KR20220067429A - 레인(rhein), 메클로페남산(meclofenamic acid), 또는 이들의 조합을 포함하는 SARS-CoV-2 및 HCoV-OC43에 대한 항바이러스용 조성물 - Google Patents
레인(rhein), 메클로페남산(meclofenamic acid), 또는 이들의 조합을 포함하는 SARS-CoV-2 및 HCoV-OC43에 대한 항바이러스용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 레인(rhein) 및 메클로페남산(meclofenamic acid)을 유효성분으로 포함하는 베타코로나바이러스(Betacoronavirus)에 대한 항바이러스용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항바이러스용 조성물을 이용하는 경우, SARS-CoV-2 및 HCoV-OC43의 바이러스 RNA 수준이 억제되어 항바이러스 효과를 나타냄으로써 COVID-19 및 감기를 치료하거나 예방할 수 있다.
Description
본 발명은 레인(rhein), 메클로페남산(meclofenamic acid), 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 베타코로나바이러스(Betacoronavirus) 속(genus)의 SARS-CoV-2 및 HCoV-OC43에 대한 항바이러스용 조성물에 관한 것이다.
코로나바이러스(coronavirus, CoV)는 양성-센스 단일 가닥 RNA 유전체를 가진 외피 바이러스(enveloped virus)이며, 코로나바이러스 과(family Coronavirinae)에 속한다.
코로나바이러스 과는 알파, 베타, 감마 및 델타 코로나바이러스의 네 개의 속(genus)으로 분류된다. 사람에게 감염을 일으키는 코로나바이러스는 현재까지 7종이 발견되었고, 이 중 5종이 베타코로나바이러스(betacoronavirus)에 속한다. 가벼운 호흡기 증상을 유발하는 인간 코로나바이러스 OC43(human coronavirus OC43, HCoV-OC43) 및 인간 코로나바이러스 HKU1(human coronavirus HKU1, HCoV-HKU1)와, 치명적인 호흡기 감염을 일으키는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV, 사스 코로나바이러스) 및 중동호흡기증후군 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV, 메르스 코로나바이러스)가 베타코로나바이러스에 속한다.
특히 2019년 12월에 중국 우한에서 원인 불명의 폐렴을 유발하기 시작하여 전세계적으로 대유행하는 급성 호흡기 질환인 코로나바이러스감염병-19(coronavirus disease 19, COVID-19)를 일으키는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)도 베타코로나바이러스로 분류된다.
SARS-CoV-2의 감염에 의한 급성 호흡기 질환인 COVID-19에 대한 신규 치료제의 개발이 활발히 연구되고 있고, 신약 개발에 걸리는 시간을 단축하고 비용을 절감하기 위해 기존에 개발된 약물에서 COVID-19의 예방 및 치료 효과를 찾는 약물재창출(drug repurposing 또는 drug repositioning) 전략이 실행되고 있다.
예를 들어, 에볼라 치료제로 개발되었던 항바이러스제 렘데시비르(remdesivir), 말라리아 치료제 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine), HIV 치료제 로피나비르/리토나비르(lopinavir/ritonavir), 사이토카인 폭풍을 억제하는 면역억제제 토실리주맙(tocilizumab), ACE 억제제(angiotensin-converting enzyme inhibitor) 등이 COVID-19 환자에게 긴급 사용으로 투여되고 있거나 임상시험 중에 있다. 이러한 잠재적 치료제는 COVID-19의 증상을 완화하거나 회복 기간을 단축할 수 있으나, 현재까지 FDA의 승인을 받은 COVID-19 치료제는 없다.
따라서 사람에게 유행성 감염을 일으켜 가벼운 감기부터 치명적인 중증 급성 호흡기 질환까지 유발하는 베타코로나바이러스에 대한 항바이러스제의 개발이 시급한 상황이다.
한편, 레인(rhein)은 안트라퀴논(anthraquinone) 유도체로서 항염증 효과가 있어 기존에 퇴행성관절염의 치료에 사용되고 있고, 메클로페남산(meclofenamic acid)은 안트라닐산(anthranilic acid) 유도체로서 기존에 비스테로이드성 항염증제(non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID) 및 해열제로 사용되고 있다. 그러나 두 화합물의 베타코로나바이러스(betacoronavirus)에 속하는 SARS-CoV-2 및 HCoV-OC43에 대한 항바이러스 효과는 알려진 바가 없다.
Llanes, A.; Restrepo, C.M.; Caballero, Z.; Rajeev, S.; Kennedy, M.A.; Lleonart, R. Betacoronavirus Genomes: How Genomic Information has been Used to Deal with Past Outbreaks and the COVID-19 Pandemic. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 4546.
본 발명자들은 베타코로나바이러스(Betacoronavirus)에 대한 항바이러스용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 레인(rhein), 메클로페남산(meclofenamic acid), 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 조성물이 바이러스 RNA를 유의하게 억제하는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 레인(rhein), 메클로페남산(meclofenamic acid), 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 베타코로나바이러스(Betacoronavirus)에 대한 항바이러스용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 레인(rhein), 메클로페남산(meclofenamic acid), 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 및 HCoV-OC43에 대한 항바이러스용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 COVID-19(Coronavirus Disease 2019)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 감기(common cold), 급성상기도염(acute upper respiratory tract infection), 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome) 또는 바이러스성 폐렴(viral pneumonia)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 레인(rhein), 메클로페남산(meclofenamic acid), 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 베타코로나바이러스(Betacoronavirus)에 대한 항바이러스용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 베타코로나바이러스(Betacoronavirus)에 대한 항바이러스용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 레인(rhein), 메클로페남산(meclofenamic acid), 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 조성물이 바이러스 RNA를 유의하게 억제하는 것을 규명하였다.
본 발명의 “레인(rhein)”이란 cassic acid 및 4,5-dihydroxy-9,10-dioxoanthracene-2-carboxylic acid로도 알려진 안트라퀴논(anthraquione) 유도체로서 항염증 효과를 가져 기존에 퇴행성관절염의 치료에 사용되고 있는, 다음의 화학식 1로 표기되는 화합물을 의미한다.
[화학식 1]
본 발명의 “메클로페남산(meclofenamic acid)”이란 메클로페나미드산염(meclofenamate)으로도 알려진 안트라닐산(anthranilic acid) 유도체로서, COX(cyclooxygenase) 억제제이며 프로스타글란딘의 형성을 억제하는 효과를 가져 기존에 비스테로이드성 항염증제(non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID) 및 해열제로 사용되는, 다음의 화학식 2로 표기되는 화합물을 의미한다.
[화학식 2]
본 명세서의 용어 “유효성분으로 포함하는”이란, 레인(rhein), 메클로페남산(meclofenamic acid), 또는 이들의 조합의 약리학적 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미하고, 약물의 전달, 안정화 및 제제화를 위하여 다양한 성분이 부가적으로 첨가될 수 있는 것을 포함하는 의미이다.
본 발명의 용어 “항바이러스용 조성물”이란 숙주 세포로의 바이러스 침입, 바이러스 유전체의 복제 및 합성, 바이러스 유전체의 전사, 바이러스의 단백질 합성, 역전사효소의 활성, 바이러스 조립(assembly) 또는 바이러스 출아(budding)를 억제함으로써, 바이러스의 감염을 예방하거나, 바이러스의 복제를 억제하거나, 바이러스의 전파를 방지하거나, 바이러스를 사멸하는 조성물 또는 바이러스 감염에 따라 발병하는 질병 또는 이에 의해 발현되는 증상을 치료하는 조성물을 의미한다.
본 명세서의 용어 “예방”은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서의 용어 “치료”는 질환 상태의 감소, 억제, 진정, 또는 근절을 의미한다.
본 명세서에서 용어 ‘베타코로나바이러스(Betacoronavirus)’란 코로나바이러스 과(family Coronavirinae)에 속하는 네 개의 속(genus) 중 하나로서, 동물 및 인간에게 감염되어 무증상이거나 경증 내지 중증의 호흡기 증상을 유발하는 RNA 바이러스를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 베타코로나바이러스(Betacoronavirus)는 HCoV-OC43(human coronavirus OC43), HCoV-HKU1(human coronavirus HKU1), SARS-CoV(severe acute respiratory syndrome coronavirus), MERS-CoV(Middle East respiratory syndrome coronavirus) 및 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 베타코로나바이러스(Betacoronavirus)는 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 및 HCoV-OC43(human coronavirus OC43)을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유효성분은 상기 베타코로나바이러스의 비구조단백질(non-structural protein, Nsp), 스파이크(spike, S), 피막(envelop, E), 막(membrane, M), 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, N) 및 헤마글루티닌 에스터라제(haemagglutinin esterase, HE) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 바이러스 RNA의 수준을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 유효성분은 상기 베타코로나바이러스의 비구조단백질(non-structural protein, Nsp), 막(membrane, M) 단백질, 및 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, N) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 바이러스 RNA의 수준을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 용어 비구조단백질(non-structural protein, Nsp)이란 코로나바이러스의 복제 및 전사 관련 비구조단백질을 의미한다. 코로나바이러스의 비구조단백질에는 16개의 Nsp1 내지 Nsp16이 있고, Nsp3 및 Nsp5는 단백질분해 활성을 가지며, Nsp7, Nsp8 및 Nsp12는 복제효소-전사효소 복합체(replicase-transcriptase complex, RTC)를 형성한다. RTC의 핵심 구성요소인 Nsp12는 RNA-의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)이며 바이러스의 복제에서 RNA 합성을 직접적으로 매개한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 비구조단백질(non-structural protein, Nsp)은 Nsp1, Nsp2, Nsp3, Nsp4, Nsp5, Nsp6, Nsp7, Nsp8, Nsp9, Nsp10, Nsp11, Nsp12, Nsp13, Nsp14, Nsp15 및 Nsp16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질이다. 본 발명의 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 비구조단백질은 Nsp12이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 항바이러스용 조성물은 추가적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체, 운반체, 부형제, 안정제 또는 희석제를 포함한다.
본 발명의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 운반체, 부형제, 안정제 또는 희석제는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것으로 본 발명의 유효성분과 약리학적으로 양립 가능한 담체, 운반체, 부형제, 안정제, 또는 희석제를 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 운반체에는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 에탄올, DMSO(dimethyl sulfoxide) 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 부형제, 안정제, 희석제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 운반체, 부형제, 안정제 또는 희석제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다
본 발명에서 사용된 포유동물 세포는 Vero 세포주(African green monkey kidney cell line), Calu-3 세포주(human lung adenocarcinoma cell line), HBEC 세포주(human bronchial epithelium cell line), 및 HCT-8 세포주(colon cancer cell line)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 포유동물 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 Vero 세포주는 아프리카 녹색 원숭이(African green monkey)의 신장 상피 세포(kidney epithelial cell)로부터 분리된 세포주로서, 바이러스 배양의 숙주 세포로 흔히 사용된다. 본 발명의 Calu-3 세포주는 인간 폐암 세포로부터 유래된 세포주(human lung adenocarcinoma cell line)로서, 호흡기 감염 바이러스에 대한 연구에 흔히 사용되고 SARS-CoV-2 연구에서 사용된다. 본 발명의 HBEC 세포주는 인간 기관지 상피 세포주(human bronchial epithelium cell line)로서 세포 배양 연구에서 한 단계 더 나아가 실제 호흡기를 모방하도록 세포배양액-stem cell에서 분화된 bronchial epithelium cell-공기층으로 배양된 세포주이다. 본 발명의 HCT-8 세포는 대장암 세포주(colon cancer cell line)로서 HCoV-OC43 연구에 흔히 사용된 세포주이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항바이러스용 조성물을 포함하는 COVID-19(coronavirus disease 2019)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 용어 “COVID-19”란 SARS-CoV-2 감염에 의한 호흡기 질환으로 코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)를 의미하며, 무증상이거나 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란, 폐렴, 가래, 인후통, 두통, 객혈, 오심, 설사 등을 포함하는 경증 내지 중증의 호흡기 증상을 나타낸다. COVID-19의 치료에는 현재 대증적인 치료로 수액 보충 및/또는 해열제의 사용 등의 보존적 치료가 있고 SARS-CoV-2에 대한 항바이러스제는 없는 실정이다.
본 발명의 COVID-19(coronavirus disease 2019)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 항바이러스용 조성물을 포함하므로, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복되는 내용을 원용하며, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항바이러스용 조성물을 포함하는 감기(common cold), 급성상기도염(acute upper respiratory tract infection), 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome) 또는 바이러스성 폐렴(viral pneumonia)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 감기(common cold), 급성상기도염(acute upper respiratory tract infection), 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome) 또는 바이러스성 폐렴(viral pneumonia)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 항바이러스용 조성물을 포함하므로, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복되는 내용을 원용하며, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 레인(rhein), 메클로페남산(meclofenamic acid), 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 베타코로나바이러스(Betacoronavirus)에 대한 항바이러스용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 레인(rhein), 메클로페남산(meclofenamic acid), 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 및 HCoV-OC43에 대한 항바이러스용 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명의 항바이러스용 조성물을 이용하는 경우, 베타코로나바이러스의 RNA 수준을 억제함으로써 COVID-19(coronavirus disease 2019), 감기(common cold), 급성상기도염(acute upper respiratory tract infection), 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome) 또는 바이러스성 폐렴(viral pneumonia)을 예방하거나 치료할 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2 또는 HCoV-OC43에 감염된 세포에 레인(rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 처리 여부에 따른 qRT-PCR로 측정한 바이러스 RNA 수준(level)을 나타낸다. 도 1의 a는 SARS-CoV-2에 감염된 Calu-3 세포(SARS-CoV-2-infected Calu-3), b는 SARS-CoV-2에 감염된 Vero 세포(SARS-CoV-2-infected Vero), c는 HCoV-OC43에 감염된 HCT-8 세포(HCoV OC43-infected HCT-8) 및 d는 HCoV-OC43에 감염된 Vero 세포(HCoV OC43-infected Vero)에서 바이러스 RNA 수준을 나타낸다. 모든 RNA 수준은 각각의 GAPDH의 RNA 수준으로 보정되었다.
도 2는 SARS-CoV-2 또는 HCoV-OC43에 감염된 세포에 메클로페남산(meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 처리 여부에 따른 qRT-PCR로 측정한 바이러스 RNA 수준을 나타낸다. 도 2의 a는 SARS-CoV-2에 감염된 Calu-3 세포(SARS-CoV-2-infected Calu-3), b는 SARS-CoV-2에 감염된 HBEC 세포(SARS-CoV-2-infected HBEC), c는 SARS-CoV-2에 감염된 Vero 세포(SARS-CoV-2-infected Vero), d는 HCoV-OC43에 감염된 HCT-8 세포(HCoV OC43-infected HCT-8) 및 e는 HCoV-OC43에 감염된 Vero 세포(HCoV OC43-infected Vero)에서 바이러스 RNA 수준을 나타낸다. 모든 RNA 수준은 각각의 GAPDH의 RNA 수준으로 보정되었다.
도 2는 SARS-CoV-2 또는 HCoV-OC43에 감염된 세포에 메클로페남산(meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 처리 여부에 따른 qRT-PCR로 측정한 바이러스 RNA 수준을 나타낸다. 도 2의 a는 SARS-CoV-2에 감염된 Calu-3 세포(SARS-CoV-2-infected Calu-3), b는 SARS-CoV-2에 감염된 HBEC 세포(SARS-CoV-2-infected HBEC), c는 SARS-CoV-2에 감염된 Vero 세포(SARS-CoV-2-infected Vero), d는 HCoV-OC43에 감염된 HCT-8 세포(HCoV OC43-infected HCT-8) 및 e는 HCoV-OC43에 감염된 Vero 세포(HCoV OC43-infected Vero)에서 바이러스 RNA 수준을 나타낸다. 모든 RNA 수준은 각각의 GAPDH의 RNA 수준으로 보정되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 항바이러스용 조성물의 제조
실시예 1-1: 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 제조
레인(Rhein)은 Sigma-Aldrich(카탈로그 번호 R7269)에서 구매하여 운반체 DMSO에서 5 μM, 10 μM, 25 μM 및 50 μM 농도의 레인(rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물을 제조하였고, 대조군으로서 DMSO만을 포함하는 조성물 또는 50%(v/v) DMSO 및 50%(v/v) 에탄올의 혼합용액(DMSO + Ethanol)을 제조하였다.
실시예 1-2: 메클로페남산(Meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 제조
메클로페남산(Meclofenamic acid, MA)은 Sigma-Aldrich(카탈로그 번호 M4531)에서 구매하여 운반체 에탄올에서 0.5 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM 및 100 μM 농도의 메클로페남산(MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물을 제조하였고, 대조군으로서 에탄올만을 포함하는 조성물 또는 50%(v/v) DMSO 및 50%(v/v) 에탄올의 혼합용액(DMSO + Ethanol)을 제조하였다.
실시예 2: 세포주
실시예 2-1: Vero 세포주
Vero 세포주(African green monkey kidney cell line, ATCC(American Type Culture Collection), 카탈로그 번호: CCL-81)는 10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)으로 37℃ 및 5% CO2의 배양기에서 배양하였다.
실시예 2-2: Calu-3 세포주
Calu-3 세포주(human lung adenocarcinoma cell line, 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB), KCLB 번호: 30055)는 10% FBS가 첨가된 DMEM으로 37℃ 및 5% CO2의 배양기에서 배양하였다.
실시예 2-3: HCT-8 세포주
HCT-8 세포주(colon cancer cell line, 한국세포주은행, KCLB 번호: 10244)는 10% FBS가 첨가된 RPMI(Rosewell Park Memorial Institute) 배양액으로 37℃ 및 5% CO2의 배양기에서 배양하였다.
실시예 2-4: HBEC 세포주
HBEC 세포주(human bronchial epithelium cell line, ATCC, 카탈로그 번호: PCS-300-010)는 STEMCELLTM Technologies에서 제공하는 프로토콜을 필요한 부분만 약간 수정하여(mutatis mutandis) 배양하였다.
보다 상세하게, HBEC 세포의 배양 시작일부터 3일째까지는 i) 배양액 PneumaCultTM-Ex plus medium(STEMCELLTM Technologies, 카탈로그 #05040)에 0.1 μg/ml의 하이드로코르티손(hydrocortisone, Sigma, 카탈로그 #H0888)을 첨가하여 배양하였다.
HBEC 세포의 분화를 위해, 배양 후 4일째부터 45일째까지는 ii) 상기 3일 동안 배양한 HBEC 세포를 3×105 세포/웰 씩 12-웰 플레이트(아래의 Basal Chamber와 위의 Apical Chamber 사이에 0.4 μm-pore 막(membrane)을 갖는 Transwell® insert, STEMCELLTM Technologies, 카탈로그 #05001)의 Apical Chamber에서 0.5 ml의 배양액 PneumaCultTM-Ex plus medium(STEMCELLTM Technologies)으로 배양하였다. 상기 12-웰 플레이트의 Basal Chamber에는 웰 당 1 ml의 배양액(PneumaCultTM-Ex plus medium, STEMCELLTM Technologies)을 첨가하였다. HBEC 세포를 배양하였던 상기 12-웰 플레이트의 Apical Chamber에서 세포 집합도(cell confluency)가 100%에 도달하면, Apical Chamber에서 배양액을 제거하여 분화(differentiation)를 유도하였다. 상기 분화 배양을 통해 HBEC 세포는 생체 내 인간의 기도(airway) 상피와 형태학적 및 기능적으로 유사한 거짓중층상피(pseudostratified epithelium)를 형성하였다.
상기 분화 배양을 시작하고 30일까지는 12-웰 플레이트의 Basal Chamber에서 배양액 PneumaCultTM-ALI maintenance medium(STEMCELLTM Technologies, 카탈로그 #05002, 05003 및 05006, 1 μg/ml의 하이드로코르티손을 첨가함)으로 2일에 1회씩 배양액을 교체하였다. 이 후 7일 동안은 상기 배양액으로 1주 2회씩 배양액을 교체하였고, 또 다음의 7일 동안은 1주 1회씩 배양액을 교체하였다.
배양 후 45일째에는 iii) 상기 분화되어 유지된 HBEC 세포에 베타코로나바이러스를 감염시켰으며, iV) 배양 후 47일째, 즉 바이러스 감염 후 48시간에 RNA 추출을 위해 샘플을 얻었다.
실시예 3: 바이러스
실시예 3-1: SARS-CoV-2
SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)는 질병관리본부 산하 국가병원체자원은행에서 분양받은 병원체자원이며, 국제백신연구소의 생물안전 3등급(biosafety level 3) 연구 시설에서 엄격한 통제하에 관리되었다.
실시예 3-2: HCoV-OC43
HCoV OC43(human coronavirus OC43)은 고려대학교 병원성바이러스은행에서 분양받았으며 생물안전 2등급 연구 시설에서 관리하였다.
실시예 4: 베타코로나바이러스의 감염 및 항바이러스용 조성물의 처리
실시예 4-1: SARS-CoV-2 또는 HCoV-OC43에 감염된 세포주에서 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 처리
1) SARS-CoV-2에 감염된 Calu-3 세포(SARS-CoV-2-infected Calu-3)
Calu-3 세포주를 12-웰 플레이트(12-well plate)에 1.75×105 세포/웰 씩 세 개의 웰(well)에 배양하였다. 배양 18시간 후에 무-혈청(serum-free) DMEM으로 각 웰을 세척하여 생물안전 3등급 연구 시설에서 SARS-CoV-2를 각 웰에 0.05의 MOI(multiplicity of infection)로 감염시켰으며, 2% FBS를 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 바이러스 감염과 동시에 25 μM 농도의 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물과 대조군으로서 DMSO를 각 웰의 세포배양액에 처리하였다. 바이러스 감염 후 24시간에 RNA 추출을 위한 샘플을 얻었다.
2) SARS-CoV-2에 감염된 Vero 세포(SARS-CoV-2-infected Vero)
Vero 세포주를 12-웰 플레이트에 1.75×105 세포/웰 씩 세 개의 웰에 배양하였다. 배양 18시간 후 무-혈청 DMEM으로 각 웰을 세척하여 생물안전 3등급 연구 시설에서 SARS-CoV-2를 0.05의 MOI로 감염시켰고, 2% FBS를 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 바이러스 감염과 동시에 25 μM 농도의 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물과 대조군으로서 DMSO를 각 웰(well)의 세포배양액에 처리하였다. 바이러스 감염 후 24시간에 RNA 추출을 위한 샘플을 얻었다.
3) HCoV-OC43에 감염된 HTC-8 세포(HCoV-OC43-infected HCT-8)
HCT-8 세포주를 12-웰 플레이트에 2×105 세포/웰 씩 두 개의 웰에 배양하였다. 배양 후 18시간에 PBS 또는 3% FBS를 포함하는 RPMI로 각 웰을 세척한 후 생물안전 2등급 연구 시설에서 HCoV-OC43를 감염시켰고, 3% FBS를 포함하는 RPMI에서 배양하였다. 바이러스 감염과 동시에 0.25 μM, 2.5 μM, 25 μM 및 250 μM 농도의 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물과 대조군으로서 DMSO 및 에탄올의 혼합용액을 각 웰의 세포배양액에 처리하였다. 바이러스 감염 후 24시간에 각 웰을 PBS 또는 3% FBS를 포함하는 RPMI로 세척한 후 RNA 추출을 위한 샘플을 얻었다.
4) HCoV-OC43에 감염된 Vero 세포(HCoV-OC43-infected Vero)
Vero 세포주를 12-웰 플레이트에 2×105 세포/웰 씩 세 개의 웰에 배양하였다. 배양 18시간 후 PBS 또는 3% FBS를 포함하는 DMEM으로 각 웰을 세척한 후 생물안전 2등급 연구 시설에서 HCoV-OC43를 감염시켰고, 3% FBS를 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 바이러스 감염과 동시에 5 μM, 10 μM, 25 μM 및 50 μM 농도의 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물과 대조군으로서 DMSO를 각 웰(well)의 세포배양액에 처리하였다. 바이러스 감염 후 24시간에 PBS 또는 3% FBS를 포함하는 DMEM으로 세척한 후 RNA 추출을 위한 샘플을 얻었다.
실시예 4-2: SARS-CoV-2 또는 HCoV-OC43가 감염된 세포주에서 메클로페남산(meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 처리
처리한 항바이러스용 조성물의 종류와 SARS-CoV-2에 감염된 HBEC 세포를 제외하고는 상기 실시예 4-1에 기재된 조건과 동일 내지 유사한 조건으로 각 세포주를 배양하여 각 바이러스를 감염시켰으므로, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복되는 내용을 원용하며, 그 기재를 생략한다.
SARS-CoV-2에 감염된 Calu-3 세포(SARS-CoV-2-infected Calu-3), SARS-CoV-2에 감염된 HBEC 세포(SARS-CoV-2-infected HBEC) 및 SARS-CoV-2에 감염된 Vero 세포(SARS-CoV-2-infected Vero)에 50 μM 농도의 메클로페남산(Meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물과 대조군으로서 에탄올을 각 웰의 세포배양액에 처리하였다.
또한, HCoV-OC43에 감염된 HTC-8 세포(HCoV-OC43-infected HCT-8)에는 0.5 μM, 5 μM 및 50 μM 농도의 메클로페남산(Meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물과 대조군으로서 DMSO 및 에탄올의 혼합용액(DMSO + Ethanol)을 각 웰의 세포배양액에 처리하였고, HCoV-OC43에 감염된 Vero 세포(HCoV-OC43-infected Vero)에는 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM 및 100 μM 농도의 메클로페남산(Meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물과 대조군으로서 DMSO을 각 웰의 세포배양액에 처리하였다.
1) SARS-CoV-2에 감염된 HBEC 세포(SARS-CoV-2-infected HBEC)
실시예 2-4와 같이 배양한 HBEC 세포주를 배양 후 3일째에 분화시키며 유지하였고, 배양 후 45일째에 생물안전 3등급 연구 시설에서 PBS로 각 웰을 세척한 후 SARS-CoV-2를 3.3×104 pfu(plaque-forming unit)로 감염시켰다. 상기 바이러스 감염 2시간 전에 50 μM 농도의 메클로페남산(Meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물과 대조군으로서 에탄올을 각 웰의 세포배양액에 처리하였다. 배양 후 47일째, 즉 바이러스 감염 후 48시간 뒤에 PBS로 각 웰을 세척한 후 RNA 추출을 위한 샘플을 얻었다.
실시예 5: RNA 분리 및 정제
상기 실시예 4에서 얻은 RNA 추출을 위한 샘플에 핵산추출용해액 Trizol(Invitrogen, 카탈로그 번호 10296028)을 처리하여 전체 RNA를 분리하였다. SARS-CoV-2에 감염된 세포의 전체 RNA는 PureLinkTM RNA Mini Kit(Invitrogen, 카탈로그 번호: 12183018A)를, HCoV-OC43에 감염된 세포의 전체 RNA는 RNeasy Mini Kit(Qiagen, 카탈로그 번호: 74106)를 이용하여 제조사의 프로토콜을 따라 정제하였다. 정제된 RNA의 농도는 분광광도계(NanoDropTM 2000c Spectrophotometer, ND-2000C, Thermo Scientific)를 이용하여 측정하였다.
실시예 6: qRT-PCR(quantative real-time PCR)
상기 실시예 5에서 얻은 정제된 RNA는 Power SYBRTM Green PCR Master Mix(Applied BiosystemsTM, 카탈로그 번호: 4367659)와 실시간 유전자 증폭 장비(Real-time QuantStudio 3 Real-Time PCR Instrument, Applied BiosystemsTM)를 이용하여 qRT-PCR를 수행하였다.
qRT-PCR 실험에 사용된 프라이머(primer)의 정방향(forward, F) 및 역방향 (reverse, R)의 서열은 다음과 같다: SARS-CoV-2에 감염된 세포에서 nsp12(non-structural protein 12), M(membrane) 및 N(nucleocapsid)의 바이러스 RNA를 측정하는 경우, 각각 프라이머‘qPCR-nsp12-F: CAG AGA GCT AGG TGT TGT AC’, ‘qPCR-nsp12-R: AAG CAC GTA GTG CGT TTA TC’, ‘qPCR-M-F: CGT GCC ACT CCA TGG CAC TAT’, ‘qPCR-M-R: CGT CCT AGA TGG TGT CCA GCA ’, ‘qPCR-N-F: GGC CAG AAG CTG GAC TTC CC’, 및 ‘qPCR-N-R: AGG ATT GCG GGT GCC AAT GT’를 사용하였고; SARS-CoV-2에 감염된 Calu-3 및 HBEC 세포에서 GAPDH의 RNA를 측정하는 경우, 프라이머‘qPCR-GAPDH-F: CTC TCT GCT CCT CCT GTT CGA C’ 및 ‘qPCR-GAPDH-R:
TGA GCG ATG TGG CTC GGC T’를 사용하였으며; SARS-CoV-2에 감염된 Vero 및 HCT-8 세포에서 GAPDH의 RNA를 측정하는 경우, ‘qPCR-GAPDH-F: TGC CAA CGT GTC AGT GGT G’ 및 ‘qPCR-GAPDH-R: GCC TGC TTC ACC ACC TTC TTG’를 사용하였고; 및 HCoV-OC43에 감염된 세포에서 N(nucleocapsid)의 바이러스 RNA 수준의 측정을 위해 프라이머 qPCR-OC43-N-F: TAA GCA ATC CAG TAG TAG AGC G’ 및 ‘qPCR-OC43-N-R: TCT AAA CTG GTC GGA CTG AT’를 사용하였다.
qRT-PCR 실험 결과로 얻은 nsp12(non-structural protein 12), 막(membrane, M) 단백질 및 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, N) 단백질 유전자의 Ct(Cycle threshold) 값을 내인성 대조군인 GAPDH의 Ct값으로 보정하여(normalized) 2-ΔΔCt의 방법을 이용해 바이러스 RNA 수준을 분석하였다.
본 발명의 실험은 2회 반복을 수행한 HCoV-OC43에 감염된 HCT-8 세포 실험을 제외하고는 모두 적어도 세 번 반복되었고, 도 1 및 도 2의 그래프상의 오차 선(error bar)은 표준오차(standard error of the mean)를 나타낸다.
실시예 7: 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 베타코로나바이러스 RNA의 억제 효과
실시예 7-1: SARS-CoV-2에 대한 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 바이러스 RNA 억제 효과
SARS-CoV-2를 감염시킨 Calu-3 세포 및 Vero 세포에 DMSO만을 처리한 대조군과 25 μM의 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 실험군에서 qRT-PCR로 측정한 nsp12, M 및 N의 바이러스 RNA 수준을 GAPDH로 보정하여 분석하였다(도 1의 a 및 b 참조). SARS-CoV-2를 감염시킨 Calu-3 세포(SARS-CoV-2-infected Calu-3)에서 DMSO만을 처리한 대조군에 비해 25 μM의 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 실험군에서 nps12, M, 및 N의 바이러스 RNA 수준이 모두 5% 미만으로 유의하게 억제되었고(도 1의 a 참조), SARS-CoV-2를 감염시킨 Vero 세포(SARS-CoV-2-infected Vero)에서 또한 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 실험군에서 nps12, M, 및 N의 바이러스 RNA 수준이 모두 약 30% 미만(도 1의 b 참조)으로 유의하게 억제되었다.
실시예 7-2: HCoV-OC43에 대한 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 바이러스 RNA 억제 효과
HCoV-OC43를 감염시킨 HCT-8 세포(HCoV OC43-infected HCT-8)에 DMSO와 에탄올의 혼합액(DMSO+Ethanol)을 처리한 대조군과 0.25 μM, 2.5 μM, 25 μM 및 250 μM의 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 실험군에서(도 1의 c 참조), HCoV-OC43를 감염시킨 Vero 세포(HCoV OC43-infected Vero)에 DMSO만을 처리한 대조군과 5 μM, 10 μM, 25 μM 및 50 μM의 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 실험군에서(도 1의 d 참조) qRT-PCR로 측정한 각각 N의 바이러스 RNA 수준을 GAPDH로 보정하여 분석하였다.
HCoV-OC43를 감염시킨 HCT-8 세포에 250 μM 및 25 μM의 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 경우와 HCoV-OC43를 감염시킨 Vero 세포에 5 μM, 10 μM, 25 μM 및 50 μM의 레인(Rhein)을 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 경우에 N의 바이러스 RNA 수준이 유의하게 억제되었다. 또한, 도 1의 d에 나타낸 바와 같이, HCoV-OC43를 감염시킨 Vero 세포에서 처리한 항바이러스용 조성물 내 레인(Rhein)의 농도가 증가함에 따라 N의 RNA 수준의 억제가 증가하는 용량-의존적 효과(dose-dependent effect)를 확인하였다.
실시예 8: 메클로페남산(Meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 바이러스 RNA의 억제 효과
실시예 8-1: SARS-CoV-2에 대한 메클로페남산(Meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 바이러스 RNA 억제 효과
SARS-CoV-2를 감염시킨 Calu-3 세포(SARS-CoV-2-infected Calu-3), HBEC 세포(SARS-CoV-2-infected HBEC) 및 Vero 세포(SARS-CoV-2-infected Vero)에 에탄올만을 처리한 대조군과 50 μM의 메클로페남산(Meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 실험군에서 qRT-PCR로 측정한 nsp12, M 및 N의 바이러스 RNA 수준을 GAPDH로 보정하여 분석하였다(도 2의 a, b 및 c 참조). SARS-CoV-2를 감염시킨 Calu-3 세포와 Vero 세포(SARS-CoV-2-infected Vero)에서는 에탄올만을 처리한 대조군에 비해 50 μM의 MA를 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 실험군에서 nps12, M 및 N의 바이러스 RNA 수준이 모두 5% 미만으로 유의하게 억제되었고(도 2의 a 및 c 참조), SARS-CoV-2를 감염시킨 HBEC 세포(SARS-CoV-2-infected HBEC)의 경우에는 약 40% 이하로 유의하게 억제되었다(도 2의 b 참조).
실시예 8-2: HCoV-OC43에 대한 메클로페남산(Meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물의 바이러스 RNA 억제 효과
HCoV-OC43를 감염시킨 HCT-8 세포(HCoV OC43-infected HCT-8)에 DMSO와 에탄올을 처리한 대조군과 0.5 μM, 5 μM 및 50 μM의 메클로페남산(Meclofenamic acid, MA)을 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 실험군에서(도 2의 d 참조), HCoV-OC43를 감염시킨 Vero 세포(HCoV OC43-infected Vero)에 DMSO만을 처리한 대조군과 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM 및 100 μM의 MA를 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 실험군에서(도 2의 e 참조) qRT-PCR로 측정한 N의 바이러스 RNA 수준을 GAPDH로 보정하여 분석하였다. HCoV-OC43를 감염시킨 HCT-8 세포에 50 μM의 MA를 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 경우와 HCoV-OC43를 감염시킨 Vero 세포에 10 μM, 25 μM, 50 μM 및 100 μM의 MA를 포함하는 항바이러스용 조성물을 처리한 경우에 N의 바이러스 RNA 수준이 유의하게 억제되었음을 확인하였다.
Claims (7)
- 레인(rhein), 메클로페남산(meclofenamic acid), 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 베타코로나바이러스(Betacoronavirus)에 대한 항바이러스용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 베타코로나바이러스(Betacoronavirus)는 HCoV-OC43(human coronavirus OC43), HCoV-HKU1(human coronavirus HKU1), SARS-CoV(severe acute respiratory syndrome coronavirus), MERS-CoV(Middle East respiratory syndrome coronavirus) 및 SARS-CoV 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)를 포함하는 것인, 항바이러스용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 유효성분은 상기 베타코로나바이러스의 비구조단백질(non-structural protein, Nsp), 스파이크(spike, S), 피막(envelop, E), 막(membrane, M), 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, N) 및 헤마글루티닌 에스터라제(haemagglutinin esterase, HE) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 바이러스 RNA 수준을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항바이러스용 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 비구조단백질(non-structural protein, Nsp)은 Nsp1, Nsp2, Nsp3, Nsp4, Nsp5, Nsp6, Nsp7, Nsp8, Nsp9, Nsp10, Nsp11, Nsp12, Nsp13, Nsp14, Nsp15 및 Nsp16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질인 것인, 항바이러스용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 항바이러스용 조성물은 추가적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체, 운반체, 부형제, 안정제 또는 희석제를 포함하는 항바이러스용 조성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 항바이러스용 조성물을 포함하는 COVID-19(coronavirus disease 2019)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 항바이러스용 조성물을 포함하는 감기(common cold), 급성상기도염(acute upper respiratory tract infection), 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome) 또는 바이러스성 폐렴(viral pneumonia)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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