JP3881514B2 - クラミジア感染症に対するｄｎａ免疫化 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫学および、具体的には、クラミジアによる感染に対しての防御を提供するための核酸を用いる宿主の免疫化に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＤＮＡ免疫化は、感染症に対する防御免疫を生み出すための１つの手法である（ｒｅｆ．１−本出願全体に渡って、様々な参考文献を括弧内に引用し、本発明が関係する技術分野の現状をより完全に説明する。それぞれの引用に関する完全な文献情報は、明細書の最後、特許請求の範囲の直前に見い出される。これらの参考文献の開示を、参照により本開示に組み込む）。タンパク質またはペプチドをベースとするサブユニットワクチンと異なり、ＤＮＡ免疫化は、宿主細胞による異種タンパクの発現によって防御免疫を提供し、ウイルスまたは細胞内病原体による感染中に生じる防御免疫により類似する方法で免疫系に対する抗原の提示を可能にする（ｒｅｆ．２）。この技法によってかなりの利益が生み出されてきたが、ウイルス疾患に関する成功した免疫は、一貫してＤＮＡ免疫化によって誘導されたものである（ｒｅｆ．３）。結果は、病原体の性質、選択された免疫化抗原、および免疫化経路の違いを反映し、非ウイルス病原体に関しては様々である（ｒｅｆ．４）。ＤＮＡワクチン接種のさらなる開発は、内在する免疫学的機構の解明およびワクチン開発の現在の戦略が失敗した他の感染症に対して適用を広げることにかかっている。
【０００３】
クラミジアトラコマティスは、偏性の細胞内細菌性病原体であり、通常、ヒト宿主の粘膜上皮表面に局在化している。クラミジア属は、基本小体と呼ばれる細胞外胞子様伝達細胞および網状体と呼ばれる細胞内複製細胞を有する二形性細菌である（ｒｅｆ．５）。公衆衛生の観点から、クラミジア感染症は、それらが不妊症、失明の重要な原因であり、１型ヒト免疫不全ウイルスの伝達を容易にする有力な補助因子であることから、その重要性は深まっている（ｒｅｆ．６）。クラミジアトラコマティスに対する防御免疫は、Ｔｈ１様ＣＤ４リンパ球応答および粘膜分泌液中の局所抗原によって放出されるサイトカインによってもたらされ、量的にクラミジア細菌細胞上の主要な表面タンパク質であり約４０ｋＤａの分子量を有する主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）を主な対象にしていると考えられている（ｒｅｆ．１９）。
【０００４】
クラミジアワクチンの開発における初期の試みは、まるごとの細菌細胞による非経口的免疫化に基づくものであった。この手法は、ヒト試験において成功したが、防御が短命かつ不完全であり、ワクチン接種が、その後の感染エピソード中に、恐らくある種のクラミジア抗原に対する病理反応により、疾患を悪化させることがあるために制限されたものであった（ｒｅｆ．８）。クラミジアワクチンの設計におけるより最近の試みは、ＭＯＭＰタンパク質またはポリペプチドを用いるサブユニット設計に基づくものである。これらのサブユニットワクチンも一般的には失敗に終わったが、それは免疫原が生物体上の未変性エピトープによって回復される防御的細胞性および体液性免疫応答を誘導しないためであろう（ｒｅｆ．９）。
【０００５】
ＥＰ１９２０３３は、以下の動作可能に結合された要素を含む、クラミジアトラコマティスＭＯＭＰポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させるためのＤＮＡ作成物の供給について記載している。
【０００６】
転写性プロモーター、
付録Ａに示す配列の少なくとも２７個の塩基対長のＭＯＭＰポリヌクレオチドを含む、クラミジアトラコマティスＭＯＭＰポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、および
転写性調節要素のうち少なくとも１つがクラミジアトラコマティス由来ではない転写性ターミネーター。この従来技術には、このような作成物によりＤＮＡ免疫化を行うための開示または示唆は存在しない。
【０００７】
ＷＯ９４／２６９００は、クラミジアトラコマティスのＭＯＭＰからクラミジアエピトープを発現し、少なくとも３種の異なるクラミジア血清型と免疫反応性である抗体を誘導することのできるハイブリッドピコルナウイルスの供給について記載している。ヒト投与には、ハイブリッドピコルナウイルスは、弱毒化されたハイブリッドポリオウイルスが好ましい。
【０００８】
本出願と同じ譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込むＷＯ９８／０２５４６は、クラミジア菌株の主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）をコードする、またはＭＯＭＰのＮ末端の半分をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターによる宿主のＤＮＡ免疫化について記載している。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、宿主において、エピトープ配列を包含するクラミジア菌株のＭＯＭＰの断片に対する防御抗体を産生するための核酸免疫化、具体的にＤＮＡ免疫化に関する。ＤＮＡ免疫化は、Ｔｈ１様ＣＤ４反応および粘膜性免疫を含む広範囲な免疫応答を誘導する。
【００１０】
本発明の一態様では、クラミジア菌株の主要外膜タンパク質の定常ドメイン２、３および５のうち少なくとも１つを含む領域をコードするヌクレオチド配列、および宿主において少なくとも１つの定常ドメインを発現するためにヌクレオチド配列に動作可能に結合されたプロモーター配列を含む非複製ベクターを提供する。
【００１１】
エピトープ配列を包含するＭＯＭＰ遺伝子断片には、クラミジア菌株のＭＯＭＰの１つまたは複数の定常ドメイン（ＣＤ）配列および／または１つまたは複数の可変ドメイン（ＶＤ）が含まれていてもよい。具体的には、断片は、ＣＤ２およびＶＤ２配列、ＣＤ３およびＶＤ３配列およびＣＤ５配列を包含することができる。このような断片をコードするヌクレオチド配列を含むクローンを、本明細書ではクローンＣＶ２、ＣＶ３およびＣＤ５と呼ぶ。クローンＣＶ２は、クラミジアトラコマティスＭＯＭＰ遺伝子の２４７から４６８のヌクレオチドを包含し、クローンＣＶ３は、クラミジアトラコマティスＭＯＭＰ遺伝子の４６９から６９６のヌクレオチドを包含し、クローンＣＶ５は、クラミジアトラコマティスＭＯＭＰ遺伝子の９３１から１０９８のヌクレオチドを包含する。本発明は、定常ドメイン２、３および５を用いる。
【００１２】
クラミジア菌株は、肺のクラミジア感染症を含むクラミジア菌株で、クラミジアトラコマティスまたは肺炎クラミジアを含む。非複製ベクターは、ヌクレオチド配列が挿入されるプラスミドｐｃＤＮＡ３である。刺激される免疫応答は、主に細胞性免疫応答である。
【００１３】
本発明の一態様では、クラミジア菌株の主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）に対する防御免疫応答を宿主で生み出すため宿主にｉｎ ｖｉｖｏで投与するための免疫原生組成物であって、ＭＯＭＰ特異的免疫応答を生み出すための非複製ベクター、および宿主においてＭＯＭＰ断片を発現するためにヌクレオチド配列に動作可能に結合されたプロモーター配列、および薬剤として許容される坦体を含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様では、クラミジア菌株の感染による疾患に対して宿主を免疫化する方法であって、ＭＯＭＰ特異的免疫応答を生み出す本明細書に示す有効量の非複製ベクターおよび宿主において定常配列を発現するために動作可能にヌクレオチド配列と結合されたプロモーター配列を宿主に投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
本発明のこれらの態様では、前述の様々な選択肢および代替策を用いることができる。
【００１６】
非複製ベクターは、筋肉内または鼻腔内などの任意の便利な方法でヒト宿主を含む宿主に投与することができる。鼻腔内投与は、本明細書で行った実験でもっとも強力な免疫応答を刺激した。
【００１７】
本発明にはまた、その追加の態様として、宿主において免疫応答を生み出すため、ＭＯＭＰ特異的免疫応答を生み出すＭＯＭＰ断片をコードするヌクレオチド配列を使用する方法であって、前述のようにヌクレオチド配列を単離すること、ヌクレオチド配列を少なくとも１つの制御配列に動作可能に結合させて非複製ベクターを製造すること、ＭＯＭＰ断片に対する免疫応答を生み出すために宿主に導入されたときにＭＯＭＰ断片を発現するように制御配列を方向づけること、および宿主へベクターを導入することを含む方法が含まれる。
【００１８】
本発明の別の態様は、クラミジア菌株の感染による疾患に対して宿主を防御するためのワクチンを製造する方法であって、前述のようにＭＯＭＰ特異的免疫応答を生み出すＭＯＭＰ断片をコードするヌクレオチド配列を単離すること、ヌクレオチド配列を少なくとも１つの制御配列に動作可能に結合させて非複製ベクターを製造すること、ＭＯＭＰ断片に対する免疫応答を生み出すために宿主に導入されたときにＭＯＭＰ断片を発現するように制御配列を方向づけること、および宿主にｉｎ ｖｉｖｏで投与するためのワクチンとしてベクターを製剤化することを含む方法を提供する。本発明は、この方法によって製造されたワクチンもその範囲に含む。
【００１９】
したがって、本発明の利点には、ＭＯＭＰ特異的免疫応答を生み出すクラミジア菌株の主要外膜タンパク質のエピトープ配列をコードする核酸配列の核酸免疫化により、クラミジア菌株によって運ばれる感染症に対する防御免疫応答を獲得する方法が含まれる。
【００２０】
（発明の一般的説明）
本発明を図示するため、自然のマウス病原体であってマウスで行う実験を可能にするクラミジアトラコマティスマウス肺炎菌株（ＭｏＰｎ）のＭＯＭＰ遺伝子断片を含むプラスミドＤＮＡを作成した。このモデルにおける一次感染は、再感染に対して強力な防御免疫を誘導することが知られている。ヒト免疫化には、クラミジアトラコマティス血清型Ｃなどのヒト病原体菌株を使用する。
【００２１】
ＭＯＭＰ遺伝子断片に対しては、ｐｃＤＮＡ３、真核ＩＩ選択可能発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）などの、サイトメガロウイルスプロモーターを含む好都合ないずれのプラスミドベクターも用いることができる。ＭＯＭＰ遺伝子断片は、好都合ないずれの方法によってもベクターに挿入することができる。遺伝子断片は、適当なプライマーを用いるＰＣＲによりクラミジアトラコマティスのゲノムＤＮＡから増幅され、ＰＣＲ生成物をベクターの中にクローン化することができる。ＭＯＭＰ遺伝子を運ぶプラスミドは、電気穿孔法などにより、複製のために大腸菌に移すことができる。プラスミドは、好都合ないずれの方法によっても大腸菌から抽出することができる。
【００２２】
ＭＯＭＰ遺伝子断片を含むプラスミドは、薬剤として許容される坦体と一緒に、筋肉内または鼻腔内などの好都合ないずれの方法によっても宿主に投与することができる。以下に概要を説明する実験では、プラスミドＤＮＡの鼻腔内投与が最も強力な免疫応答をもたらすことが判明した。
【００２３】
本明細書に示され詳細を後述するデータは、特異的クラミジアトラコマティスＭＯＭＰ遺伝子断片によるＤＮＡ免疫化が、細胞性と体液性免疫応答を共にもたらし、クラミジアトラコマティスＭｏＰｎによる肺チャレンジ感染に対して顕著な防御免疫を生み出すことを示している。その結果は、免疫原として組換えＭＯＭＰタンパク質または合成ペプチドを用いて得られた結果より有望であり、ＤＮＡ免疫化は、必要な防御的細胞性および体液性免疫応答をもたらすためにクラミジアのサブユニット免疫原を送達する代替方法であることを示唆している。
【００２４】
本明細書に示されるデータはまた、ＤＮＡ免疫化のためには抗原遺伝子断片の選択が重要であることを示している。前述のＷＯ９８／０２５４６に記載されているように、抗原遺伝子は、自然の病原体に暴露後の免疫回復を刺激できる免疫応答をもたらす。具体的には、主要表面タンパク質（ｐＭＯＭＰ）またはその断片をコードするＤＮＡ発現ベクターの注射は、その後のクラミジアによるチャレンジに対する顕著な防御免疫を生み出すが、クラミジアトラコマティスの細胞質酵素（ＣＴＰ合成酵素）をコードするＤＮＡ発現ベクターは防御免疫を生み出さない。ＤＮＡワクチン接種によってもたらされる抗体はもとのままのＥＢに結合しないため、防御免疫応答は、体液性免疫ではなく主に細胞性免疫によって仲介されるようである。さらに、陽性ＤＴＨ反応で示されるように、ＣＴＰ合成酵素ＤＮＡ免疫化ではなくＭＯＭＰ ＤＮＡ免疫化がもとのままのＥＢによって容易に回復する細胞性免疫をもたらした。
【００２５】
さらに、ＷＯ９８／０２５４６に示されるように、ＭＯＭＰ ＤＮＡの粘膜送達は、筋肉内注射に比べ、クラミジアトラコマティス感染症に対する防御免疫を誘導するのにより効率的である。このことは、本質的に粘膜表面に限定されるクラミジアトラコマティス感染症の性質および抗原提示の効率性に関連していると思われる（ｒｅｆ．１４）。樹枝状細胞が肺の呼吸性上皮に豊富にあり迅速に動員されることが鼻腔内ＤＮＡ免疫化実験の有効性が高められたことと関連していると思われる（ｒｅｆ．１５）。ＷＯ９８／０２５４６に示されたデータは、実質的な防御免疫を生じさせる初めてのサブユニットクラミジアワクチンの実証を表している。
【００２６】
さらに、完全な免疫を達成するため、抗原遺伝子の他に免疫調節性サイトカインを発現するＤＮＡを同時投与することにより防御免疫応答を増幅する（および／または導く）ことができると考えられる（ｒｅｆ．２１）。クラミジアの複数の抗原遺伝子を使用することは、ＤＮＡワクチン接種によって達成される防御免疫のレベルを高めると考えられる。
【００２７】
ＷＯ９８／０２５４４６によるＭＯＭＰ ＤＮＡ免疫化に関する可能な関心は、ヒトクラミジアトラコマティス菌株のＭＯＭＰが高度な二形性であるため（ｒｅｆ．１６）、この抗原遺伝子に基づく普遍的なクラミジアワクチンを生み出すことが困難と考えられているという観察から生じたものである。この問題を解決する方法の１つは、本明細書に記載するように、ＭＯＭＰ分子内の定常的防御エピトープを探すことである。以下に示す結果に見られるように、図２で同定された定常および可変ドメイン、または定常ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むある種のベクターは、図３に示すように、体重損失による測定で、防御免疫応答を生み出した。図４は、ｐＣＶ３およびｐＣＤ５抗原が、チャレンジ後１０日目の肺組織におけるＭｏＰｎのｉｎ ｖｉｖｏ成長によって測定されるように、ＭｏＰｎチャレンジに対する防御免疫応答を引き起こしたことを示している。図５は、ベクターによる免疫化が、ＭｏＰｎ Ｅｂの足蹠注射の場合に可変的陽性ＤＴＨ反応をもたらしたことを示している。
【００２８】
図６および７は、定常および可変ドメインおよび全ＭＯＭＰ遺伝子を含むベクターに対する脾細胞の増殖応答を示している。図６および７に示す結果は、ｐＣＶ３およびｐＭＯＭＰが細胞性免疫応答をもたらすことを示している。
【００２９】
図８は、定常および可変ドメインおよび全ＭＯＭＰ遺伝子を含むベクターに対する脾細胞のインターフェロンγ分泌反応を示している。図８で得られた結果は、サイトカイン産生は防御免疫応答と必ずしも相関していないことを示唆している。
【００３０】
別のより実行可能と思われる方法は、複数のＭＯＭＰ遺伝子に基づいて多価ワクチンを設計することである。後者の手法は、関連血清型のＭＯＭＰの推定アミノ酸配列が比較的一定で（図１０を参照のこと）クラミジアトラコマティス遺伝子突然変異株の数は有限と思われる（ｒｅｆ．１６）という事実によって正当化される。
【００３１】
本発明の様々な実施形態が、ワクチン接種、クラミジア感染症の診断および治療の分野で多くの応用を有することは当業者には明らかであろう。そのような使用方法のさらに非限定的考察を以下に示す。
１．ワクチンの調製および使用方法
ワクチンとして使用するのに適当な免疫原性組成物は、明細書に開示したようなＭＯＭＰ遺伝子断片およびベクターから調製することができる。このワクチンは、抗ＭＯＭＰ抗体の産生を含む免疫応答を対象にもたらす。核酸を含むワクチンを含む免疫原生組成物は、ポリヌクレオチド投与用のために、生理学的に許容される溶液または乳濁液中の注射可能物質として調製することができる。核酸は、レシチンリポソームまたは核酸リポソーム（例えば、ＷＯ９３／２４６４０に記載されているような）のように当技術分野で知られている他のリポソームなどのリポソームと連結するか、核酸は、詳細を後述するようにアジュバントと連結していてもよい。カチオン性脂質を含むリポソームは、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリアニオンと自発的かつ迅速に相互作用し、その結果ポリヌクレオチドを１００％まで捕獲するリポソーム／核酸複合体になる。さらにポリカチオン性複合体は、細胞膜と融合し、その結果、リソソーム区画の分解性酵素を迂回してポリヌクレオチドを細胞内に送達することになる。ＷＯ９４／２７４３５は、カチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝的免疫化のための組成物について記載している。核酸の細胞内取り込みを助けるカルシウムイオン、ウイルスタンパク質およびトランスフェクションを容易にする他の試剤などの試剤を、有利に用いることができる。
【００３２】
ポリヌクレオチド免疫原生調製物はまた、生物分解性の徐放性粒子を含むマイクロカプセルとして製剤化することができる。すなわち、米国特許第５，１５１，２６４号は、Ｂｉｏ Ｖｅｃｔｅｕｒｓ Ｓｕｐｒａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅｓ（ＢＶＳＭ）と呼ばれるリン脂質／糖脂質／多糖の性質を有する粒子担体について記載している。粒子担体は、その層の１つに生物活性を有する様々な分子を輸送することが意図されている。
【００３３】
米国特許第５，０７５，１０９号は、抗原であるトリニトロフェニル化されたキーホールリンペットヘモシアニンおよびブドウ球菌エンテロトキシンＢの５０：５０ポリ（ＤＬ−ラクチドコ−グリコリド）中へのカプセル化について記載している。カプセル化用の他のポリマーには、ポリ（グリコリド）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）、コポリオキシラート、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポリオルトエステルおよびポリ（８−ヒドロキシ酪酸）、およびポリ無水物などが提案されている。
【００３４】
ＷＯ９１／０６２８２は、複数の生物接着性ミクロスフェアおよび抗原を含む送達手段について記載している。ミクロスフェアは、デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンからなる。この送達手段は、具体的に、鼻粘膜を越えてワクチンを取り込むことを意図している。送達手段はさらに、吸収賦活薬を含むことができる。
【００３５】
非複製ベクターを含むＭＯＭＰ遺伝子断片は、それと適合する薬剤として許容される賦形剤と混合することができる。このような賦形剤には、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールおよびその組合せが含まれる。免疫原生組成物およびワクチンは、さらに湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバントなどの補助物質を含み、その有効性を高めることができる。免疫原生組成物およびワクチンは、非経口、注射による皮下、静脈内、皮内または筋肉内で、注射部位を局所麻酔薬であらかじめ処置した後で投与することができる。あるいは、本発明によって作成された免疫原生組成物は、粘膜表面で免疫応答を引き起こすような方法で製剤化および送達することができる。したがって、この免疫原生組成物は、例えば、鼻または口（胃内）経路によって粘膜表面に投与することができる。あるいは、坐剤および経口用製剤を含む他の投与方法が望ましいこともある。坐剤の場合には、結合剤および担体には、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。経口製剤には、例えば、医薬等級のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常用いられる賦形剤（ｉｎｃｉｐｉｅｎｔ）が含まれる。
【００３６】
免疫原生調製物およびワクチンは、剤形に適合する方法で、治療に有効で、防御的および免疫原生となる量で投与される。投与される量は、治療される対象によって異なり、例えば、ＭＯＭＰおよびそれに対する抗体を合成する個々の免疫系の能力、および必要ならば、細胞性免疫応答を生み出す能力が含まれる。投与に必要な活性成分の正確な量は、医師の判断によって異なる。しかしながら、適当な用量範囲は当業者によって容易に決めることが可能であり、ＭＯＭＰ遺伝子含有ベクター約１μｇから約１ｍｇ程度である。初回投与および追加免疫投与に適当な投与計画もまた可変的であるが、初回投与と、続く事後投与が含まれる。用量もまた、投与経路によって異なり、宿主の大きさに従って異なる。１つの病原体のみを防ぐワクチンは、一価のワクチンである。いくつかの病原体の抗原性材料を含むワクチンは、混合ワクチンであり、本発明に属する。このような混合ワクチンは、例えば、様々な病原体または同一の病原体の様々な菌株、または様々な病原体の組合せから得られる材料を含む。
【００３７】
ベクターを、通常用いられる０．０５から０．１パーセントのリン酸緩衝食塩水溶液のアジュバントと同時投与すると、免疫原生を著しく改善することができる。アジュバントは、抗原の免疫原生を高めるが、それ自体は必ずしも免疫原生ではない。アジュバントは、投与部位の近くに抗原を局所的に保持することによって作用し、免疫系の細胞に抗原をゆっくりと徐々に放出することを容易にするデポ効果を生み出す。アジュバントはまた、免疫系の細胞を抗原デポに引き付け、細胞を刺激して免疫応答をもたらす。
【００３８】
免疫賦活剤またはアジュバントは、例えば、ワクチンに対する宿主免疫応答を改善するために長年用いられてきた。すなわち、アジュバントが、抗原に対する免疫応答を増強することが確認されている。しかしながら、これらのアジュバントの一部には毒性があり、望ましくない副作用を引き起こすこともあって、ヒトおよび多くの動物での使用に不適当とされてきた。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（まとめて一般にミョウバンと呼ばれる）のみが、ヒトおよび動物用ワクチンのアジュバントとして通常用いられる。
【００３９】
広範囲の外因性アジュバントおよび他の免疫調整材料は、抗原に対する強力な免疫応答を引き起こすことがある。これらには、膜タンパク質抗原と複合体を作って免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）を作るサポニン、鉱油を含む多機能性（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリマー、鉱油中の死んだミコバクテリア、フロイントの完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）などの細菌生成物、ならびにＱｕｉｌ Ａ誘導体およびその成分、ＱＳ２１、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、アミノ酸のオクタデシルエステル、ＩＳＣＯＰＲＥＰ、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ＤＤＢＡおよびポリホスファゼンが含まれる。アジュバントの有利な組合せは、本明細書と同じ譲受人に譲渡された同時係属の１９９４年６月１６日出願の米国特許第０８／２６１，１９４号および１９９５年６月７日出願の第０８／４８３，８５６号に記載されており、その開示を参照により本明細書に組み込む（ＷＯ９５／３４３０８）。
【００４０】
本発明の具体的実施形態では、クラミジアのＭＯＭＰ遺伝子断片をコードする第１のヌクレオチド配列を含む非複製ベクターは、免疫系の細胞を含む選択された細胞をベクターの目標とする標的分子と一緒に送達することができる。
【００４１】
非複製ベクターは、様々な手順で宿主に送達することが可能で、例えば、Ｔａｎｇ他（ｒｅｆ．１７）は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡでコーティングされた金微小発射物（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）をマウスの皮膚に導入した結果、マウスに抗ＢＧＨ抗体が産生したことを開示し、一方、Ｆｕｒｔｈ他（ｒｅｆ．１８）は、ジェット注射器を用いて生きた動物の皮膚、筋肉、脂肪および乳腺組織に形質移入できることを示した。
２．イムノアッセイ
本発明のＭＯＭＰ遺伝子断片およびベクターはまた、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよび他の非酵素結合抗体結合アッセイまたは当技術分野で知られている方法で用いるための抗ＭＯＭＰ抗体産生用の抗原としても有用である。ＥＬＩＳＡアッセイでは、非複製ベクターをまず、宿主に投与してＭＯＭＰに特異的な抗体を産生させる。これらのＭＯＭＰ特異的抗体を、選択された表面、例えば、ポリスチレンのマイクロタイタープレートなどの抗体を結合できる表面に固定する。洗浄して不完全に吸着した抗体を除去した後、試験試料に関して抗原として中性であることが知られているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液などの非特異的タンパク質を、選択された表面に結合させることができる。これによって、固定化された表面上の非特異的吸着部位をブロックすることが可能となり、表面上への抗血清の非特異的結合によるバックグラウンドが減少する。
【００４２】
次いで、固定化された表面を、免疫複合体（抗原／抗体）形成の助けとなるように、試験される臨床的または生物学的材料などの試料と接触させる。この手順には、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ溶液などの希釈剤で試料を希釈することが含まれていてもよい。次いで、約２０℃から３７℃程度の温度で約２から４時間インキュベートさせる。インキュベーション後、試料が接触した表面を洗浄して免疫複合体を形成しなかった材料を除去する。洗浄手順には、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎまたはホウ酸緩衝液などの溶液で洗浄することが含まれていてもよい。試験試料と結合したＭＯＭＰ特異抗体との間の特異的免疫複合体の形成と、続く洗浄の後、免疫複合体形成の発生およびイベント量を測定することができる。
【００４３】
（実施例）
上記の開示は、本発明を一般的に説明している。より完全な理解は、以下の具体的実施例を参照することによって得ることができる。これらの実施例は、例示の目的で記載されたに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図していない。状況が適切あると示唆または適切となるような形の変更および等価体の置換は、企図されている。本明細書では具体的な用語を用いてきたが、これらの用語は記述的意味を意図するもので、限定の目的ではない。
実施例１
本実施例は、ＷＯ９８／０２５４６にも記載されているような、ＭＯＭＰ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製を説明するものである。
【００４４】
ｐＭＯＭＰ発現ベクターは、以下のように製造した。ＭＯＭＰ遺伝子は、ＢａｍＨ１部位、リボソーム結合部位、および開始コドンを含む５′プライマー（ＧＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＡＡＴＣＣＴ）（配列番号：１６）およびＭｏＰｎの成熟ＭＯＭＰのＮ末端配列ならびにＭｏＰｎ ＭＯＭＰのＣ末端配列、Ｘｈｏｌ部位および停止コドンを含む３′プライマー（ＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＡＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣ）（配列番号：１７）によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、クラミジアトラコマティスマウス肺炎（ＭｏＰｎ）菌株ゲノムＤＮＡから増幅した。ＭＯＭＰリーダーペプチド遺伝子配列のＤＮＡ配列は除外した。ＢａｍＨ１およびＸｈｏｌの消化後、ＰＣＲ生成物を、ヒトサイトメガロウイルスの主要中間初期エンハンサー領域（ＣＭＶプロモーター）の制御の下での複製によりｐｃＤＮＡ３真核ＩＩ選択可能発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）の中にクローン化した。ＭＯＭＰ遺伝子をコードするプラスミドは、電気穿孔法により、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢブロス中で生育した大腸菌ＤＨ５αＦの中に移された。プラスミドは、Ｗｉｚａｒｄ（商標）Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ）により抽出した。組換えＭＯＭＰ遺伝子の配列は、記載されたように（ｒｅｆ．２０）ＰＣＲ直接配列解析によって検証した。精製されたプラスミドＤＮＡを１ｍｇ／ｍｌの濃度で食塩水に溶かした。ＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍでＤＵ−６２分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）により測定し、プラスミドのサイズは、臭化エチジウム染色アガロースゲル中でＤＮＡ標準品と比較した。
【００４５】
このようにして得られたプラスミドを含むＭＯＭＰ遺伝子ｐｃＤＮＡ３／ＭＯＭＰ、およびその構成要素を図１に示す。同様のプラスミド（ｐＭ（Ｃ））は、クラミジアトラコマティスのＭＯＭＰ遺伝子血清型Ｃから構築した。
【００４６】
実験デザインに関しては、４から５週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスの群（１群当たり５から１３匹）を、筋肉内（ＩＭ）または鼻腔内（ＩＮ）で、実施例１に記載のように調製したＭｏＰｎ ＭＯＭＰ遺伝子をコードする配列を含むプラスミドＤＮＡ（１０９５ｂｐ）、または実施例１の記載に類似した手順で調製したクラミジアトラコマティス血清型Ｌ₂ ＣＴＰ合成酵素遺伝子（１６１９ｂｐ（ｒｅｆ．１０、１２））をコードする配列により免疫化した。ＣＴＰ合成酵素は、ピリミジン生合成の最終ステップを触媒する定常的なクラミジア細胞質酵素であり、防御免疫を誘導することは知られていない。陰性対照動物には、食塩水または挿入されたクラミジア遺伝子を欠くプラスミドベクターを注射した。
実施例２
本実施例は、マウスのＤＮＡ免疫化およびＤＴＨテストの結果を説明するものである。
【００４７】
クラミジアトラコマティスマウス肺炎菌株（ＭｏＰｎ）によって誘発されるマウス肺炎モデルを用いた（ｒｅｆ．１１）。ヒトにおいて感染症および疾患を生じることに限定される大部分のクラミジアトラコマティス菌株とは異なり、ＭｏＰｎは自然のマウス病原体である。このモデルの一次感染は、再感染に対する強い防御免疫を誘導することが以前から明らかにされてきた。さらに、感染のクリアランスは、ＣＤ４ Ｔｈ１リンパ球応答と関連し、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示に依存する（ｒｅｆ．１１）。
【００４８】
ＩＭ免疫化の場合には、０、３および６週の３回、注射部位当たり食塩水１００μｌに溶かしたＤＮＡ１００μｇを注射した。ＩＮ免疫化の場合には、０、３および６週の３回、ＤＮＡ５０μｇを含む食塩水２５μｌを、麻酔したマウスに吸入させた。陽性対照としては、上記スケジュールに従い、不完全フロイントアジュバントに溶かした５×１０⁶封入体形成単位（ＩＦＵ）のＭｏＰｎ ＥＢを腹腔内投与で別個の群のマウスに与えた。８週目に、抗体の測定のために全群のマウスから血清を集め、足蹠注射によるＭｏＰｎ Ｅｂに対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）をテストした（ｒｅｆ．１３）。
【００４９】
陽性の４８および７２時間ＤＴＨ反応は、ＭＯＭＰ ＤＮＡまたはＭｏＰｎ Ｅｂで免疫化したマウスで検出されたが、ブランクベクターで免疫化されたマウスでは検出されなかった（ＷＯ９８／０２５４６の図１を参照）。鼻腔内で送達されるＭＯＭＰ ＤＮＡによってもたらされるＤＴＨ反応は、ＥＢで免疫化されたマウスで観察された反応と同程度であった。ＣＴＰ合成酵素ＤＮＡをワクチン接種されたマウスの群では、ＤＴＨ反応は検出されなかった（下表１を参照）。すなわち、ＭＯＭＰ ＤＮＡの注射は、クラミジアトラコマティスＥＢから自然に処理されたペプチドによって回復できるＤＴＨ反応を生み出したが、ＣＴＰ合成酵素ＤＮＡの注射は、ＤＴＨ反応を生み出さなかった。
実施例３
本実施例は、マウスの免疫化および抗体の産生を説明するものである。
【００５０】
実施例２に記載したように、ＣＴＰ合成酵素ＤＮＡを注射した結果、組換えＣＴＰ合成酵素に対する血清抗体が産生した（表１）（ｒｅｆ．１４）。抗原特異的血清Ａｂは、ＥＬＩＳＡによって測定した。平底９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ２５８０５、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を、組換えクラミジアＣＴＰ合成酵素（１μｇ／ｍｌ）または精製ＭｏＰｎ ＥＢ（６×１０⁴ＩＦＵ／ウエル）により４℃で一夜コーティングした。蒸留水でプレートを洗浄し、４％ＢＳＡ ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎおよび１％低脂肪スキムミルクにより室温で２時間ブロックした。血清試料の希釈は、抗原をコーティングしたプレートに塗布する直前に、９６穴丸底プレート中で行った。プレートを４℃で一夜インキュベートし、１０回洗浄した。次に、ビオチン化したヤギ抗マウスＩｇＧ１またはヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を、３７℃で１時間塗布した。洗浄後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．Ｍｉｓｓｉｓｓａｇｕａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。再度の洗浄ステップの後、ホスファターゼ緩衝液（ｐＨ９．８）に溶かしたホスファターゼ基質を加え、１時間展開させた。プレートを、ＢＩＯＲＡＤ３５５０マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍで読んだ。
【００５１】
ＩｇＧ２ａ抗体価は、ＩｇＧ１抗体価に比べて１０倍大きく、ＤＮＡ免疫化がより支配的なＴ_H1様応答をもたらしたことを示唆した。実施例２に記載したように、ＭＯＭＰ ＤＮＡを注射した結果、イムノブロットアッセイで検出されたように（ＷＯ９８／０２５４６の図２）、ＭＯＭＰに対する血清抗体が産生した（表２）。しかしながら、マウスを免疫化したＣＴＰ合成酵素ＤＮＡおよびＭＯＭＰ ＤＮＡはいずれも、未変性のクラミジアトラコマティスＥＢに結合する抗体は産生せず（表１）、抗体応答が、主要な防御機構ではないことを示唆した。
実施例４
本実施例は、防御を獲得するためのマウスのＤＮＡ免疫化を説明するものである。
【００５２】
ＭＯＭＰ ＤＮＡによってもたらされる細胞性免疫応答が機能的に有意なものかどうかを検討するため、１×１０³ＩＦＵのクラミジアトラコマティスＭｏＰｎで鼻腔内チャレンジされたマウスで、ｉｎ ｖｏｖｏの防御効果を評価した。クラミジアによる罹患率の尺度を得るため、クラミジアトラコマティスによるチャレンジ後１０日間にわたって体重損失を測定した。非修飾ベクターを注射したマウスを陰性対照として用い、ＥＢで免疫化したマウスを陽性対照として用いた。鼻腔内でＭＯＭＰ ＤＮＡにより免疫化されたマウスは、ＥＢで免疫化したマウスで観察される体重と同程度の体重を維持した。筋肉内でＭＯＭＰ ＤＮＡにより免疫化されたマウスは体重を減らしたが、陰性対照群を下回る速度の減少であった。
【００５３】
ＤＮＡワクチン接種の有効性のより直接的尺度は、ＭＯＭＰ ＤＮＡで免疫化したマウスにおける、致死に至らない肺感染の後で、クラミジアのｉｎ ｖｉｖｏにおける成長を制限する能力である。チャレンジ後１０日目が成長のピーク時であり（ｒｅｆ．１３）、マウスの様々な群間で肺力価を比較するために選択した。鼻腔内でＭＯＭＰ ＤＮＡにより免疫化されたマウスは、ブランクベクターで免疫化された対照マウスの力価（ｌｏｇ₁₀ＩＦＵ５．０±０．３、ｐ＜０．０１）に比べ、１０００分の１を下回るクラミジア肺力価（ｌｏｇ₁₀ＩＦＵ１．３±０．３、平均±ＳＥＭ）を有していた。筋肉内でＭＯＭＰ ＤＮＡにより免疫化されたマウスは、非修飾ベクター群に比べ、１０分の１以下のクラミジア肺力価を有していた（ｐ＝０．０１）。鼻腔内でＭＯＭＰ ＤＮＡにより免疫化されたマウスは、筋肉内でＭＯＭＰ ＤＮＡにより免疫化されたマウスに比べ、著しく低いクラミジア肺力価を有していた（それぞれ、ｌｏｇ₁₀ＩＦＵ１．３±０．８に対しｌｏｇ₁₀ＩＦＵ０．６６±０．３、ｐ＝０．３８）。ＭＯＭＰ ＤＮＡにより鼻腔内で免疫化されたマウスと筋肉内で免疫化されたマウスとの間で観察されたクラミジア肺力価の著しい差（２．４ｌｏｇ）は、免疫応答を誘導し、肺のクラミジアクリアランスを加速するには、粘膜免疫化がより効率的であることを示唆している。非修飾ベクター対照の防御効果の欠如により、ＤＮＡ自体は免疫応答に関与していないことが確認される。さらに、ＣＴＰ合成酵素ＤＮＡによる免疫化後に防御免疫が存在しないことから、免疫がＭＯＭＰ ＤＮＡに特異的であることが確認される（表１を参照）。
実施例５
本実施例は、ＭＯＭＰ ＤＮＡの断片を含むプラスミドの構築を説明するものである。
【００５４】
ＭｏＰｎ ＭＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド配列の断片を含む一連のベクターは、実施例１に概述した手順に従い、ＰＣＲクローニングと、続くベクターｐｃＤＮＡ３の中へのクローン化により作成し、図２に示すＭｏＰｎ ＭＯＭＰ遺伝子のそれぞれの断片を含むそれぞれのプラスミドｐＣＶ１、ｐＣＶ２、ｐＣＶ３、ｐＣＶ４およびｐＣＤ５を作成した。
実施例５
本実施例は、ｐＣＶ１、ｐＣＶ２、ｐＣＶ３、ｐＣＶ４およびｐＣＤ５によるマウスの免疫化を説明するものである。
【００５５】
実施例２に記載の手順に従い、ｐＣＶ１、ｐＣＶ２、ｐＣＶ３、ｐＣＶ４およびｐＣＤ５ＤＮＡにより３週間の間隔で３回、四頭筋でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。
【００５６】
最後の免疫化から１５日後および最初の注射から６０日後、ＥＩＡアッセイにおけるＭｏＰｎ ＥＢの血清抗体を測定するためにマウスから血液を採取し、７２時間目に測定されるＤＴＨを測定するため、熱によって殺したＥＢ２５μｌ（５×１０⁴封入体形成単位）と共に足蹠に注射した。１０００感染単位のＭｏＰｎをマウスに鼻腔内チャレンジし、続く１０日間、体重を毎日測定した。その時点でマウスを致死せしめ、肺の中のＭｏＰｎの定量培養を測定した（ｒｅｆ．１３）。
【００５７】
図３は、感染後の体重損失によって測定されるように、ｐＣＶ２、ｐＣＶ３およびｐＣＤ５免疫化が、疾患を防がれたマウスにおける免疫応答と同等な防御免疫応答をＭｏＰｎチャレンジに対して引き起こすことを示している。図４は、肺組織内のＭｏＰｎのｉｎ ｖｉｖｏ成長によって測定されるように、ｐＣＶ３およびｐＣＤ５免疫化が、ｐＭＯＭＰと同等の防御免疫応答を引き起こすことを示している。
【００５８】
しかしながら、これらの免疫応答をもたらす具体的ドメインには、当技術分野でＴ細胞エピトープを含むと予想されるドメインは含まれていない。これに関しては、いくつかのグループがＭＯＭＰ Ｔ細胞エピトープを明らかにすることを試みている（ｒｅｆ．２２から２６）。これらの研究のすべてが、プライム（ｐｒｉｍｅ）マウスに対するＭＯＭＰタンパク質の様々な領域にオーバーラップした合成ペプチドを用いた。予想されたエピトープはいずれも、防御性であると判明した領域にはなかった。
【００５９】
図５は、ｐＣＶ１、ｐＣＶ２、ｐＣＶ３、ｐＣＶ４およびｐＣＤ５による免疫化が、ＭｏＰＮ ＥＢの足蹠注射に対して様々な陽性ＤＴＨ応答をもたらすことを示している。ｐＣＶ３およびｐＣＤ５は、ｐＭＯＭＰと同等のより強い応答をもたらす。非修飾ベクターによる免疫化は、血清抗体もＤＴＨ応答ももたらさなかった。
【００６０】
図９は、定常および可変ドメインならびに完全長ＭＯＭＰ遺伝子を含むベクターによる免疫化から６０日後にマウスから採取した血清中のＩｇＧ_2a抗体価を示したものである。ｐＣＶ３およびｐＣＤ５による免疫化の場合にのみＩｇＧ_2a免疫応答が生じ、これらのベクターによりＴｈ１様応答がもたらされたことを示した。
【００６１】
本実施例に見られるように、ＭＯＭＰ遺伝子の特定のセグメントを含むベクター、すなわちｐＣＶ２およびｐＣＤ５は、体重損失から見て、疾患を防ぐことができた。さらにベクターｐＣＶ３およびｐＣＤ５は、肺力価から見て感染を防ぐことができた。
実施例６
本実施例は、ベクターｐＭＯＭＰ、ｐＣＶ１、ｐＣＶ２、ｐＣＶ３、ｐＣＶ４およびｐＣＤ５に対する脾細胞の増殖応答を説明するものである。
【００６２】
実施例２のプロトコルに従い、４回目の免疫化から２週間後にマウスを致死せしめた。脾臓を除去し、単一細胞懸濁液を調製した。１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％Ｌ−グルタミンおよび２−メルカプトエタノール（２ＭＥ、Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）５×１０^-5Ｍを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中の細胞懸濁液２００μｌ（５×１０⁵ウエル）を、９６穴平底プレート中、１×１０⁵ＩＦＵ／ｍｌのＭｏＰｎと共に、５％ＣＯ₂の中、３７℃で９６時間、３つを組にしてインキュベートした。陰性対照ウエルには抗原のない脾臓細胞を入れ、陽性対照ウエルには、コンカナバリンＡ０．２５μｇ／ｍｌを含む膵臓細胞が入れた。３日の培養後、採取の１６時間前に、トリチウム化した（³Ｈ）チミジン（２Ｃｉ／ｍｍｏｌ、７４Ｇｂｑ／ｍｍｏｌ、ｉｍＣｉ／ｍｌ、ＩＣＮ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）０．２５μＣｉ／ウエルを加えた。ＰＨＤ細胞採取器（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）で細胞を採取し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ５０００カウンタ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＵＫ）によりシンチレーション溶液（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ、ＩＣＮ、Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ）２ｍｌ中でカウントした。
【００６３】
図６および７に示す結果に見られるように、ｐＣＶ３およびｐＭＯＭＰは、細胞性免疫応答をもたらした。
実施例７
本実施例は、ベクターｐＭＯＭＰ、ｐＣＶ１、ｐＣＶ２、ｐＣＶ３、ｐＣＶ４およびｐＣＤ５に対する脾細胞のインターフェロンγ分泌応答を説明するものである。
【００６４】
マウス脾臓におけるマウスＩＦＮγおよびＩＬ−１０分泌細胞を定量するため、サイトカイン特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いた。すべてのアッセイで、９６穴ニトロセルロースベースのミクロタイター（Ｍｉｌｉｔｉｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＨＡプレート、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ、Ｍｏｌｓｈｅｍ、Ｆｒａｎｃｅ）を、５μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに希釈した抗サイトカインｍＡｂ１００μｌにより４℃で一夜コーティングした。コーティング溶液をプレートから除去した後、４０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃で少なくとも１時間、ＣＯ₂の中でウエルをブロックした。ＰＢＳ−Ｔでプレートを１回洗浄後、試験細胞をウエルに加えた。
【００６５】
免疫化マウスにおける抗原特異的ＩＦＮγ分泌細胞の誘導の場合には、単一細胞を５×１０⁶細胞／ｍｌに調整し、ＭｏＰｎのＵＶで殺したＥＢ２×１０⁵ＩＦＵ／ｍｌと共に２４穴プレート中７２時間培養した。ＲＰＭＩ１６４０で洗浄後、９６穴プレートに７２時間、細胞を加えた。ＲＰＭＩ１６４０で洗浄後、前もって抗サイトカイン抗体でコーティングした９６穴ニトロセルロースベースのミクロタイタープレートに細胞を加えた。細胞を個々のウエルに加え（２×１０⁵または１×１０⁵／１００−μｌ／ウエル）、ＣＯ₂インキュベーター中３７℃で２４時間インキュベートした。ウエルを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔで広範囲にわたって洗浄した。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後（支持マニホールド（ｍａｎｉｆｏｌｄ）を除去し、プレートの裏をＰＢＳ−Ｔで十分に洗浄する）、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに１：２０００で溶かしたアルカリホスファターゼの結合したストレプトアビジンを、０．５μｇ／ｍｌの濃度で加え、ＣＯ₂中、３７℃で４５分間インキュベートした。十分に洗浄した後、基質緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５、０．０５Ｍ ＭｇＣｌ₂）にＢＩＣＰ０．１６ｍｇ／ｍｌおよびＮＢＴ１ｍｇ／ｍｌを溶かした比色分析用基質リン酸ＢＩＣＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸）／ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）１００μｌ／ウエルを加え、スポットが現れるまで室温でインキュベートした。水を加えると、反応は停止した。
【００６６】
得られた結果を図８に示すが、サイトカイン産生は、防御免疫応答と必ずしも相関していないことを示唆している。
【００６７】
（開示の概要）
本開示を要約すると、本発明は、クラミジア菌株、具体的にはクラミジアトラコマティスの感染による疾患に対して、ヒトを含む宿主のＤＮＡを含む核酸免疫化の方法であって、非複製ベクター、具体的には、クラミジア菌株の主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）のエピトープ断片をコードし、ＭＯＭＰ特異的免疫応答を生み出すヌクレオチド配列を含むプラスミドベクター、および宿主におけるＭＯＭＰ断片の発現を行うプロモーターを用いる方法を提供する。本発明の範囲内の変更は可能である。
【００６８】
【表１】

【００６９】
【表２】

引例（Ref.）リスト
【００７０】
【表３】

【００７１】
【表４】

【００７２】
【表５】

【図面の簡単な説明】
【図１】 サイズが６４９５ｂｐのプラスミドｐｃＤＮＡ３／ＭＯＭＰの要素および構成を示す図である。
【図２】 同定された定常（ＣＤ）および可変（ＶＤ）ドメインを有するクラミジアトラコマティスＭｏＰｎ菌株の成熟ＭＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド構造ならびに実施例において後述するように同定された配列をｐｃＤＮＡ３の中にクローン化することにより生成したクローンを概略的に示す図である。
【図３】 ブランクベクター（ｐｃＤＮＡ３）、ＭＯＭＰヌクレオチド配列をコードするＣＶ１からＣＤ５を個別にクローン化したｐｃＤＮＡ３（ＣＶ１など）、およびヌクレオチド配列をコードする全ＭＯＭＰをクローン化したｐｃＤＮＡ３（ｐＭＯＭＰ）で筋肉内免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの群に５×１０³ＩＦＵのＭｏＰｎを鼻腔内チャレンジしたときの体重損失（グラム）を示す図である。
【図４】 ブランクベクター（ｐｃＤＮＡ３）、ＭＯＭＰヌクレオチド配列をコードするＣＶ１からＣＤ５を個別にクローン化したｐｃＤＮＡ３（ｐＣＶ１など）、およびヌクレオチド配列をコードする全ＭＯＭＰをクローン化したｐｃＤＮＡ３（ｐＭＯＭＰ）による筋肉内免疫化後のマウスの肺に５×１０³ＩＦＵのＭｏＰｎをチャレンジして１０日目のクラミジアトラコマティスの成長を測定するためのアッセイの結果を示す図である。
【図５】 ブランクｐｃＤＮＡ３ベクター（ＰＣ）、ＭＯＭＰヌクレオチド配列をコードするＣＶ１からＣＤ５を個別にクローン化したｐｃＤＮＡ３（ＣＶ１など）、およびヌクレオチド配列をコードする全ＭＯＭＰをクローン化したｐｃＤＮＡ３（ｐＭ）で筋肉内免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの群に２×１０⁵ＩＦＵの不活性化ＭｏＰｎ ＥＢを足蹠注射してから４８時間後の足蹠腫脹反応（ＤＴＨ）を示す図である。
【図６】 ブランクｐｃＤＮＡ３ベクター（ｐｃ）、ＭＯＭＰヌクレオチド配列をコードするＣＶ１からＣＤ５を個別にクローン化したｐｃＤＮＡ３（ＣＶ１など）、およびヌクレオチド配列をコードする全ＭＯＭＰをクローン化したｐｃＤＮＡ３（ｐＭ）で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの群を、全不活性化ＭｏＰｎ ＥＢにより９６時間ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後、免疫化後６０日目における脾細胞の増殖応答を示す図である。
【図７】 結果を刺激指数（ＳＩ）で表した以外は図６と同一の作成物に対する脾細胞の増殖応答を示す図である。
【図８】 ブランクｐｃＤＮＡ３ベクター（ｐｃ）、ＭＯＭＰヌクレオチド配列をコードするＣＶ１からＣＤ５を個別にクローン化したｐｃＤＮＡ３（ＣＶ１など）、およびヌクレオチド配列をコードする全ＭｏＰｎ ＭＯＭＰをクローン化したｐｃＤＮＡ３（ｐＭ）で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの群で、免疫化後６０日目に採集したＭｏＰｎ刺激脾細胞のインターフェロンγ分泌応答の図である。
【図９】 ブランクｐｃＤＮＡ３ベクター（ｐｃ）、ＭＯＭＰヌクレオチド配列をコードするＣＶ１からＣＤ５を個別にクローン化したｐｃＤＮＡ３（ＣＶ１など）、およびヌクレオチド配列をコードする全ＭＯＭＰをクローン化したｐｃＤＮＡ３（ｐＭ）で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの群で、免疫化後６０日目に採集した血清を用いた、全ＭｏＰｎ ＥＢに対するＩｇＧ２ａ抗体価を示す図である。
【図１０】 クラミジアトラコマティスの様々な血清型からのＭＯＭＰ配列のアミノ酸配列（配列番号１から１５）を比較する図である。血清型Ｅ ＭＯＭＰに一致する残基は点で表した。４つのＶＤ（ＶＤＩからＶＤＩＶ）および定常のシステインは実線で囲んだ。すべてのクラミジアトラコマティスおよび肺炎クラミジアＭＯＭＰ配列で１つのシステインが位置するが、ＧＰＩＣおよびＭｎ ＭＯＭＰでは１つのセリンが位置する定常位置は、破線で囲んだ。囲みの上の番号は、血清型Ｅ ＭＯＭＰのみのアミノ酸残基を示す。

Claims (13)

1. 非複製ベクターであって、
   クラミジア菌株の主要外膜タンパク質の以下の部分：
   （１）定常ドメイン３及び可変ドメイン３からなる部分、及び
   （２）定常ドメイン５からなる部分
   のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片と、
   前記ヌクレオチド配列のみと動作可能に結合されるプロモーター配列と、
   を含むことを特徴とする非複製ベクター。
2. 前記プロモーター配列が、サイトメガロウイルスプロモーターである請求項１に記載の非複製ベクター。
3. 前記非複製ベクターが、下記に示す構造：
   

   

   のプラスミドｐｃＤＮＡ３／ＭＯＭＰの有するＭＯＭＰ遺伝子の位置にＭＯＭＰ遺伝子の代わりに前記ＤＮＡ断片が挿入された構造を有する請求項１または２に記載の非複製ベクター。
4. 前記クラミジア菌株が、肺のクラミジア感染症を生じさせる菌株である請求項１〜３のいずれかに記載の非複製ベクター。
5. 前記クラミジア菌株が、クラミジア トラコマティスの菌株である請求項４に記載の非複製ベクター。
6. クラミジア菌株の主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）の断片に対する防御免疫応答を宿主で生み出すため宿主にｉｎ ｖｉｖｏで投与するための免疫原性組成物であって、
   請求項１〜５のいずれかに記載の非複製ベクターと、
   薬剤として許容される担体と、
   を含むことを特徴とする免疫原性組成物。
7. 前記免疫応答において細胞性免疫応答が優勢である請求項６に記載の免疫原性組成物。
8. クラミジア菌株の感染による疾患に対して宿主を防御するためのワクチンを製造する方法であって、
   クラミジア菌株の主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ)の以下のＭＯＭＰ断片：
   （１）定常ドメイン３及び可変ドメイン３からなる部分、及び
   （２）定常ドメイン５からなる部分
   のいずれか１つをコードし、ＭＯＭＰ特異的免疫応答を生み出すヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を単離する工程と、
   前記ヌクレオチド配列を、少なくとも１つの制御配列に動作可能に結合させて非複製ベクターを製造し、該制御配列は該非複製ベクターが宿主に導入された時にＭＯＭＰ断片を発現させ、該ＭＯＭＰ断片に対する免疫応答を生み出すものである工程と、
   該非複製ベクターを宿主へのｉｎ ｖｉｖｏ投与のためのワクチンに製剤化する工程と、
   を有することを特徴とするワクチンの製造方法。
9. 前記プロモーター配列が、サイトメガロウイルスプロモーターである請求項８に記載の製造方法。
10. 前記クラミジアの菌株が、肺のクラミジア感染症を生じさせる菌株である請求項８または９に記載の製造方法。
11. 前記クラミジアの菌株が、クラミジア トラコマティスの菌株である請求項１０に記載の製造方法。
12. 前記非複製ベクターが、下記に示す構造：
    

    

    のプラスミドｐｃＤＮＡ３／ＭＯＭＰの有するＭＯＭＰ遺伝子の位置にＭＯＭＰ遺伝子の代わりに前記ＤＮＡ断片が挿入された構造を有する請求項８〜１１のいずれかに記載の製造方法。
13. 請求項８〜１２のいずれかに記載の製造方法によって製造されたことを特徴とするワクチン。

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