 제조하는 것을 포함하는, 백신의 제조 방법.
  40. 대상에서 알파바이러스 표적 항원에 대한 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
    제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 35 항에 따른 약학 조성물을 대상에게 투여하는 것.
  41. 제 40 항에 있어서, 대상이 알파바이러스로 감염되지 않은 방법.
  42. 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 알파바이러스 표적 항원이 알파바이러스로부터의 것이며, 알파바이러스가 치쿤구니아 바이러스 (CHIKV), 오니옹니옹 바이러스 (ONNV), 로스 리버 바이러스 (RRV), 마야로 열 바이러스 (MAYV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV), 서부 말 뇌척수염 바이러스 (WEEV), 동부 말 뇌염 바이러스 (EEEV), 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 방법.
  43. 대상에서 치쿤구니아 바이러스 감염을 예방하는 방법으로서, 하기를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법:
    E2b 유전자 부위에서의 결실을 포함하는 복제 결함성 바이러스 벡터; 및
    적어도 하나의 치쿤구니아 표적 항원을 인코딩하는 핵산 서열.
  44. 제 40 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에 대해 기존 면역성을 갖는 방법.
  45. 제 40 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 인간 또는 비-인간 동물인 방법.
  46. 제 40 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 정맥내, 피하, 림프선내, 종양내, 피부내, 근육내, 복강내, 직장내, 질내, 비강내, 경구, 방광 점적주입, 또는 난절법 (scarification) 을 통한 것인 방법.
  47. 제 40 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에게 조성물을 투여하는 것이 적어도 1 회이거나, 적어도 2 회 반복되거나, 또는 적어도 3 회 반복되는 방법.
  48. 제 40 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에게 투여하는 것이 용량 당 1x109 내지 5x1012 바이러스 입자를 포함하는 방법.
  49. 제 40 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에게 투여하는 것이 용량 당 적어도 109 바이러스 입자, 적어도 1010 바이러스 입자, 또는 적어도 1011 바이러스 입자를 포함하는 방법.
  50. 제 40 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함성 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 방법.
  51. 제 40 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함성 바이러스 벡터가 아데노바이러스 5 (Ad5) 벡터인 방법.
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