CN117042760A - 包含大黄酸、甲氯芬那酸或它们的组合的针对SARS-CoV-2以及HCoV-OC43的抗病毒用组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种包含大黄酸(rhein)以及甲氯芬那酸(meclofenamic acid)作为有效成分的针对乙型冠状病毒(Betacoronavirus)的抗病毒用组合物。在利用本发明的抗病毒用组合物的情况下，通过抑制SARS‑CoV‑2以及HCoV‑OC43的病毒RNA水平来表现出抗病毒效果，从而可以治疗或预防COVID‑19以及感冒。
Description
【技术领域】
本发明是在韩国科学技术情报通信部的支援下，根据课题固有编号1711101405进行的，上述课题的研究管理专门机构为首尔大学产学合作团，研究项目名称为“国际科学商务带建设(基础科学研究院支援研究运营费用)”，研究课题名称为“通过RNA调控细胞命运的研究”，主管机构为基础科学研究院，研究时间为2020.03.03-2020.08.28。
本专利申请要求于2020年11月17日向韩国专利局提交的韩国专利申请第10-2020-0154110号的优先权，上述专利申请的公开内容通过引用并入本文。
本发明涉及一种针对乙型冠状病毒(Betacoronavirus)属(genus)的SARS-CoV-2以及HCoV-OC43的抗病毒用组合物，包含大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamicacid)、或它们的组合作为有效成分。
【背景技术】
冠状病毒(coronavirus，CoV)为具有正义单链RNA基因组的包膜病毒(envelopedvirus)，属于冠状病毒科(family Coronavirinae)。
冠状病毒科分为4个属(genus)，即，α、β、γ以及δ冠状病毒。到目前为止，已发现7种引起人类感染的冠状病毒，其中5种属于乙型冠状病毒(Betacoronavirus)。引起轻微呼吸道症状的人冠状病毒OC43(human coronavirus OC43，HCoV-OC43)以及人冠状病毒HKU1(human coronavirus HKU1，HCoV-HKU1)、引起致命呼吸道感染的严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV，SARS冠状病毒)以及中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV，MERS冠状病毒)属于乙型冠状病毒。
尤其，引起2019冠状病毒感染病(coronavirus disease 19，COVID-19)的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)也归类为乙型冠状病毒。
正在积极研究针对由SARS-CoV-2的感染引起的急性呼吸道疾病COVID-19的新型治疗剂的开发，并且正在实施在以往开发的药物中寻找COVID-19的预防以及治疗效果的药物再利用(药物再定位)(drug repurposing或drug repositioning)策略以缩短新药开发所需的时间并降低成本。
例如，曾作为埃博拉治疗剂开发的抗病毒剂瑞德西韦(remdesivir)、疟疾治疗剂羟氯喹(hydroxychloroquine)、HIV治疗剂洛匹那韦/利托那韦(lopinavir/ritonavir)、用于抑制细胞因子风暴的免疫抑制剂托珠单抗(tocilizumab)、血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACE抑制剂)等正在作为急用药给予COVID-19患者或正在进行临床试验。这种潜在的治疗剂可以缓解COVID-19的症状或缩短恢复期，但到目前为止还没有获得FDA批准的COVID-19治疗剂。
因此，急需开发一种针对乙型冠状病毒的抗病毒剂，乙型冠状病毒在人类中引起流行性感染，导致从轻度感冒到致命的重度急性呼吸道疾病。
另一方面，大黄酸(rhein)作为一种蒽醌(anthraquinone)衍生物，因具有抗炎效而以往用于退行性关节炎的治疗，甲氯芬那酸(meclofenamic acid)作为一种邻氨基苯甲酸(anthranilic acid)衍生物，以往用作非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)以及退烧药。然而，这两种化合物针对属于乙型冠状病毒(Betacoronavirus)的SARS-CoV-2以及HCoV-OC43的抗病毒效果尚不清楚。
【发明内容】
【技术问题】
本发明人进行了深入研究以开发一种针对乙型冠状病毒(Betacoronavirus)的抗病毒用组合物。结果，通过查明包含大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、或它们的组合作为有效成分的组合物显著抑制病毒RNA，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供一种针对乙型冠状病毒(Betacoronavirus)的抗病毒用组合物，包含大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、或它们的组合作为有效成分。
本发明的再一目的在于，提供一种针对SARS-CoV-2以及HCoV-OC43的抗病毒用组合物，包含大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、或它们的组合作为有效成分。
本发明的另一目的在于，提供一种用于预防或治疗COVID-19(CoronavirusDisease 2019)的药物组合物。
本发明的还有一目的在于，提供一种用于预防或治疗感冒(common cold)、急性上呼吸道感染(acute upper respiratory tract infection)、严重急性呼吸综合征(severeacute respiratory syndrome)或病毒性肺炎(viral pneumonia)的药物组合物。
【解决问题的方案】
根据本发明一实施方式，本发明提供一种包含大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、或它们的组合作为有效成分的针对乙型冠状病毒(Betacoronavirus)的抗病毒用组合物。
本发明人进行了深入研究以开发一种针对乙型冠状病毒(Betacoronavirus)的抗病毒用组合物。结果，查明包含大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、或它们的组合作为有效成分的组合物显著抑制病毒RNA。
本发明的“大黄酸(rhein)”是指一种又被称为山扁豆酸(cassic acid)以及4,5-二羟基-9,10-二氧代蒽-2-羧酸(4,5-dihydroxy-9,10-dioxoanthracene-2-carboxylicacid)的蒽醌(anthraquione)衍生物，因具有抗炎效果而以往用于退行性关节炎的治疗，是如下述化学式1所示的化合物。
【化学式1】
本发明的“甲氯芬那酸(mec lofenamic ac id)”是指一种又被称为甲氯芬那酸钠(meclofenamate)的邻氨基苯甲酸(anthranilic acid)衍生物，并且是一种环氧合酶(cyclooxygenase，COX)抑制剂，因具有抑制前列腺素的形成的效果而以往用作非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)以及退烧药，是指如下述化学式2所示的化合物。
【化学式2】
本说明书的术语“包含作为有效成分”是指包含足以达到大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、或它们的组合的药理功效或活性的量，是指为了药物的传递、稳定以及配制可以额外添加各种成分。
本发明的术语“抗病毒用组合物”是指抑制病毒侵入宿主细胞、病毒基因组的复制以及合成、病毒基因组的转录、病毒的蛋白合成、逆转录酶的活性、病毒装配(assembly)或病毒出芽(budding)，从而预防病毒的感染、或抑制病毒的复制、或防止病毒的传播、或杀死病毒的组合物，或者用于治疗由病毒感染引起的疾病或由此出现的症状的组合物。
本说明书的术语“预防”是指疾病或疾病状态的预防性或保护性治疗。本说明书的术语“治疗”是指疾病状态的减轻、抑制、镇静或根除。
在本说明书中，术语“乙型冠状病毒(Betacoronavirus)”是指属于冠状病毒科(family Coronavirinae)的4个属(genus)之一，是一种通过感染动物以及人类来引起无症状或轻度至重度的呼吸道症状的RNA病毒。
在本发明一实例中，本发明的乙型冠状病毒(Betacoronavirus)包括HCoV-OC43(human coronavirus OC43)、HCoV-HKU1(human coronavirus HKU1)、SARS-CoV(severeacute respiratory syndrome coronavirus)、MERS-CoV(Middle East respiratorysyndrome coronavirus)以及SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)。
在本发明一具体例中，本发明的乙型冠状病毒(Betacoronavirus)包括SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)以及HCoV-OC43(humancoronavirus OC4)。
在本发明一实例中，本发明的特征在于，本发明的有效成分抑制选自由上述乙型冠状病毒的非结构蛋白(non-structural protein，Nsp)、刺突(spike，S)蛋白、包膜(envelop，E)蛋白、膜(membrane，M)蛋白、核衣壳(nucleocapsid，N)蛋白以及血凝素酯酶(haemagglutinin esterase，HE)蛋白组成的组中的至少一种病毒RNA水平。
在本发明一具体例中，本发明的特征在于，本发明的有效成分抑制选自由上述乙型冠状病毒的非结构蛋白(non-structural protein，Nsp)、膜(membrane，M)蛋白以及核衣壳(nucleocapsid，N)蛋白组成的组中的至少一种病毒RNA水平。
本发明的术语非结构蛋白(non-structural protein，Nsp)是指与冠状病毒的复制以及转录相关的非结构蛋白。冠状病毒的非结构蛋白中包含16个Nsp1至Nsp16，Nsp3以及Nsp5具有蛋白分解活性，Nsp7、Nsp8以及Nsp12形成复制酶-转录酶复合物(replicase-transcriptase complex，RTC)。作为RTC的核心结构要素的Nsp12为RNA-依赖RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，在病毒的复制中直接介导RNA合成。
在本发明一具体例中，本发明的非结构蛋白(non-structural protein，Nsp)为选自由Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7、Nsp8、Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12、Nsp13、Nsp14、Nsp15以及Nsp16组成的组中的一种以上蛋白质。在本发明另一具体例中，本发明的非结构蛋白为Nsp12。
在本发明一实例中，本发明的抗病毒用组合物还包含药学上可接受的载体、媒介物、赋形剂、稳定剂或稀释剂。
本发明的药学上可接受的载体、媒介物、赋形剂、稳定剂或稀释剂是本发明所属技术领域常用的，是指与本发明的有效成分药理学上可相容的载体、媒介物、赋形剂、稳定剂或稀释剂。
本发明的药物组合物的药学上可接受的载体或媒介物包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、乙醇、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)等，但不限于此。本发明的药物组合物除了上述成分以外还可以包含赋形剂、稳定剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、增香剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药学上可接受的载体、媒介物、赋形剂、稳定剂或稀释剂详细记载于雷明顿制药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)(19th ed.，1995)中。
本发明的药物组合物可以口服或肠胃外给予，在肠胃外给予的情况下，可以通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、透皮给予等方式给予。
本发明的药物组合物的合适的给予量因如配制方法、给予方式、患者的年龄、体重、性别、病症状态、饮食、给予时间、给予途径、排泄速度以及反应敏感性等因素而异，一般熟练医生可以容易地决定及开出对所需治疗或预防有效的给予量。另一方面，优选地，本发明的药物组合物的给予量为每天0.0001-1000mg/kg(体重)。
本发明的药物组合物可以根据本发明所属技术领域的普通技术人员易于实施的方法，利用药剂学上可以接受的载体和/或赋形剂来配制，从而可以以单位剂量的形式制备或以放入多剂量容器中的形式制备。在此情况下，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形式，也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形式，还可以额外包含分散剂或稳定剂。
本发明中使用的哺乳动物细胞包括选自由Vero细胞系(African green monkeykidney cell line)、Calu-3细胞系(human lung adenocarcinoma cell line)、HBEC细胞系(human bronchial epithelium cell line)以及HCT-8细胞系(colon cancer cellline)组成的组中的至少一种哺乳动物细胞，但不限于此。
本发明的Vero细胞系作为从非洲绿猴(African green monkey)的肾上皮细胞(kidney epithelial cell)分离的细胞系，常用作病毒培养的宿主细胞。本发明的Calu-3细胞系作为来源于人肺腺癌细胞的细胞系(human lung adenocarcinoma cell line)，常用于呼吸道感染病毒的研究并用于SARS-CoV-2研究。本发明的HBEC细胞系作为人支气管上皮细胞系(human bronchial epithelium cell line)，是由细胞培养液-干细胞(stemcell)中分化的支气管上皮细胞(bronchial epitheliumcell)-空气层培养的细胞系，以在细胞培养研究的基础上更进一步模拟真实的呼吸道。本发明的HCT-8细胞系作为结肠癌细胞系(colon cancer cell line)，是常用于HCoV-OC43研究的细胞系。
根据本发明再一实施方式，本发明提供一种用于预防或治疗COVID-19(Coronavirus Disease 2019)的药物组合物，其包含上述抗病毒用组合物。本发明的术语“COVID-19”是指19冠状病毒感染病(coronavirus disease 2019，COVID-19)作为由SARS-CoV-2感染引起的呼吸道疾病，表现出无症状或包括发烧、疲惫、咳嗽、呼吸困难、肺炎、咳痰、咽喉痛、头痛、咳血、恶心、腹泻等在内的轻度至重度的呼吸道症状。对于COVID-19的治疗，目前有补液和/或使用退烧药等作为对症治疗的保守治疗，尚无针对SARS-CoV-2的抗病毒剂。
本发明的用于预防或治疗COVID-19(Coronavirus Disease 2019)的药物组合物包含上述本发明再一实施方式的抗病毒用组合物，因此引用重复的内容以避免本说明书中的记载过于复杂，并省略其记载。
根据本发明另一实施方式，本发明提供一种用于预防或治疗感冒(common cold)、急性上呼吸道感染(acute upper respiratory tract infection)、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome)或病毒性肺炎(viral pneumonia)的药物组合物，其包含上述抗病毒用组合物。
本发明的用于预防或治疗感冒(common cold)、急性上呼吸道感染(acute upperrespiratory tract infection)、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratorysyndrome)或病毒性肺炎(viral pneumonia)的药物组合物包含上述本发明再一实施方式的抗病毒用组合物，因此引用重复的内容以避免本说明书中的记载过于复杂，并省略其记载。
根据本发明还有一实施方式，本发明提供一种病毒抑制方法，包括向需要其的对象体给予上述本发明再一实施方式的针对乙型冠状病毒(Betacoronavirus)的抗病毒用组合物的步骤，上述抗病毒用组合物包含大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、或它们的组合作为有效成分。
根据本发明又一实施方式，本发明提供一种治疗由病毒感染引起的疾病的方法，包括向需要其的对象体给予上述本发明再一实施方式的针对乙型冠状病毒(Betacoronavirus)的抗病毒用组合物的步骤，上述抗病毒用组合物包含大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、或它们的组合作为有效成分。
作为本发明的病毒抑制方法以及疾病治疗方法的对象的病毒及疾病如上述抗病毒用组合物中所定义。
在本发明一实例中，本发明的对象体为哺乳动物或人类。上述哺乳动物包括狗、猫、牛、马、猪、小鼠、大鼠、黑猩猩、猩猩、狒狒(baboon)等，但不限于此。
本发明的上述病毒抑制方法以及疾病治疗方法通过给予上述本发明再一实施方式的抗病毒用组合物来实现，因此引用重复的内容以避免本说明书中的记载过于复杂，并省略其记载。
【发明的效果】
概括本发明的特征以及优点如下：
(a)本发明提供一种针对乙型冠状病毒(Betacoronavirus)的抗病毒用组合物，包含大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、或它们的组合作为有效成分。
(b)本发明提供一种针对SARS-CoV-2以及HCoV-OC43的抗病毒用组合物，包含大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、或它们的组合作为有效成分。
(c)本发明提供一种病毒抑制方法，包括向需要其的对象体给予针对乙型冠状病毒(Betacoronavirus)的抗病毒用组合物的步骤，上述抗病毒用组合物包含大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、或它们的组合作为有效成分。
(d)本发明提供一种治疗由病毒感染引起的疾病的方法，包括向需要其的对象体给予针对乙型冠状病毒(Betacoronavirus)的抗病毒用组合物，上述抗病毒用组合物包含大黄酸(rhein)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、或它们的组合作为有效成分。
(e)在利用本发明的抗病毒用组合物的情况下，可以通过抑制乙型冠状病毒的RNA水平来预防或治疗COVID-19(coronavirus disease 2019)、感冒(common cold)、急性上呼吸道感染(acute upper respiratory tract infection)、严重急性呼吸综合征(severeacute respiratory syndrome)或病毒性肺炎(viral pneumonia)。
【附图说明】
图1a至图1d示出通过qRT-PCR测定根据是否用包含大黄酸(rhein)的抗病毒用组合物处理感染SARS-CoV-2或HCoV-OC43的细胞的病毒RNA水平(level)。图1a示出感染SARS-CoV-2的Calu-3细胞(SARS-CoV-2-infected Calu-3)中的病毒RNA水平，图1b示出感染SARS-CoV-2的Vero细胞(SARS-CoV-2-infected Vero)的病毒RNA水平，图1c示出感染HCoV-OC43的HCT-8细胞(HCoV OC43-infected HCT-8)的病毒RNA水平，以及图1d示出感染HCoV-OC43的Vero细胞(HCoV OC43-infected Vero)的病毒RNA水平。所有RNA水平均被校正为每个GAPDH的RNA水平。
图2a至图2e示出通过qRT-PCR测定根据是否用包含甲氯芬那酸(meclofenamicacid，MA)的抗病毒用组合物处理感染SARS-CoV-2或HCoV-OC43的细胞的病毒RNA水平。图2a示出感染SARS-CoV-2的Calu-3细胞(SARS-CoV-2-infected Calu-3)中的病毒RNA水平，图2b示出感染SARS-CoV-2的HBEC细胞(SARS-CoV-2-infected HBEC)中的病毒RNA水平，图2c示出感染SARS-CoV-2的Vero细胞(SARS-CoV-2-infected Vero)中的病毒RNA水平，图2d示出感染HCoV-OC43的HCT-8细胞(HCoV OC43-infected HCT-8)中的病毒RNA水平，以及图2e示出感染HCoV-OC4的Vero细胞(HCoV OC43-infected Vero)中的病毒RNA水平。所有RNA水平均被校正为每个GAPDH的RNA水平。
【具体实施方式】
以下，将通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，根据本发明的主旨本发明的范围不限制于这些实施例。
【实施例】
【实施例1：制备抗病毒用组合物】
【实施例1-1：制备包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物】
大黄酸(Rhein)购自Sigma-Aldrich(货号R7269)，并制备在媒介物DMSO中以5μM、10μM、25μM以及50μM的浓度包含大黄酸(rhein)的抗病毒用组合物，制备仅包含DMSO的组合物或包含50％(v/v)的DMSO以及50％(v/v)的乙醇的混合溶液(DMSO+Ethanol)作为对照组。
【实施例1-2：制备包含甲氯芬那酸(Meclofenamic acid，MA)的抗病毒用组合物】
甲氯芬那酸(Meclofenamic acid，MA)购自Sigma-Aldrich(货号M4531)，并制备在媒介物乙醇中以0.5μM、5μM、10μM、25μM、50μM以及100μM的浓度包含甲氯芬那酸(MA)的抗病毒用组合物，制备仅包含乙醇的组合物或包含50％(v/v)的DMSO以及50％(v/v)的乙醇的混合溶液(DMSO+Ethanol)作为对照组。
【实施例2：细胞系】
【实施例2-1：Vero细胞系】
Vero细胞系(非洲绿猴肾细胞系，African green monkey kidney cell line，ATCC(美国菌种保藏中心，American Type Culture Collection)，货号：CCL-81)在37℃以及5％CO2的培养箱中用添加10％的FBS(fetal bovine serum)的DMEM(Dulbecco'sModified Eagle Medium)进行培养。
【实施例2-2：Calu-3细胞系】
Calu-3细胞系(人肺腺癌细胞系，human lung adenocarcinoma cell line，韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank，KCLB)，KCLB编号：30055)在37℃以及5％CO2的培养箱中用添加10％的FBS的DMEM进行培养。
【实施例2-3：HCT-8细胞系】
HCT-8细胞系(结肠癌细胞系，colon cancer cell line，韩国细胞系库，KCLB编号：10244)在37℃以及5％CO2的培养箱中用添加10％的FBS的RPMI(Rosewell ParkMemorial Institute)进行培养。
【实施例2-4：HBEC细胞系】
HBEC细胞系(人支气管上皮细胞系，human bronchial epithelium cell line，ATCC，货号：PCS-300-010)是通过对STEMCELLTM Technologies提供的方案作必要的修正(mutatis mutandis)来培养的。
更详细地，从HBEC细胞培养开始到第三天，i)在添加0.1μg/ml的氢化可的松(hydrocortisone，Sigma，货号#H0888)的PneumaCultTM-Ex plus medium(STEMCELLTMTechnologies，货号#05040)培养基中进行培养。
为了HBEC细胞的分化，从培养后第4天到第45天，ii)将培养3天的上述HBEC细胞以3Х105个细胞/孔在12-孔板(在底部的基底室(Basal Chamber)与顶部的顶室(ApicalChamber)之间具有0.4μM孔(pore)膜(membrane)的insert，STEMCELL TMTechnologies，货号#05001)的顶室(Apical Chamber)中用0.5ml的培养基PneumaCult TM-Ex plus medium(STEMCELL TM Technologies)进行培养。在上述12-孔板的基底室(BasalChamber)中每孔添加1ml的培养基(PneumaCult TM-Ex plus medium，STEMCELL TMTechnologies)。当培养的HBEC细胞在上述12-孔板的顶室(Apical Chamber)中的细胞融合度(cell confluency)达到100％时，从顶室(Apical Chamber)中去除培养基并诱导分化(differentiation)。通过上述分化培养，HBEC细胞形成在形态及功能上与人体内的气道(airway)上皮相似的假复层上皮(pseudostratified epithelium)。
从上述分化培养开始到第30天，在12-孔板的基底室(Basal Chamber)中用培养基PneumaCult TM-ALI maintenance medium(STEMCELL TM Technologies，货号#05002、05003以及05006，添加1μg/ml的氢化可的松)每2天更换1次培养基。之后的7天期间用上述培养基一周更换2次培养基，再之后的7天期间一周更换1次培养基。
在培养后第45天，iii)对分化并保持的上述HBEC细胞感染乙型冠状病毒，iV)在培养后第47天，即在病毒感染48小时后得到用于RNA提取的样品。
【实施例3：病毒】
【实施例3-1：SARS-CoV-2】
SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒，severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2)是从韩国疾病控制和预防中心下属的国家病原体资源库得到的病原体资源，并在国际疫苗研究所的生物安全三级(biosafety level 3)实验室的严格控制下进行管理。
【实施例3-2：HCoV-OC43】
HCoV OC43(人冠状病毒OC43，human coronavirus OC43)从韩国高丽大学病原病毒库获得，并在生物安全二级实验室中进行管理。
【实施例4：感染乙型冠状病毒以及处理抗病毒用组合物】
【实施例4-1：对感染SARS-CoV-2或HCoV-OC43的细胞系处理包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物】
(1)感染SARS-CoV-2的Calu-3细胞(SARS-CoV-2-infected Calu-3)
将Calu-3细胞系以1.75Х105个细胞/孔在12-孔板(12-well plate)的3个孔(well)中进行培养。在培养18小时之后，用无血清(serum-free)DMEM清洗每孔，并在生物安全三级实验室中将SARS-CoV-2以每孔0.05的感染复数(multiplicity of infection，MOI)感染细胞，并在包含2％的FBS的DMEM中进行培养。在病毒感染的同时，用以25μM浓度包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物以及DMSO作为对照组处理每孔的细胞培养基。在病毒感染24小时之后得到用于RNA提取的样品。
(2)感染SARS-CoV-2的Vero细胞(SARS-CoV-2-infected Vero)
将Vero细胞系以1.75Х105个细胞/孔在12-孔板的3个孔中进行培养。在培养18小时之后，用无血清DMEM清洗每孔，并在生物安全三级实验室中将SARS-CoV-2以0.05的MOI感染细胞，并在包含2％的FBS的DMEM中进行培养。在病毒感染的同时，用以25μM的浓度包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物以及DMSO作为对照组处理每孔(well)的细胞培养基。在病毒感染24小时之后得到用于RNA提取的样品。
(3)感染HCoV-OC43的HTC-8细胞(HCoV-OC43-infected HCT-8)
将HCT-8细胞系以2Х105个细胞/孔在12-孔板的2个孔中进行培养。在培养18小时之后，用包含PBS或3％的FBS的RPMI清洗每孔，然后在生物安全二极实验室中感染HCoV-OC43，并在包含3％的FBS的RPMI中进行培养。在病毒感染的同时，用以0.25μM、2.5μM、25μM以及250μM的浓度包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物以及DMSO和乙醇的混合溶液作为对照组处理每孔的细胞培养基。在病毒感染24小时之后，用包含PBS或3％的FBS的RPMI清洗每孔后得到用于RNA提取的样品。
(4)感染HCoV-OC43的Vero细胞(HCoV-OC43-infected Vero)
将Vero细胞系以2Х105个细胞/孔在12-孔板的3个孔中进行培养。在培养18小时之后，用包含PBS或3％的FBS的DMEM清洗每孔，然后在生物安全二级实验室中感染HCoV-OC43，并在包含3％的FBS的DMEM中进行培养。在病毒感染的同时，用以5μM、10μM、25μM以及50μM的浓度包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物以及DMSO作为对照组处理每孔(well)的细胞培养基。在病毒感染24小时之后，用包含PBS或3％的FBS的DMEM清洗每孔后得到用于RNA提取的样品。
【实施例4-2：对感染SARS-CoV-2或HCoV-OC43的细胞系处理包含甲氯芬那酸(meclofenamic acid，MA)的抗病毒用组合物】
除了处理的抗病毒用组合物的种类及感染SARS-CoV-2的HBEC细胞以外，在与上述实施例4-1中记载的条件相同或相似的条件下培养每种细胞系并感染每种病毒，因此引用重复的内容以避免本说明书中的记载过于复杂，并省略其记载。
对感染SARS-CoV-2的Calu-3细胞(SARS-CoV-2-infected Calu-3)、感染SARS-CoV-2的HBEC细胞(SARS-CoV-2-infected HBEC)以及感染SARS-CoV-2的Vero细胞(SARS-CoV-2-infected Vero)用以50μM的浓度包含甲氯芬那酸(Meclofenamic acid，MA)的抗病毒用组合物以及乙醇作为对照组处理每孔的细胞培养基。
并且，对感染HCoV-OC43的HTC-8细胞(HCoV-OC43-infected HCT-8)用以0.5μM、5μM以及50μM的浓度包含甲氯芬那酸(Meclofenamic acid，MA)的抗病毒用组合物以及DMSO和乙醇的混合溶液(DMSO+(乙醇)Ethanol)作为对照组处理每孔的细胞培养基，对感染HCoV-OC43的Vero细胞(HCoV-OC43-infected Vero)用以5μM、10μM、25μM、50μM以及100μM的浓度包含甲氯芬那酸(Meclofenamic acid，MA)的抗病毒用组合物以及DMSO作为对照组处理每孔的细胞培养基。
(1)感染SARS-CoV-2的HBEC细胞(SARS-CoV-2-infected HBEC)
与实施例2-4相同，在培养后第3天分化并保持培养的HBEC细胞系，在培养后第45天在生物安全三级实验室中用PBS清洗每孔，然后以3.3Х104个噬斑形成单位(plaque-forming unit，pfu)感染SARS-CoV-2。在上述病毒感染2小时之前，用以50μM的浓度包含甲氯芬那酸(Meclofenamic acid，MA)的抗病毒用组合物以及乙醇作为对照组处理每孔的细胞培养基。在培养后第47天，即在病毒感染48小时之后，用PBS清洗每孔后得到用于RNA提取的样品。
【实施例5：分离以及纯化RNA】
通过用核酸提取溶液Trizol(英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，货号：10296028)处理上述实施例4中得到的用于RNA提取的样品来分离整个RNA。根据制造商的方案，利用PureLink TM RNA小提试剂盒(PureLink TM RNA Mini Kit)(英杰生命技术有限公司，货号：12183018A)纯化感染SARS-CoV-2的细胞的整个RNA，并利用RNeasy Mini Kit(Qiagen，货号：74106)纯化感染HCoV-OC43的细胞的整个RNA。利用分光光度计(NanoDropTM 2000c Spectrophotometer，ND-2000C，Thermo Scientific)测定纯化的RNA的浓度。
【实施例6：qRT-PCR(quantative real-time PCR)】
用Power SYBR TM Green PCR主混合物(Power SYBR TM Green PCR Master Mix)(Applied Biosystems TM，货号：4367659)以及实时基因扩增装置(Real-timeQuantStudio 3Real-Time PCR Instrument，Applied Biosystems TM)对上述实施例5中得到的纯化的RNA进行qRT-PCR。
用于qRT-PCR实验的引物(primer)的正向(forward，F)以及反向(reverse，R)的序列如下表1所示。在感染SARS-CoV-2的细胞中测定非结构蛋白12(non-structural protein12，NSP12)、膜(membrane，M)蛋白以及核衣壳(nucleocapsid，N)蛋白的病毒RNA水平的情况下，使用具有序列号1至6所示的寡核苷酸序列的引物。当在感染SARS-CoV-2的Calu-3细胞以及HBEC细胞中测定GAPDH的RNA时，使用具有序列号7以及8所示的寡核苷酸序列的引物。当在感染SARS-CoV-2的Vero细胞以及HCT-8细胞中测定GAPDH的RNA时，使用具有序列号9以及10所示的寡核苷酸序列的引物。使用具有序列号11以及12所示的寡核苷酸序列的引物以在感染HCoV-OC43的细胞中测定核衣壳(nucleocapsid，N)蛋白的病毒RNA水平。
【表1】
将通过qRT-PCR实验结果得到的非结构蛋白12(non-structural protein 12，nsp12)、膜(membrane，M)蛋白以及核衣壳(nucleocapsid，N)蛋白基因的循环阈值(Cyclethreshold，Ct)校正(normalized)为作为对照组的GAPDH的Ct值并利用2-ΔΔCt的方法分析病毒RNA水平。
除了重复2次感染HCoV-OC43的HCT-8细胞实验以外，本发明的实验均至少重复3次，图1a至图1d以及图2a至图2e的柱形图上的误差条(error bar)表示标准误差(standarderror of the mean)。
【实施例7：包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物对乙型冠状病毒RNA的抑制效果】
【实施例7-1：包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物对SARS-CoV-2的病毒RNA抑制效果】
在仅用DMSO处理感染SARS-CoV-2的Calu-3细胞以及Vero细胞的对照组以及用以25μM的浓度包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物处理的实验组中，将通过qRT-PCR测定的nsp12、M蛋白以及N蛋白的病毒RNA水平校正为GAPDH并进行分析(参照图1a以及图1b)。与仅用DMSO处理感染SARS-CoV-2的Calu-3细胞(SARS-CoV-2-infected Calu-3)的对照组相比，用以25μM的浓度包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物处理的实验组中的nsp12、M蛋白以及N蛋白的病毒RNA水平均显著抑制到低于5％(参照图1a)，并且，在用包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物处理感染SARS-CoV-2的Vero细胞(SARS-CoV-2-infected Vero)的实验组中的nsp12、M蛋白以及N蛋白的病毒RNA水平均显著抑制到低于约30％(参照图1b)。
【实施例7-2：包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物对HCoV-OC43的病毒RNA抑制效果】
在用DMSO和乙醇的混合溶液(DMSO+乙醇)处理感染HCoV-OC43的HCT-8细胞(HCoVOC43-infected HCT-8)的对照组以及用以0.25μM、2.5μM、25μM以及250μM的浓度包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物处理的实验组中(参照图1c)，并且在仅用DMSO处理感染HCoV-OC43的Vero细胞(HCoV OC43-infected Vero)的对照组以及用以5μM、10μM、25μM以及50μM的浓度包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物处理的实验组中(参照图1d)，将通过qRT-PCR测定的每个N蛋白的病毒RNA水平校正为GAPDH并进行分析。
在用以250μM以及25μM的浓度包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物处理感染HCoV-OC43的HCT-8细胞的情况下，以及在用以5μM、10μM、25μM以及50μM的浓度包含大黄酸(Rhein)的抗病毒用组合物处理感染HCoV-OC43的Vero细胞的情况下，显著抑制蛋白的病毒RNA水平。并且，如图1d所示，确认到N蛋白的RNA水平的抑制随着处理到感染HCoV-OC43的Vero细胞中的抗病毒用组合物中大黄酸(Rhein)的浓度增加而增加的剂量依赖效应(dose-dependent effect)。
【实施例8：包含甲氯芬那酸(Meclofenamic acid，MA)的抗病毒用组合物对病毒RNA的抑制效果】
【实施例8-1：包含甲氯芬那酸(Meclofenamic acid，MA)的抗病毒用组合物对SARS-CoV-2的病毒RNA抑制效果】
在仅用乙醇处理感染SARS-CoV-2的Calu-3细胞(SARS-CoV-2-infected Calu-3)、HBEC细胞(SARS-CoV-2-infected HBEC)以及Vero细胞(SARS-CoV-2-infected Vero)的对照组以及用以50μM的浓度包含甲氯芬那酸(Meclofenamic acid，MA)的抗病毒用组合物处理的实验组中，将通过qRT-PCR测定的nsp12、M蛋白以及N蛋白的病毒RNA水平校正为GAPDH并进行分析(参照图2a、图2b以及图2c)。与仅用乙醇处理感染SARS-CoV-2的Calu-3细胞以及Vero细胞(SARS-CoV-2-infected Vero)的对照组相比，用以50μM的浓度包含MA的抗病毒用组合物处理的实验组中的nsp12、M蛋白以及N蛋白的病毒RNA水平均显著抑制到低于5％(参照图2a以及图2c)，在感染SARS-CoV-2的HBEC细胞(SARS-CoV-2-infected HBEC)的情况下显著抑制到约40％以下(参照图2b)。
【实施例8-2：包含甲氯芬那酸(Meclofenamic acid，MA)的抗病毒用组合物对HCoV-OC43的病毒RNA抑制效果】
在用DMSO和乙醇处理感染HCoV-OC43的HCT-8细胞(HCoV OC43-infected HCT-8)的对照组以及用以0.5μM、5μM以及50μM的浓度包含甲氯芬那酸(Meclofenamic acid，MA)的抗病毒用组合物处理的实验组中(参照图2d)，并且在仅用DMSO处理感染HCoV-OC43的Vero细胞(HCoV OC43-infected Vero)的对照组以及用以5μM、10μM、25μM、50μM以及100μM的浓度包含MA的抗病毒用组合物处理的实验组中(参照图2e)，将通过qRT-PCR测定的N蛋白的病毒RNA水平校正为GAPDH并进行分析。经确认，在用以50μM的浓度包含MA的抗病毒用组合物处理感染HCoV-OC43的HCT-8细胞的情况下，以及在用以10μM、25μM、50μM以及100μM的浓度包含MA的抗病毒用组合物处理感染HCoV-OC43的Vero细胞的情况下，显著抑制N蛋白的病毒RNA水平。
序列表
<110> 首尔大学校产学协力团
基础科学研究院
<120> 包含大黄酸、甲氯芬那酸或它们的组合的针对SARS-CoV-2以及HCoV-OC43的抗病毒用组合物
<130> PP200082
<150> KR 10-2020-0154110
<151> 2020-11-17
<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> qPCR-nsp12-F: 用于针对SARS-CoV-2-感染的细胞中的nsp12的qPCR的正向引物序列
<400> 1
cagagagcta ggtgttgtac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> qPCR-nsp12-R: 用于针对SARS-CoV-2-感染的细胞中的nsp12的qPCR的反向引物序列
<400> 2
aagcacgtag tgcgtttatc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> qPCR-M-F: 用于针对SARS-CoV-2-感染的细胞中的M的qPCR的正向引物序列
<400> 3
cgtgccactc catggcacta t 21
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> qPCR-M-R: 用于针对SARS-CoV-2-感染的细胞中的M的qPCR的反向引物序列
<400> 4
cgtcctagat ggtgtccagc aa 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> qPCR-N-F: 用于针对SARS-CoV-2-感染的细胞中的N的qPCR的正向引物序列
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ggccagaagc tggacttccc 20
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<212> DNA
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<220>
<223> qPCR-N-R: 用于针对SARS-CoV-2-感染的细胞中的N的qPCR的反向引物序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> qPCR-GAPDH-F: 用于针对Calu-3和HBEC细胞中的GAPDH的qPCR的正向引物序列
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ctctctgctc ctcctgttcg ac 22
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<212> DNA
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<223> qPCR-GAPDH-R: 用于针对Calu-3和HBEC细胞中的GAPDH的qPCR的反向引物序列
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<223> qPCR-GAPDH-F: 用于针对Vero和HCT-8细胞中的GAPDH的qPCR的正向引物序列
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<212> DNA
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<223> qPCR-GAPDH-R: 用于针对Vero和HCT-8细胞中的GAPDH的qPCR的反向引物序列
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gcctgcttca ccaccttctt g 21
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<212> DNA
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<220>
<223> qPCR-OC43-N-F: 用于针对HCoV-OC43-感染的细胞中的N的qPCR的正向引物序列
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tctaaactgg tcggactgat 20
Claims (7)
1.针对乙型冠状病毒的抗病毒用组合物，其包含大黄酸、甲氯芬那酸或它们的组合作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的抗病毒用组合物，其中所述乙型冠状病毒包含HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV以及SARS-CoV-2。
3.根据权利要求1所述的抗病毒用组合物，其中所述有效成分抑制选自由所述乙型冠状病毒的非结构蛋白、刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白以及血凝素酯酶蛋白组成的组中的至少一种病毒RNA水平。
4.根据权利要求3所述的抗病毒用组合物，其中所述非结构蛋白为选自由Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7、Nsp8、Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12、Nsp13、Nsp14、Nsp15以及Nsp16组成的组中的一种以上蛋白质。
5.根据权利要求1所述的抗病毒用组合物，其中所述抗病毒用组合物还包含药学上可接受的载体、媒介物、赋形剂、稳定剂或稀释剂。
6.用于预防或治疗COVID-19的药物组合物，其包含根据权利要求1～5之任一项所述的抗病毒用组合物。
7.用于预防或治疗感冒、急性上呼吸道感染、严重急性呼吸综合征或病毒性肺炎的药物组合物，其包含根据权利要求1～5之任一项所述的抗病毒用组合物。
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