JP2000503325A - クラミジア感染に対するｄｎａ免疫法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 好ましくは、ＭＯＭＰと特異的に反応する抗体を生産するＭＯＭＰまたはＭＯＭＰ断片コードする核酸配列と宿主内でのＭＯＭＰの発現に関する第一の核酸配列に作動可能なように連結されたプロモーター配列とを含むクラミジア系統の主要外膜タンパク質に対する、ヒトをはじめとする宿主において、防御免疫応答起こす、ＤＮＡをはじめとする核酸免疫感作。この非複製ベクターは宿主にin vivo投与するための医薬上許容される担体とともに配合されてよい。

Description

【発明の詳細な説明】 クラミジア感染に対するＤＮＡ免疫法 発明の分野 本発明は、免疫学、詳しくはクラミジア感染に対する防御を提供する核酸を用 いた宿主の免疫法に関する。 発明の背景 ＤＮＡ免疫法は、感染症に対する防御免疫の形成に関するアプローチである( 参考文献1-本出願を通じ、種々の参考文献を括弧内で引用して、本発明が属する 技術の状況をさらに十分に記載する。各引用に関する十分な参考文献情報は、本 明細書の末尾、請求の範囲の直前に記載されている。これらの参考文献の開示は 出典明示して本明細書の開示の一部とみなす)。タンパク質またはペプチドに基 づくサブユニットワクチンとは異なり、ＤＮＡ免疫法は、宿主細胞による異種タ ンパク質の発現を通して防御免疫を提供し、かくして、ウイルスまたは細胞内病 原体の感染中に起こるのとより類似した様式で、免疫系に抗原を提示することが 可能になる(参考文献２)。この技術により多大な関心が持ち上がっているが、ウ イルス病に対するＤＮＡ免疫法により、首尾よい免疫がかなり一貫して誘導され ている。(参考文献３)。病原体の性質、選択された免疫抗原、および免疫感作経 路において差異を示す非ウイルス性病原体により、結果はかなり変わってきてい る(参考文献４)。さらなるＤＮＡワクチン接種の開発は、根底にある免疫学的メ カニズムを明確にすること、ならびに既存のワクチン開発戦略では上手くいかな い他の感染症への幅広い適用にかかっている。 クラミジア・トラコーマティス(Chlamydia trachomatis)は、偏性細胞内細菌 病原体であり、これは通常では、ヒト宿主の粘膜上皮表面に局在化して留まって いる。クラミジアは、基本小体(ＥＢ)と呼ばれる細胞外胞子様伝達細胞および網 状小体と呼ばれる細胞内複製細胞を有する二形性細菌である(参考文献５)。公衆 衛生の展望から、クラミジア感染は非常に重要になる。なぜならば、それらは不 妊、失明の重大な原因であり、１型ヒト免疫不全ウイルスの伝播を助長する有力 な副因子である(参考文献６)。Ｃ.トラコーマティスに対する防御免疫は、Th1様 ＣＤ４リンパ球の応答により、また粘膜分泌液中の局所抗体によって放出された サイトカイン類を介して達成され、主として主要外膜タンパク質(ＭＯＭＰ)に向 けられていると確信されており、この主要外膜タンパク質は、クラミジア菌細胞 上における量的に優勢な表面タンパク質であり、約４０ｋＤａの分子量を有して いる(参考文献１９)。 クラミジアワクチンの開発における最初の試みは、全バクテリア細胞を用いた 非経口免疫法に基づくものであった。このアプローチはヒトでの試みにおいては 上手く適合したが、防御が一時的、部分的であり、かつ、ワクチン接種がおそら くあるクラミジア抗原に対する病理反応により、それに続く感染症状の発現中に 疾病を悪化させる可能性があるので、限定されるものであった(参考文献８)。ク ラミジアワクチンの設計に関するさらに最近の試みは、ＭＯＭＰタンパク質また はペプチドを用いたサブユニット設計に基づいている。これらのサブユニツトワ クチンもまた、おそらく免疫原が生来のエピトープによって想起された防御細胞 性免疫応答および体液性免疫応答を誘発しないために、概して首尾よくいってい ない(参考文献９)。 欧州特許第１９２０３３号は、以下に示す作動可能なように結合させた構成要 素： 転写プロモーター、 補遺(Appendix)Ａ中に提供された配列由来の、少なくとも２７塩基対の長さの ＭＯＭＰポリヌクレオチドを含んでなるクラミジア・トラコーマテイス ＭＯＭ ＰポリペプチドをコードするＤＮＡ分子と 少なくとも１個の転写調節要素はクラミジア・トラコーマティスに由来するも のではない転写ターミネーター を含んでなるクラミジア・トラコーマティスＭＯＭＰポリペプチドのin vitro での発現のためのＤＮＡ構築体の提供について記載している。かかる構築体のい ずれを用いたＤＮＡ免疫感作を達成するためのこの先行技術においても、開示や 示唆は何も存在しない。 ＷＯ ９４/２６９００は、クラミジア・トラコーマティスのＭＯＭＰ由来の ク ラミジアエビトープを発現し、少なくとも３個の異なるクラミジア・セロバルス (Chlamydia serovars)と免疫反応性がある抗体を誘導することができる雑種ピ コルナウイルスの提供について記載している。この雑種ピコルナウイルスは、好 ましくはヒトへの投与のために弱毒された雑種ポリオウイルスである。 発明の概要 本発明は、クラミジア系統のＭＯＭＰに対する防御抗体を宿主中に形成させる ための核酸免疫感作、特にＤＮＡ免疫感作に関する。ＤＮＡ免疫感作は、Th1様 ＣＤ４応答および粘膜免疫をはじめとする広範囲の免疫応答を誘導する。 従って、１つの態様において、本発明は、宿主へin vivo投与してクラミジア 系統の主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）に対する防御免疫応答を宿主中に形成さ せるためのin vivo免疫原組成物であって、ＭＯＭＰ特異的免疫応答を形成する ＭＯＭＰまたはＭＯＭＰ断片をコードするヌクレオチド配列と、宿主中の当該Ｍ ＯＭＰの発現に対するヌクレオチド配列と作動可能なように連結させたプロモー ター配列とを含んでなる非複製ベクター；ならびにそのための医薬上許容される 担体を含んでなる組成物を提供する。 該ヌクレオチド配列は、全長ＭＯＭＰタンパク質をコードしていてもよいし、 またはＭＯＭＰのＮ末端半分のような断片をコードしていてもよい。このヌクレ オチド配列は、野生型クラミジアに曝された後に想起免疫応答を刺激するＭＯＭ Ｐをコードしていてもよい。このプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモ ーターであってよい。 クラミジア系統は、クラミジア・トラコーマティスやクラミジア・プニューモ ニアエ(Chlamydia pneumoniae)をはじめとする肺のクラミジア感染を引き起こ すクラミジアの系統であってもよい。非複製べクターは、該ヌクレオチド配列が 挿入されているプラスミドpcＤＮＡ３であってよい。刺激される免疫応答は、主 として細胞性免疫応答であってよい。 本発明のさらなる態様において、クラミジア系統の感染によって引き起こされ た疾病に対して宿主を免疫感作させる方法であって、クラミジア系統の主要外膜 タンパク質(ＭＯＭＰ)またはＭＯＭＰ特異的免疫応答を形成するＭＯＭＰ断片を コードするヌクレオチド配列と、宿主での当該ＭＯＭＰの発現のためのヌクレオ チド配列と作動可能なように連結させたプロモーター配列を含んでなる非複製ベ クターの有効量を宿主に投与することを特徴とする方法を提供する。 本発明のこの態様において、前記で議論した種々の選択、ならびに別法が使用 され得る。 非複製ベクターは、筋肉内または鼻腔内などのいずれの常法で、ヒト宿主をは じめとする宿主に投与されてよい。同投与法において、ここで行われた実験では より強力な免疫応答が刺激された。 本発明は、また、該非複製ベクターがプロモーター配列とそのプロモーター配 列に関して作動可能なように挿入されているヌクレオチド配列を含有するプラス ミドpcＤＮＡ３を含んでなる、本発明のさらなる態様を含む。 本発明のさらなる態様において、本発明のさらなる態様は、クラミジア系統の 感染によって引き起こされる疾病に対して宿主を防御するためのワクチンを製造 する方法であって、クラミジア系統の主要外膜タンパク質(ＭＯＭＰ)またはＭＯ ＭＰ特異的免疫応答を形成するＭＯＭＰ断片をコードするヌクレオチド配列を単 離し、該ヌクレオチド配列を少なくとも１個の制御配列に連結して、非複製ベク ターを形成し、その制御配列が、宿主へ導入して該ＭＯＭＰに対する免疫応答を 起こした場合には、該ＭＯＭＰの発現を指示し、さらに、該ベクターを宿主への in vivo投与用ワクチンとして処方することを特徴とする方法を提供する。 従って、本発明の有利な点には、クラミジア系統の主要外膜タンパク質をコー ドするＤＮＡのＤＮＡ免疫感作によってクラミジア系統がもたらした感染に対す る防御免疫応答を得る方法が含まれる。 図面の簡単な説明 図１は、免疫感作後の遅延型過敏感(ＤＴＨ)応答を示す。ＤＮＡワクチン接種 後のＤＴＨ応答。Balb/cマウス(各群につき４匹)を、０、３、６週目にMoPn Ｍ ＯＭＰ遺伝子のコーディング配列を含有するプラスミドＤＮＡを用いて、または ＭｏＰｎ基本小体(ＥＢ)を用いて筋肉内に(pＭＯＭＰ ＩＭ)または鼻腔内に(p ＭＯＭＰ ＩＮ）免疫感作させる。対照群は、ブランクのプラスミドベクター(p cＤＮＡ ３)で処理した。最終の免疫感作後１５日目に、マウスについてＭｏＰｎ特異的 ＤＴＨ応答を次の通りに試験した:ＳＰＧ緩衝液中の２５μｌの加熱のより不活 性化したＭｏＰｎ ＥＢ(５ ｘ １０⁴ ＩＦＵ)を右後脚に注射し、同容量の ＳＰＧ緩衝液を左後脚に注射した。脚の腫脹を、注射後４８時間および７２時間 に測定した。２本の脚の厚さの違いを、ＤＴＨ応答の尺度として用いた。データ は、平均値±ＳＥＭとして示す。 図２はパネルＡおよびＢを含み、ＤＮＡ免疫感作後のｍｏｍｐ遺伝子産物のＭ ｏＰｎ感染に対する防御を示す。Balb/cマウスを、(○)pcＤＮＡ３(n=１１)、( ●)pＭＯＭＰ筋肉内投与(n=１２)、(△)pＭＯＭＰ鼻腔内投与(n=５)または(▲) ＭｏＰｎ ＥＢ(n=１２)を用いて免疫感作させた。最終の免疫感作後１５日目に 、マウスの鼻腔内に伝染性ＭｏＰｎ(１０００ ＩＦＵ)を適用した。パネルＡは 体重の減少をしている。体重は感染試験の後に毎日測定し、それそれの点は体重 減少の平均値±ＳＥＭを表す。パネルＢは、in vivoでのクラミジアのクリアラ ンスを示す。感染後１０日目にマウスを犠牲にし、肺組織由来の伝染性ＭｏＰｎ の回復を定量的組織培養によって分析して、in vivoでのクラミジアのクリアラ ンスを決定した。データは、肺当たりのlog₁₀ ＩＦＵの平均値±ＳＥＭを表す 。 図３は、イムノブロット分析によるＤＮＡ免疫感作マウス中のＭｏＰｎ ＭＯ ＭＰに対する血清抗体の検出を示す。６０日目に、ＭｏＰｎ ＥＢ(レーンＡ)、 pＭＯＭＰ(レーンＢ)、ブランクのpcＤＮＡ３ベクター(レーンＣ)または塩水(レ ーンＤ)で免疫感作させたマウスからプールした血清を１：１００に希釈し、１ ０％ ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルで分離した精製ＭｏＰｎ ＥＢと反応さ せて、ニトロセルロース膜に移した。 図４はパネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤを含み、血清IgＧのサブクラスIgＧ_2a(パネ ルＡおよびＣ)を、組換えＭＯＭＰタンパク質(パネルＡおよびＢ)またはＤＮＡ 免疫感作によって誘導されたＭｏＰｎ ＥＢ(レーンＣおよびＤ)に対するIgＧ( パネルＢおよびＤ)と比較する。マウスを免疫感作させないか、あるいは０，３ 、６週目にpＭＯＭＰ、ＣＴＰシンセターゼＤＮＡ(pＣＴＰ)またはブランクのプ ラスミドベクター(pcＤＮＡ３)を用いて筋肉内に免疫感作して、各群からプール した血清を最終の免疫感作(１０日目)後２週目に採取した。データは、４回の反 復実験のＯ Ｄ値の平均値±ＳＥＭを表す。 図５はパネルＡおよびＢを含み、ＭＯＭＰ遺伝子を用いたＤＮＡワクチン接種 が肺中のＭｏＰｎ感染のクリアランスを高めたことを実証するものである。Balb /cマウス群をpＭＯＭＰ(n=１０)、pcＤＮＡ３(n=１０)または塩水(n=５)をで免 疫感作させた。最終の免疫感作後１５日目に、マウスの鼻腔内に伝染性ＭｏＰｎ (１０⁴ ＩＦＵ)を適用した。パネルＡは、感染試験の後１０日目にマウスを犠 牲にするまで毎日測定した体重を示している。それそれの点は体重変化の平均値 ±ＳＥＭを表す。^★はpcＤＮＡ３処理群と比較したＰ＜０．０５を表す。パネル Ｂ：感染後１０日目にマウスを犠牲にし、定量的組織培養によって肺でのＭｏＰ ｎ増殖を分析した。データは、肺当たりのlog₁₀ ＩＦＵの平均値±ＳＥＭを表 す。^★はpcＤＮＡ３処理群と比較したＰ＜０．０１を表す。 図６はパネルＡおよびＢを含み、鼻腔内ＭｏＰｎ感染の試みに対するマウスの 応答を評価したものを示している。パネルＡでは試みの後の体重変化を示し、パ ネルＢでは試みの後１０日目に採取した肺組織中のＭｏＰｎの増殖を示す。免疫 感作を模擬し、マウスを、先立つＭｏＰｎの肺感染から回収したＭｏＰｎ ＥＳ を用いて腹膜内に免疫感作させるか、またはＰ^1/2ＭＯＭＰを用いて筋肉内に免 疫感作させた。 図７は、プラスミドpcＤＮＡ３/ＭＯＭＰの構成要素および構造を示す。 発明の詳細な説明 本発明を説明するために、プラスミドＤＮＡをＣ.トラコーマティス・マウス ・プニユーモニティス(pneumonitis)系統(ＭｏＰｎ)(これは自然界に存在するネ ズミ病原体であり、マウスにおいて実験を達成を可能にする)由来のＭＯＭＰ遺 伝子を含有するように構築した。一次感染は再感染に対する強力な防御免疫を誘 発するモデルであることが知られている。ヒト免疫感作に対しては、ヒト病原体 系統が用いられる。 サイトメガロウイルスプロモーターを含有する、pcＤＮＡ３、真核生物１１選 択可能発現ベクター(Invitrogen,San Diego,ＣＡ,ＵＳＡ)など、いずれの都合 のよいプラスミドベクターを用いてもよい。該ＭＯＭＰ遺伝子をベクター中にい ずれの便宜な方法によって挿入してもよい。この遺伝子は適切なプライマーを用 い てＰＣＲにより、クラミジア・トラコーマティスのケノムＤＮＡから増幅しても よく、次いでこのＰＣＲ産物をベクター中にクローン化する。該ＭＯＭＰ遺伝子 含有プラスミドをその中で複製するための大腸菌中に、エレクトロペレーション (electroperation)によるなどして、移入してもよい。プラスミドはこの大腸菌 からいずれの便宜な方法によって抽出してもよい。 ＭＯＭＰ遺伝子を有するプラスミドを、筋肉内または鼻腔内のようないずれの 便宜な方法で、医薬上許容される担体と結合させて宿主に投与してもよい。下記 に概説する実験では、プラスミドＤＮＡの鼻腔内投与がより強力な免疫応答を惹 起することか見出された。 本明細書に供し、下記に詳細に記載するデータは、Ｃ.トラコーマティスＭＯ ＭＰ遺伝子を用いたＤＮＡ免疫感作が細胞性および体液性免疫応答の双方を惹起 し、かつ、Ｃ.トラコーマティスＭｏＰｎの肺感染の試みに対して顕著な防御免疫 をもたらすということを実証するものである。結果は、組換えＭＯＭＰタンパク 質または合成ぺプチドを用いて得られたものよりもさらに奨励されるものであり 、必須の防御細胞性免疫応答および体液性免疫応答を惹起するために、ＤＮＡ免 疫感作はクラミジアサブユニット免疫原を送達する代替法であることを示唆して いる。 本明細書に供するデータはまた、ＤＮＡ免疫感作に関する抗原遺伝子の選択に おける重要性を実証するものである。この抗原遺伝子は、天然の病原体に曝され た後に免疫想起を刺激することｇできる免疫応答を惹起する。特に、Ｃ.トラコ ーマティスの細胞質酵素(ＣＴＰシンセターゼ)をコードするものではなく、主要 表面タンパク質(ｐＭＯＭＰ)をコードするＤＮＡ発現ベクターの注射は、それに 続くクラミジアの適用に対する顕著な防御免疫を形成した。ＤＮＡワクチン接種 によって惹起された抗体は本来のＥＢとは結合しなかったので、この防御免疫応 答には体液性免疫ではなく、主として細胞性免疫が介在しているようである。さ らに、ＣＴＰシンセターゼＤＮＡではなく、ＭＯＭＰ ＤＮＡ免疫感作が、陽性 ＤＴＨ反応によって示されるように、本来のＥＢによって容易に想起される細胞 性免疫を惹起した。 さらに、ここでは、ＭＯＭＰ ＤＮＡの粘膜送達は、筋肉内注射よりもＣ.ト ラコーマティス感染に対する防御免疫の誘発に著しく有効であることが実証され て いる。このことは、粘膜表面および抗原の提示の効率に本質的に制限を受けると いうＣ.トラコーマティス感染の性質に関連していると考えられる(参考文献１４ )。分布が豊富であること、また樹状突起細胞が肺の呼吸上皮へと急速に補充さ れることは、鼻腔内ＤＮＡ免疫感作実験の効率を上げるために適切であると考え られる(参考文献１５)。本明細書で提供されるデータは、実質的な防御免疫を生 じさせる初めてのサブユニットクラミジアワクチンの実証を提供するものである 。 さらには、完全な免疫性に到達するために、抗原遺伝子に加えて免疫調節サイ トカイン類を発現するＤＮＡの同時投与によって防御免疫応答を増幅させる(お よび/または導く)ことが可能である(参考文献２１)。クラミジア由来の複数の抗 原遺伝子を使用することにより、ＤＮＡワクチン接種によって達成される防御免 疫のレベルを増大させることができる。 ＭＯＭＰ ＤＮＡ免疫感作に関して危惧される点は、ヒト・Ｃ.トラコーマティ ス系統の中でもＭＯＭＰが極めて多型である(参考文献16)との知見から生じてお り、それゆえにこの抗原遺伝子に基づいた普万能のクラミジアワクチンを作製す ることは困難であると考えられる。この問題を解決する１つの方法は、ＭＯＭＰ 分子内に保存された防御エピトープを検索することであり得る。もう１つのおそ らくより実行可能な方法としては、複数のＭＯＭＰ遺伝子に基づいた多価ワクチ ンを設計することである。後者のアプローチは、関連する血液型亜型の中でＭＯ ＭＰの推定アミノ酸配列は比較的保存されており、Ｃ.トラコーマティス遺伝子 変異型のレパートリーは限定されたものであるらしいという事実によってもっと もであるとされている(参考文献１６)。 本発明の種々の具体例がクラミジア感染の防接種、診断および治療の分野にお いて多くの応用を有するということは当業者にとって明白である。限定されるも のではないが、かかる使用のさらなる議論をさらに以下に示す。 1.ワクチンの製造および使用 ワクチンとして使用するために適切な免疫原組成物は、本明細書に開示したよ うにＭＯＭＰ遺伝子とベクターから製造できる。このワクチンは、抗ＭＯＭＰ抗 体を生産している患者において免疫応答を惹起する。ワクチンをはじめとする、 核酸を含有する免疫原組成物は、注射可能なようにポリヌクレオチドの投与のた めの生理学上許容される液体水剤または乳剤として調製すればよい。この核酸は 、(例えば、ＷＯ ９３２４６４０)参考文献１２に記載されたような)核酸リポ ソームとしてレシチンリポソームまたは当該技術分野において公知である他のリ ポソームのようなリポソームと会合させてもよいし、またはこの核酸を下記にさ らに詳細に記載するように、アジュバントと会合させてもよい。リポソームは、 カチオン性脂質とＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリアニオンとの自発的かつ即時的 な相互作用を含んでなり、その結果ポリヌクレオチドを１００％まで捕捉するリ ポソーム/核酸複合体を生ずる。さらに、このポリカチオン性複合体が細胞膜と 融合した結果、リポソームのコンパートメントの分解酵素を迂回するポリヌクレ オチドの細胞間送達が起こる。公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ ９４/２７４３５ は、カチオン性脂質とポリヌクレオチドを含んでなる遺伝子免疫感作のための組 成物について記載している。カルシウムイオン、ウイルスタンパク質および他の トランスフェクション促進剤のように核酸の細胞取り込みを補助する薬剤を有利 に用いることができる。 ポリヌクレオチド免疫原製剤もまた、生分解可能な徐放性粒子を含有するマイ クロカプセルとして処方され得る。このように、米国特許第５,１５１,２６４号 は、Bio Vecteurs Supra Moleculaires(ＳＶＳＭ)と呼ばれている、リン脂質 /糖脂質/多糖類の性質を有する粒子状担体について記載している。該粒子状担体 は、その層の１つにおいて生物活性を有する種々の分子を輸送すべく意図されて いる。 米国特許第５,０７５,１０９号は、５０:５０ポリ(ＤＬ-ラクチトドコ-グリコ リド)中へのカサガイ・ヘモシアニンをトリニトロフェニル化した抗原とブドウ 状球菌のエンテロトキシンＢのカプセル封入について記載している。カプセル封 入用の他のポリマーとしては、ポリ(グリコリド)、ポリ(ＤＬ-ラクチド-コ-グリ コリド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ(ラクチド-コ-カプロ ラクトン)、ポリ(エステルアミド)、ポリオルトエステルおよびポリ(８-ヒドロ キシブチル酸)、およびポリ無水物などが提案されている。 公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ ９１/０６２８２は、複数の生体付着性微小球 および抗原を含んでなる送達ビヒクルについて記載している。この微小球はデン プ ン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンからなる。この送達 ビヒクルは、鼻の粘膜を通じてワクチンを取り込むために特に意図されている。 該送達ビヒクルは、さらに吸収増強剤を含有し得る。 非複製ベクターを含有するＭＯＭＰ遺伝子は、それと適合する医薬上許容され る賦形剤と混合してもよい。かかる賦形剤には、水、塩水、ブドウ糖、グリセロ ール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられる。免疫原組成物およ びワクチンは、さらに浸潤剤または乳化剤、pH緩衝剤のような補助物質、あるい はそれらの効率を上げるためのアジュバントを含んでもよい。免疫原組成物およ びワクチンは、できれば注射部位を局所麻酔によって前処理した後に、皮下、静 脈、皮内または筋肉注射により非経口的に投与すればよい。別法として、本発明 に従って製造された免疫原組成物を処方して、粘膜表面で免疫応答を引き起こす ように送達することができる。このように、免疫原組成物は、例えば鼻腔または 経口(胃内)経路によつて粘膜表面に投与し得る。別法として、坐薬および経口処 方をはじめとする他の投与様式も望ましい。坐薬用のバインダーおよび担体には 、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドがある。経口処方の場 合、例えば医薬等級の砂糖、セルロースおよび炭酸マグネシウムのような通常用 いられる導入剤を含んでもよい。 免疫原組成物およびワクチンは、用量処方と適合するように、かつ、かかる量 が治療上有効であり、防御および免疫原性を有するに十分な量で投与する。投与 量は治療する患者に依存し、例えばＭＯＭＰおよびそれに対する抗体を合成し、 必要であれば細胞媒介免疫応答を引き起こすための個々の免疫系の許容量が含ま れる。投与に必要とされる有効成分の正確な量は、医師の判断による。しかしな がら、適切な用量の範囲は当業者により容易に決定でき、ＭＯＭＰ遺伝子含有ベ クターの約１μgないし約１mgのオーダーであればよい。最初の投与の用量と追 加用量の適切な養生法もまた様々であるが、最初の投与とそれに続く投与が含ま れ得る。用量はまた、投与経路にも依存し、宿主の大きさによりさまざまであろ う。１種の病原体のみを防御するワクチンが、１価ワクチンである。数種の病原 体の抗原物質を含有するワクチンは複合ワクチンであり、これもまた本発明に属 する。かかる複合ワクチンは、例えば種々の病原体または種々の系統の同一の病 原体、 あるいは種々の病原体を組み合わせたものに由来する物質を含有する。 ベクターを、通常はリン酸緩衝塩水中の０.０５ないし０.１パーセント溶液と して用いるアジュバントと同時に投与すれば、免疫原性を著しく向上させること ができる。アジュバントは抗原の免疫原性を増大させるが、必ずしも免疫原性そ のものであるわけではない。アジュバントは、投与部位の近傍に局所的に抗原を 保持することによって、免疫系の細胞に抗原の緩慢な徐放を促す貯蔵庫効果をも たらす作用をする。アジュバントはまた、抗原貯蔵庫に免疫系の細胞を引き付け 、かかる細胞を刺激して免疫応答を惹起することができる。 免疫刺激剤またはアジュバントを何年もの間用いることによって、例えばワク チンに対する宿主の免疫応答が改良される。このようにアジュバントは抗原に対 して免疫応答を増大させるということが確認されている。しかしながら、これら のアジュバントのいくつかには毒性があり、望ましくない副作用を引き起こすた め、ヒトおよび多くの動物でのそれらの使用が不適当とされることがある。実際 に、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム(ひとまとめにして通常は、 アルミと呼ばれる)のみが、ヒトおよび家畜用ワクチンにおいてアジュバントと して慣例的に用いられる。 広範囲の外来性のアジュバントおよび他の免疫刺激物質が、抗原に対して効力 ある免疫応答を引き起こすことができる。これらには、免疫刺激複合体(ＩＳＣ ＯＭＳ)を生産するための膜タンパク質と複合化したサポニン、鉱油とのプルロ ニックポリマー、鉱油中の死滅マイコバクテリア、フレンドの完全アジュバント 、ムラミルジペプチド(ＭＤＰ)およびリポ多糖類(ＬＰＳ)のような細菌生成物、 ならびにモノフォリル脂質Ａ，ＱＳ ２１およびポリホスフアゼンが挙げられる 。 本発明の特定の具体例では、クラミジアのＭＯＭＰ遺伝子をコードする第１の ヌクレオチド配列を含んでなる非複製ベクターは標的分子と結合して送達され、 該ベクターを免疫系細胞をはじめとする選択細胞を標的化すればよい。 この非複製ベクターは種々の方法によって宿主に送達すればよく、例えば、Ta ngら(参考文献１７)はウシ生長ホルモン(ＢＧＨ)をコードするＤＮＡで被覆した 金マイクロプロジェクティルをマウスの皮膚に導入した結果、このマウス中に抗 ＢＧＨ抗体が生産されることを開示しているが、Furthら(参考文献１８)はジェ ッ ト・インジェクターを用いて生きている動物の皮膚、筋肉、脂肪および乳房組織 をトランスフェクトすることが可能であったことを示した。 ２.イムノアッセイ 本発明のＭＯＭＰ遺伝子およびベクターは、酵素結合イムノソルベントアッセ イ(ＥＬＩＳＡ)、ＲＩＡおよび非酵素結合抗体結合アッセイまたは当該技術分野 において公知の方法をはじめとするイムノアッセイで使用する、抗ＭＯＭＰ抗体 の生産に対する免疫原として有用である。ＥＬＩＳＡアッセイでは、まず、非複 製ベクターを宿主に投与してＭＯＭＰに特異的な抗体を生産させる。これらのＭ ＯＭＰ特異的抗体を、選択した表面、例えばポリスチレン製マイクロタイタープ レートのウェルのような抗体結合が可能な表面上に固定する。洗浄して吸着の不 完全な抗体を除去した後に、試験サンプルに関して抗原としては無効であること か知られているウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)溶液のような非特異的タンパク質を 、その選択表面に結合させればよい。これによって、固定化表面上の非特異的吸 着部位をブロックすることができ、かくして、この表面上の抗血清の非特異的結 合によって引き起こされるバックグラウンドを減じることができる。 次いでこの固定化表面を臨床上または生物学上用いられる物質のようなサンプ ルと接触させて、免疫複合体(抗原/抗体)形成を起こすように試験する。この方 法として、サンプルを、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン(ＢＧＧ)および/または リン酸緩衝塩水(ＰＢＳ)/Ｔween溶液のような希釈剤で希釈することが挙げられ る。次いでサンプルを、約２０℃ないし３７℃のオーダーの温度で約２ないし４ 時間インキュベートさせる。インキュベーションの後に、サンプルと接触させた 表面を洗浄して免疫複合体を形成していない物質を除去する。この洗浄方法とし ては、ＰＢＳ／Ｔweenまたはホウ酸緩衝液のなどの溶液で洗浄することが挙げら れる。試験サンプルと、結合したＭＯＭＰ特異的抗体との間の特異的免疫複合体 を形成させ、続いて洗浄した後、免疫複合体の存在、さらには量までをも決定す ることができる。 実施例 前記の開示は、本発明を概して記載したものであって、以下の特定の実施例を 参照することにより、より完全な理解を得ることかできる。これらの実施例は単 に例示のために記載するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するも のではない。状況を示唆し、また、便宜をはかる場合には方法の変更および同等 物による代替が考慮される。本明細書において特定の用語が使用されているが、 かかる用語は限定を目的とするものではなく、説明のためのものである。実施例１： 本実施例は、ＭＯＭＰ遺伝子を含むプラスミドベクターの製造法を示すもので ある。 pＭＯＭＰ発現ベクターは以下のように作製した。クラミジア・トラコーマテ ィス・マウス・プニューモニティス(ＭｏＰｎ)系統のゲノムＤＮＡから、ＭｏＰ ｎの成熟ＭＯＭＰのＢａｍＭ１部位、リボゾーム結合部位、開始コドンおよびＮ 末端配列を含む５'プライマー(ＧＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣ ＴＧＴＧＧＧＧＡＡＴＣＣＴ)(配列番号１)およびＭｏＰｎ ＭＯＭＰのＣ末端 配列、Ｘhol部位および停止コドンを含む３'プライマー(ＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧ ＣＴＡＴＴＡＡＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣ)(配列番号２)を用い、ポリメラーゼ鎖 反応(ＰＣＲ)によってＭＯＭＰ遺伝子を増幅した。ＭＯＭＰリーダーペプチド遺 伝子配列のＤＮＡ配列は排除した。ＢａｍＨ１およびＸholによる消化の後に、 このＰＣＲ生成物を、ヒト・サイトメガロウイルス主要中間初期エンハンサー領 域(ＣＭＶプロモーター)の制御下での転写により、pcＤＮＡ３真核II-選択的発 現ベクター(Invitrogen,San Diego)中にクローン化した。このＭＯＭＰ遺伝子 をコードするプラスミドを、１００μg/mlのアンピシリンを含有するＬＢ肉汁中 で増殖させた大腸菌 ＤＨ５αＦ中にエレクトロポレーションにより移入した。 このプラスミドをWizard^TM Plus MaxiprepＤＮＡ精製システム(Promega,Madis on)により抽出した。記載されたように(参照文献２０)、組換えＭＯＭＰ遺伝子 の配列をＰＣＲ直接配列解析により証明した。精製プラスミドＤＮＡを1mg/mlの 濃度で塩水に溶解させた。ＤＮＡ濃度はＯＵ−６２分光光度計(Beckman,Fullert on,ＣＡ)により２６０ｎｍにて測定し、プラスミドのサイズはエチジウムブロマ イドで染色したアガロースゲルでＤＮＡ標準と比較した。 プラスミド含有ＭＯＭＰ遺伝子、pcＤＮＡ３/ＭＯＭＰは図７に示してある。実施例２： 本実施例はマウスのＤＮＡ免疫感作およびＤＴＨ試験の結果を示すものである 。 Ｃ.トラコーマティス・マウス・プニューモニティス系統(ＭｏＰｎ)により 誘発されたネズミ肺炎モデルを使用した(参照文献１１)。感染および疾病を引き 起こすのはヒトに限定されるＣ.トラコーマティスの大部分の系統とは異なり、 ＭｏＰｎは天然のネズミ病原体である。このモデルにおける一次感染は、再感染 に対して強力な防御免疫を誘発することが従前に証明されている。加えて、感染 のクリアランスはＣＤ４Ｔh1リンパ球応答に関連し、かつ、ＭＨＣクラスII抗原 提示に依存している(参照文献１１)。 実験デザインとして、４ないし５週齢のBalb/c雌マウス(５ないし１３匹/群 )を、実施例１の記載と同様にして作製したＭｏＰｎ ＭＯＭＰ遺伝子(１０９５ bp)のコーディング配列、または実施例１の記載と類似の方法で作製したＣ.ト ラコーマティス・セロバール(serovar)Ｌ₂ ＣＴＰシンセターゼ遺伝子(1619 b p(参照文献１０,１２))のコーディング配列を含有するプラスミドＤＮＡの筋肉 内投与(ＩＭ)または鼻腔内投与(ＩＮ)により免疫感作させた。ＣＴＰシンセター ゼはピリミジン生合成の最終工程を触媒する保存されたクラミジアの細胞質酵素 であり、防御免疫を誘発することは知られていない。陰性対照動物は塩水または 挿入されたクラミジア遺伝子を欠くプラスミドベクターを注射した。 筋肉内投与による免疫感作としては、両側の大腿四頭筋に、１注射部位あた り１００μgのＤＮＡの１００μl塩水溶液を０,3,および６週間目の３回注射し た。鼻腔内投与免疫感作としては、麻酔マウスに５０μgのＤＮＡを含有する塩 水２５μlを０,３,６週間目の３回吸入させた。陽性対照として、別のマウス群 に５×１０⁶封入体形成ユニット(ＩＦＵs)のＭｏＰｎ ＥＢsをフロイントの不 完全アジュバントとともに、上記スケジュールに従って腹腔内投与した。抗体の 測定のため、８週間目に全ての群のマウスの血清を採取し、脚への注射によりＭ ｏＰｎ Ｅbsに対する遅延型過敏症(ＤＴＨ)試験を行った(参照文献１３)。 ＭＯＭＰ ＤＮＡまたはＭｏＰｎ Ｅbsで感作させたマウスにおいて４８お よび７２時間における陽性ＤＴＨ反応が検出されたが、ブランクベクターで感作 させたマウスにおいては認められなかった(図１参照)。鼻腔内に送達されたＭＯ ＭＰ ＤＮＡにより惹起されたＤＴＨ反応は、Ｅbsで感作させたマウスにおいて 認め られたものに匹敵した。ＣＴＰシンセターゼによりワクチン接種されたマウス群 においてはＤＴＨ反応は認められなかった(表１の下記参照)。かくして、ＭＯＭ ＰＤＮＡの注射により、自然にプロセッシングを受けたＣ.トラコーマティスＥ Ｂsからのペプチドにより想起可能なＤＴＨ反応が生起され、一方ＣＴＰシンセ ターゼＤＮＡの注射によってはＤＴＨ反応は生起されなかった。実施例３： 本実施例は、マウスのＤＮＡ免疫感作および抗体産生を示すものである。 実施例２の記載と同様にＣＴＰシンセターゼＤＮＡの注射の結果として、組換 えＣＴＰシンセターゼに対する血清抗体が産生された(表１)(参照文献１４)。抗 原特異的血清Ａbsは、ＥＬＩＳＡ法により測定した。平底９６ウェルプレート(C orning ２５８０５,Corning Science Products,Corning,ＮＹ)を、組換えク ラミジアＣＴＰ-シンセターゼ(１μg/ml)または精製ＭｏＰｎ ＥＢs(６×１０⁴ ＩＦＵ/ウェル)の何れかを用い、４℃にて一晩被覆した。プレートを蒸留水です すぎ、４% ＢＳＡ ＰＢＳ-Ｔweenおよび1%低脂肪スキムミルクを用いて、室温 にて２時間ブロッキングした。血清サンプルの希釈は、９６ウェル丸底プレート で、抗原被覆プレートに適用直前に行った。このプレートを４℃で一晩インキュ ベートし、１０回洗浄した。次いでビオチニル化ヤギ抗マウスIgＧ１またはヤギ 抗マウスＩgＧ２ａ(Southern Biotechnology Associates,Inc.Birmingham,Ａ Ｌ)を３７℃にて１時間適用した。洗浄した後、ストレプトアビジン-アルカリホ スファターゼ複合体(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.Mississagua ,Ontario，Canada)を添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした。さらな る洗浄工程の後に、ホスファターゼ緩衝液(ｐＨ ９．８)中のホスファターゼ基 質を添加し、１時間放置して進展させた。このプレートをＢＩＯＲＡＤ３５５０ マイクロプレートリーダーを用い、４０５ｎｍにて測定した。 InＧ１の抗体価に比べてIgＧ２ａ抗体価は約１０倍高く、このことはＤＮＡ免 疫感作がより有力なＴ_H1様応答を惹起することを示唆している。実施例２の記載 と同様に、イムノブロットアッセイにより検出された(図２)ように、ＭＯＭＰＤ ＮＡの注射により、ＭＯＭＰに対する血清抗体の産生が起こった(表２)。しかし ながら、ＣＴＰシンセターゼＤＮＡまたはＭＯＭＰＤＮＡ免疫感作マウスのいず れに おいても、天然Ｃ.トラコーマティス・ＥＢsに結合する抗体の産生は認められず (表１)、このことは、抗体応答が主要な防御メカニズムではない可能性を示唆す るものである。前記したようなＤＮＡ免疫感作により誘発されるＭＯＭＰタンパ ク質(パネルＡおよびＢ)またはＭｏＰｎ(パネルＣおよびＤ)に対する血清IgＧサ ブクラス、IgＧ２ａ(パネルＡおよびＣ)およびIgＧ₁(パネルＢおよびＤ)の比較 は図４に含まれている。実施例４： 本実施例は、防御を達成するためのマウスのＤＮＡ免疫感作を示すものである 。 ＭＯＭＰＤＮＡにより惹起される細胞性免疫応答が機能的に重要であるかどう かを検討するために、in vivoにおける防御有効性を、１×１０³ＩＦＵのＣ.ト ラコーマティスＭｏＰｎの鼻腔内投与マウスにおいて評価した。クラミジアによ る罹患率の指標を得るために、Ｃ.トラコーマティス適用後１０日間にわたって 体重の減少を測定した(図２、パネルＡ参照)。非修飾ベクターを注射したマウス を陰性対照として用い、ＥＢsにより免疫感作させたマウスを陽性対照として用 いた。ＭＯＭＰＤＮＡの鼻腔内投与により免疫感作させたマウスはＥＢ免疫感作 マウスで観察されたものに匹敵する体重を維持した。ＭＯＭＰＤＮＡの筋肉内投 与により免疫感作させたマウスでは体重減少が認められたが、陰性対照群におい て認められたものほどの低下率ではなかった。 ＤＮＡワクチン接種による有効性のより直接的な指標は、ＭＯＭＰ ＤＮＡで 免疫感作させたマウスの、致死量以下の肺感染後のin vivoにおけるクラミジア の増殖を制限する能力である。適用後１０日目か増殖のピーク時期であり(参照 文献１３)、これを種々のマウス群の間の肺力価の比較のために選択した。ＭＯ ＭＰＤＮＡの鼻腔内投与により免疫感作させたマウスのクラミジア肺力価(log₁₀ ＩＦＵ １.３±０.３；平均±ＳＥＭ)は、ブランクベクターで免疫感作させ た対照マウスの値(Iog₁₀ ＩＦＵ ５.０±０.3)；に比して１０００倍以上低か った(p<０.０１)(図２、パネルＢ参照)。ＭＯＭＰＤＮＡの筋肉内投与により免 疫感作させたマウスのクラミジア肺力価は、非修飾ベクター群に比して１０倍以 上低かった(p=０.０１)。ＭＯＭＰＤＮＡの鼻腔内投与により免疫されたマウスの クラミジア肺力価はＭＯＭＰＤＮＡの筋肉内投与により免疫されたマウスの値に 比して有意に 低かった(それぞれlog₁₀ ＩＦＵ １.３±０.８対log₁₀ ＩＦＵ ０.６６±０. ３；p=０.３８)。ＭＯＭＰＤＮＡの鼻腔内投与および筋肉内投与免疫感作マウス において認められたクラミジア肺力価における実質的な相違(２.４ logs)は、 肺におけるクラミジア・クリアランスを促進するための免疫応答を誘発すること において、粘膜の免疫の方がより効果的であることを示唆している。非修飾ベク ター対照群において防御効果が認められなかったことより、ＤＮＡそのものが免 疫応答を担っているわけではないことが確認された。さらに、ＣＴＰシンセター ゼＤＮＡでの免疫感作後に防御免疫が認められなかったことより、免疫はＭＯＭ ＰＤＮＡ特異的であったことが確認された(表１参照)。図５はより高い適用用量 における同様の適用データを示している。実施例５： 本実施例はp^1/2ＭＯＭＰの構築について記載する。 ＰＣＲによりクローン化したMoPn遺伝子は、コドン１７７において欠失突然 変異を含むように構築した。この再構築(recitation)は、約１８３個のアミノ末 端アミノ酸を含有するＭＯＭＰタンパク質の切断をもたらす(参照文献１０)。p^{1 /2} ＭＯＭＰ と呼ばれるこの構築体を、実施例１に記載された方法により、ベク ターpcＤＮＡ３(Invitrogen)中ヘクローン化した。実施例６： 本実施例はp^1/2ＭＯＭＰを用いるマウスの免疫感作を示すものである。 Balb/cマウスを大腿四頭筋における３週間隔の３回の１００μgのp^1/2ＭＯＭ ＰＤＮＡで免疫感作させた。 最終の免疫感作後１５日目、すなわち、最初の注射後６０日目に、ＥＩＡアツ セイにおいてＭｏＰｎ Ｅbsの血清抗体を測定するためにマウスを採血し、ＤＴ Ｈの測定のため熱で死滅させたＥbs２５μl(５×１０⁴）を用いて脚に注射した( このＤＴＨは７２時間目に測定した)(参照文献１３)。マウスの鼻腔内にＭｏＰ ｎの１０００感染単位を適用し、それに続く１０日間にわたってそれらの体重を 測定した。この時、マウスを犠牲にし、肺中のＭｏＰｎの定量的培養物を測定し た(参考文献１３)。 表３は、p^1/2ＭＯＭＰ免疫感作がＭｏＰｎ Ｅbsの脚への注射に対して陽性Ｄ ＴＨ 応答を惹起したことを示している。また、Ｅbsの表面決定基に対する低力価(お よそ１/１００力価)の血清抗体もワクチン接種６０日後に検出された。非修飾ベ クターでの免疫感作は、血清抗原もＤＴＨ応答も惹起しなかった。図６のパネル Ａは、p^1/2ＭＯＭＰ免疫感作が、感染後の体重変化により、また、適用１０日後 の肺組織中のＭｏＰｎのin vivo増殖により測定した場合のＭｏＰｎの適用に対 する防御免疫応答が誘発したことを示している。塩水処理マウスのin vivo 増 殖はlog₁₀ ５.８±０.２１であり、p^1/2ＭＯＭＰ免疫感作マウスではlog₁₀ ３ .９±０.２５、p<０.０００１図２パネルＢであった。陽性対照として、熱で死 滅させたＥＢsで免疫感作させた、または、ＭｏＰｎの感染に先立って回復させ たマウスが著しく、試みた感染に対して同等の防御を示した(p<０.０００１)。 ＭｏＰｎ遺伝子のコドン１７７におけるフレームシフト欠失突然変異を用いる 本実施例で示されたように、感染の試みに対して顕著な防御免疫が惹起され、こ のことは防御部位がそのタンパク質のアミノ末端半分で見られ得ることを示唆す るものである。 開示の要約 本開示の要約において、本発明は、クラミジア系統、特に、Ｃ.トラコーマテ ィスによる感染によって引き起こされる疾病に対する、ヒトをはじめとする宿主 のＤＮＡをはじめとする核酸免疫感作方法であって、非複製ベクター、特にクラ ミジア系統の主要外膜タンパク質(ＭＯＭＰ)と宿主内でＭＯＭＰの発現を達成す るプロモーターとをコードするプラスミドベクターを使用する方法を提供する。 本発明の範囲内で改良が可能である。 表１ pＣＴＰシンターゼまたはＭｏＰｎＥＢ免疫感作後の血清抗体力価および 遅延型過敏応答、ならびにクラミジア・トラコーマティスのin vivo増殖。表２ クラミジア・トラコーマティス・マウス・プニューモニティス組換えＭＯ ＭＰおよびＥbsに対す る血清抗体ＥＬＩＳＡ力価は、ブランクベクター単独(p cＤＮＡ３)、ＭＯＭＰ遺伝子を含有するベクター(pＭＯＭＰ)およびＣＴＰシン ターゼ遺伝子を含有するベクター(pＣＴＰ)で免疫感作されたマウスの最初の免 疫感作後６０日に測定した。 また、非免疫感作マウスも試験した。 ＲＭＯＭＰ ＥＢ Ig Ｇ2a Ig Ｇ1 Ig Ｇ2a Ig Ｇ1 pcＤＮＡ３ <2.6^* <2.6 <2.6 <2.6 pＭＯＭＰ 3.77±0.1 2.90±0.14 3.35±0.11 <2.6 pＣＴＰ ＮＤ ＮＤ <2.6 <2.6 免疫感作前 <2.6 <2.6 <2.6 <2.6^* log１０平均±ＳＥlgＧイソタイプ特異的抗体力価 ＮＤ=実施されず表３ Ｐ１/２ＭＯＭＰまたはＥＢ免疫感作後６０日の免疫応答 免疫原 EBIgG_2a抗体力価(log₁₀) EBに対するDTH応答(mm×10²) EB(n=13) 5.6±0.4 9.6±2.0 p^1/2ＭＯＭＰ(n=13) 2.0±0 6±l.6 PcＤＮＡ３(n=13) 1.3±0 1±1 参考文献 １．Ｍ.Ａ.Liu,Ｍ.Ｒ.Hilleman,Ｒ.Kurth,Ann.Ｎ.Ｙ.Acad.Sci.772(1995)． ２．Ｄ.Ｍ.Pardoll and Ａ.Ｍ.Beckering,Immunity ３，165(1995); Ｗ.Ｍ. 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【手続補正書】特許法１８４条の第１項 【提出日】１９９９年３月３日（１９９９．３．３） 【補正内容】 (１)明細書第１頁の２４行の、「細胞外胞子様伝達細胞」を「細胞外胞子様伝 播 細胞」に訂正する。 (２)明細書第３頁の１〜２行の、「少なくとも３個の異なるクラミジア・セロ バルス(Chlamydia serovars)」を、「少なくとも３個の異なるクラミジアのセ ロバール(serovars、亜型) 」に訂正する。 (３)明細書第４頁の１６行の、「該ヌクレオチド配列を少なくとも１個の制御 配列に連結して、」を、「該ヌクレオチド配列を少なくとも１個の制御配列に作 動可能なように 連結して、」に訂正する。 (４)明細書第５頁の１０〜１１行の、「最終の免疫感作後１５日目に、マウス の鼻腔内に伝染性ＭｏＰｎ(１０００ ＩＦＵ)を適用した。」を、「最終の免疫 感作後１８日目に、マウスの鼻腔内に伝染性ＭｏＰｎ(１０００ ＩＦＵ)を適用 した.」に訂正する。 (５)明細書第５頁の１４〜１５行の、「肺組織由来の伝染性ＭｏＰｎの回復を 定量的組織培養によって分析して、」を、「肺組織由来の伝染性ＭｏＰｎの回収 量 的組織培養によって分析して、」に訂正する。 (６)明細書第６頁の５〜６行の、「最終の免疫感作後１５日目に、マウスの鼻 腔内に伝染性ＭｏＰｎ(１０⁴ ＩＦＵ)を適用した。」を、「最終の免疫感作後１ ８日目に、マウスの鼻腔内に伝染性ＭｏＰｎ(10⁴ ＩＦＵ)を適用した。」に訂正 する。 (７)明細書第９頁の８〜１０行の、「さらに、このポリカチオン性複合体が細 胞膜と融合した結果、リポソームのコンパートメントの分解酵素を迂回するポリ ヌクレオチドの細胞間送達が起こる。」を、「さらに、このポリカチオン性複合 体が細胞膜と融合した結果、リソソームのコンパートメントの分解酵素を迂回す るポリヌクレオチドの細胞間送達が起こる。」に訂正する。 (８)明細書第９頁の２１〜２３行の、 「米国特許第５，０７５，１０９号は、５０：５０ポリ(DＬ−ラクチトドコ-グ リコリド)中へのカサガイ・ヘモシアニンをトリニトロフェニル化した抗原とブ ドウ状球菌のエンテロトキシンＢのカプセル封入について記載している。」を、 「米国特許第５，０７５，１０９号は、５０：５０ポリ(ＤＬ−ラクチド-コ-グ リコリド)中へのトリニトロフェニル化した鍵穴をもつカサガイ・ヘモシアニン抗 原 とブドウ状球菌のエンテロトキシンＢのカプセル封入について記載している。 」に訂正する。 (９)明細書第１０頁の２３〜２５行の、「経口処方の場合、例えば医薬等級の 砂糖、セルロースおよび炭酸マグネシウムのような通常用いられる導入剤を含ん でもよい。」を、「経口処方の場合、例えば医薬等級のサッカリン、セルロース および炭酸マグネシウムのような通常用いられる導入剤を含んでもよい。」に訂 正する。 (１０)明細書第１１頁の１５〜１７行の、 「本発明の特定の具体例では、クラミジアのＭＯＭＰ遺伝子をコードする第１の ヌクレオチド配列を含んでなる非複製ベクターは標的分子と結合して送達され、 該ベクターを免疫系細胞をはじめとする選択細胞を標的化すればよい。」を、「 本発明の特定の具体例では、クラミジアのＭＯＭＰ遺伝子をコードする第１のヌ クレオチド配列を含んでなる非複製ベクターが、免疫系細胞を含む選択細胞をこ のベクターの標的とするための標的分子と結合して送達される。 」に訂正する。 (１１)明細書第１４頁の９〜１４行の、 「実験デザインとして、４ないし５週齢のBalb/c雌マウス(５ないし１３匹／群) を、実施例１の記載と同様にして作製したＭｏＰｎ ＭＯＭＰ遺伝子(１０９５ bp)のコーディング配列、または実施例１の記載と類似の方法で作製したＣ．ト ラコーマティス・セロバール(serovar)Ｌ₂ ＣＴＰシンセターゼ遺伝子(１６１ ９ bp(参照文献１０，１２))のコーディング配列を含有するプラスミドＤＮＡ の筋肉内投与(ＩＭ)または鼻腔内投与(ＩＮ)により免疫感作させた。」を、 「実験デザインとして、４ないし５週齢のBalb/c雌マウス群(５ないし１３匹/群 )を、実施例１の記載と同様にして作製したＭｏＰｎ ＭＯＭＰ遺伝子（１０９ ５ bp)のコーディング配列、または実施例１の記載と類似の方法で作製したＣ. トラコーマティスのセロバール(serovar)亜型)Ｌ₂ＣＴＰシンセターゼ遺伝子(１ ６１９ bp(参照文献１０，１２))のコーディング配列を含有するプラスミドＤ ＮＡの筋肉内投与(ＩＭ)または鼻腔内投与(ＩＮ)により免疫感作させた。」に訂 正する。 (１２)明細書第１６頁の９〜１１行の、 「ＭＯＭＰＤＮＡにより惹起される細胞性免疫応答が機能的に重要であるかどう かを検討するために、in vivoにおける防御有効性を、１×１０³ＩＦＵのＣ.ト ラコーマティスＭｏＰｎの鼻腔内投与マウスにおいて評価した。」を、 「ＭＯＭＰ ＤＮＡにより惹起される細胞媒介性免疫応答が機能的に重要である かどうかを検討するために、in vivoにおける防御有効性を、１×１０³ＩＦＵ のＣ.トラコーマティスMoPnの鼻腔内投与マウスにおいて評価した。」に訂正する 。 (１３)明細書第１６頁の１１〜１３行の、 「クラミジアによる罹患率の指標を得るために、Ｃ.トラコーマティス適用後１ ０日間にわたって体重の減少を測定した(図２、パネルＡ参照)。」を、 「クラミジアによる罹患率の指標を与えるために、Ｃ.トラコーマティス適用後 １０日間にわたって体重の減少を測定した(図２、パネルＡ参照)。」に訂正する 。 (１４)明細書p１７の２４行の、 「最終の免疫感作後１５日目、すなわち、最初の注射後６０日目に、ＥＩＡアッ セイにおいてＭｏＰｎ Ｅbsの血清抗体を測定するためにマウスを採血し、ＤＴ Ｈの測定のため熱で死滅させたＥbs２５μl(５×１０⁴)を用いて脚に注射した( このＤＴＨは７２時間目に測定した)(参照文献１３)。」を、 「最終の免疫感作後１５日目、すなわち、最初の注射後６０日目に、ＥＩＡアッ セイにおいてＭｏＰｎ ＥＢbsの血清抗体を測定するためにマウスを採血し、Ｄ ＴＨの測定のため熱で死滅させたＥＢｓ２５μl( ５×１０⁴ ＩＦＵ(封入体形成 ユニット)) を用いて脚に注射した(このＤＴＨは７２時間目に測定した)(参照文 献１３)。」に訂正する。 (１５)明細書p１８の６〜８行の、「塩水処理マウスのin vivo 増殖はlog₁₀ ５.８±０.２１であり、p^1/2ＭＯＭＰ免疫感作マウスではlog₁₀ ３.９±０. ２５、ｐ＜０.０００１、図２パネルＢであった。」を、「塩水処理マウスのin vivo 増殖はlog₁₀ ５.８±０.２１であり、p^1/2ＭＯＭＰ免疫感作マウスではl og₁₀ ３.９±０.２５、ｐ＜０.００１、(図２パネルＢ)。」に訂正する。 (１６)明細書p１９の１〜２行の、 「表１ pＣＴＰシンターゼまたはＭｏＰｎＥＢ免疫感作後の血清抗体力価およ び遅延型過敏応答、ならびにクラミジア・トラコーマティスのin vivo増殖。」 を、「表１ pＣＴＰシンターゼまたはＭｏＰｎＥＢ免疫感作後の血清抗体力価 および遅延型過敏( ＤＴＨ)応答、ならびにクラミジア・トラコーマティスのin vivo増殖。結果は平均±ＳＥＭで示した。」に訂正する。 【手続】 【提出日】1９９９年３月３日（１９９９．３．３） 【手続補正書】 【補正内容】 (１)請求の範囲を別紙の通り補正する。 (２)明細書第３頁の４行の、「弱毒された」を「弱毒化された」に変更する。 (２)明細書第４頁の４行の、「選択」を「選択肢」に変更する。 (３)明細書第４頁の７行の、「同投与法」を「鼻腔内投与法」に変更する。 (４)明細書第４頁の２４〜２５行の「ＤＮワクチン接種後のＤＴＨ応答。」を 削除する。 (５)明細書第６頁の４行の、「(n=５)をで」を「(n=５)で」に変更する。 (６)明細書第６頁の１４〜１６行の、「免疫感作を………免疫感作させた。」 を「マウスを(□)模擬免疫感作させ、(○)死滅させたＭｏＰｎ ＥＢsを用いて 腹膜内に免疫感作させ、(△)前もってＭｏＰｎの肺感染から回復させ、または( ●)Ｐ^1/2ＭＯＭＰを用いて筋肉内に免疫感作させた。」に変更する。 (７)明細書第６頁の２１行の、「マウスにおいて実験を達成を可能にする」を 、「マウスに作用させる実験を可能にする」に変更する。 (８)明細書第６頁の２２〜２３行の、「一次感染は再感染に対する強力な防御 免疫を誘発するモデルであることが」を「このモデルにおいては一次感染は再感 染に対する強力な防御免疫を誘発することが」に変更する。 (９)明細書第７頁の３〜４行の、「エレクトロペレーション(electroperation )」を「エレクトロポレーション(electroporation)」に変更する。 (１０)明細書第７頁の６行の、「のようないずれの」を「のようないずれかの 」に変更する。 (１１)明細書第７頁の１９行の、「ことｇできる」を「ことができる」に変更 する。 (１２)明細書第８頁の１８行の、「血液型亜型」を「亜型」に変更する。 (１３)明細書第９頁の１７行の、「ＳＶＳＭ」を「ＢＶＳＭ」に変更する。 (１４)明細書第１０頁の２５〜２６行の、「最初の投与とそれに続く投与」を 「最初の投与にそれ以降の投与が従うやり方」に変更する。 (１５)明細書第１１頁の９〜１０行の、「アジュバントを何年もの間用いるこ とによって、例えばワクチンに対する宿主の免疫応答が改良される。」を「アジ ュバントは、例えばワクチンに対する宿主の免疫応答を改良するために、長年に わたり用いられてきた。」に変更する。 (１６)明細書第１１頁の１７行の、「免疫刺激物質」を「免疫調節物質」に変 更する。 (１７)明細書第１１頁の１９行の、「膜タンパク質」を「膜タンパク質抗原」 に変更する。 (１８)明細書第１２頁の５〜６行の、「ＲＩＡおよび非酵素結合抗体結合アッ セイまたは当該技術分野において公知の方法をはじめとする」を、「ＲＩＡおよ び他の非酵素結合抗体結合アッセイまたは当該技術分野において公知の方法を含 む」に変更する。 (１９)明細書第１３頁の１０行の、「ＢａｍＭ１部位」を「ＢａｍＨ１部位」 に変更する。 (２０)明細書第１３頁の２５行の、「ＯＵ−６２」を「ＤＵ−６２」に変更す る。 (２１)明細書第１４頁の１６〜１７行の、「挿入されたクラミジア遺伝子を欠 く」を、「クラミジア遺伝子の挿入を欠く」に変更する。 (２２)明細書第１５頁の２５行の、「InＧ1を、「IgＧ1に変更する。 (２３)明細書第１５頁の２７行、および２９行にそれぞれ記載の「ＭＯＭＰＤ ＮＡ」を「ＭＯＭＰ ＤＮＡ」に変更する。 (２４)明細書第１６頁の９行、１４〜１５行、１６行、２２〜２３行、２６行 、2２８行および２９行にそれぞれ記載の「ＭＯＭＰＤＮＡ」を「ＭＯＭＰ Ｄ ＮＡ」に変更する。 (２５)明細書第１６頁の２５〜２６行の、「(log₁₀ ＩＦＵ ５.０±０.３) ；に比して１０００倍以上低かつた(p＜０.０１)(図２、パネルＢ参照)。」を、 「(log₁₀ ＩＦＵ ５.０±０.３;p＜０.０１)に比して１０００倍以上低かった (図２、パネルＢ参照)。」に変更する。 (２６)明細書第１８頁の２行、８行および２０〜２１行にそれぞれ記載の「Ｍ ＯＭＰＤＮＡ」を「ＭＯＭＰ ＤＮＡ」に変更する。 (２７)明細書第１７頁の５行の、「免疫の」を、「免疫感作の」に変更する。 (２８)明細書第１７頁の１４〜１５行の、「(recitation)は、………切断をも たらす」を、「(recitation)により、約１８３個のアミノ末端アミノ酸を含有す るＭＯＭＰタンパク質の切断片が得られる」に変更する。 (２９)明細書第１７頁の２３行、２４行及び２９行に記載の「Ｅbs」を「ＥＢ s」に変更する。 (３０)明細書第１８頁の１行の「Ｅbs」を「ＥＢs」に変更する。 (３１)明細書第１８頁の９行の、「ＭｏＰｎの感染に先立って」を、「前もっ てＭｏＰｎの肺感染より」に変更する。 (３２)明細書第１８頁の２０行の、「コードするプラスミドベクター」を、「 コードするヌクレオチド配列を含むプラスミドベクター」に変更する。 (３３)明細書第１９頁の表２を以下のとおりに変更する。 表２ クラミジア・トラコーマティス・マウス・プニューモニティス組換えＭＯ ＭＰおよびＥＢｓに対する血清抗体ＥＬＩＳＡ力価は、ブランクベクター単独(p cＤＮＡ３）、ＭＯＭＰ遺伝子を含有するベクター（ｐＭＯＭＰ）およびＣＴＰ シンターゼ遺伝子を含有するベクター(pCTP)で免疫感作されたマウスの最初の免 疫感作後６０日に測定した。 また、非免疫感作マウスも試験した。 ｒＭＯＭＰ ＥＢ Ig Ｇ2a Ig Ｇ1 Ig Ｇ2a Ig Ｇ1 pcＤＮＡ３ <2.6^* <2.6 <2.6 <2.6 ｐＭＯＭＰ 3.77±0.1 2.90±0.14 3.35±0.11 <2.6 pＣＴＰ ＮＤ ＮＤ <2.6 <2.6 免疫感作前 <2.6 <2.6 <2.6 <2.6^* log₁₀平均±ＳＥIgＧイソタイプ特異的抗体力価 ＮＤ＝実施されず (３４)明細書第２０頁の表３の表題の、「Ｐ１／２ＭＯＭＰ」を、「Ｐ^1/2Ｍ ＯＭＰ」に変更する。 請求の範囲 １.クラミジア系統主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）に対する、防護免疫応答 を宿主内に形成させるため、in vivoで宿主に投与する免疫原組成物であって、 ＭＯＭＰ特異的免疫応答を起こすＭＯＭＰまたはＭＯＭＰ断片をコードするヌ クレオチド配列と、 宿主中での該ＭＯＭＰの発現のための該ヌクレオチド配列に作動可能なように 連結させたプロモーター配列と、 それらのための医薬上許容される担体と、 を有する非複製ベクター を含むことを特徴とする組成物。 ２.該ヌクレオチド配列がＭＯＭＰの全長をコードすることを特徴とする請求 項１記載の組成物。 ３.該ヌクレオチド配列がＭＯＭＰのＮ末端からその全長の約半分までのサイ ズを有する断片をコードすることを特徴とする請求項１記載の組成物。 ４.該プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーターであることを特 徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の組成物。 ５.該クラミジア系統が肺のクラミジア感染を起こす系統であることを特徴と する請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。 ６.該クラミジア系統がクラミジア・トラコーマティス系統であることを特徴 とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。 ７.該非複製ベクターが該プロモーター配列を含むプラスミドpcＤＮＡ３を含 んでなり、かつ該ヌクレオチド配列が該プロモーター配列に対して作動するよう に挿入されたことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物 。 ８.該免疫応答が主として細胞性免疫応答であることを特徴とする請求項１な いし７のいずれか１項に記栽の組成物。 ９.該ヌクレオチド配列が、野生型クラミジアに曝された後に、想起免疫応答 を刺激するＭＯＭＰをコードすることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか １項に記載の組成物。 １０.非複製ベクターであって、 ＭＯＭＰ特異的免疫応答を起こす、クラミジア系統の主要外膜タンパク質(Ｍ ＯＭＰ)またはＭＯＭＰ断片をコードするヌクレオチド配列と、 免疫原組成物のin vivoでの投与によりＭＯＭＰに対する防護免疫応答を起こ すための、該免疫原組成物の生産における、該ベクターがin vivoで投与された 宿主における該ＭＯＭＰの発現のために該ヌクレオチド配列に作動可能なように 連結されたプロモーター配列 とを含んでなる非複製ベクター。 １１.該ヌクレオチド配列がＭＯＭＰの全長をコードすることを特徴とする請 求項１０記載の非複製ベクター。 １２.該ヌクレオチド配列がＭＯＭＰのＮ末端からその全長の約半分までのサ イズを有する断片をコードすることを特徴とする請求項10記載の非複製ベクター 。 １３.該プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーターであることを 特徴とする請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の非複製ベクター。 １４.該クラミジア系統が肺のクラミジア感染を起こす系統であることを特徴 とする請求項１０ないし１３のいずれか１項に記載の非複製ベクター。 １５.該クラミジア系統がクラミジア・トラコーマティス系統であることを特 徴とする請求項１０ないし１４のいずれか１項に記載の非複製ベクター。 １６.該非複製ベクターが、該ヌクレオチド配列が該プロモーター配列に対し て作動するように挿入された該プロモーター配列を含むプラスミドpcＤＮＡ３か らなることを特徴とする請求項１０ないし１５のいずれか１項に記載の非複製ベ クター。 １７.該免疫原組成物が鼻腔内投与される請求項１０ないし１６のいずれか１ 項に記載の非複製ベクター。 １８.該宿主がヒト宿主である請求項１０ないし１７のいずれか１項に記載の 非複製ベクター。 １９.クラミジア系統の感染により引き起こされる疾病に対する宿主の防御の ためのワクチンを製造する方法であって、 ＭＯＭＰ特異的免疫応答を起こすクラミジア系統の主要外膜タンパク質(ＭＯ ＭＰ)またはＭＯＭＰ断片をコードするヌクレオチド配列を単離し、 ヌクレオチド配列を少なくとも１つの制御配列に作動可能なように連結させて 、非複製ベクターを生産し、この制御配列が、宿主に導入された場合に、該ＭＯ ＭＰの発現を指示して、該ＭＯＭＰに対する免疫応答を起こし、 次いで、該ベクターを宿主へのin vivo投与のためのワクチンとして処方する ことを特徴とする方法。 ２０.請求項１９記載の方法により生産されたワクチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/295 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １.クラミジア系統主要外膜タンパク質(ＭＯＭＰ)に対する、防護免疫応答を 宿主内に形成させるため、in vivoで宿主に投与する免疫原組成物であって、 ＭＯＭＰ特異的免疫応答を起こすＭＯＭＰまたはＭＯＭＰ断片をコードするヌ クレオチド配列と、 宿主中での該ＭＯＭＰの発現のための該ヌクレオチド配列に作動可能なように 連結させたプロモーター配列と、 それらのための医薬上許容される担体を含んでなる非複製ベクターを含んでな る組成物 ２.該ヌクレオチド配列が全長ＭＯＭＰをコードする請求項１記載の組成物。 ３.該ヌクレオチド配列が全長ＭＯＭＰの約半分のサイズのＭＯＭＰのＮ末端 断片をコードする請求項１記載の免疫原組成物。 ４.該プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーターである請求項１ 記載の免疫原組成物。 ５.該クラミジア系統が肺のクラミジア感染を起こす系統である請求項１記載 の免疫原組成物。 ６.該クラミジア系統がクラミジア・トラコーマティス系統である請求項１記 載の免疫原性。 ７.該非複製ベクターが該プロモーター配列を含むプラスミドpcＤＮＡ３を含 んでなり、かつ該ヌクレオチド配列が該プロモーター配列に対して作動するよう に挿入された請求項６記載の免疫原組成物。 ８.該免疫応答が主として細胞性免疫応答である請求項１記載の組成物。 ９.該ヌクレオチド配列が、野生型クラミジアに曝された後に、想起免疫応答 を刺激するＭＯＭＰをコードする請求項１記載の組成物。 １０.クラミジア系統の感染により引き起こされる疾病に対して宿主を免疫感 作させる方法であって、 ＭＯＭＰ特異的免疫応答を起こす、クラミジア系統の主要外膜タンパク質(Ｍ ＯＭＰ)またはＭＯＭＰ断片をコードするヌクレオチド配列と、 宿主における該ＭＯＭＰの発現のために該ヌクレオチド配列に作動可能なよう に連結されたプロモーター配列 とを含んでなる非複製ベクターの有効量を、宿主へ投与することを特徴とする方 法。 １１.該ヌクレオチド配列が全長ＭＯＭＰをコードする請求項１０記載の方法 。 １２.該ヌクレオチド配列が全長ＭＯＭＰの約半分のサイズのＭＯＭＰのＮ末 端断片をコードする請求項１０記載の方法。 １３.該プロモーター列がサイトメガロウイルスプロモーターある請求項１Ｏ 記載の方法。 １４.該クラミジア系統が肺のクラミジア感染を起こす系統である請求項1１０ 記載の方法。 １５.該クラミジア系統がクラミジア・トラコーマティス系統である請求項１ ０記載の方法。 １６.該非複製ベクターが、該ヌクレオチド配列が該プロモーター配列に対し て作動するように挿入された該プロモーターを含むプラスミドpcＤＮＡ３からな る請求項１０記載の方法。 １７.該免疫応答が主として細胞性免疫応答である請求項１０記載の方法。 １８.該ヌクレオチド配列が、野生型クラミジアに曝された後に、想起免疫応 答を刺激するＭＯＭＰをコードする請求項１０記載の方法。 １９.該非複製ベクターが鼻腔内投与される請求項１０記載の方法。 ２０.該宿主がヒト宿主である請求項１０記載の方法。 ２１.宿主においてＭＯＭＰ特異的免疫応答を形成して免疫応答を起こさせる 、クラミジア系統の主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）またはＭＯＭＰ断片をコー ドする遺伝子を用いる方法であって、 遺伝子を単離し、 遺伝子を、少なくとも１つの制御配列に作動可能なように連結して、非複製ベ クターを生産し、この制御配列が、宿主に導入された場台に、該ＭＯＭＰの発現 を指示して該ＭＯＭＰに対する免疫応答を起こし、 次いで、該ベクターを宿主に導入することを特徴とする方法。 ２２.ＭＯＭＰをコードする該遺伝子が全長ＭＯＭＰをコードする請求項２１ 記載の方法。 ２３.ＭＯＭＰをコードする遺伝子が全長ＭＯＭＰの約半分のサイスのＭＯＭ ＰのＮ末端断片をコードする請求項２１記載の方法。 ２４.該制御配列がサイトメガロウイルスプロモーターである請求項２１記載 の方法。 ２５.該クラミジア系統が肺のクラミジア感染を起こす系統である請求項２１ 記載の方法。 ２６.該クラミジア系統がクラミジア・トラコーマティス系統である請求項２ １記載の方法。 ２７.該非複製ベクターが該制御配列を含むプラスミドpcＤＮＡ３を含んでな り、かつＭＯＭＰをコードする該遺伝子が該制御配列に対して作動するように挿 入された請求項２１記載の方法。 ２８.該免疫応答が主として細胞性免疫応答である請求項２１記載の方法。 ２９.ＭＯＭＰをコードする該遺伝子が、野生型クラミジアに対する曝露の後 に起こる免疫応答回復を刺激する請求項２１記載の方法。 ３０.該べクターが該宿主に鼻腔内投与される請求項２１記載の方法。 ３１.該宿主がヒト宿主である請求項２１記載の方法。 ３２.クラミジア系統の感染により引き起こされる疾病に対する宿主の防御の ためのワクチンを製造する方法であって、 ＭＯＭＰ特異的免疫応答を起こすクラミジア系統の主要外膜タンパク質(ＭＯ ＭＰ)またはＭＯＭＰ断片をコードするヌクレオチド配列を単離し、 ヌクレオチド配列を少なくとも１つの制御配列に作動可能なように連結させて 、非複製ベクターを生産し、この制御配列が、宿主に導入された場合に、該ＭＯ ＭＰの発現を指示して、該ＭＯＭＰに対する免疫応答を起こし、 次いで、該ベクターを宿主へのin vivo投与のためのワクチンとして処方する ことを特徴とする方法。 ３３.求項３２の方法により生産されたワクチン。