KR101857685B1 - 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법 - Google Patents

코로나바이러스의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코로나바이러스의 4가지 아형인 HKU1, OC43, 229E 및 NL63을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 일반적으로 사람에게 감염되는 코로나바이러스인 HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63 및 HCoV-HKU1를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브는 민감도가 우수하며, HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63 및 HCoV-HKU1를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63 및 HCoV-HKU1의 검출 및 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

코로나바이러스의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법{PRIMERS AND PROBES FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF SUBTYPES OF CORONAVIRUS AND DETECTING METHOD FOR CORONAVIRUS USING THE SAME}
본 발명은 코로나바이러스의 아형인 HKU1, OC43, 229E 및 NL63을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법에 관한 것이다.
코로나바이러스(coronavirus)는 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하며 구형의 외막을 가지는 약 100 내지 120 nm 크기의 단일가닥 양성 RNA 바이러스로, 가장 외각에 있는 스파이크(spike; S) 단백질, 헤마글루티닌-에스테라제(hemagglutinin-esterase; HE) 단백질, 막관통(transmembrane; M) 단백질, 작은 막(small membrane; E) 단백질 및 뉴클레오캡시드(nucleocapsid; N) 단백질과 같은 5개의 구조 단백질로 이루어져 있다(Lai and Homes, 2001. Fields Virology).
코로나바이러스는 1937년 닭에서 처음 발견된 뒤 박쥐, 고양이, 소, 쥐, 개, 돼지, 조류 등의 동물을 거쳐 1965년에는 사람에게서도 발견되었다. 사람에게 감염되는 일반적인 사람 코로나바이러스로 HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63 및 HCoV-HKU1가 알려져 있다. 지금까지 코로나바이러스는 사람에게는 거의 감염되지 않고 주로 개, 돼지, 소 등의 동물에 감염되는 병원균으로 인식되어 왔으며, 사람에게 감염될 때에도 호흡기 증상을 유발하는 여러 바이러스 가운데 하나로서 단순한 감기를 유발하거나 어린이에게 위험성이 그리 높지 않은 설사 등의 장질환을 일으키는 경우가 있을 뿐이었다. 그러나, 2003년 3월 중순에 처음으로 발생하여 세계적으로 100명이 넘는 사망자와 3,000여 명의 환자를 발생시킨 중증급성호흡기증후군(SARS) 및 2012년 9월에 사우디아라비아에서 처음으로 발생하여 세계적으로 600명이 넘는 사망자와 1,980여 명의 환자를 발생시킨 중동호흡기증후군(MERS)의 원인균이 신종(변종) 코로나 바이러스인 것으로 알려지면서 점차 주목받기 시작하였다.
SARS 또는 MERS 바이러스는 일반적인 코로나바이러스와 달리, 사람에게 감염되면 생명을 위협할만큼 치명적이므로, 이를 구별하여 검출할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
이와 관련하여, 대한민국 특허등록 제10-0625325호에는 SARS 바이러스의 리더서열 또는 N 단백질을 코딩하는 염기서열 유래의 프로브 조성물과 프라이머 및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법이 개시되어 있다.
이에, 본 발명자들은 코로나바이러스의 아형을 구별하여 검출하기 위한 방법을 개발하던 중, 일반적으로 사람에게 감염되는 코로나바이러스인 HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63 및 HCoV-HKU1를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하고, 상기 프라이머 및 프로브를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하면 우수한 민감도로 HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63 및 HCoV-HKU1를 동시에 특이적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브 세트를 사용하여 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 및 11로 각각 기재되는 모든 염기서열로 이루어진 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3, 6, 9 및 12로 각각 기재되는 모든 염기서열로 이루어진 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 검체를 주형으로 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 것을 포함하는 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브는 일반적으로 사람에게 감염되는 코로나바이러스인 HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63 및 HCoV-HKU1를 특이적으로 동시에 검출할 수 있고, 민감도가 우수하므로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 코로나바이러스의 아형을 검출 및 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 HCoV-HKU1을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브를 이용하여 다른 아형의 코로나바이러스와 유전자 얼라인먼트를 수행함으로써, 다른 아형의 코로나바이러스가 검출되지 않는 것을 확인한 도이다.
도 2는 HCoV-OC43를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브를 이용하여 다른 아형의 코로나바이러스와 유전자 얼라인먼트를 수행함으로써, 다른 아형의 코로나바이러스가 검출되지 않는 것을 확인한 도이다.
도 3은 HCoV-229E를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브를 이용하여 다른 아형의 코로나바이러스와 유전자 얼라인먼트를 수행함으로써, 다른 아형의 코로나바이러스가 검출되지 않는 것을 확인한 도이다.
도 4는 HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브를 이용하여 다른 아형의 코로나바이러스와 유전자 얼라인먼트를 수행함으로써, 다른 아형의 코로나바이러스가 검출되지 않는 것을 확인한 도이다.
도 5는 HCoV-HKU1을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계를 분석한 결과 그래프이다.
도 6은 HCoV-OC43을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계를 분석한 결과 그래프이다.
도 7은 HCoV-229E를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계를 분석한 결과 그래프이다.
도 8은 HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계를 분석한 결과 그래프이다.
도 9는 HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E 및 HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 특이도를 분석한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 및 11로 각각 기재되는 모든 염기서열로 이루어진 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
상기 코로나바이러스의 아형은 HKU1, OC43, 229E 및 NL63일 수 있다.
상기 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 코로나바이러스 HKU1 검출용 프라이머일 수 있다. 상기 서열번호 4 및 5로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 코로나바이러스 OC43 검출용 프라이머일 수 있다. 상기 서열번호 7 및 8로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 코로나바이러스 229E 검출용 프라이머일 수 있다. 상기 서열번호 10 및 11로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 코로나바이러스 NL63 검출용 프라이머일 수 있다.
상기 프라이머는 코로나바이러스 HKU1, OC43, 229E 또는 NL63의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 상기 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 20 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 쌍일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 및 11로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 3, 6, 9 및 12로 각각 기재되는 모든 염기서열로 이루어진 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 프로브 세트를 제공한다.
상기 코로나바이러스의 아형은 HKU1, OC43, 229E 및 NL63일 수 있다.
상기 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브는 코로나바이러스 HKU1 검출용 프로브일 수 있다. 상기 서열번호 6으로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브는 코로나바이러스 OC43 검출용 프로브일 수 있다. 상기 서열번호 9로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브는 코로나바이러스 229E 검출용 프로브일 수 있다. 상기 서열번호 12로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브는 코로나바이러스 NL63 검출용 프로브일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어“프로브”는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM, JOE, Cy5 또는 NED일 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 소광자는 BHQ2일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 및 11로 각각 기재되는 모든 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 3, 6, 9 및 12로 각각 기재되는 모든 염기서열로 이루어진 프로브 세트를 포함하는 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물을 제공한다.
상기 코로나바이러스의 아형은 HKU1, OC43, 229E 및 NL63일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머는 코로나바이러스 HKU1, OC43, 229E 또는 NL63의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트는 상기 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 20 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 쌍일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 및 11로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 프로브는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM, JOE, Cy5 또는 NED, 상기 소광자는 BHQ2일 수 있다.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 및 11로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 3, 6, 9 및 12로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 제작하고(표 1 내지 4 참조), 이를 이용하여 실시간 RT-PCR의 검출한계를 분석한 결과, RNA를 1.0×100 까지 희석하는 경우에도 HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E 및 HCoV-NL63가 검출됨을 확인하였다(표 6 내지 9 및 도 5 내지 8 참조). 또한, 상기 프라이머 및 프로브는 HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E 및 HCoV-NL63만을 특이적으로 검출함을 확인하였다(표 10, 11 및 도 9 참조).
또한, 본 발명은 본 발명의 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물을 포함하는 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트를 제공한다.
상기 코로나바이러스의 아형은 HKU1, OC43, 229E 및 NL63일 수 있다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 및 11로 각각 기재되는 모든 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 3, 6, 9 및 12로 각각 기재되는 모든 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 코로나바이러스 HKU1, OC43, 229E 또는 NL63의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 및 11로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM, JOE, Cy5 또는 NED, 상기 소광자는 BHQ2일 수 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 코로나바이러스 HKU1, OC43, 229E 또는 NL63의 특정 영역에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 코로나바이러스 HKU1, OC43, 229E 또는 NL63의 유전자인 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 검체를 주형으로 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 및 11로 각각 기재되는 모든 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 3, 6, 9 및 12로 각각 기재되는 모든 염기서열로 이루어진 프로브 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 것을 포함하는 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
상기 코로나바이러스의 아형은 HKU1, OC43, 229E 및 NL63일 수 있다.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.
상기 프라이머 세트 및 프로브 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머는 코로나바이러스 HKU1, OC43, 229E 또는 NL63의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있으며, 상기 프라이머 세트는 상기 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 20 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 쌍일 수 있다. 또한, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E 및 HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 제작
<1-1> HCoV-HKU1을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 제작
NCBI 데이터베이스로부터 HKU1에 대한 NCBI 표준 염기서열을 수집하고 이를 NCBI에서 블라스트(BLAST)하여 유전자 은행(Genebank)에 등록된 31개의 HKU1 염기서열을 획득하였다. 확보된 염기서열을 Geneious 소프트웨어를 이용하여 다중-얼라인먼트(multi-alignment)한 후, 이로부터 HKU1에서만 동일하게 나타나는 염기서열에 해당하는 프라이머 및 프로브를 제작하였다. 프라이머는 Tm(melting temperature)이 60℃, 프로브는 Tm이 70℃가 되도록 제작하였으며, primer express 소프트웨어를 이용하여 GC 비율 및 Tm 값을 계산하였다. 이때, 프로브의 5' 말단에는 리포터로 Cy5를, 3' 말단에는 소광자로 BHQ2를 붙였다. HCoV-HKU1을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 서열은 하기 표 1과 같다. 제작된 프라이머 및 프로브를 이용하여 다른 아형의 코로나바이러스가 검출되지 않는지 여부를 다른 아형의 코로나바이러스와 유전자 얼라인먼트(alignment)를 통해 확인하였다.
HCoV-HKU1 코로나바이러스를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 서열
타겟 프라이머 또는
프로브		 농도 서열(5'→3')
HCoV-HKU1 Forward 0.5 μM GTAGTGGCTTGGCATGTAGTTCG(서열번호 1)
Reverse 0.5 μM GTGCAACATATTTAATACCACAAATAGTAGC(서열번호 2)
Probe 0.1 μM TTCACGATTTGTTATGCGCCTGCAGACT(서열번호 3)
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 제작한 프라이머 및 프로브에 의해 다른 아형의 코로나바이러스가 검출될 확률은 없음을 확인하였다(도 1).
<1-2> HCoV-OC43를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 제작
논문과 NCBI에서 확보한 총 451개의 OC43 서열을 기초로 프로브의 5' 말단에는 리포터로 FAM을, 3' 말단에는 소광자로 MGB NFQ를 붙인 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 프라이머 및 프로브를 제작하였다. HCoV-OC43을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 서열은 하기 표 2와 같다. 제작된 프라이머 및 프로브를 이용하여 다른 아형의 코로나바이러스가 검출되지 않는지 여부를 다른 아형의 코로나바이러스와 유전자 얼라인먼트(alignment)를 통해 확인하였다.
HCoV-OC43 코로나바이러스를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 서열
타겟 프라이머 또는
프로브		 농도 서열(5'→3')
HCoV-OC43 Forward 0.5 μM AGTACTGCTATTTCTGTTCAAACATGTG(서열번호 4)
Reverse 0.5 μM GCTCYACGACTTCGTCTGTTTTTAGA(서열번호 5)
Probe 0.1 μM TCTCACAGTAGGTAGTGGTT(서열번호 6)
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 제작한 프라이머 및 프로브에 의해 다른 아형의 코로나바이러스가 검출될 확률은 없음을 확인하였다(도 2).
<1-3> HCoV-229E를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 제작
논문과 NCBI에서 확보한 총 117개의 229E 서열을 기초로 프로브의 5' 말단에는 리포터로 JOE를, 3' 말단에는 소광자로 MGB NFQ를 붙인 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 프라이머 및 프로브를 제작하였다. HCoV-229E를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 서열은 하기 표 3과 같다. 제작된 프라이머 및 프로브를 이용하여 다른 아형의 코로나바이러스가 검출되지 않는지 여부를 다른 아형의 코로나바이러스와 유전자 얼라인먼트(alignment)를 통해 확인하였다.
HCoV-229E 코로나바이러스를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 서열
타겟 프라이머 또는
프로브		 농도 서열(5'→3')
HCoV-229E Forward 0.5 μM AAGGGCAAACGGGTGGAT(서열번호 7)
Reverse 0.5 μM GGGTCCTGTGCCAAGATAATAAA(서열번호 8)
Probe 0.1 μM TGTCACCCAAGCTGCAT(서열번호 9)
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 제작한 프라이머 및 프로브에 의해 다른 아형의 코로나바이러스가 검출될 확률은 없음을 확인하였다(도 3).
<1-4> HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 제작
논문과 NCBI에서 확보한 총 69개의 NL63 서열을 기초로 프로브의 5' 말단에는 리포터로 NED를, 3' 말단에는 소광자로 MGB NFQ를 붙인 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 프라이머 및 프로브를 제작하였다. HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 서열은 하기 표 4와 같다. 제작된 프라이머 및 프로브를 이용하여 다른 아형의 코로나바이러스가 검출되지 않는지 여부를 다른 아형의 코로나바이러스와 유전자 얼라인먼트(alignment)를 통해 확인하였다.
HCoV-NL63 코로나바이러스를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 서열
타겟 프라이머 또는
프로브		 농도 서열(5'→3')
HCoV-NL63 Forward 0.825 μM AATCGCAAACGTAATCAGAAACC(서열번호 10)
Reverse 0.825 μM GAGCTCTGGAGGCAAAGCAA(서열번호 11)
Probe 0.2 μM TTGGAACCAAAGTTCT(서열번호 12)
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 제작한 프라이머 및 프로브에 의해 다른 아형의 코로나바이러스가 검출될 확률은 없음을 확인하였다(도 4).
HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E 및 HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계 분석
<2-1> HCoV-HKU1을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계 분석
먼저, HCoV-HKU1의 타겟 유전자 부위를 대상으로 상기 표 1에 기재된 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, PCR 산물을 PCR 정제 키트(quiagen)를 사용하여 정제했다. 정제된 PCR 산물을 pGMEM-T-easy vector(Invitrogen)에 클로닝하여 PCR 산물이 삽입된 플라스미드 DNA를 제작하였다. 삽입된 PCR 산물의 방향성을 고려하여 PstⅠ 또는 ApaⅠ 제한효소(NEB)로 플라스미드 DNA를 선형화하고 T7 또는 SP6 RNA 중합효소(NEB)를 이용해 RNA를 수득했다. 상기 RNA는 DNase(Ambion)를 처리하여 플라스미드 DNA를 제거한 후 Trizol 용액(Life Technology)을 이용해 회수하여 주형으로 사용하였다. 상기 HCoV-HKU1 주형 RNA는 1.0×100 내지 1.0×106 copies/㎕의 총 7단계로 단계희석하여 실시간 RT-PCR을 통해 프라이머 및 프로브의 검출한계를 분석하였다.
이때, 실시간 RT-PCR의 반응용액은 5 ㎕(1 ng/㎕)의 주형 RNA, 상기 표 1에 기재된 4 ㎕(10 pmol/㎕)의 프라이머와 프로브의 혼합물과 11 ㎕의 RT-MIX(Thermofisher scientific, USA), RT-Enzyme(Thermofisher scientific, USA) 및 멸균증류수를 혼합하여 총 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다. 실시간 RT-PCR 반응은 ABI 7500 Fast(ABI, USA) 기기를 사용하였고, 반응 조건은 하기 표 5와 같으며, 데이터는 검출 소프트웨어(ABI Version 2.3, USA)를 이용하여 분석하였다.
실시간-RT PCR 반응조건
온도(℃) 시간 사이클
50 30분 1
95 10분 1
95 15초 45
60 1분
HCoV-HKU1을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계
주형의 농도(copies/㎕) Ct값 검출(%)
1.0×106 17.57 100
1.0×105 20.92 100
1.0×104 24.27 100
1.0×103 27.72 100
1.0×102 31.07 100
1.0×101 33.94 100
1.0×100 36.58 100
그 결과, 표 6 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 HCoV-HKU1을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브는 HCoV-HKU1의 RNA를 1.0×100 까지 희석하는 경우에도 이를 검출할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 HCoV-HKU1을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브는 민감도가 우수함을 알 수 있었다(표 6 및 도 5).
<2-2> HCoV-OC43을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계 분석
먼저, HCoV-OC43의 타겟 유전자 부위를 대상으로 상기 표 2에 기재된 서열번호 4 및 서열번호 5로 기재되는 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 HCoV-OC43으로부터 RNA를 추출하고 이를 주형으로, 상기 표 2에 기재된 프라이머와 프로브를 이용한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행해 프라이머 및 프로브의 검출한계를 분석하였다.
HCoV-OC43을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계
주형의 농도(copies/㎕) Ct값 검출(%)
1.0×106 16.26 100
1.0×105 19.5 100
1.0×104 22.98 100
1.0×103 26.29 100
1.0×102 29.69 100
1.0×101 32.99 100
1.0×100 36.95 100
그 결과, 표 7 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 HCoV-OC43을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브는 HCoV-OC43의 RNA를 1.0×100 까지 희석하는 경우에도 이를 검출할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 HCoV-OC43을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브는 민감도가 우수함을 알 수 있었다(표 7 및 도 6).
<2-3> HCoV-229E를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계 분석
먼저, HCoV-229E의 타겟 유전자 부위를 대상으로 상기 표 3에 기재된 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 HCoV-229E로부터 RNA를 추출하고 이를 주형으로, 상기 표 3에 기재된 프라이머와 프로브를 이용한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행해 프라이머 및 프로브의 검출한계를 분석하였다.
HCoV-229E를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계
주형의 농도(copies/㎕) Ct값 검출(%)
1.0×106 15.96 100
1.0×105 19.33 100
1.0×104 22.73 100
1.0×103 25.96 100
1.0×102 29.22 100
1.0×101 32.7 100
1.0×100 35.71 100
그 결과, 표 8 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 HCoV-229E를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브는 HCoV-229E의 RNA를 1.0×100 까지 희석하는 경우에도 이를 검출할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 HCoV-229E를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브는 민감도가 우수함을 알 수 있었다(표 8 및 도 7).
<2-4> HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계 분석
먼저, HCoV-NL63의 타겟 유전자 부위를 대상으로 상기 표 4에 기재된 서열번호 10 및 서열번호 11로 기재되는 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 HCoV-NL63으로부터 RNA를 추출하고 이를 주형으로, 상기 표 4에 기재된 프라이머와 프로브를 이용한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행해 프라이머 및 프로브의 검출한계를 분석하였다.
HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 검출한계
주형의 농도(copies/㎕) Ct값 검출(%)
1.0×106 17.65 100
1.0×105 20.95 100
1.0×104 24.31 100
1.0×103 27.6 100
1.0×102 30.92 100
1.0×101 34.2 100
1.0×100 37.48 100
그 결과, 표 9 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브는 HCoV-NL63의 RNA를 1.0×100 까지 희석하는 경우에도 이를 검출할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브는 민감도가 우수함을 알 수 있었다(표 9 및 도 8).
HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E 및 HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 특이도 분석
<실시예 1>에서 제작한 HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E 및 HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 특이도는 인간 코로나바이러스 7종, 다른 종류의 호흡기 바이러스 13종, 장관계 바이러스 3종과 병원성 세균 18종, 및 다양한 종의 동식물 게놈 DNA 8종을 이용한 교차반응 시험을 통해 평가하였다.
각각의 바이러스로부터 추출한 RNA를 주형으로 하여, <실시예 1>에서 제작한 상기 표 1 내지 4에 기재된 서열을 갖는 프라이머와 프로브를 이용한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E 및 HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 코로나바이러스, 호흡기 바이러스 및 장관계 바이러스에 대한 특이도
이름 참조 OC43 229E NL63 HKU1
코로나
바이러스		 OC43 분리균주 + - - -
229E 분리균주 - + - -
NL63 분리균주 - - + -
HKU1 분리균주 - - - +
MERS1 분리균주 - - - -
MERS2 분리균주 - - - -
SARS 분리균주 - - - -
호흡기
바이러스		 adeno 분리균주 - - - -
PIV1 분리균주 - - - -
PIV2 분리균주 - - - -
PIV3 분리균주 - - - -
RSVa 분리균주 - - - -
RSVb 분리균주 - - - -
Rhino 분리균주 - - - -
HMVa 분리균주 - - - -
HMVb 분리균주 - - - -
H1N1 분리균주 - - - -
H3N2 분리균주 - - - -
Inf. B type 분리균주 - - - -
장관계
바이러스		 Astro 분리균주 - - - -
Noro 분리균주 - - - -
Rota 분리균주 - - - -
HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E 및 HCoV-NL63을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브의 코로나바이러스, 호흡기 바이러스 및 장관계 바이러스에 대한 특이도
이름 참조 OC43 229E NL63 HKU1
병원성
세균		 Bacillus cereus ATCC 14579 - - - -
Bacillus subtilis KCTC 2213 - - - -
Bacillus thuringiensis KCTC1108 - - - -
Campylobacter coli ATCC 33559 - - - -
Campylobacter jejuni ATCC 33250 - - - -
E. coli KCCM 11234 - - - -
Listeria innocua KCTC 3586 - - - -
Listeria monocytogenes ATCC 19115 - - - -
Listeria welshimeri ATCC 35897 - - - -
Salmonella Dublin NCCP 12232 - - - -
Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 43971 - - - -
Salmonella enteritidis ATCC 13076 - - - -
Salmonella typhimurium ATCC 13311 - - - -
Shigella boydii KCTC 22528 - - - -
Shigella sonnei ATCC 9290 - - - -
Staphylococcus aureus ATCC 13565 - - - -
Vibrio vulnificus KCTC 2980 - - - -
Yersinia enterocolitica KCCM 41657 - - - -
기타
동식물		 소 gDNA - - - -
닭 gDNA - - - -
말 gDNA - - - -
오리 gDNA - - - -
칠면조 gDNA - - - -
염소 gDNA - - - -
돼지 gDNA - - - -
사람 gDNA - - - -
그 결과, 표 10, 11 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 및 프로브는 높은 특이도로 HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E 및 HCoV-NL63만을 검출하였다(표 10, 11 및 도 9). 따라서, 본 발명의 프라이머 및 프로브는 일반적으로 사람에게 감염되는 코로나바이러스인 HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63 및 HCoV-HKU1를 동시에 검출하는데 사용할 수 있다.
<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> PRIMERS AND PROBES FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF SUBTYPES OF CORONAVIRUS AND DETECTING METHOD FOR CORONAVIRUS USING THE SAME <130> 2017P-07-011 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-HKU1 forward primer <400> 1 gtagtggctt ggcatgtagt tcg 23 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-HKU1 reverse primer <400> 2 gtgcaacata tttaatacca caaatagtag c 31 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-HKU1 probe <400> 3 ttcacgattt gttatgcgcc tgcagact 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-OC43 forward primer <400> 4 agtactgcta tttctgttca aacatgtg 28 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-OC43 reverse primer <400> 5 gctcyacgac ttcgtctgtt tttaga 26 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-OC43 probe <400> 6 tctcacagta ggtagtggtt 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-229E forward primer <400> 7 aagggcaaac gggtggat 18 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-229E reverse primer <400> 8 gggtcctgtg ccaagataat aaa 23 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-229E probe <400> 9 tgtcacccaa gctgcat 17 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-NL63 forward primer <400> 10 aatcgcaaac gtaatcagaa acc 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-NL63 reverse primer <400> 11 gagctctgga ggcaaagcaa 20 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-NL63 probe <400> 12 ttggaaccaa agttct 16

Claims (12)

  1. 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 및 11로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 아형은 HKU1, OC43, 229E 및 NL63인, 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트.
  3. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 서열번호 3, 6, 9 및 12로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브 세트를 더 포함하는, 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합된, 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합된, 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 리포터가 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 소광자가 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  9. 제 3항에 있어서, 상기 아형은 HKU1, OC43, 229E 및 NL63인, 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  10. 제 3항 또는 제4항의 조성물을 포함하는 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트.
  11. 검체를 주형으로 제 1항의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 검체가 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는, 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법.
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