KR20200026358A - 광견병 바이러스 및 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법 - Google Patents

광견병 바이러스 및 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광견병 바이러스(Rabies virus, RABV) 및 광견병 바이러스의 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주(V-RG, ERAGS 또는 Ad-0910G)를 특이적으로 동시에 구분하여 검출할 수 있고, 민감도가 우수하므로, 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주의 감별에 유용하게 사용될 수 있고, 광견병 미끼 백신 살포지역에서의 역학조사 및 백신 감시 사업 등에 활용될 수 있다.

Description

광견병 바이러스 및 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법{Primers for differentiation between Rabies virus and vaccine strains and differentiating method between Rabies virus and vaccine strains using the same}
본 발명은 광견병 바이러스(Rabies virus, RABV) 및 광견병 바이러스의 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법에 관한 것이다.
광견병 바이러스는 Rhabdoviridae과, Lyssavirus속에 속하는 신경친화성 바이러스로, 단일 가닥의 음성 RNA를 핵산으로 가지고 있다. 광견병 바이러스의 RNA는 nucleoprotein(N), non-structural protein(NS), matrix protein(M), glycoprotein(G), 또는 RNA polymerase(L)를 발현하는 5개의 유전자로 구성 되어있다. N, NS 및 L 단백질은 핵단백질 코어(nucleoprotein core)를 형성하는데 관여하고, M 단백질은 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)의 응축에 관여하며, G 단백질은 바이러스가 타겟 세포와 결합하는데 관여한다.
광견병 바이러스는 주로 온혈동물에 감염되어 광견병을 유발한다. 광견병은 인수공통전염병으로 세계적으로 매년 2만 5천 ~ 7만 5천명의 사람에게 감염되고, 그 중 2만 9천건 이상이 아시아 지역에서 발생한다. 광견병의 초기 증상으로는 발열, 두통, 전신쇠약감, 불안감, 발열, 권태감, 물린 부위의 감각이상 등이 나타나고, 후기 증상으로는 불면증, 불안, 혼돈, 흥분, 부분적인 마비, 환청, 흥분, 타액, 땀, 눈물 등 과다분비, 연하곤란, 물을 두려워하는 증세가 나타나며, 이후 수일 내에 섬망, 경련, 혼미, 혼수에 이르고, 호흡근 마비 또는 합병증으로 사망하게 된다. 광견병은 박쥐, 붉은 여우, 스컹크, 너구리, 개, 늑대, 몽구스 등의 숙주동물에 의해 전파되는데, 우리나라에서는 1993년 이후 개에 의한 전파는 사라지고 너구리 또는 오소리에 의해 전파되고 있으며, 1907년 처음으로 광견병이 발견된 이후 꾸준히 발생하여 1993년부터 2016년까지 총 444건이 보고되었다.
광견병 발생을 감소시키기 위해, 우리나라는 2000년부터 미끼 백신을 지속적으로 살포하고 있다. 미끼 백신은 주사용 백신을 접종하기 어려운 야생동물(여우, 너구리, 코요태 등)에게 적용하기 위한 경구용 백신으로서, 야생동물이 좋아하는 썩은 고기 안에 백신을 넣어 야생동물이 섭취하도록 유도하여 면역을 형성시킨다. 강원도와 경기도 북부지역의 광견병 발생지역을 중심으로 너구리가 서식하는 산간지역에 매년 미끼백신을 살포해 광견병 전파를 사전에 차단하고 있다.
현재 미끼백신으로 사용되는 V-RG(vaccinia rabies glycoprotein) 백신주는스컹크, 개 및 고양이에 경구투여 시 항체형성이 미비하여 야생 너구리와 여우에만 적용되고, 사람에게 접촉 시 감염사례가 보고되어 안전성이 문제되고 있다. 이에, 경구투여 시 목적동물(너구리, 개, 고양이)뿐 아니라 비목적동물(사람, 멧돼지, 조류 등)에도 안전한 새로운 광견병 백신 후보주가 연구되고 있다. 이와 관련하여, 광견병 백신 후보주로서 대한민국 공개특허 제10-2015-0138956호는 광견병 바이러스 G 단백질의 333번째 아미노산이 글루탐산으로, 194번째 아미노산이 세린으로 치환된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS, genetically modified rabies vaccine)를, 'Jiyoung Choi et al., Clin. Exp. Vaccine Res., 4: 189-194 (2015)'는 광견병 바이러스의 G 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스(Ad-0910G, recombinant Adenoviruses expressing the glycoprotein of rabies)를 개시하고 있다.
광견병을 효과적으로 방역하기 위해서는 지속적인 모니터링이 필요하다. 광견병 바이러스를 검출하기 위해 직접 형광항체 시험(direct fluorescent antibody test), 마우스 접종 시험(mouse inoculation test), 또는 광견병 조직 배양 접종 시험(rabies tissue culture inoculation test)등이 이용되고 있으나 시료 상태에 따라 감도가 떨어지는 문제점이 있다. 최근에는 분자 진단 기반의 방법인 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)이 이용되며, 이는 반응시간이 짧고, 민감도 및 특이도가 좋아 광견병 바이러스를 포함한 각종 바이러스 검출에 이용된다.
대한민국 공개특허 제10-2015-0138956호
Jiyoung Choi et al., Clin. Exp. Vaccine Res., 4: 189-194 (2015)
본 발명의 목적은 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제2 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 V-RG 백신주 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트, 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제3 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 ERAGS 백신주 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트, 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제4 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 Ad-0910G 백신주 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 광견병 바이러스(RABV) 및 광견병 바이러스의 백신주(V-RG, ERAGS 또는 Ad-0910G)를 특이적으로 동시에 구분하여 검출할 수 있고, 민감도가 우수하므로, 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주의 감별에 유용하게 사용될 수 있고, 광견병 미끼 백신 살포지역에서의 역학조사 및 백신 감시 사업 등에 활용될 수 있다.
도 1은 광견병 바이러스(RABV) 및 V-RG 백신주 감별용 프라이머 세트(A), RABV 및 ERAGS 백신주 감별용 프라이머 세트(B), 및 RABV 및 Ad-0910G 백신주 감별용 프라이머 세트(C)를 이용한 PCR 결과를 나타낸 도면이다(N, 대조군(no template control); M, 마커(marker); 106 내지 100, RABV 또는 백신주의 농도(copies/㎕).
도 2는 본 발명의 RABV/ERAGS 감별용 프라이머 세트(A), 기존 프라이머 세트 1(B), 및 기존 프라이머 세트 2(C)를 이용한 PCR 결과를 나타낸 도면이다(N, 대조군(no template control); M, 마커(marker); 1 내지 8, 05, 104, 103, 102, 101, 100, 10-1, 및 10-2 copies/㎕ 농도의 ERAGS 백신주).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제2 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 V-RG 백신주 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트, 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제3 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 ERAGS 백신주 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트, 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제4 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 Ad-0910G 백신주 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 광견병 바이러스 및 V-RG 백신주 감별용 프라이머 세트의 프라이머는 광견병 바이러스 또는 V-RG 백신주의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1 또는 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2 또는 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
본 발명의 광견병 바이러스 및 ERAGS 백신주 감별용 프라이머 세트의 프라이머는 광견병 바이러스 또는 ERAGS 백신주의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1 또는 5으로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2 또는 6로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
본 발명의 광견병 바이러스 및 Ad-0910G 백신주 감별용 프라이머 세트의 프라이머는 광견병 바이러스 또는 Ad-0910G 백신주의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1 또는 7으로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2 또는 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 광견병 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별용 조성물을 제공한다.
상기 광견병 바이러스의 백신주는 V-RG, ERAGS 또는 Ad-0910G일 수 있다.
상기 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별용 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트의 프라이머는 광견병 바이러스, V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 또는 Ad-0910G 백신주의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있고, 보다 구체적으로, 서열번호 1, 3, 5, 또는 7로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1 내지 8로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머들을 제작하고(표 1), 이를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 상기 프라이머들은 RABV와 각 백신주들을 특이성 있게 검출하였고(표 2 및 3 참조), 최소검출한계가 1 내지 10 copies/㎕으로 우수한 민감도를 나타냈다(도 1 참조). 또한, 본 발명의 RABV/ERAGS 감별용 프라이머 세트는 기존에 보고된 프라이머 세트에 비하여 우수한 검출능을 보임을 확인하였다(표 4 및 도 2 참조).
또한, 본 발명은 상기 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별용 조성물을 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별용 키트를 제공한다.
상기 광견병 바이러스의 백신주는 V-RG, ERAGS 또는 Ad-0910G일 수 있다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별용 프라이머 세트를 포함할 수 있고, 상기 프라이머 세트의 프라이머는 광견병 바이러스, V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 또는 Ad-0910G 백신주의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있으며, 보다 구체적으로, 서열번호 1, 3, 5, 또는 7로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 광견병 바이러스, V-RG 백신주, ERAGS 백신주 또는 Ad-0910G 백신주의 특정 영역에 대한 특이적인 프라이머 쌍들 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별방법을 제공한다.
상기 광견병 바이러스의 백신주는 V-RG, ERAGS 또는 Ad-0910G일 수 있다.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.
상기 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별용 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트의 프라이머는 광견병 바이러스, V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 또는 Ad-0910G 백신주의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있고, 보다 구체적으로, 서열번호 1, 3, 5, 또는 7로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. RABV, V-RG 백신주, ERAGS 백신주 및 Ad-0910G 백신주 검출용 프라이머 세트 제작
1-1. RABV 검출용 프라이머 제작
한국에서 주로 발생하는 RABV 균주(strain)를 조사하여 미국국립생물정보센터(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 각 균주의 염기서열을 수집하였다. 수집된 염기서열에서 보존 영역(conserved region)을 확인하여 이를 표적으로 하고, 증폭 산물의 크기가 122 bp인 프라이머 쌍을 제작하였다(표 1, 서열번호 1 및 2).
프라이머명a 서열(5'→3') 증폭 산물 크기(bp) 서열번호
RABV F GCAAGAAGAACATGAGGAACTTTTG 122 1
RABV R ATTTCCAGAATATATCTCGTCGAATGAT 2
V-RG F CGGTAAGGAAGTAGAATCATAAAGAACAGT 202 3
V-RG R TTCGTCCTCCACTACCAAATTGTT 4
ERAGS F GTGTTTTGGGAAATTCCCTATT 611 5
ERAGS R ATGCTCTCTTCCCTCTACTGGA 6
Ad-0910G F CACCTTCCGGATGTACACAAAC 401 7
Ad-0910G R CTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCC 8
aF: 정방향(forward) 프라이머
R: 역방향(reverse) 프라이머
1-2. RABV의 백신주 검출용 프라이머 제작
RABV에 대한 V-RG 백신주, ERAGS 백신주 및 Ad-0910G 백신주의 염기서열을 NCBI 데이터베이스 및 염기서열 분석을 통해 수집하였다. 수집한 염기서열들을 Geneious 소프트웨어를 이용하여 다중-얼라인먼트(multi-alignment)하여, V-RG 백신주, ERAGS 백신주 및 Ad-0910G 백신주 각각의 염기서열에서 특이적으로 나타나는 부위에 해당하는 프라이머를 제작하였다(표 1. 서열번호 3 내지 8). 프라이머는 Tm(melting temperature) 값이 60℃가 되도록 제작하였으며, 프라이머 익스프레스(primer express) 소프트웨어로 GC 비율 및 Tm 값을 계산하였다.
실험예 1. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR의 분석적 특이도 확인
상기 실시예 1에서 제작한 3종 프라이머 세트를 이용한 PCR 방법의 분석적 특이도를 백신주들의 gRNA(genomic RNA), 다양한 종류의 gDNA(genomic DNA) 및 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 키트(PowerAmpTM One Step RT-PCR Kit, 코젠바이오텍, 대한민국)를 이용하여 확인하였다.
구체적으로, RABV, V-RG 백신주, ERAGS 백신주 및 Ad-0910G 백신주의 gRNA 시료, 및 하기 표 5의 병원체들의 각 gDNA 시료, 및 RABV 또는 이의 백신주들에 노출되지 않은 건강한 동물들의 gDNA 시료를 한국수의유전자원은행에서 분양받았다. 각 gRNA를 역전사 효소와 함께 50℃에서 30분 동안 반응시켜 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)로 합성하였고, 상기 gDNA들은 분양받은 시료를 100배 희석하여 준비하였다. 상기 cDNA 및 희석된 gDNA 각 5 ㎕, 하기 표 2에 기재된 각 프라이머들 1 ㎕(각 조성물별로 4종의 프라이머 사용), 2×RT-PCR 마스터 믹스 10 ㎕ 및 뉴클레아제가 없는 증류수(nuclease-free water) 1 ㎕를 혼합하여 총 20 ㎕의 PCR 반응물을 제조하고, 하기 표 3에 기재된 반응 조건으로 PCR을 수행하였다(GeneAmp 9700 PCR System, Life technologies, 미국). 증폭된 PCR 산물을 2% 아가로스 젤에 5 ㎕씩 전기영동하여 밴드 검출 여부를 확인하였다.
조성물 프라이머 농도(pmole/㎕)
RABV/V-RG duplex RABV F 10
RABV R 10
V-RG F 10
V-RG R 10
RABV/ERAGS duplex RABV F 10
RABV R 10
ERAGS F 10
ERAGS R 10
RABV/Ad-0910G duplex RABV F 10
RABV R 10
Ad-0910G F 10
Ad-0910G R 10
온도(℃) 시간 싸이클 수
50 30분 1
94 15분 1
94 30초 35
60 30초
72 1분
72 7분 1
4 -
번호 카테고리 균주명 RABV/V-RG duplex RABV/ERAGS duplex RABV/Ad-0910G duplex
RABV
(122bp) 		V-RG
(611bp) 		RABV
(122bp) 		ERAGS
(202bp) 		RABV
(122bp) 		Ad-0910G
(401bp)
1 Rabies virus Rabies virus + - + - + -
2 Rabies virus vaccine strain V-RG strain - + - - - -
3 ERAGS strain + - + + + -
4 Ad-0910G strain - - - - - +
5 Influenza virus Influenza A H1 - - - - - -
6 Influenza A H3 - - - - - -
7 Influenza A H5 - - - - - -
8 Respiratory virus Adenovirus - - - - - -
9 Parainfluenza 1 - - - - - -
10 Parainfluenza 2 - - - - - -
11 Parainfluenza 3 - - - - - 　
12 Coronavirus - - - - - -
13 Respiratory syncytial virus A - - - - - -
14 Respiratory syncytial virus B - - - - - -
15 Measles - - - - - -
16 Rubella - - - - - -
17 Mumps - - - - - -
18 Pathogenic bacteria Bacillus cereus - - - - - -
19 Bacillus subtilis - - - - - -
20 Campylobacter jejuni - - - - - -
21 E.coli O157 - - - - - -
22 Listeria monocytogenes - - - - - -
23 Yersinia enterocolitica - - - - - -
24 Clostridium perfringens - - - - - -
25 Salmonella typhi - - - - - -
26 Salmonella typhimurium - - - - - -
27 Shigella sonnei - - - - - -
28 Staphylococcus aureus - - - - - -
29 Vibrio vulnificus - - - - - -
30 Yersinia enterocolitica - - - - - -
31 Legionella pneumophila - - - - - -
32 Pseudomonas aeruginosa - - - - - -
33 Mycoplasma pneumoniae - - - - - -
34 Other
species 		Cow - - - - - -
35 Pork - - - - - -
36 Chicker - - - - - -
37 Duck - - - - - -
38 Sheep - - - - - -
39 Goat - - - - - -
40 Turkey - - - - - -
41 Raccoon dog - - - - - -
42 Horse - - - - - -
43 Donkey - - - - - -
44 Human - - - - - -
45 Dog - - - - - -
그 결과, 본 발명의 RABV/ERAGS 감별용 프라이머 세트는 RABV 및 ERAGS 백신주를, RABV/V-RG 감별용 프라이머 세트는 RABV 및 V-RG 백신주를, RABV/Ad-0910G 감별용 프라이머 세트는 RABV 및 Ad-0910G 백신주를 특이적으로 구별하여 검출하였으며, 다른 병원체 gDNA 시료들이나 RABV 또는 이의 백신주들에 노출되지 않은 건강한 동물의 gDNA 시료에서는 증폭반응을 나타내지 않았다(표 4). 이는 본 발명의 프라이머 세트들이 표적 서열에 대해 높은 특이도를 나타냄을 제시한다.
실험예 2. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR의 분석적 민감도 확인
상기 실시예 1에서 제작한 3종 프라이머 세트를 이용한 PCR 방법의 분석적 민감도를 최소검출한계(limit of detection, LoD)를 측정하여 확인하였다.
2-1. 분석적 민감도 확인을 위한 PCR 산물의 제작
주형 RNA 시료 각 5 ㎕, 10 pmole/㎕로 희석하여 혼합한 프라이머 쌍 1 ㎕, 2×RT-PCR 마스터 믹스 10 ㎕, 및 뉴클레아제가 없는 증류수 4 ㎕를 혼합하여 총 20의 PCR 반응물을 제조하고, 하기 표 3에 기재된 반응 조건으로 PCR을 수행하였다(GeneAmp 9700 PCR System, Life technologies, 미국). RABV의 프라이머 쌍(서열번호 1 및 2) 및 ERAGS 백신주의 프라이머 쌍(서열번호 5 및 6)은 ERAGS 백신주 유전자와, V-RG 백신주의 프라이머 쌍(서열번호 3 및 4)은 V-RG 백신주 유전자와, Ad-0910G 백신주의 프라이머 쌍(서열번호 7 및 8)은 Ad-0910G 백신주 유전자와 혼합하여 반응시켰다. 증폭된 PCR 산물을 PCR 정제 키트(QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen, 독일)로 정제하여 RABV, V-RG 백신주, ERAGS 백신주 및 Ad-0910G 백신주의 합성 DNA를 수득하였다.
2-2. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR의 분석적 민감도 확인
상기 실험예 2-2에서 정제한 각 합성 DNA의 농도를 계산하여 106, 105, 104, 103, 102, 101 또는 100 copies/㎕ 농도로 준비하여 PCR을 수행한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 최소검출한계는 육안으로 밴드가 관찰되는 최소 농도를 기준으로 평가하였다.
그 결과, 3종 프라이머 세트 모두에서 RABV는 10 copies/㎕까지 검출되었고, V-RG 백신주 및 ERAGS 백신주는 10 copies/㎕까지, Ad-0910G 백신주는 1 copy/㎕까지 검출되었다(도 1).
실험예 3. 기존에 보고된 프라이머 세트를 이용한 RABV 및 백신주 감별 PCR 검출효율 확인
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR의 분석적 민감도의 우수성을 확인하고자, 기존에 보고된 RABV 및 ERAGS 백신주의 감별을 위한 프라이머 세트(대한민국 공개특허 제10-2015-0138956호; 공지 프라이머 세트 1)와 RABV 검출용 프라이머 세트(동물질병 표준 진단요령, 농림축산검역본부, 2015; 공지 프라이머 세트 2)를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다.
구체적으로, 본 발명의 프라이머에 대한 검출효율 확인은 본 발명의 RABV/ERAGS duplex의 프라이머들을 사용하고, 상기 실험예 1에서 합성한 것과 동일한 ERAGS 백신주의 cDNA를 105 copies/㎕에서 1/10씩 단계적으로 희석한 총 8개 농도의 시료를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.
공지 프라이머 세트 1에 대한 검출효율 확인은 하기 표 5의 서열번호 9 내지 12의 프라이머들(50 pmole/㎕) 각 1 ㎕, 2×RT-PCR 마스터 믹스 12.5 ㎕ 및 뉴클레아제가 없는 증류수 3.5 ㎕ 및 농도별로 희석한 ERAGS 백신주의 cDNA 각 5 ㎕를 혼합하여 총 25 ㎕의 PCR 반응물을 제조하고, 하기 표 6의 반응 조건(대한민국 공개특허 제10-2015-0138956호)을 적용한 것을 제외하고는 상기 본 발명의 프라이머에 대한 검출효율 확인과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.
공지 프라이머 세트 2에 대한 검출효율 확인은 하기 표 5의 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍을 각각 10 pmole/㎕의 농도로 희석하여 사용하고, 하기 표 7의 반응 조건을 적용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.
구분 프라이머명a 서열(5'→3') 서열번호 증폭산물
크기(bp)
공지 프라이머
세트 1		 ERAGS-F TGTCTTGTGACATTTTTACCtcc 9 459
ERAGS-R GGATGATCTCATTCCAAGTTtc 10
ComRABV-F AGGRAATTGGGCTTTGACTGGA 11 183
ComRABV-R AAAGGGGCTGTCTCGAAAAT 12
공지 프라이머
세트 2		 RVNS-F GCA GAT AGG ATA GAG CAR A 13 467
RVNS-R AAA GTG AAT GAG ATT GAA C 14
aF: 정방향(forward) 프라이머
R: 역방향(reverse) 프라이머
온도(℃) 시간 싸이클 수
42 15분 1
95 3분 1
95 30초 39
55 30초
72 30초
72 5분 1
4 10분 1
온도(℃) 시간 싸이클 수
50 30분 1
95 15분 1
94 30초 35
55 30초
72 30초
72 10분 1
4 -
그 결과, 본 발명의 RABV/ERAGS 감별용 프라이머 세트는 RABV 및 ERAGS 백신주의 공통적인 유전자를 검출하는 RABV에 대한 프라이머 쌍(서열번호 1 및 2)에 의하여 ERAGS 백신주를 102 copies/㎕까지 검출하였고, ERAGS 백신주의 유전자만을 특이적으로 검출하는 ERAGS 백신주에 대한 프라이머 쌍(서열번호 5 및 6)에 의하여 ERAGS 백신주를 101 copies/㎕까지 검출하였다(도 2A). 반면, 공지 프라이머 세트 1은 RABV 및 ERAGS 백신주의 공통적인 유전자를 검출하는 RABV에 대한 프라이머 쌍(서열번호 9 및 10)에 의하여 ERAGS 백신주를 104 copies/㎕까지 검출하였고, ERAGS 백신주의 유전자만을 특이적으로 검출하는 ERAGS 백신주에 대한 프라이머 쌍(서열번호 11 및 12)에 의하여 ERAGS 백신주를 103 copies/㎕까지 검출하였다(도 2B). 이는 본 발명의 프라이머 세트가 공지 프라이머 세트 1에 비하여 현저히 우수한 검출능을 가지고 있음을 제시한다.
또한, 공지 프라이머 세트 2는 RABV를 검출하는 프라이머 쌍(서열번호 13 및 14)에 의하여 ERAGS 백신주를 101 copies/㎕까지 검출하여 본 발명의 프라이머 세트와 유사한 검출효율을 나타냈으나(도 2C), 공지 프라이머 세트 2와는 달리 본 발명은 RABV 및 ERAGS 백신주를 동시에 구별하여 검출할 수 있는 점에서 보다 우수한 검출능을 가진다.
<110> KoGene BioTech Co., LTD. <120> Primers for differentiation between Rabies virus and vaccine strains and differentiating method between Rabies virus and vaccine strains using the same <130> 2018P-07-046 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RABV F <400> 1 gcaagaagaa catgaggaac ttttg 25 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RABV R <400> 2 atttccagaa tatatctcgt cgaatgat 28 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V-RG F <400> 3 cggtaaggaa gtagaatcat aaagaacagt 30 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V-RG R <400> 4 ttcgtcctcc actaccaaat tgtt 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERAGS F <400> 5 gtgttttggg aaattcccta tt 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERAGS R <400> 6 atgctctctt ccctctactg ga 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ad-0910G F <400> 7 caccttccgg atgtacacaa ac 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ad-0910G R <400> 8 ctccttccgt gtttcagtta gcc 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERAGS-F <400> 9 tgtcttgtga catttttacc tcc 23 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERAGS-R <400> 10 ggatgatctc attccaagtt tc 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ComRABV-F <400> 11 aggraattgg gctttgactg ga 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ComRABV-R <400> 12 aaaggggctg tctcgaaaat 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVNS-F <400> 13 gcagatagga tagagcara 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVNS-R <400> 14 aaagtgaatg agattgaac 19

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트; 및
    서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제2 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 V-RG(vaccina rabies glycoprotein) 백신주 감별용 프라이머 세트.
  2. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트; 및
    서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제3 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 ERAGS(genetically modified rabies vaccine) 백신주 감별용 프라이머 세트.
  3. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트; 및
    서열번호 7의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 제4 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 Ad-0910G(recombinant Adenoviruses expressing glycoprotein of rabies) 백신주 감별용 프라이머 세트.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항의 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 광견병 바이러스의 백신주는 V-RG, ERAGS 또는 Ad-0910G인, 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별용 조성물.
  6. 제4항의 조성물을 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 광견병 바이러스의 백신주는 V-RG, ERAGS 또는 Ad-0910G인, 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별용 키트.
  8. 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 제1항, 제2항 또는 제3항의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 광견병 바이러스의 백신주는 V-RG, ERAGS 또는 Ad-0910G인, 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는, 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스의 백신주 감별방법.
KR1020180102226A 2018-08-29 2018-08-29 광견병 바이러스 및 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법 KR102142137B1 (ko)

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