KR20150138956A - 재조합 광견병 바이러스, 이를 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 및 야외 광견병 바이러스와의 감별을 위한 멀티플렉스 rt-pcr - Google Patents
재조합 광견병 바이러스, 이를 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 및 야외 광견병 바이러스와의 감별을 위한 멀티플렉스 rt-pcr Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 재조합 광견병 바이러스, 이를 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 및 야외 광견병 바이러스와의 감별을 위한 멀티플렉스 RT-PCR에 관한 것으로, 구체적으로 광견병 바이러스의 G 단백질에서 333번째 아미노산이 글루탐산으로 치환되고 194번째 아미노산이 세린으로 치환되어 안정성과 효과가 우수해진 재조합 광견병 바이러스, 이를 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 및 이 재조합 광견병 바이러스와 야외 광견병 바이러스를 명확하게 감별할 수 있도록 하는 멀티플렉스 RT-PCR에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 광견병 바이러스는 G 단백질의 333번째 아미노산 및 194번째 아미노산이 각각 글루탐산과 세린으로 치환되어 기존 생백신주에 비해 매우 안전하고, 경구 투여용으로 사용할 수 있어 기존 광견병 백신의 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 제조방법에 따르면 상기와 같은 우수한 재조합 광견병 바이러스를 숙주세포 내에서 효율적으로 생산할 수 있어, 대량생산을 통해 보다 많이 백신을 보급함으로써 광견병의 예방에 크게 기여할 수 있을 것이라 기대된다. 그리고 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 검출방법 또는 재조합 광견병 바이러스 검출용 키트를 사용하면 본 발명의 재조합 광견병 바이러스와 야외바이러스의 감염여부를 명확하게 구별하여 확인할 수 있으므로, 백신이 야생동물에게 투여가 되었는지 혹은 광견병 바이러스에 감염이 되어 광견병을 유발할 수 있는지의 여부를 용이하게 판단할 수 있다.
본 발명의 재조합 광견병 바이러스는 G 단백질의 333번째 아미노산 및 194번째 아미노산이 각각 글루탐산과 세린으로 치환되어 기존 생백신주에 비해 매우 안전하고, 경구 투여용으로 사용할 수 있어 기존 광견병 백신의 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 제조방법에 따르면 상기와 같은 우수한 재조합 광견병 바이러스를 숙주세포 내에서 효율적으로 생산할 수 있어, 대량생산을 통해 보다 많이 백신을 보급함으로써 광견병의 예방에 크게 기여할 수 있을 것이라 기대된다. 그리고 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 검출방법 또는 재조합 광견병 바이러스 검출용 키트를 사용하면 본 발명의 재조합 광견병 바이러스와 야외바이러스의 감염여부를 명확하게 구별하여 확인할 수 있으므로, 백신이 야생동물에게 투여가 되었는지 혹은 광견병 바이러스에 감염이 되어 광견병을 유발할 수 있는지의 여부를 용이하게 판단할 수 있다.
Description
본 발명은 재조합 광견병 바이러스, 이를 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 및 야외 광견병 바이러스와의 감별을 위한 멀티플렉스 RT-PCR에 관한 것으로, 구체적으로 광견병 바이러스의 G 단백질에서 333번째 아미노산이 글루탐산으로 치환되고 194번째 아미노산이 세린으로 치환되어 안정성과 효과가 우수해진 재조합 광견병 바이러스, 이를 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 및 이 재조합 광견병 바이러스와 야외 광견병 바이러스를 명확하게 감별할 수 있도록 하는 멀티플렉스 RT-PCR에 관한 것이다.
광견병은 사람과 동물에서 가장 치명적인 인수공통전염병으로 세계적으로 매년 2만 5천명에서 7만 5천명 사이의 사람이 감염되고 있으며, 그 중에 2만 9천건 이상이 중국을 포함한 아시아 지역에서 발생하고 있다. 광견병은 박쥐, 붉은 여우, 스컹크, 너구리, 개, 늑대, 몽구스와 같은 숙주동물에 의해 전파되는데, 한국의 경우 1993년 이후에 개에 의한 전파는 사라지고 너구리 혹은 오소리에 의해 전파되는 산림형이 나타나고 있다.
동물에서 광견병을 억제하고, 사람의 광견병을 예방하기 위해 보다 효과적이고, 안전하며, 값싼 백신이 필요하다. DNA 백신 및 기타 재조합 백신을 포함한 많은 새로운 백신들이 개발 및 시험되고 있다. 광견병 바이러스 G를 발현하는 DNA 벡터는 T 헬퍼 세포와 광견병 바이러스 중화항체의 생성을 자극하는 것으로 밝혀졌다 (Xiang et al., 1994). 이들 DNA 벡터로 마우스의 면역화를 유도하는 방법은, 마우스 및 원숭이를 치명적인 광견병 바이러스의 후속 도전 감염에 대하여 보호하였다 (Xiang et al., 1994; Ray et al., 1997; Lodmell et al., 1998). 그러나, DNA 백신에 의한 면역 반응의 유도는 보통 오래 걸리며 면역 반응의 크기는 통상적인 백신에 비하여 낮은 문제점이 있다(Xiang et al., 1994; Osorio et al., 1999).
야생동물에 의해 전파되는 광견병을 예방하기 위하여 한국에서는 2000년부터 V-RG(vaccinia-rabies glycoprotein) 미끼백신을 경기도와 강원도 지역에 살포하여 왔다. 하지만 이 V-RG 미끼백신은 살아있는 백시니아 바이러스에 광견병 바이러스의 G 단백질을 발현하도록 만들어져 있어서, 이 미끼백신을 사람이 접촉하였을 때 백시니아에 감염되는 문제점이 미국의 CDC에 2건이 보고된 적이 있어, 사람에 대한 안전성이 문제가 되고 있고 있으며, 스컹크, 개 및 고양이에서는 경구투여 시 항체형성이 미비하여 야생 너구리와 여우에만 적용하도록 되어있다.
현재 한국에서 사용 중인 광견병 생백신은 SAD 주를 여러 가지 세포를 이용하여 연속적으로 계대하여 순화시키고, 한계 희석법에 의해 바이러스를 클로닝하여 만든 순화 백신주이다. 해당 생백신은 개에 접종하도록 허가되어 있으나, 고양이, 소와 같은 다른 동물에 접종하지 못하도록 되어 있으며, 마우스에 뇌 내에 접종하였을 때 마우스가 폐사하는 것으로 알려져 있다. 이러한 광견병 생백신주는 병원성 부위인 G 단백질 333번째의 아미노산이 아르기닌(Arginine; R)으로 확인되고 있으며, 경구용으로 접종하였을 때 안전성을 보장할 수 없어, 단지 주사용으로만 허가가 되어 있다. 또한 불활화 백신은, 한국에서 1980년대부터 허가되어 개, 고양이, 소 등 여러 동물에 접종이 가능하지만 경구로 접종하였을 때 불활화되어 있기 때문에 항체를 형성하는데 미진한 것으로 알려져 있다.
이처럼 현재 사용되고 있는 광견병 백신은 안전성에서 문제가 있으며, 접종 개체 종류 및 접종 방법의 한계점도 있어, 야생동물을 포함한 여러 동물에 안전하고 효과적으로 접종할 수 있는 새로운 순화된 바이러스를 이용한 광견병 예방 백신의 개발이 필요하다.
Xiang ZQ, Spitalnik S, Tran M, Wunner WH, Cheng J, Ertl HC. Vaccination with a plasmid vector carrying the rabies virus glycoprotein gene induces protective immunity against rabies virus. Virology. 1994 Feb 15; 199(1): 132-40.
Ray NB1, Ewalt LC, Lodmell DL. Nanogram quantities of plasmid DNA encoding the rabies virus glycoprotein protect mice against lethal rabies virus infection. Vaccine. 1997 Jun; 15(8): 892-5.
Lodmell DL1, Ray NB, Parnell MJ, Ewalt LC, Hanlon CA, Shaddock JH, Sanderlin DS, Rupprecht CE. DNA immunization protects nonhuman primates against rabies virus. Nat Med. 1998 Aug; 4(8): 949-52.
Osorio JE1, Tomlinson CC, Frank RS, Haanes EJ, Rushlow K, Haynes JR, Stinchcomb DT. Immunization of dogs and cats with a DNA vaccine against rabies virus. Vaccine. 1999 Mar 5; 17(9-10): 1109-16.
본 발명의 주된 목적은 포유동물에 경구접종하더라도 백신으로써의 효과를 충분히 발휘할 수 있으며, 안정성이 우수하고 대량생산이 가능한 광견병 백신용 재조합 바이러스를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 바이러스를 함유함으로써 광견병을 효과적으로 예방할 수 있는 광견병 예방용 백신 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 바이러스를 용이하게 제조할 수 있는 재조합 바이러스 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 바이러스의 감염여부를 용이하게 확인할 수 있는 재조합 바이러스 검출방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 바이러스 검출방법을 용이하게 실시할 수 있는 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 G 단백질의 333번째 아미노산이 글루탐산으로 치환되고, G 단백질의 194번째 아미노산이 세린으로 치환된 재조합 광견병 바이러스를 제공한다.
G 단백질은 광견병 바이러스(Rabies virus, RABV)의 병원성에 가장 크게 관여하는 단백질로 바이러스의 외피를 구성하는 단백질이다. 숙주세포의 수용체(receptor)에 결합하여 세포 내부로 들어갈 수 있도록 하는 역할을 한다. 광견병 바이러스주 중 하나인 ERA 바이러스주의 경우 G 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지며, 이를 암호화하는 유전자의 염기서열은 서열번호 7과 같다. 서열번호 7에서 1054 ~ 1056번째 염기서열이 333번째 아미노산(아르기닌) 코딩부위이며, 이를 글루탐산 코돈서열(GAA 또는 GAG)로 치환하면 333번째 아미노산을 글루탐산으로 치환할 수 있다. 또한, 서열번호 7에서 637 ~ 639번째 염기서열이 194번째 아미노산(아스파라긴) 코딩부위이며, 이를 세린 코돈서열(TCT, TCC, TCA, TCG, AGC 또는 AGT)로 치환하면 194번째 아미노산을 세린으로 치환할 수 있다.
상기와 같은 코돈서열 중에서도 본 발명에서는 상기 G 단백질의 333번째 아미노산을 암호화하는 코돈이 GAA 코돈이고, 상기 G 단백질의 194번째 아미노산을 암호화하는 코돈이 TCC 코돈인 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 광견병 바이러스에 있어서, 상기 재조합 광견병 바이러스의 유전체가 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 이 염기서열은 광견병 바이러스주 중 하나인 ERA 바이러스주의 유전체 중 G 단백질 유전자에서 1054 ~ 1056번째 염기서열이 글루탐산 코돈서열로 637 ~ 639번째 염기서열이 세린 코돈서열로 치환된 서열이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 광견병 바이러스를 유효성분으로 함유하는 광견병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
상기 백신 조성물은 추가로 약리학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.
또한, 상기 백신 조성물은 애주번트를 추가로 포함할 수 있다. 이때 애주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용가능한 애주번트는 프로인트 완전애주번트, 프로인트 불완전애주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 등을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직한 애주번트는 Fort Dodge Animal Health의 METASTIM 애주번트이다.
상기 백신은 경구백신, 생백신 및 불활화 백신으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 백신일 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 백신 조성물의 투여량은 투여대상의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1kg 당 0.2㎖ 내지 0.4㎖를 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.
본 발명의 백신 조성물은 근육 투여용, 피하 투여용, 복강 투여용, 정맥 투여용, 경구 투여용, 진피 투여용, 안구 투여용 및 뇌 내 투여용 조성물로 이루어진 군에서 선택된 1종의 조성물일 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여용 백신 조성물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 광견병 바이러스의 유전체 서열에서 G 단백질의 333번째 아미노산을 암호화하는 서열을 글루탐산을 암호화하는 서열로 치환하고, G 단백질의 194번째 아미노산을 암호화하는 서열을 세린을 암호화하는 서열로 치환하여 재조합 유전체를 제작하는 단계; 상기 재조합 유전체를 세포에 형질주입하는 단계; 및 상기한 세포에서 상기 재조합 유전체를 갖는 바이러스의 생성을 유도하는 단계;를 포함하는 재조합 광견병 바이러스 제조방법을 제공한다.
상기 재조합 광견병 바이러스 제조방법에서 유전체의 일부 서열을 치환하는 것은 통상의 바이러스 유전체 재조합 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 바람직하게는 RNA 상태의 유전체를 역전사(reverse transcription)하여 DNA로 바꾸고, 벡터에 삽입하여 클로닝한 상태에서 재조합하여 치환하는 것이 좋다. 서열의 치환은 통상의 DNA 또는 RNA 재조합 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 상동재조합(homologous recombination), 또는 제한효소(restriction enzyme)와 연결효소(ligase)를 사용하는 방법으로 재조합 유전체를 제작할 수 있다.
치환된 재조합 유전체는 통상의 형질주입 방법을 통해 포유동물세포 등의 숙주세포 내로 도입할 수 있으며, 이후 재조합 유전체의 유전자 발현, 패키징 또는 복제를 유도하는 통상의 방법을 사용하여 재조합 바이러스를 생산할 수 있다. 재조합 유전체만으로 숙주세포에서 바이러스가 생성될 수 없을 경우 헬퍼 바이러스의 중복감염 또는 헬퍼 벡터의 추가 형질주입 방법을 사용하여 재조합 바이러스의 생성을 유도할 수 있다.
본 발명의 재조합 광견병 바이러스 제조방법에 있어서, 상기 글루탐산을 암호화하는 서열은 'GAA'이고, 상기 세린을 암호화하는 서열은 'TCC'인 것이 바람직하다. 또한, 상기 재조합 유전체 서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(제1프라이머세트)를 프라이머로 사용하고, 시료의 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 것을 특징으로 하는 재조합 광견병 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 광견병 바이러스 검출방법에 있어서, 상기 프라이머로 서열번호 4의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(제2프라이머세트)를 더 사용하는 것이 바람직하다.
상기 서열번호 2의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(제1프라이머세트)는 PCR을 통해 본 발명 재조합 광견병 바이러스의 유전체에서 G 단백질 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 반면, G 단백질의 333번째 아미노산이 글루탐산이 아니거나 194번째 아미노산이 세린이 아닌 다른 광견병 바이러스(예를 들어 야외바이러스, ERA 바이러스주)의 G 단백질 유전자는 증폭할 수 없다. 따라서 이들 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하면 시료 내에 본 발명 재조합 광견병 바이러스의 존재여부를 광견병 야외바이러스와 구별하여 명확하게 확인할 수 있다.
또한 상기 서열번호 4의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(제2프라이머세트)는 PCR을 통해 본 발명의 재조합 광견병 바이러스와 야외바이러스 모두의 N 단백질 유전자의 일부를 증폭할 수 있어, 상기 제1프라이머세트와 함께 사용할 경우 시료 내에 본 발명 재조합 광견병 바이러스의 존재여부 뿐만 아니라 야외바이러스의 존재여부도 명확하게 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(제1프라이머세트)를 포함하는 재조합 광견병 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 재조합 광견병 바이러스 검출용 키트에 있어서, 상기 백신용 광견병 바이러스 검출용 키트는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(제2프라이머세트)를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 검출용 키트는 상기 올리고뉴클레오티드(제1프라이머세트 및 제2프라이머세트) 그 자체일 수 있으며, 이들 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 중합효소연쇄반응을 용이하게 수행할 수 있도록 구성된 형태로 제공될 수 있다. 중합효소연쇄반응을 수행할 수 있도록 구성된 키트는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
이러한 검출용 키트는 상기 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 중합효소연쇄반응에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 Tris-HCl, TAE, PBS 등의 완충액 일 수 있다.
본 발명의 재조합 광견병 바이러스는 G 단백질의 333번째 아미노산 및 194번째 아미노산이 각각 글루탐산과 세린으로 치환되어 기존 생백신주에 비해 매우 안전하고, 경구 투여용으로 사용할 수 있어 기존 광견병 백신의 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 제조방법에 따르면 상기와 같은 우수한 재조합 광견병 바이러스를 숙주세포 내에서 효율적으로 생산할 수 있어, 대량생산을 통해 보다 많이 백신을 보급함으로써 광견병의 예방에 크게 기여할 수 있을 것이라 기대된다. 그리고 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 검출방법 또는 재조합 광견병 바이러스 검출용 키트를 사용하면 본 발명의 재조합 광견병 바이러스와 야외바이러스의 감염여부를 명확하게 구별하여 확인할 수 있으므로, 백신이 야생동물에게 투여가 되었는지 혹은 광견병 바이러스에 감염이 되어 광견병을 유발할 수 있는지의 여부를 용이하게 판단할 수 있다.
도 1은 ERAG3G(G 단백질의 333번째 아미노산을 글루탐산으로 치환한 바이러스) 바이러스의 유전체를 역전사하여 DNA로 만들고 pUC19에 클로닝한 플라스미드의 모식도이다.
도 2는 상기 플라스미드를 SpeI과 NotI 제한효소로 처리하여 전기영동한 사진이다. M: 1Kb ladder, lane 1: SpeI과 NotI의 제한효소로 절단한 ERAGS 플라스미드.
도 3은 본 발명의 재조합 광견병 바이러스(ERAGS)를 제조하는 방법을 간략히 도식화한 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예를 통해 생산된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS)를 광견병 G 단백질에 대한 특이항체로 형광염색하여 촬영한 현미경 사진이다.
도 5는 전자현미경 하에서 본 발명의 재조합 광견병 바이러스(ERAGS) 입자를 촬영한 사진이다.
도 6은 재조합된 광견병 바이러스의 염기서열을 분석하여 기존 ERA 바이러스주의 염기서열과 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 BHK 및 NG108-15 세포에서 증식한 재조합 광견병 바이러스의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 ERAGS(A) 및 ERAG3G(B)를 마우스에 접종 후 바이러스 증식 여부를 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 9는 ERAGS를 직접 너구리에 근육, 경구 투여한 것과 미끼제형내에 장착하여 투여한 너구리에서 광견병 항체가를 나타낸 그래프이다.
도 10은 야외 광견병 바이러스와 미끼백신주 ERAGS를 감별하기위한 프라이머 작성 및 올리고뉴클레오티드를 나타내는 도이다.
도 11은 본 발명 프라이머의 야외 광견병 바이러스와 미끼백신주 ERAGS에 대한 민감도를 나타낸 것이다. M: 1Kb ladder, lane 1 - 7: ERAGS 100 ~ 10-6, lane 8-14; ERA 100 - 10-6.
도 12는 본 발명 프라이머를 야외 광견병 바이러스에 적용한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 상기 플라스미드를 SpeI과 NotI 제한효소로 처리하여 전기영동한 사진이다. M: 1Kb ladder, lane 1: SpeI과 NotI의 제한효소로 절단한 ERAGS 플라스미드.
도 3은 본 발명의 재조합 광견병 바이러스(ERAGS)를 제조하는 방법을 간략히 도식화한 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예를 통해 생산된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS)를 광견병 G 단백질에 대한 특이항체로 형광염색하여 촬영한 현미경 사진이다.
도 5는 전자현미경 하에서 본 발명의 재조합 광견병 바이러스(ERAGS) 입자를 촬영한 사진이다.
도 6은 재조합된 광견병 바이러스의 염기서열을 분석하여 기존 ERA 바이러스주의 염기서열과 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 BHK 및 NG108-15 세포에서 증식한 재조합 광견병 바이러스의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 ERAGS(A) 및 ERAG3G(B)를 마우스에 접종 후 바이러스 증식 여부를 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 9는 ERAGS를 직접 너구리에 근육, 경구 투여한 것과 미끼제형내에 장착하여 투여한 너구리에서 광견병 항체가를 나타낸 그래프이다.
도 10은 야외 광견병 바이러스와 미끼백신주 ERAGS를 감별하기위한 프라이머 작성 및 올리고뉴클레오티드를 나타내는 도이다.
도 11은 본 발명 프라이머의 야외 광견병 바이러스와 미끼백신주 ERAGS에 대한 민감도를 나타낸 것이다. M: 1Kb ladder, lane 1 - 7: ERAGS 100 ~ 10-6, lane 8-14; ERA 100 - 10-6.
도 12는 본 발명 프라이머를 야외 광견병 바이러스에 적용한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 광견병 바이러스 유전자 포함 재조합 플라스미드 제조
대표적인 광견병 바이러스주인 CVS, SAD, HEP, ERA 중 ERA 바이러스주를 이용하여, 유전자 조작을 통하여 순화된 재조합 광견병 바이러스를 생산하였다. ERA는 1970년도에 캐나다 Connaught Medical research Lab에서 근무했던 조한길 박사로부터 분양 받았으며, 돼지 콩팥세포 및 Vero 세포에서 10대 계대하였으며 10대 계대 후 십진 희석법에 의해 ERA 균주를 클로닝하고, 전체 유전자 서열을 분석하였다.
염기서열 분석결과 기존에 알려진 ERA를 바탕으로 하여 G 유전자에 병원성을 나타내는 것으로 알려진 333번째의 아미노산인 아르기닌을 글루탐산으로 치환하였고, 이 플라스미드를 이용하여 도 1에서와 같이 병원성의 복귀와 관련이 있는 194번째의 아미노산 아스파라긴을 세린으로 치환하기위해 제한효소 부위를 작성하여 플라스미드의 변화를 일으켰다. ERA 전체 유전자 염기서열을 바탕으로 변이된 전체 유전자(ERAGS), N, P 및 L 유전자를 클로닝 벡터에 클로닝하였다.
재조합 광견병 바이러스의 전체 유전자를 클로닝하기 위해 3 리더(leader) 및 5 트레일러(trailer) 염기서열을 함유하는 ERA 게놈 cDNA와 간염 델타 바이러스의 리보자임 cDNA와 T7 프로모터를 융합하여 이 cDNA를 pUC19 플라스미드에 클로닝하였다.
N 및 P 단백질을 발현하기 위하여 pTM-1 발현벡터에 PCR 기법으로 증폭한 cDNA로부터 N 및 P 전체유전자를 클로닝하였다. 클로닝된 유전자들이 T7 RNA 폴리머라아제(polymerase) 통제하에서 N과 P 단백질을 발현하는지를 확인하기 위하여 BHK/T7 세포에 재조합 플라스미드를 형질감염(transfection) 시키고, SDS-PAGE와 웨스턴 블랏을 수행하였고, 클로닝된 유전자로부터 N 및 P 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. N, P, 및 L 헬퍼 플라스미드의 명칭을 각각 pT7IRES RN, pT7IRES RP, 및 pT7IRES RL로 명명하였다.
실시예 2. 형질주입을 이용한 재조합 광견병 바이러스의 제조
실시예 1에서 제작한 광견병 바이러스 전체유전자를 함유하는 플라스미드와 N, P 및 L 플라스미드를 BHK/T7 세포에 형질주입하였다. 이때 사용하는 플라스미드의 농도는 ERAGS 전장-플라스미드 0.5㎍/㎕, pT7IRES RN 0.25㎍/㎕, pT7IRES RP 0.25㎍/㎕, pT7IRES RL 0.25㎍/㎕로 하였다. 보다 구체적으로, cDNA로부터 재조합 광견병 바이러스를 제작하기 위하여 ERA 전장-플라스미드 0.5㎍/㎕, OPTI-MEM 50㎕/well, pT7IRES RN 0.25㎍/㎕, TransIT-LT1 3㎍/㎍ of DNA, pT7IRES RP 0.25㎍/㎕, pT7IRES RL 0.25㎍/㎕의 재료를 이용하여, TransIT-LT1 시약을 실온에 옮겨 놓고 사용 전에 조심스럽게 혼합하였다. 혈청이 들어있지 않는 Opti-MEM 배지 250㎕를 멸균 튜브에 넣고 TransIT-LT1 시약 7.5㎕를 첨가하고 조심스럽게 혼합하였다. 희석된 TransIT-LT1 시약에 2.5㎍ 플라스미드 DNA를 더하고 조심스럽게 혼합하고 30분간 실온에 방치하였다. TransIT-LT1 시약-DNA 혼합액을 세포에 시계방향으로 떨어트리고 조심스럽게 배양용기를 흔들어 TransIT-LT1 시약-DNA 혼합액이 잘 퍼지도록 흔든 후, 72시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 재조합 광견병 바이러스를 제조하는 형질주입 방법을 도 3에 도식화하였다.
형질주입 후, 매일 세포의 특이현상을 관찰하였고, 7일 후에 특이적인 세포변성효과가 나타나는 것을 확인하였다. 그리고 재조합 광견병 바이러스의 확인을 위하여 광견병 N 및 G 단백질에 대한 특이항체를 이용하여 형광염색법을 실시하였으며, 전자현미경을 통해 BHK/T7 세포에 감염된 재조합 광견병 바이러스의 입자를 확인하였다. 이의 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 광견병 G 특이 단클론 항체를 이용한 결과 세포질 내에서 특이 형광을 확인할 수 있어, 재조합 광견병 바이러스가 효과적으로 형질주입 되었음을 확인하였다. 또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 전자현미경 하에서 재조합 광견병 바이러스 입자를 확인할 수 있었다.
실시예 3. 재조합 광견병 바이러스의 염기서열 분석
재조합된 광견병 바이러스의 염기서열 분석을 수행하여 병원성을 나타내는 G 단백질의 194번째 및 333번째 유전자가 기존에 알려진 ERA 균주와 차이를 나타내는지 확인하였다. 이의 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서와 같이, 광견병 바이러스 G 단백질의 194번째 및 333번째 아미노산이 각각 아스파라긴에서 세린으로, 아르기닌에서 글루탐산으로 치환된 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 재조합 광견병 바이러스주는 유전자에 변이를 가진 새로운 바이러스주이므로, ERAGS 라고 명명하였다. 재조합 광견병 바이러스의 염기서열 결과에서 G 단백질의 194번째 및 333번째 아미노산 부위 이외에도 몇 군데의 염기가 치환된 것으로 나타났으나, 아미노산의 서열에는 영향을 미치지 않는 침묵돌연변이(silence mutation)이다.
실시예 4. ERAGS 균주의 백신 효용성 평가
4-1. 바이러스 함량 시험
바이러스의 증식능이 낮으면 백신으로 사용할 수 없으므로, 바이러스의 함량 시험을 수행하였다. 재조합 광견병 바이러스 ERAGS 균주를 BHK/T7 및 NG108-15 세포에 접종하여 수확하고 바이러스 함량을 확인하였다. 이의 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서와 같이, BHK/T7 및 NG108-15세포에서 증식한 재조합 광견병 바이러스 함량이 108.0TCID50/㎖ 이상을 나타내었다. 따라서 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 ERAGS 균주는 백신으로 제조 시, 바이러스의 함량이 충분히 높으므로 백신으로 사용 가능함을 확인하였다.
4-2. ERAGS 균주를 이용한 백신의 안정성 평가
재조합 광견병 바이러스의 안전성을 확인하기 위해 4일령 Balb/C 포유마우스를 사용하였다. 바이러스 함량을 108.0TCID50/㎖으로 조정한 재조합 광견병 바이러스 ERAGS 균주(본 발명의 재조합 광견병 바이러스)를 10마리의 마우스에 뇌 내로 0.03㎖를 접종하고, 또 다른 그룹의 마우스 10마리에는 ERAG3G(대조군, 이 광견병 바이러스는 G 단백질의 333번째 아미노산만을 글루탐산으로 치환한 것임)를 뇌 내로 0.03㎖를 접종한 후, 임상관찰을 10일 동안 실시하였다. 이의 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서와 같이, 재조합 광견병 바이러스 ERAGS를 접종한 그룹이 ERAG3G(대조군)를 접종한 마우스 보다 바이러스의 형광이 매우 낮게 나타났다. 이것은 포유마우스에 접종한 ERAGS 균주는 뇌 내에서 바이러스의 증식 낮게 나타나고 있다는 사실을 증명하는 것으로 병원성이 낮아졌음을 나타낸다. 4일령 포유마우스에 3대에 걸쳐 지속적으로 계대한 결과 재조합 광견병 바이러스 ERAGS를 뇌 내에 접종한 10마리의 포유 마우스는 모두 생존하였다.
이렇게 안전성이 우수한 재조합 광견병 바이러스 ERAGS를 너구리에 근육 및 경구접종하고 임상증상 및 항체형성을 관찰하였다. 이의 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서와 같이 ERAGS를 너구리 8두에 근육, 경구로 각각 접종(1두당 108.0 TCID50/㎖)하고 5주 및 10주후에 항체가를 확인한 결과 접종한 너구리는 모두 높은 항체가를 나타내었고, 10주가 지나도 유지되었으며, 근육접종군 보다 경구투여군이 더 높은 항체가를 나타내었다.
ERAGS를 미끼제형의 백신부에 넣고 미끼백신을 너구리에 투여한 결과가 진정한 미끼백신의 면역원성 평가이다. 따라서 야생 너구리 11마리에 ERAGS를 함유한 미끼백신을 투여한 후 5주째에 면역원성을 확인한 결과 14.5 IU/㎖의 중화항체가를 나타내었다. 11마리 중 9마리(81.8%)가 항체반응을 나타내었으며, 그중 7마리(63.6%)가 방어 항체가 이상의 역가를 나타내었다. 또한 백신을 접종 받은 너구리는 5주 동안 건강하게 생존하였다. 반면 3두의 대조군 너구리는 항체가를 나타내지 않았다. 이것은 동거시킨 너구리에서 수평전파가 이루어지지 않으며 안전성이 향상된 우수한 백신임을 나타낸다.
실시예 5. 광견병 야외바이러스와 미끼백신주인 ERAGS 균주를 감별하는 프라이머에 대한 효용성 평가
재조합 광견병 바이러스 ERAGS는 G 단백질의 염기서열 637부터 639번째까지TCC의 뉴클레오타이드를 그리고 1054 ~ 1055번째까지 GA의 뉴클레오타이드를 가지고 있어 야외 광견병바이러스 및 ERA 균주와 특이적으로 다르다. 이를 바탕으로 ERAGS만을 특이적으로 인식하는 프라이머를 제작하였다. 전방향 프라이머(forward primer)는 G 단백질을 코딩하는 유전자 617 ~ 639번째에 해당하는 염기서열(TGTCTTGTGACATTTTTACCtcc)이며, 역방향 프라이머(reverse primer)는 G 단백질을 코딩하는 유전자 1075 - 1054 번째의 염기서열(GGATGATCTCATTCCAAGTTtc)로 459bp를 증폭한다.
재조합 광견병 바이러스 ERAGS와 야외 광견병바이러스를 공통적으로 증폭하는 프라이머는 N 단백질을 코딩하는 유전자 351 ~ 514번째의 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머로 증폭크기는 183bp에 달한다. 공통 프라이머의 전방향 프라이머는 N 단백질을 코딩하는 유전자 351 ~ 372번째의 염기서열(AGGRAATTGGGCTTTGACTGGA)로 이루어지며, 역방향 프라이머는 533 ~ 514번째의 염기서열(AAAGGGGCTGTCTCGAAAAT)로 이루어진다.
서열번호 | 프라이머명 | 염기서열 | 방향 | 유전자 | 목적 감별용 |
1 | ERAGS-F | TGTCTTGTGACATTTTTACCtcc | Forward | G | ERAGS |
2 | ERAGS-R | GGATGATCTCATTCCAAGTTtc | Reverse | G | ERAGS |
3 | ComRABVF | AGGRAATTGGGCTTTGACTGGA | Reverse | N | ERA 및 야외주 |
4 | ComRABVR | AAAGGGGCTGTCTCGAAAAT | Reverse | N | ERA 및 야외주 |
디자인된 프라이머는 상업적으로 제작의뢰를 통해 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로 제작하였다(Bioneer cooperation, 대한민국).
상기 표 1의 프라이머로 multiplex RT-PCR을 수행함으로써 광견병 야외바이러스와 ERAGS 균주를 구별하여 검출할 수 있는지를 평가하였다. 실험과정(도 10 참조)을 간단히 설명하면, 우선 실험에 사용된 광견병 바이러스는 RNeasy mini kit(QIGEN)를 사용하여 RNA 추출하였고, One-step RT-PCR을 위해 one-step RT-PCR kit(QIAGEN)를 준비하였다. multiplex-RT-PCR을 위하여 Qiagen사의 one-step RT-PCR kit의 시약에 상기 표 1의 전방향 및 역방향 프라이머 4종(ERAGSF, ERAGSR, ComRABVF, ComRABVR)을 각각 50 pM, RNA 5 ㎕, DEPC-water 13 ㎕, 5X buffer 10 ㎕, dNTP 0.5 ㎕, enzyme mix 0.5 ㎕를 넣어 총 25 ㎕의 mix를 만든다. 만들어진 mix를 원심한 후 PCR 장비(GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystem)에 넣고 42℃ 15분, 95℃ 3분, 39cycle의 PCR (95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초), 72℃ 5분, 4℃ 10분의 조건으로 하여 반응시킨 후 1.8% agarose gel에 전기영동하여 증폭된 유전자 밴드를 확인하였다.
이의 결과 도 11에 나타낸 바와 같이, ERAGS주는 두 개의 프라이머에 모두 반응하고 10-4 까지 459bp 및 183bp의 유전자가 증폭되었다. 그러나 ERA주는 재조합 광견병 바이러스 ERAGS를 특이적으로 증폭하는 프라이머에 반응하지 않았고, 공통적으로 증폭이 가능한 프라이머에 대하여 10-4 까지 반응을 나타내었다. 이는 상기 프라이머를 사용한 multiplex PCR로 광견병 야외바이러스와 ERAGS 균주를 명확히 구분하여 효율적으로 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Management : Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> Recombinant rabies virus and vaccine composition containing the
same for preventing rabies, and multiplex RT-PCR for
differentiation of street rabies virus
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<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 11933
<212> RNA
<213> Rabies virus ERAGS strain
<400> 1
acgcuuaaca accagaucaa agaaaaaaca gacauuguca auugcaaagc aaaaauguaa 60
caccccuaca auggaugccg acaagauugu auucaaaguc aauaaucagg uggucucuuu 120
gaagccugag auuaucgugg aucaauauga guacaaguac ccugccauca aagauuugaa 180
aaagcccugu auaacccuag gaaaggcucc cgauuuaaau aaagcauaca agucaguuuu 240
gucaggcaug agcgccgcca aacuugaucc ugacgaugua uguuccuauu uggcagcggc 300
aaugcaguuu uuugagggga cauguccgga agacuggacc agcuauggaa ucgugauugc 360
acgaaaagga gauaagauca ccccagguuc ucugguggag auaaaacgua cugauguaga 420
agggaauugg gcucugacag gaggcaugga acugacaaga gaccccacug ucccugagca 480
ugcguccuua gucggucuuc ucuugagucu guauagguug agcaaaauau ccgggcaaaa 540
cacugguaac uauaagacaa acauugcaga caggauagag cagauuuuug agacagcccc 600
uuuuguuaaa aucguggaac accauacucu aaugacaacu cacaaaaugu gugcuaauug 660
gaguacuaua ccaaacuuca gauuuuuggc cggaaccuau gacauguuuu ucucccggau 720
ugagcaucua uauucagcaa ucagaguggg cacaguuguc acugcuuaug aagacuguuc 780
aggacuggua ucauuuacug gguucauaaa acaaaucaau cucaccgcua gagaggcaau 840
acuauauuuc uuccacaaga acuuugagga agagauaaga agaauguuug agccagggca 900
ggagacagcu guuccucacu cuuauuucau ccacuuccgu ucacuaggcu ugagugggaa 960
aucuccuuau ucaucaaaug cuguugguca cguguucaau cucauucacu uuguaggaug 1020
cuauaugggu caagucagau cccuaaaugc aacgguuauu gcugcaugug cuccucauga 1080
aaugucuguu cuagggggcu aucugggaga ggaauucuuc gggaaaggga cauuugaaag 1140
aagauucuuc agagaugaga aagaacuuca agaauacgag gcggcugaac ugacaaagac 1200
ugacguagca cuggcagaug auggaacugu caacucugac gacgaggacu acuucucagg 1260
ugaaaccaga aguccggagg cuguuuauac ucgaaucaug augaauggag gucgacuaaa 1320
gagaucucac auacggagau augucucagu caguuccaau caucaagccc guccaaacuc 1380
auucgccgag uuucuaaaca agacauauuc gagugacuca uaagaaguug aauaacaaaa 1440
ugccggaaau cuacggauug uguauaucca ucaugaaaaa aacuaacacc ccuccuuucg 1500
aaccauccca aacaugagca agaucuuugu caauccuagu gcuauuagag ccggucuggc 1560
cgaucuugag auggcugaag aaacuguuga ucugaucaau agaaauaucg aagacaauca 1620
ggcucaucuc caaggggaac ccauagaggu ggacaaucuc ccugaggaua uggggcgacu 1680
ucaccuggau gauggaaaau cgcccaacca uggugagaug gccaaggugg gagaaggcaa 1740
guaucgagag gacuuucaga uggaugaagg agaggauccu agcuuccugu uccagucaua 1800
ccuggaaaau guuggagucc aaauagucag acaaaugagg ucaggagaga gauuucucaa 1860
gauaugguca cagaccguag aagagauuau auccuauguc gcggucaacu uucccaaccc 1920
uccaggaaag ucuucagagg auaaaucaac ccagacuacu ggccgagagc ucaagaagga 1980
gacaacaccc acuccuucuc agagagaaag ccaaucaucg aaagccagga uggcggcuca 2040
aacugcuucu ggcccuccag cccuugaaug gucggccacc aaugaagagg augaucuauc 2100
aguggaggcu gagaucgcuc accagauugc agaaaguuuc uccaaaaaau auaaguuucc 2160
cucucgaucc ucagggauac ucuuguauaa uuuugagcaa uugaaaauga accuugauga 2220
uauaguuaaa gaggcaaaaa auguaccagg ugugacccgu uuagcccaug acggguccaa 2280
acucccccua agauguguac ugggaugggu cgcuuuggcc aacucuaaga aauuccaguu 2340
guuagucgaa uccgacaagc ugaguaaaau caugcaagau gacuugaauc gcuauacauc 2400
uugcuaaccg aaccucuccc cucagucccu cuagacaaua aaguccgaga uguccuaaag 2460
ucaacaugaa aaaaacaggc aacaccacug auaaaaugaa cuuccuacgu aagauaguga 2520
aaaauugcag ggacgaggac acucaaaaac ccucucccgc gucagccccu cuggaugacg 2580
augacccgug gcuuccaccc ccugaauacg ucccgcugaa agaaccuaca agcaagaaga 2640
acaugaggaa cuuuuguauc aacggagggg uuaaagugug uagcccgaau gguuacucgu 2700
ucaggauccu gcggcacauu cugaaaucau ucgacgagau auauucuggg aaucauagga 2760
ugaucggguu agucaaagua guuauuggac uggcuuuguc aggaucucca gucccugagg 2820
gcaugaacug gguauacaaa uugaggagaa ccuuuaucuu ccagugggcu gauuccaggg 2880
gcccucuuga aggggaggag uuggaauacu cucaggagau cacuugggau gaugauacug 2940
aguucgucgg auugcaaaua agagugauug caaaacagug ucauauccag ggcagaaucu 3000
gguguaucaa caugaacccg agagcauguc aacuaugguc ugacaugucu cuucagacac 3060
aaagguccga agaggacaaa gauuccucuc ugcuucuaga auaaucagau uauaucccgc 3120
aaauuuauca cuuguuuacc ucuggaggag agaacauaug agcucaacuc caacccuugg 3180
gagcaauaua acaaaaaaac auguuauggu gccauuaaac cgcugcauuu caucaaaguc 3240
aaguugauua ccuuuacauu uugauccucu uggaugugaa aaaaacuagu uaacaucccu 3300
caaaagacuc aaggaaagau gguuccucag gcucuccugu uuguaccccu ucugguuuuu 3360
ccauuguguu uugggaaauu cccuauuuac acgauaccag acaagcuugg ucccuggagc 3420
ccgauugaca uacaucaccu cagcugccca aacaauuugg uaguggagga cgaaggaugc 3480
accaaccugu caggguucuc cuacauggaa cuaaaaguug gauacaucuu agccauaaaa 3540
augaacgggu ucacuugcac aggcguugug acggaggcug aaaccuacac uaacuucguu 3600
gguuauguca caaccacguu caaaagaaag cauuuccgcc caacaccaga ugcauguaga 3660
gccgcguaca acuggaagau ggccggugac cccagauaug aagagucucu acaaaauccg 3720
uacccugacu accgcuggcu ucgaacugua aaaaccacca aggagucucu cguuaucaua 3780
ucuccaagug uggcagauuu ggacccauau gacagauccc uucacucgag ggucuucccu 3840
agcgggaagu gcucgggagu agcggugucu ucuaccuacu gcuccacuaa ccacgauuac 3900
accauuugga ugcccgagaa uccgagacua gggaugucuu gugacauuuu uaccuccagu 3960
agagggaaga gagcauccaa agggagugag acuugcggcu uuguagauga aagaggccua 4020
uauaagucuu uaaaaggagc augcaaacuc aaguuaugug gaguucuagg acuuagacuu 4080
auggauggaa caugggucgc gaugcaaaca ucaaaugaaa ccaaauggug cccucccgau 4140
caguugguga accugcacga cuuucacuca gacgaaauug agcaccuugu uguagaggag 4200
uuggucagga agagagagga gugucuggau gcacuagagu ccaucaugac aaccaaguca 4260
gugaguuuca gacgucucag ucauuuaaga aaacuugucc cuggguuugg aaaagcauau 4320
accauauuca acaagaccuu gauggaagcc gaugcucacu acaagucagu cgaaacuugg 4380
aaugagauca ucccuucaaa aggguguuua agaguugggg ggagguguca uccucaugug 4440
aacggggugu uuuucaaugg uauaauauua ggaccugacg gcaaugucuu aaucccagag 4500
augcaaucau cccuccucca gcaacauaug gaguuguugg aauccucggu uaucccccuu 4560
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guugaaguuc accuucccga ugugcacaau caggucucag gaguugacuu gggucucccg 4680
aacuggggga aguauguauu acugagugca ggggcccuga cugccuugau guugauaauu 4740
uuccugauga cauguuguag aagagucaau cgaucagaac cuacgcaaca caaucucaga 4800
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gcacagucaa ugauuucucu cugguuauau ggugcccacu cugaauccaa caggagccgg 5760
agauguauaa cagacuuggc ccauuucuau uccaagucgu cccccauaga gaagcuguug 5820
aaucucacgc uaggaaauag agggcugaga auccccccag agggaguguu aaguugccuu 5880
gagaggguug auuaugauaa ugcauuugga agguaucuug ccaacacgua uuccucuuac 5940
uuguucuucc auguaaucac cuuauacaug aacgcccuag acugggauga agaaaagacc 6000
auccuagcau uauggaaaga uuuaaccuca guggacaucg ggaaggacuu gguaaaguuc 6060
aaagaccaaa uauggggacu gcugaucgug acaaaggacu uuguuuacuc ccaaaguucc 6120
aauugucuuu uugacagaaa cuacacacuu augcuaaaag aucuuuucuu gucucgcuuc 6180
aacuccuuaa uggucuugcu cucuccccca gagccccgau acucagauga cuugauaucu 6240
caacuaugcc agcuguacau ugcuggggau caagucuugu cuaugugugg aaacuccggc 6300
uaugaaguca ucaaaauauu ggagccauau gucgugaaua guuuagucca gagagcagaa 6360
aaguuuaggc cucucauuca uuccuuggga gacuuuccug uauuuauaaa agacaaggua 6420
agucaacuug aagagacguu cggucccugu gcaagaaggu ucuuuagggc ucuggaucaa 6480
uucagcaaca uacaugacuu gguuuuugug uauggcuguu acaggcauug ggggcaccca 6540
uauauagauu aucgaaaggg ucugucaaaa cuauaugauc agguucacau uaaaaaagug 6600
auagauaagu ccuaccagga gugcuuagca agcggccuag ccaggaggau ccuuagaugg 6660
gguuuugaua aguacuccaa gugguaucug gauucaagau uccuagcccg agaccacccc 6720
uugacuccuu auaucaaaac ccaaacaugg ccacccaaac auauuguaga cuuggugggg 6780
gauacauggc acaagcuccc gaucacgcag aucuuugaga uuccugaauc aauggauccg 6840
ucagaaauau uggaugacaa aucacauucu uucaccagac cgagacuagc uucuuggcug 6900
ucagaaaacc gaggggggcc uguuccuagc gaaaaaguua uuaucacggc ccugucuaag 6960
ccgccuguca auccccgaga guuucugagg ucuauagacc ucggaggauu gccagaugaa 7020
gacuugauaa uuggccucaa gccaaaggaa cgggaauuga agauugaagg ucgauucuuu 7080
gcucuaaugu cauggaaucu aagauuguau uuugucauca cugaaaaacu cuuggccaac 7140
uacaucuugc cacuuuuuga cgcgcugacu augacagaca accugaacaa gguguuuaaa 7200
aagcugaucg acagggucac cgggcaaggg cuuuuggacu auucaagggu cacauaugca 7260
uuucaccugg acuaugaaaa guggaacaac caucaaagau uagagucaac agaggaugua 7320
uuuucugucc uagaucaagu guuuggauug aagagagugu uuucuagaac acacgaguuu 7380
uuucaaaagg ccuggaucua uuauucagac agaucagacc ucaucggguu acgggaggau 7440
caaauauacu gcuuagaugc guccaacggc ccaaccuguu ggaauggcca ggauggcggg 7500
cuagaaggcu uacggcagaa gggcuggagu cuagucagcu uauugaugau agauagagaa 7560
ucucaaauca ggaacacaag aaccaaaaua cuagcucaag gagacaacca gguuuuaugu 7620
ccgacauaua uguugucgcc agggcuaucu caagaggggc uccucuauga auuggagaga 7680
auaucaagga augcacuuuc gauauacaga gccgucgagg aaggggcauc uaagcuaggg 7740
cugaucauca agaaagaaga gaccaugugu aguuaugacu uccucaucua uggaaaaacc 7800
ccuuuguuua gagguaacau auuggugccu gaguccaaaa gaugggccag agucucuugc 7860
gucucuaaug accaaauagu caaccucgcc aauauaaugu cgacaguguc caccaaugcg 7920
cuaacagugg cacaacacuc ucaaucuuug aucaaaccga ugagggauuu ucugcucaug 7980
ucaguacagg cagucuuuca cuaccugcua uuuagcccaa ucuuaaaggg aagaguuuac 8040
aagauucuga gcgcugaagg ggagagcuuu cuccuagcca ugucaaggau aaucuaucua 8100
gauccuucuu ugggaggggu aucuggaaug ucccucggaa gauuccauau acgacaguuc 8160
ucagacccug ucucugaagg guuauccuuc uggagagaga ucugguuaag cucccacgag 8220
uccuggauuc acgcguugug ucaagaggcu ggaaacccag aucuuggaga gagaacacuc 8280
gagagcuuca cucgccuucu agaagauccu accaccuuaa auaucagagg aggggccagu 8340
ccuaccauuc uacucaagga ugcaaucaga aaggcuuuau augacgaggu ggacaaggug 8400
gagaauucag aguuucgaga ggcaauccug uuguccaaga cccauagaga uaauuuuaua 8460
cucuucuuaa caucuguuga gccucuguuu ccucgauuuc ucagugagcu auucaguucg 8520
ucuuuuuugg gaauccccga gucaaucauu ggauugauac aaaacucccg aacgauaaga 8580
aggcaguuua gaaagagucu cucaaaaacu uuagaagaau ccuucuacaa cucagagauc 8640
cacgggauua gucggaugac ccagacaccu cagaggguug ggggggugug gccuugcucu 8700
ucagagaggg cagaucuacu uagggagauc ucuuggggaa gaaaaguggu aggcacgaca 8760
guuccucacc cuucugagau guugggguua cuucccaagu ccucuauuuc uugcacuugu 8820
ggagcaacag gaggaggcaa uccuagaguu ucuguaucag uacucccguc cuuugaucag 8880
ucauuuuuuu cacgaggccc ccuaaagggg uacuugggcu cguccaccuc uaugucgacc 8940
cagcuauucc augcauggga aaaagucacu aauguucaug uggugaagag agcucuaucg 9000
uuaaaagaau cuauaaacug guucauuacu agagauucca acuuggcuca agcucuaauu 9060
aggaacauua ugucucugac aggcccugau uucccucuag aggaggcccc ugucuucaaa 9120
aggacggggu cagccuugca uagguucaag ucugccagau acagcgaagg aggguauucu 9180
ucugucugcc cgaaccuccu cucucauauu ucuguuagua cagacaccau gucugauuug 9240
acccaagacg ggaagaacua cgauuucaug uuccagccau ugaugcuuua ugcacagaca 9300
uggacaucag agcugguaca gagagacaca aggcuaagag acucuacguu ucauuggcac 9360
cuccgaugca acaggugugu gagacccauu gacgacguga cccuggagac cucucagauc 9420
uucgaguuuc cggauguguc gaaaagaaua uccagaaugg uuucuggggc ugugccucac 9480
uuccagaggc uucccgauau ccgucugaga ccaggagauu uugaaucucu aagcgguaga 9540
gaaaagucuc accauaucgg aucagcucag gggcucuuau acucaaucuu aguggcaauu 9600
cacgacucag gauacaauga uggaaccauc uucccuguca acauauacgg caagguuucc 9660
ccuagagacu auuugagagg gcucgcaagg ggaguauuga uaggauccuc gauuugcuuc 9720
uugacaagaa ugacaaauau caauauuaau agaccucuug aauugaucuc agggguaauc 9780
ucauauauuc uccugaggcu agauaaccau cccuccuugu acauaaugcu cagagaaccg 9840
ucucuuagag gagagauauu uucuaucccu cagaaaaucc ccgccgcuua uccaaccacu 9900
augaaagaag gcaacagauc aaucuugugu uaucuccaac augugcuacg cuaugagcga 9960
gagauaauca cggcgucucc agagaaugac uggcuaugga ucuuuucaga cuuuagaagu 10020
gccaaaauga cguaccuaac ccucauuacu uaccagucuc aucuucuacu ccagaggguu 10080
gagagaaacc uaucuaagag uaugagagau aaccugcgac aauugaguuc cuugaugagg 10140
caggugcugg gcgggcacgg agaagauacc uuagagucag acgacaacau ucaacgacug 10200
cuaaaagacu cuuuacgaag gacaagaugg guggaucaag aggugcgcca ugcagcuaga 10260
accaugacug gagauuacag ccccaacaag aagguguccc guaagguagg auguucagaa 10320
ugggucugcu cugcucaaca gguugcaguc ucuaccucag caaacccggc cccugucucg 10380
gagcuugaca uaagggcccu cucuaagagg uuccagaacc cuuugaucuc gggcuugaga 10440
gugguucagu gggcaaccgg ugcucauuau aagcuuaagc cuauucuaga ugaucucaau 10500
guuuucccau cucucugccu uguaguuggg gacgggucag gggggauauc aggggcaguc 10560
cucaacaugu uuccagaugc caagcuugug uucaacaguc uuuuagaggu gaaugaccug 10620
auggcuuccg gaacacaucc acugccuccu ucagcaauca ugaggggagg aaaugauauc 10680
gucuccagag ugauagaucu ugacucaauc ugggaaaaac cguccgacuu gagaaacuug 10740
gcaaccugga aauacuucca gucaguccaa aagcagguca acauguccua ugaccucauu 10800
auuugcgaug cagaaguuac ugacauugca ucuaucaacc ggauaacccu guuaaugucc 10860
gauuuugcau ugucuauaga uggaccacuc uauuuggucu ucaaaacuua ugggacuaug 10920
cuaguaaauc caaacuacaa ggcuauucaa caccugucaa gagcguuccc cucggucaca 10980
ggguuuauca cccaaguaac uucgucuuuu ucaucugagc ucuaccuccg auucuccaaa 11040
cgagggaagu uuuucagaga ugcugaguac uugaccucuu ccacucuucg agaaaugagc 11100
cuuguguuau ucaauuguag cagccccaag agugagaugc agagagcucg uuccuugaac 11160
uaucaggauc uugugagagg auuuccugaa gaaaucauau caaauccuua caaugagaug 11220
aucauaacuc ugauugacag ugauguagaa ucuuuucuag uccacaagau gguugaugau 11280
cuugaguuac agaggggaac ucugucuaaa guggcuauca uuauagccau caugauaguu 11340
uucuccaaca gagucuucaa cguuuccaaa ccccuaacug accccuuguu ccauccaccg 11400
ucugauccca aaauccugag gcacuucaac auauguugca guacuaugau guaucuaucu 11460
acugcuuuag gugacguccc uagcuucgca agacuucacg accuguauaa cagaccuaua 11520
acuuauuacu ucagaaagca agucauucga gggaacguuu aucuaucuug gaguuggucc 11580
aacgacaccu caguguucaa aaggguagcc uguaauucua gccugagucu gucaucucac 11640
uggaucaggu ugauuuacaa gauagugaag acuaccagac ucguuggcag caucaaggau 11700
cuauccagag aaguggaaag acaccuucau agguacaaca gguggaucac ccuagaggau 11760
aucagaucua gaucaucccu acuagacuac aguugccugu gaaccggaua cuccuggaag 11820
ccugcccaug cuaagacucu ugugugaugu aucuugaaaa aaacaagauc cuaaaucuga 11880
accuuugguu guuugauugu uuuucucauu uuuguuguuu auuuguuaag cgu 11933
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for B protein gene of ERAGS
<400> 2
tgtcttgtga catttttacc tcc 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for B protein gene of ERAGS
<400> 3
ggatgatctc attccaagtt tc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for N protein gene of Rabies virus
<400> 4
graattgggc tttgactgga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for N protein gene of Rabies virus
<400> 5
aaaggggctg tctcgaaaat 20
<210> 6
<211> 524
<212> PRT
<213> Rabies virus ERA strain
<400> 6
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
1 5 10 15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro
20 25 30
Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val
35 40 45
Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu
50 55 60
Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys
65 70 75 80
Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr
85 90 95
Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala
100 105 110
Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu
115 120 125
Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg Thr Val
130 135 140
Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp
145 150 155 160
Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly
165 170 175
Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His
180 185 190
Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys
195 200 205
Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu
210 215 220
Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly
225 230 235 240
Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp
245 250 255
Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro
260 265 270
Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu
275 280 285
His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp
290 295 300
Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu
305 310 315 320
Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile
325 330 335
Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg
340 345 350
Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly
355 360 365
Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu
370 375 380
Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu
385 390 395 400
Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His
405 410 415
Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Ile Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu
420 425 430
Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly
435 440 445
Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala
450 455 460
Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys
465 470 475 480
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
485 490 495
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
500 505 510
Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu
515 520
<210> 7
<211> 1575
<212> RNA
<213> Rabies virus ERA strain
<400> 7
augguuccuc aggcucuccu guuuguaccc cuucugguuu uuccauugug uuuugggaaa 60
uucccuauuu acacgauacc agacaagcuu ggucccugga gcccgauuga cauacaucac 120
cucagcugcc caaacaauuu gguaguggag gacgaaggau gcaccaaccu gucaggguuc 180
uccuacaugg aacuuaaagu uggauacauc uuagccauaa aaaugaacgg guucacuugc 240
acaggcguug ugacggaggc ugaaaccuac acuaacuucg uugguuaugu cacaaccacg 300
uucaaaagaa agcauuuccg cccaacacca gaugcaugua gagccgcgua caacuggaag 360
auggccggug accccagaua ugaagagucu cuacacaauc cguacccuga cuaccgcugg 420
cuucgaacug uaaaaaccac caaggagucu cucguuauca uaucuccaag uguggcagau 480
uuggacccau augacagauc ccuucacucg agggucuucc cuagcgggaa gugcucagga 540
guagcggugu cuucuaccua cugcuccacu aaccacgauu acaccauuug gaugcccgag 600
aauccgagac uagggauguc uugugacauu uuuaccaaua guagagggaa gagagcaucc 660
aaagggagug agacuugcgg cuuuguagau gaaagaggcc uauauaaguc uuuaaaagga 720
gcaugcaaac ucaaguuaug uggaguucua ggacuuagac uuauggaugg aacauggguc 780
gcgaugcaaa caucaaauga aaccaaaugg ugcccucccg aucaguuggu gaaccugcac 840
gacuuucgcu cagacgaaau ugagcaccuu guuguagagg aguuggucag gaagagagag 900
gagugucugg augcacuaga guccaucaug acaaccaagu cagugaguuu cagacgucuc 960
agucauuuaa gaaaacuugu cccuggguuu ggaaaagcau auaccauauu caacaagacc 1020
uugauggaag ccgaugcuca cuacaaguca gucagaacuu ggaaugagau caucccuuca 1080
aaaggguguu uaagaguugg ggggaggugu cauccucaug ugaacggggu guuuuucaau 1140
gguauaauau uaggaccuga cggcaauguc uuaaucccag agaugcaauc aucccuccuc 1200
cagcaacaua uggaguuguu ggaauccucg guuauccccc uugugcaccc ccuggcagac 1260
ccgucuacca uuuucaagga cggugacgag gccgaggauu uuguugaagu ucaccuuccc 1320
gaugugcaca aucaggucuc aggaguugac uugggucucc cgaacugggg gaaguaugua 1380
uuacugagug caggggcccu gacugccuug auguugauaa uuuuccugau gacauguugu 1440
agaagaguca aucgaucaga accuacgcaa cacaaucuca gagggacagg gagggaggug 1500
ucagucacuc cccaaagcgg gaagaucaua ucuucauggg aaucacacaa gagugggggu 1560
gagaccagac uguga 1575
<210> 8
<211> 12058
<212> RNA
<213> Rabies virus ERA strain
<400> 8
aagcuuuaau acgacucacu auagggacgc uuaacaacca gaucaaagaa aaaacagaca 60
uugucaauug caaagcaaaa auguaacacc ccuacaaugg augccgacaa gauuguauuc 120
aaagucaaua aucagguggu cucuuugaag ccugagauua ucguggauca auaugaguac 180
aaguacccug ccaucaaaga uuugaaaaag cccuguauaa cccuaggaaa ggcucccgau 240
uuaaauaaag cauacaaguc aguuuuguca ggcaugagcg ccgccaaacu ugauccugac 300
gauguauguu ccuauuuggc agcggcaaug caguuuuuug aggggacaug uccggaagac 360
uggaccagcu auggaaucgu gauugcacga aaaggagaua agaucacccc agguucucug 420
guggagauaa aacguacuga uguagaaggg aauugggcuc ugacaggagg cauggaacug 480
acaagagacc ccacuguccc ugagcaugcg uccuuagucg gucuucucuu gagucuguau 540
agguugagca aaauauccgg gcaaaacacu gguaacuaua agacaaacau ugcagacagg 600
auagagcaga uuuuugagac agccccuuuu guuaaaaucg uggaacacca uacucuaaug 660
acaacucaca aaaugugugc uaauuggagu acuauaccaa acuucagauu uuuggccgga 720
accuaugaca uguuuuucuc ccggauugag caucuauauu cagcaaucag agugggcaca 780
guugucacug cuuaugaaga cuguucagga cugguaucau uuacuggguu cauaaaacaa 840
aucaaucuca ccgcuagaga ggcaauacua uauuucuucc acaagaacuu ugaggaagag 900
auaagaagaa uguuugagcc agggcaggag acagcuguuc cucacucuua uuucauccac 960
uuccguucac uaggcuugag ugggaaaucu ccuuauucau caaaugcugu uggucacgug 1020
uucaaucuca uucacuuugu aggaugcuau augggucaag ucagaucccu aaaugcaacg 1080
guuauugcug caugugcucc ucaugaaaug ucuguucuag ggggcuaucu gggagaggaa 1140
uucuucggga aagggacauu ugaaagaaga uucuucagag augagaaaga acuucaagaa 1200
uacgaggcgg cugaacugac aaagacugac guagcacugg cagaugaugg aacugucaac 1260
ucugacgacg aggacuacuu cucaggugaa accagaaguc cggaggcugu uuauacucga 1320
aucaugauga auggaggucg acuaaagaga ucucacauac ggagauaugu cucagucagu 1380
uccaaucauc aagcccgucc aaacucauuc gccgaguuuc uaaacaagac auauucgagu 1440
gacucauaag aaguugaaua acaaaaugcc ggaaaucuac ggauugugua uauccaucau 1500
gaaaaaaacu aacaccccuc cuuucgaacc aucccaaaca ugagcaagau cuuugucaau 1560
ccuagugcua uuagagccgg ucuggccgau cuugagaugg cugaagaaac uguugaucug 1620
aucaauagaa auaucgaaga caaucaggcu caucuccaag gggaacccau agagguggac 1680
aaucucccug aggauauggg gcgacuucac cuggaugaug gaaaaucgcc caaccauggu 1740
gagauggcca aggugggaga aggcaaguau cgagaggacu uucagaugga ugaaggagag 1800
gauccuagcu uccuguucca gucauaccug gaaaauguug gaguccaaau agucagacaa 1860
augaggucag gagagagauu ucucaagaua uggucacaga ccguagaaga gauuauaucc 1920
uaugucgcgg ucaacuuucc caacccucca ggaaagucuu cagaggauaa aucaacccag 1980
acuacuggcc gagagcucaa gaaggagaca acacccacuc cuucucagag agaaagccaa 2040
ucaucgaaag ccaggauggc ggcucaaacu gcuucuggcc cuccagcccu ugaauggucg 2100
gccaccaaug aagaggauga ucuaucagug gaggcugaga ucgcucacca gauugcagaa 2160
aguuucucca aaaaauauaa guuucccucu cgauccucag ggauacucuu guauaauuuu 2220
gagcaauuga aaaugaaccu ugaugauaua guuaaagagg caaaaaaugu accaggugug 2280
acccguuuag cccaugacgg guccaaacuc ccccuaagau guguacuggg augggucgcu 2340
uuggccaacu cuaagaaauu ccaguuguua gucgaauccg acaagcugag uaaaaucaug 2400
caagaugacu ugaaucgcua uacaucuugc uaaccgaacc ucuccccuca gucccucuag 2460
acaauaaagu ccgagauguc cuaaagucaa caugaaaaaa acaggcaaca ccacugauaa 2520
aaugaacuuc cuacguaaga uagugaaaaa uugcagggac gaggacacuc aaaaacccuc 2580
ucccgcguca gccccucugg augacgauga cccguggcuu ccacccccug aauacguccc 2640
gcugaaagaa ccuacaagca agaagaacau gaggaacuuu uguaucaacg gagggguuaa 2700
aguguguagc ccgaaugguu acucguucag gauccugcgg cacauucuga aaucauucga 2760
cgagauauau ucugggaauc auaggaugau cggguuaguc aaaguaguua uuggacuggc 2820
uuugucagga ucuccagucc cugagggcau gaacugggua uacaaauuga ggagaaccuu 2880
uaucuuccag ugggcugauu ccaggggccc ucuugaaggg gaggaguugg aauacucuca 2940
ggagaucacu ugggaugaug auacugaguu cgucggauug caaauaagag ugauugcaaa 3000
acagugucau auccagggca gaaucuggug uaucaacaug aacccgagag caugucaacu 3060
auggucugac augucucuuc agacacaaag guccgaagag gacaaagauu ccucucugcu 3120
ucuagaauaa ucagauuaua ucccgcaaau uuaucacuug uuuaccucug caggagagaa 3180
cauaugagcu caacuccaac ccuugggagc aauauaacaa aaaaacaugu uauggugcca 3240
uuaaaccgcu gcauuucauc aaagucaagu ugauuaccuu uacauuuuga uccucuugga 3300
ugugaaaaaa acuauuaaca ucccucaaaa gacucaagga aagaugguuc cucaggcucu 3360
ccuguuugua ccccuucugg uuuuuccauu guguuuuggg aaauucccua uuuacacgau 3420
accagacaag cuuggucccu ggagcccgau ugacauacau caccucagcu gcccaaacaa 3480
uuugguagug gaggacgaag gaugcaccaa ccugucaggg uucuccuaca uggaacuuaa 3540
aguuggauac aucuuagcca uaaaaaugaa cggguucacu ugcacaggcg uugugacgga 3600
ggcugaaacc uacacuaacu ucguugguua ugucacaacc acguucaaaa gaaagcauuu 3660
ccgcccaaca ccagaugcau guagagccgc guacaacugg aagauggccg gugaccccag 3720
auaugaagag ucucuacaca auccguaccc ugacuaccgc uggcuucgaa cuguaaaaac 3780
caccaaggag ucucucguua ucauaucucc aaguguggca gauuuggacc cauaugacag 3840
aucccuucac ucgagggucu ucccuagcgg gaagugcuca ggaguagcgg ugucuucuac 3900
cuacugcucc acuaaccacg auuacaccau uuggaugccc gagaauccga gacuagggau 3960
gucuugugac auuuuuacca auaguagagg gaagagagca uccaaaggga gugagacuug 4020
cggcuuugua gaugaaagag gccuauauaa gucuuuaaaa ggagcaugca aacucaaguu 4080
auguggaguu cuaggacuua gacuuaugga uggaacaugg gucgcgaugc aaacaucaaa 4140
ugaaaccaaa uggugcccuc ccgaucaguu ggugaaccug cacgacuuuc gcucagacga 4200
aauugagcac cuuguuguag aggaguuggu caggaagaga gaggaguguc uggaugcacu 4260
agaguccauc augacaacca agucagugag uuucagacgu cucagucauu uaagaaaacu 4320
ugucccuggg uuuggaaaag cauauaccau auucaacaag accuugaugg aagccgaugc 4380
ucacuacaag ucagucagaa cuuggaauga gaucaucccu ucaaaagggu guuuaagagu 4440
uggggggagg ugucauccuc augugaacgg gguguuuuuc aaugguauaa uauuaggacc 4500
ugacggcaau gucuuaaucc cagagaugca aucaucccuc cuccagcaac auauggaguu 4560
guuggaaucc ucgguuaucc cccuugugca cccccuggca gacccgucua ccauuuucaa 4620
ggacggugac gaggccgagg auuuuguuga aguucaccuu cccgaugugc acaaucaggu 4680
cucaggaguu gacuuggguc ucccgaacug ggggaaguau guauuacuga gugcaggggc 4740
ccugacugcc uugauguuga uaauuuuccu gaugacaugu uguagaagag ucaaucgauc 4800
agaaccuacg caacacaauc ucagagggac agggagggag gugucaguca cuccccaaag 4860
cgggaagauc auaucuucau gggaaucaca caagaguggg ggugagacca gacugugagg 4920
acuggccguc cuuucaacga uccaaguccu gaagaucacc uccccuuggg ggguucuuuu 4980
ugaaaaaaaa ccuggguuca auaguccucc uugaacucca ugcaacuggg uagauucaag 5040
agucaugaga uuuucauuaa uccucucagu ugaucaagca agaucaugua gauucucaua 5100
auaggggaga ucuucuagca guuucaguga cuaacgguac uuucauucuc caggaacuga 5160
caccaacagu uguagacaaa ccacggggug ucucggguga cucugugcuu gggcacagac 5220
aaaggucaug guguguucca ugauagcgga cucaggauga guuaauugag agaggcaguc 5280
uuccucccgu gaaggacaua agcaguagcu cacaaucauc ucgcgucuca gcaaagugug 5340
cauaauuaua aagugcuggg ucaucuaagc uuuucagucg agaaaaaaac auuagaucag 5400
aagaacaacu ggcaacacuu cucaaccuga gaucuacuuc aagaugcucg auccuggaga 5460
ggucuaugau gacccuauug acccaaucga guuagaggcu gaacccagag gaacccccau 5520
uguccccaac aucuugagga acucugacua caaucucaac ucuccuuuga uagaagaucc 5580
ugcuagacua auguuagaau gguuaaaaac agggaauaga ccuuaucgga ugacucuaac 5640
agacaauugc uccaggucuu ucagaguuuu gaaagauuau uucaagaagg uagauuuggg 5700
uucucucaag gugggcggaa uggcugcaca gucaaugauu ucucucuggu uauauggugc 5760
ccacucugaa uccaacagga gccggagaug uauaacagac uuggcccauu ucuauuccaa 5820
gucguccccc auagagaagc uguugaaucu cacgcuagga aauagagggc ugagaauccc 5880
cccagaggga guguuaaguu gccuugagag gguugauuau gauaaugcau uuggaaggua 5940
ucuugccaac acguauuccu cuuacuuguu cuuccaugua aucaccuuau acaugaacgc 6000
ccuagacugg gaugaagaaa agaccauccu agcauuaugg aaagauuuaa ccucagugga 6060
caucgggaag gacuugguaa aguucaaaga ccaaauaugg ggacugcuga ucgugacaaa 6120
ggacuuuguu uacucccaaa guuccaauug ucuuuuugac agaaacuaca cacuuaugcu 6180
aaaagaucuu uucuugucuc gcuucaacuc cuuaaugguc uugcucucuc ccccagagcc 6240
ccgauacuca gaugacuuga uaucucaacu augccagcug uacauugcug gggaucaagu 6300
cuugucuaug uguggaaacu ccggcuauga agucaucaaa auauuggagc cauaugucgu 6360
gaauaguuua guccagagag cagaaaaguu uaggccucuc auucauuccu ugggagacuu 6420
uccuguauuu auaaaagaca agguaaguca acuugaagag acguucgguc ccugugcaag 6480
aagguucuuu agggcucugg aucaauucga caacauacau gacuugguuu uuguguaugg 6540
cuguuacagg cauugggggc acccauauau agauuaucga aagggucugu caaaacuaua 6600
ugaucagguu cacauuaaaa aagugauaga uaaguccuac caggagugcu uagcaagcgg 6660
ccuagccagg aggauccuua gaugggguuu ugauaaguac uccaaguggu aucuggauuc 6720
aagauuccua gcccgagacc accccuugac uccuuauauc aaaacccaaa cauggccacc 6780
caaacauauu guagacuugg ugggggauac auggcacaag cucccgauca cgcagaucuu 6840
ugagauuccu gaaucaaugg auccgucaga aauauuggau gacaaaucac auucuuucac 6900
cagaccgaga cuagcuucuu ggcugucaga aaaccgaggg gggccuguuc cuagcgaaaa 6960
aguuauuauc acggcccugu cuaagccgcc ugucaauccc cgagaguuuc ugaggucuau 7020
agaccucgga ggauugccag augaagacuu gauaauuggc cucaagccaa aggaacggga 7080
auugaagauu gaaggucgau ucuuugcucu aaugucaugg aaucuaagau uguauuuugu 7140
caucacugaa aaacucuugg ccaacuacau cuugccacuu uuugacgcgc ugacuaugac 7200
agacaaccug aacaaggugu uuaaaaagcu gaucgacagg gucaccgggc aagggcuuuu 7260
ggacuauuca agggucacau augcauuuca ccuggacuau gaaaagugga acaaccauca 7320
aagauuagag ucaacagagg auguauuuuc uguccuagau caaguguuug gauugaagag 7380
aguguuuucu agaacacacg aguuuuuuca aaaggccugg aucuauuauu cagacagauc 7440
agaccucauc ggguuacggg aggaucaaau auacugcuua gaugcgucca acggcccaac 7500
cuguuggaau ggccaggaug gcgggcuaga aggcuuacgg cagaagggcu ggagucuagu 7560
cagcuuauug augauagaua gagaaucuca aaucaggaac acaagaacca aaauacuagc 7620
ucaaggagac aaccagguuu uauguccgac auauauguug ucgccagggc uaucucaaga 7680
ggggcuccuc uaugaauugg agagaauauc aaggaaugca cuuucgauau acagagccgu 7740
cgaggaaggg gcaucuaagc uagggcugau caucaagaaa gaagagacca uguguaguua 7800
ugacuuccuc aucuauggaa aaaccccuuu guuuagaggu aacauauugg ugccugaguc 7860
caaaagaugg gccagagucu cuugcgucuc uaaugaccaa auagucaacc ucgccaauau 7920
aaugucgaca guguccacca augcgcuaac aguggcacaa cacucucaau cuuugaucaa 7980
accgaugagg gauuuucugc ucaugucagu acaggcaguc uuucacuacc ugcuauuuag 8040
cccaaucuua aagggaagag uuuacaagau ucugagcgcu gaaggggaga gcuuucuccu 8100
agccauguca aggauaaucu aucuagaucc uucuuuggga gggguaucug gaaugucccu 8160
cggaagauuc cauauacgac aguucucaga cccugucucu gaaggguuau ccuucuggag 8220
agagaucugg uuaagcuccc acgaguccug gauucacgcg uugugucaag aggcuggaaa 8280
cccagaucuu ggagagagaa cacucgagag cuucacucgc cuucuagaag auccuaccac 8340
cuuaaauauc agaggagggg ccaguccuac cauucuacuc aaggaugcaa ucagaaaggc 8400
uuuauaugac gagguggaca agguggagaa uucagaguuu cgagaggcaa uccuguuguc 8460
caagacccau agagauaauu uuauacucuu cuuaacaucu guugagccuc uguuuccucg 8520
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gauacaaaac ucccgaacga uaagaaggca guuuagaaag agucucucaa aaacuuuaga 8640
agaauccuuc uacaacucag agauccacgg gauuagucgg augacccaga caccucagag 8700
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gggaagaaaa gugguaggca cgacaguucc ucacccuucu gagauguugg gguuacuucc 8820
caaguccucu auuucuugca cuuguggagc aacaggagga ggcaauccua gaguuucugu 8880
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cagauacagc gaaggagggu auucuucugu cugcccgaac cuccucucuc auauuucugu 9240
uaguacagac accaugucug auuugaccca agacgggaag aacuacgauu ucauguucca 9300
gccauugaug cuuuaugcac agacauggac aucagagcug guacagagag acacaaggcu 9360
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ucuugaauug aucucagggg uaaucucaua uauucuccug aggcuagaua accaucccuc 9840
cuuguacaua augcucagag aaccgucucu uagaggagag auauuuucua ucccucagaa 9900
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caacaggugg aucacccuag aggauaucag aucuagauca ucccuacuag acuacaguug 11820
ccugugaacc ggauacuccu ggaagccugc ccaugcuaag acucuugugu gauguaucuu 11880
gaaaaaaaca agauccuaaa ucugaaccuu ugguuguuug auuguuuuuc ucauuuuugu 11940
uguuuauuug uuaagcgugg gucggcaugg caucuccacc uccucgcggu ccgaccuggg 12000
cauccgaagg aggacgcacg uccacucgga uggcuaaggg agagcuacgc guggaucc 12058
Claims (11)
- G 단백질의 333번째 아미노산이 글루탐산으로 치환되고,
G 단백질의 194번째 아미노산이 세린으로 치환된 재조합 광견병 바이러스. - 제 1항에 있어서,
상기 G 단백질의 333번째 아미노산을 암호화하는 코돈이 GAA 코돈이고,
상기 G 단백질의 194번째 아미노산을 암호화하는 코돈이 TCC 코돈인 것을 특징으로 하는 재조합 광견병 바이러스. - 제 1항에 있어서,
상기 재조합 광견병 바이러스의 유전체가 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 재조합 광견병 바이러스. - 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 재조합 광견병 바이러스를 유효성분으로 함유하는 광견병 예방용 백신 조성물.
- 광견병 바이러스의 유전체 서열에서 G 단백질의 333번째 아미노산을 암호화하는 서열을 글루탐산을 암호화하는 서열로 치환하고, G 단백질의 194번째 아미노산을 암호화하는 서열을 세린을 암호화하는 서열로 치환하여 재조합 유전체를 제작하는 단계;
상기 재조합 유전체를 세포에 형질주입하는 단계;
상기한 세포에서 상기 재조합 유전체를 갖는 바이러스의 생성을 유도하는 단계;를 포함하는 재조합 광견병 바이러스 제조방법. - 제 5항에 있어서,
상기 글루탐산을 암호화하는 서열은 'GAA'이고,
상기 세린을 암호화하는 서열은 'TCC'인 것을 특징으로 하는 재조합 광견병 바이러스 제조방법. - 제 6항에 있어서,
상기 재조합 유전체의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 재조합 광견병 바이러스 제조방법. - 서열번호 2의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하고, 시료의 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 것을 특징으로 하는 재조합 광견병 바이러스 검출방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 프라이머로
서열번호 4의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 더 사용하는 것을 특징으로 하는 재조합 광견병 바이러스 검출방법. - 서열번호 2의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 재조합 광견병 바이러스 검출용 키트.
- 제 10항에 있어서,
서열번호 4의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 광견병 바이러스 검출용 키트.
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KR1020140066041A KR20150138956A (ko) | 2014-05-30 | 2014-05-30 | 재조합 광견병 바이러스, 이를 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 및 야외 광견병 바이러스와의 감별을 위한 멀티플렉스 rt-pcr |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020140066041A KR20150138956A (ko) | 2014-05-30 | 2014-05-30 | 재조합 광견병 바이러스, 이를 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 및 야외 광견병 바이러스와의 감별을 위한 멀티플렉스 rt-pcr |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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KR20150138956A true KR20150138956A (ko) | 2015-12-11 |
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ID=55020207
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020140066041A KR20150138956A (ko) | 2014-05-30 | 2014-05-30 | 재조합 광견병 바이러스, 이를 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 및 야외 광견병 바이러스와의 감별을 위한 멀티플렉스 rt-pcr |
Country Status (1)
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KR (1) | KR20150138956A (ko) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR20200026356A (ko) | 2018-08-29 | 2020-03-11 | 주식회사 코젠바이오텍 | 광견병 바이러스 및 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법 |
KR20200026358A (ko) | 2018-08-29 | 2020-03-11 | 주식회사 코젠바이오텍 | 광견병 바이러스 및 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법 |
-
2014
- 2014-05-30 KR KR1020140066041A patent/KR20150138956A/ko active Search and Examination
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KR20200026356A (ko) | 2018-08-29 | 2020-03-11 | 주식회사 코젠바이오텍 | 광견병 바이러스 및 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법 |
KR20200026358A (ko) | 2018-08-29 | 2020-03-11 | 주식회사 코젠바이오텍 | 광견병 바이러스 및 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법 |
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