TW202207972A - Stat3之磷酸化抑制劑、自體免疫疾病及冠狀病毒傳染病之預防或治療劑 - Google Patents

Abstract

一種STAT3之磷酸化抑制劑，其含有司坦尼氏降鈣素1(Stanniocalcin-1, STC1)作為有效成分。一種JAK之表現或磷酸化之抑制劑，其含有司坦尼氏降鈣素1作為有效成分。一種自體免疫疾病之預防或治療劑，其含有司坦尼氏降鈣素1作為有效成分。一種流行性感冒病毒傳染病之預防或治療劑，其含有司坦尼氏降鈣素1作為有效成分。一種冠狀病毒傳染病之預防或治療劑，其含有司坦尼氏降鈣素1作為有效成分。

Description

STAT3之磷酸化抑制劑、自體免疫疾病及冠狀病毒傳染病之預防或治療劑

相關申請案之相互參照 本申請案主張基於2020年6月30日所提申日本國專利申請第2020-112680號之說明書的優先權(在本說明書中參照其揭示整體並援引之)。本發明係關於自體免疫疾病及冠狀病毒傳染病之預防或治療劑。

在呼吸道領域中，間葉系幹細胞(MSCs：Mesenchymal Stem Cells)之肺損傷、纖維化抑制作用與抗發炎作用備受注目(非專利文獻3)。又，TNF-α與IL-1β、CCL2、IL-6等的促發炎細胞激素，是在細胞激素風暴中重要的因子。特別是，經由IL-6/JAK/STAT傳遞路徑等誘導IL-6的機制被稱為IL-6放大器(IL-6 amplifier, IL-6 AMP)，其為細胞激素風暴的主要機制，其中細胞激素風暴被認為是以類風濕性關節炎等為代表的自體免疫疾病、COVID-19等重症化的原因(非專利文獻4)。

自體免疫疾病是因免疫系統對自身的正常細胞及/或組織過度反應並攻擊而引起症狀，如此免疫耐受之缺陷所致疾病的總稱。有許多疾病被分類為自體免疫疾病，又其中也有被指定為難治疾病者，因此其治療方法的開發備受期望。

又，冠狀病毒作為引起所謂感冒症狀的病毒而廣為人知，然而其有時會因突變而生成高感染力、高毒性的病毒株而造成問題。特別是現在，如此突變株之嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(SARS-CoV2)的傳染病，即嚴重特殊傳染性肺炎(Coronavirus disease 2019, Covid-19)，也就是所謂的新型冠狀病毒傳染病在全世界擴散，還出現了許多死者，因此其治療法的開發迫在眉睫。 先前技術文獻 專利文獻

專利文獻1：日本專利第5946191號公報 非專利文獻

非專利文獻1：Hoffmann et al. Cell 181, 1-10 (2020) 非專利文獻2：東京大學網站「有望阻止新型冠狀病毒感染之國內現有藥劑之鑑定)」：https://www.ims.u-tokyo.ac.jp/imsut/content/000002328.pdf 非專利文獻3：Clin Med Insights Circ Respir Pulm Med. 2015; 9: 91-6 非專利文獻4：Immunity. 2020; 52: 731-33. 非專利文獻5：Mol Immunol 2007 2497 非專利文獻6：病毒(ウイルス)第69卷 第1號, pp.61-72, 2019

發明欲解決之課題 本發明應解決之課題在於提供一種STAT3磷酸化及IL6AMP之新穎抑制劑。又，本發明亦有課題在於提供一種能夠藉由抑制STAT3之磷酸化來處理的疾病之新預防或治療劑。例如，本發明進一步應解決之課題在於提供一種新穎的自體免疫疾病之預防或治療劑，其以至今在自體免疫疾病之治療效果上不為人知的物質作為有效成分。更進一步提供一種新穎的冠狀病毒傳染病之預防或治療劑，其以至今在冠狀病毒傳染病之治療效果上不為人知的物質作為有效成分。

用以解決課題之手段 在如此狀況下，本案發明人等探討了數千種類的化合物，結果發現，司坦尼氏降鈣素1(Stanniocalcin-1, STC1)會抑制在IL-6/JAK/STAT傳遞路徑下游的STAT3之磷酸化。更進一步，本案發明人等在STAT3之磷酸化抑制的關聯下，使用STC1而得到了下述見解。具體而言，本案發明人等也發現，STC1在表觀遺傳學上會誘導抗發炎因子SOCS1的表現。並且，本案發明人等還發現，STC1藉由抑制位於細胞表面的冠狀病毒s蛋白質受體、以及對病毒外膜與細胞膜融合重要之因子的表現，而抑制冠狀病毒感染細胞。本發明係以此等新見解為基礎。

據此，本發明提供以下項目： 項1.一種STAT3之磷酸化抑制劑，含有司坦尼氏降鈣素1(STC1)作為有效成分。

項2.一種JAK之表現或磷酸化抑制劑，含有司坦尼氏降鈣素1作為有效成分。

項3.一種自體免疫疾病之預防或治療劑，含有司坦尼氏降鈣素1作為有效成分。

項4.一種流行性感冒病毒傳染病之預防或治療劑，含有司坦尼氏降鈣素1作為有效成分。

項5.一種冠狀病毒傳染病之預防或治療劑，含有司坦尼氏降鈣素1作為有效成分。

項6.如項5之冠狀病毒傳染病之預防或治療劑，其中前述冠狀病毒具有能夠與ACE2結合之S蛋白質。

項7.如項5或6之冠狀病毒傳染病之預防或治療劑，其中前述冠狀病毒係SARS相關冠狀病毒。

項8.一種ACE2及TMPRSS2之表現抑制劑，含有司坦尼氏降鈣素1作為有效成分。

項9.一種IL6 AMP之抑制劑，含有司坦尼氏降鈣素1作為有效成分。

項10.如項1之STAT3之磷酸化抑制劑、項2之JAK之表現或磷酸化抑制劑、項3之自體免疫疾病之預防或治療劑、項4之流行性感冒病毒傳染病之預防或治療劑、項5~7中任一項之冠狀病毒傳染病之預防或治療劑、項8之ACE2及TMPRSS2之表現抑制劑、或項9之IL6 AMP之抑制劑，其係吸入劑。

發明效果 根據本發明即能夠提供一種STAT3磷酸化及IL6 AMP之新穎抑制劑。又，本發明提供一種能夠藉由抑制STAT3之磷酸化來處理的疾病之新預防或治療劑。例如，本發明提供一種新穎的自體免疫疾病的新預防或治療劑，其以至今在自體免疫疾病之治療效果上不為人知的物質作為有效成分。更進一步，藉由將至今在冠狀病毒傳染病的治療效果上不為人知的物質之STC1作為有效成分，而能夠提供一種新穎的冠狀病毒傳染病的預防或治療劑。具體而言，根據本發明即能夠經由抑制ACE2及TMPRSS2表現來抑制冠狀病毒的感染，因此對冠狀病毒傳染病之預防及治療有用。又，本案發明人等已經發現STC1會顯著地抑制肺纖維化(專利文獻1)。據此，根據本發明，不僅是冠狀病毒傳染病的預防或治療，還能夠預防冠狀病毒傳染病重症化時的肺纖維化，即使是發生肺纖維化時也能夠期待其治療、抑制發展的效果，而更為有用。又，能夠抑制肺纖維化的藥劑並非必然能夠預防或治療冠狀病毒傳染病，因此本發明如此的效果是在預期之外的。

用以實施發明之形態 STAT3之磷酸化抑制劑 本發明提供一種含有司坦尼氏降鈣素1作為有效成分之STAT3之磷酸化抑制劑。STAT3(訊息傳遞及轉錄活化蛋白3, signal transducer and activator of transcription 3)是屬於STAT蛋白質家族的蛋白質，且已知在IL-6/JAK/STAT傳遞路徑等中被磷酸化而活化。關於STAT3，典型上來說可舉胺基酸序列登錄為NCBI 登錄編號NP_001356441.1者。 本發明之有效成分STC1是記載於專利文獻1等的公知成分，其為一種雙體醣蛋白荷爾蒙。本發明中的STC1，可以是由動物細胞或組織等獲得的天然STC1分子，亦可以是與天然STC1具有相同胺基酸序列的重組型STC1、基於經基因工程技術改變的STC1基因而生成的重組型STC1、合成STC1。又，本發明中的STC1亦可以是STC1之活性片段等的功能等價物等。因此，關於本發明中「司坦尼氏降鈣素1」(STC1)之用語，除非有明示並非如此，是以包含此等各種的STC1之意義來使用。

又，關於本發明中所使用之STC1，宜為具有人類來源之胺基酸序列者、或是基於人類來源之胺基酸序列且在不損害其功能下改變者(例如1個或數個(例如2個、2~3個、2~4個、2~5個)的胺基酸缺失、插入及/或取代者)。人類STC1的胺基酸序列及鹼基序列為公知，並登錄為登錄編號NP#003146.1、NM#003155.2。例如，序列編號1顯示登錄為登錄編號NP#003146.1之人類STC1胺基酸序列。又，有許多人類以外動物來源之STC1，其胺基酸序列及鹼基序列亦為已知。此等任一者皆已知相對於人類STC1具有高相同性(表1)。

表1

據此，關於在本發明之一實施型態中可使用的STC1，可舉相對於人類STC1胺基酸序列具有80%以上相同性者，且宜為具有90%以上相同性者，以具有94%以上相同性者為佳。典型上來說，更佳是使用具有與人類STC1序列(例如293細胞來源之人類STC1序列)100%一致胺基酸序列之天然或重組STC1(rSTC1)。在本發明中，此等STC1可單獨使用1種或組合2種以上使用。

本發明之有效成分STC1及其鹽也會以水合物或溶劑合物的形式存在，因此該等水合物及溶劑合物亦包含在本發明之有效成分化合物中。

關於形成溶劑合物的溶劑，可例示乙醇、丙醇等醇；乙酸等有機酸；乙酸乙酯等酯類；四氫呋喃、二乙醚等醚類；丙酮等酮類；DMSO等。此等溶劑可單獨1種，或將2種以上作為混合溶劑來使用。

在本發明中，可將本發明之有效成分STC1本身用作STAT3之磷酸化抑制劑，亦可作為組合有藥學上容許之各種載劑(例如，等張化劑、螯合劑、安定化劑、pH調節劑、防腐劑、抗氧化劑、溶解輔助劑、黏稠化劑等)之醫藥組成物來使用。

關於等張化劑，例如可舉葡萄糖、海藻糖、乳糖、果糖、甘露醇、木糖醇、山梨糖醇等醣類；甘油、聚乙二醇、丙二醇等多元醇類；氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等無機鹽類。此等等張化劑可單獨1種或組合2種以上使用。

關於螯合劑，例如可舉依地酸二鈉、依地酸鈣二鈉、依地酸三鈉、依地酸四鈉、依地酸鈣等依地酸鹽類；乙二胺四乙酸鹽、氮三乙酸或其鹽、六偏磷酸鈉、檸檬酸等。此等螯合劑可單獨1種或組合2種以上使用。

關於安定化劑，例如可舉亞硫酸氫鈉等。

關於pH調節劑，例如可舉鹽酸、碳酸、乙酸、檸檬酸等酸；進一步可舉氫氧化鈉、氫氧化鉀等鹼金屬氫氧化物；碳酸鈉等鹼金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽；乙酸鈉等鹼金屬乙酸鹽；檸檬酸鈉等鹼金屬檸檬酸鹽；三羥甲基胺基甲烷(Trometamol)等鹼。此等pH調節劑可單獨1種或組合2種以上使用。

關於防腐劑，例如可舉山梨酸、山梨酸鉀；對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯等對羥基苯甲酸酯；葡萄糖酸洛赫西定、氯化苄二甲烴銨、氯化本索寧、氯化十六烷基吡啶等四級銨鹽；烷基聚胺基乙基甘胺酸、氯丁醇、POLYQUAD、聚六亞甲基雙胍、洛赫西定等。此等防腐劑可單獨1種或組合2種以上使用。

關於抗氧化劑，例如可舉亞硫酸氫鈉、乾燥亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、濃縮混合生育醇等。此等抗氧化劑可單獨1種或組合2種以上使用。

關於溶解輔助劑，例如可舉苯甲酸鈉、甘油、D-山梨糖醇、葡萄糖、丙二醇、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯二醇、D-甘露醇等。此等溶解輔助劑可單獨1種或組合2種以上使用。

關於黏稠化劑，例如可舉聚乙二醇、甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、黃原膠、硫酸軟骨素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等。此等黏稠化劑可單獨1種或組合2種以上使用。

在醫藥組成物之實施型態，組成物中的STC1含量並無特別限制，例如可由90質量%以上、70質量%以上、50質量%以上、30質量%以上、10質量%以上、5質量%以上、1質量%以上等的條件適宜設定。

製劑型態並無特別限制，例如可舉錠劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑等的經口投予劑；注射劑(靜脈注射、肌肉注射、局部注射等)、含漱劑、點滴劑、外用劑(軟膏、乳劑、貼片藥、吸入藥)、栓劑等的非經口投予劑等的各種製劑型態。在上述製劑型態中，適宜者可舉外用劑等，其中又可舉吸入藥(經氣管投予藥)。

在本發明中，STC1投予量依投予途徑、患者的年齡、體重、症狀等有所不同而無法一律規定，但對成人的1日投予量通常設為約5000mg以下，且宜設為1000mg以下的量即可。STC1投予量的下限亦無特別限制，例如，作為STC1投予量，對成人的1日投予量通常可適宜設定為0.1mg以上，且宜設定為0.5mg以上。當1日投予1次時，1製劑中含有此量即可；當1日投予3次時，1製劑中含有此3分之1的量即可。

本發明STAT3之磷酸化抑制劑可投予給哺乳動物等患者。關於哺乳動物，可舉人、猴、小鼠、大鼠、兔、貓、狗、豬、牛、馬、羊等。

自體免疫疾病之預防或治療劑 本發明提供一種含有司坦尼氏降鈣素1作為有效成分之自體免疫疾病之預防或治療劑。當IL6等的細胞激素結合上受體，會誘導JAK及STAT的磷酸化，而誘導急性期蛋白等的轉錄(非專利文獻5)。SOCS藉由抑制JAK的磷酸化，間接的也抑制STAT的磷酸化。IL6/JAK/STAT路徑被認為是與類風濕性關節炎等自體免疫疾病的發病有關的重要路徑，而成為藥物開發之標的。在此，如前所述，本案發明人等這次發現STC1會抑制在IL-6/JAK/STAT傳遞路徑下游的STAT3之磷酸化。本發明係以此等新見解為基礎。本發明之有效成分STC1亦可使用其水合物及溶劑合物，關於此點如前所述。

關於本發明之對象疾病，自體免疫疾病可舉類風濕性關節炎、卡斯爾曼氏病、克隆氏病、華格納氏肉芽病、類肉瘤病、異位性皮膚炎、慢性膿皮病、乾癬、伴隨肺炎的高IgE症候群等。

在本發明中，可將本發明之有效成分STC1本身用作自體免疫疾病之預防或治療劑，亦可作為組合有藥學上容許之載劑之醫藥組成物來使用。關於載劑，可將於前有關STAT3之磷酸化抑制劑所述者，以同前所述的量使用。

又，上述醫藥組成物，除了STC1之外，亦可更加含有被視為具有自體免疫疾病之預防或治療作用的化合物。關於已知具有自體免疫疾病之預防或治療作用的化合物，例如可舉皮質類固醇(普賴蘇穠(Prednisolone)等)、JAK抑制藥(托法替尼(Tofacitinib)等)、鈣調磷酸酶抑制藥(環孢素(Ciclosporin)、他克莫司(Tacrolimus)等)、DNA合成抑制藥(環磷醯胺(Cyclophosphamide)等)、mTOR抑制藥(西羅莫司(Sirolimus)等)、IMDH抑制藥(Mycophenolate mofetil等)、抗體製劑(托珠單抗(Tocilizumab)、利妥昔單抗(Rituximab)等)等。此等化合物可單獨1種或組合2種以上使用。醫藥組成物之實施型態中，關於組成物中的STC1含量、製劑型態、投予量、投予對象患者等，同前關於STAT3之磷酸化抑制劑所述者。

冠狀病毒傳染病之預防或治療劑 本發明係提供一種含有STC1冠狀病毒傳染病之預防或治療劑。本發明之有效成分STC1亦可使用其水合物及溶劑合物，關於此點等如前所述。

關於本發明之對象疾病，所謂的冠狀病毒，意指屬冠狀病毒科(Coronaviridae)的病毒。關於冠狀病毒，可舉α冠狀病毒屬、β冠狀病毒屬等，且宜舉β冠狀病毒屬等。關於α冠狀病毒屬，可舉Duvinacovirus亞屬(例如，HCoV-229E等)、Setracovirus亞屬(例如，HCoV-NL63等)等。關於β冠狀病毒屬，可舉Embecovirus亞屬(例如，HCoV-OC43、HCoV-HKU1等)、Sarbecovirus亞屬、Merbecovirus亞屬(例如，中東呼吸症候群冠狀病毒(MERS-CoV)等)等，且宜舉Sarbecovirus亞屬等。關於Sarbecovirus亞屬等，可舉嚴重急性呼吸道症候群相關冠狀病毒(SARSr-CoV)等。關於SARSr-CoV，可舉嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(SARS-CoV)、嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(SARS-CoV2)等。

就SARS-CoV2等冠狀病毒來說，其外膜上會具有棘(Spike)蛋白質(S蛋白質)，該S蛋白質會結合上細胞膜的受體(ACE2)，然後，會受到蛋白質分解酵素之第二型跨膜絲胺酸蛋白酶(Transmembrane protease, serine 2, TMPRSS2)之蛋白質分解，使S蛋白質活化，目前已知此對病毒外膜與細胞膜的融合是重要的，對於SARS-CoV-2的感染來說，在氣管細胞中ACE2與TMPRSS2被認為是必須要的(非專利文獻1、非專利文獻2)。本案發明人等發現，當肺損傷導致ACE2及TMPRSS2的表現增強時，藉由使用本發明之預防或治療劑之有效成分STC1，會抑制該肺損傷時ACE2及TMPRSS2的表現增強。因此，冠狀病毒傳染病的預防或治療劑對於具有S蛋白質之冠狀病毒，又典型上來說是對於具有能夠與ACE2結合的S蛋白質之冠狀病毒特別有效。

在本發明中，可將本發明之有效成分STC1本身用作冠狀病毒傳染病之預防或治療劑，亦可作為組合有藥學上容許之載劑之醫藥組成物來使用。關於載劑，可使用同前有關STAT3之磷酸化抑制劑所述者。

又，上述醫藥組成物，除了STC1之外，亦可更加含有被視為具有冠狀病毒傳染病之預防或治療作用的化合物。關於已知具有冠狀病毒傳染病之預防或治療作用的化合物，例如可舉法匹拉韋(Favipiravir)、瑞德西韋(Remdesivir)、伊維菌素(Ivermectin)、環索奈德(Ciclesonide)、托珠單抗(Tocilizumab)、卡莫司他(Camostat)、萘莫司他(Nafamostat)。此等化合物可單獨1種或組合2種以上使用。醫藥組成物之實施型態中，關於組成物中的STC1含量、製劑型態、投予量、投予對象患者等，同前關於STAT3之磷酸化抑制劑所述者。

本發明之冠狀病毒傳染病之預防或治療劑之有效成分STC1，係至少藉由ACE2及TMPRSS2的表現抑制來預防、治療及/或舒緩冠狀病毒傳染病。據此，本發明也提供一種含有STC1之ACE2及TMPRSS2之表現抑制劑。又，本案發明人等發現STC1會顯著地抑制肺纖維化，且含有STC1作為有效成分之肺纖維化之預防、治療及/或抑制發展用醫藥組成物已取得專利(專利文獻1)。然而，雖然當冠狀病毒傳染病嚴重化時有可能會發生肺纖維化，肺的纖維化已知會因各種各樣的因素發生，而冠狀病毒傳染病僅不過是其中一種，顯然，能夠治療肺纖維化的化合物並不一定會抑制冠狀病毒的感染自身。又，關於ACE2及TMPRSS2之表現與STC1的關係，至今沒有任何報告。據此，在本發明中STC1所致ACE2及TMPRSS2之表現抑制效果及冠狀病毒傳染病的預防或治療效果，是無法由先前技術預期的。又，有報告指出，TMPRSS2在流行性感冒(A型、B型)、其他呼吸道相關病毒等的感染中皆扮演重要的角色(非專利文獻6)。據此，本發明的ACE2及TMPRSS2之表現抑制劑，可用作呼吸道相關病毒(例如，冠狀病毒、流行性感冒病毒)等的預防或治療劑。另外，ACE2及TMPRSS2之表現抑制劑、呼吸道相關病毒的預防或治療劑之有效成分、製劑型態、投予量等，與冠狀病毒傳染病之預防或治療劑相同。 IL-6 AMP之抑制劑 當SARS-CoV2結合上ACE2，會使原本會結合上ACE2而被分解的血管收縮素Ⅱ透過稱為AT1R之受體而誘導TNFα、IL6等。結果會使STAT3活化，而更加增強IL6的合成。此為IL6自身放大IL6，因此被稱為IL6放大器(AMP)，且被認為與COVID19的急遽重症化有關。又，先天免疫系統識別病毒而活化NfkB的途徑，也被認為會促進IL6AMP。如前所述，本發明之有效成分STC1會藉由阻礙IL-6/JAK/STAT傳遞路徑而抑制IL-6 AMP。據此，本發明也提供一種含有STC1之IL-6 AMP抑制劑。另外，IL-6 AMP抑制劑之有效成分、製劑型態、投予量等，與前述相同。

以下列舉實施例來更具體說明本發明，但本發明並不限定於此。

實施例 在本實施例中，人類重組(r)STC1係由BioVender公司製造。具體而言，將附加有TAG結構之人類來源STC1基因導入293細胞，並使用TAG序列分離出rSTC1。在以下實施例中，有時會將上述人類重組(r)STC1僅表示為STC1。

實施例1 博萊黴素肺損傷模式中STC1之經氣管投予抑制ACE2與TMPRSS2之表現 在本實施例中，使用小鼠的經氣管投予博萊黴素(BLM)肺損傷模式(圖1)。具體而言，在Day0，對每1組各6隻的C57BL6/J小鼠(雌，8週齡)利用腹腔內投予麻醉藥(將鹽酸氯胺酮300μg+甲苯噻嗪(Xylazine)160ng稀釋於100μL生理食鹽水)來麻醉。然後，將頸部切開並露出氣管，並將23G之SURFLO針的外套插入氣管。進而從SURFLO外套將以下藥劑分別投予至各組小鼠氣管內。 (i)生理食鹽水組(控制組)：生理食鹽水50μL (ii)BLM組：含有博萊黴素之生理食鹽水50μL(博萊黴素濃度0.4mg/ml) (iii)BLM+STC1組：含有博萊黴素之生理食鹽水50μL(博萊黴素濃度0.4mg/mL) 在Day1，如上所述將小鼠麻醉，並從SURFLO外套將以下藥劑分別投予至各組小鼠氣管內。 (i)生理食鹽水組(控制組)：生理食鹽水50μL (ii)BLM組：生理食鹽水50μL (iii)BLM+STC1組：含有STC1之生理食鹽水50μL(STC1濃度40μg/mL) 在Day3，對各組各3隻小鼠施以如同上述麻醉後，藉由切斷頸動脈來將小鼠安樂死，然後將肺取出。進一步，在Day14對各組各3隻小鼠施以如同上述麻醉後，藉由切斷頸動脈來將小鼠安樂死，然後將肺取出。 對取出的肺進行西方墨點法。抗體係使用SantaCruz公司的抗ACE2抗體(E-11、2E2)、抗TMPRSS2抗體(H8)。將各組的西方墨點法結果顯示於圖2A。如圖2A所示，博萊黴素肺損傷所誘導的ACE2及TMPRSS2之上升會被STC1強力抑制。

又，使用Applied Biosystem公司的ABI 7500 Real Time PCR system進行定量PCR。將結果顯示於圖2B。如圖2B所示，肺損傷使ACE2及TMPRSS2的表現增強(生理食鹽水組與Bleo組的對比)。而且，經圖2B中Bleo組與Bleo+STC1組的對比明顯可知，STC1的經氣管投予抑制了肺損傷時的ACE2及TMPRSS2之表現上升。 如前所述，對冠狀病毒的感染來說，氣管細胞中ACE2與TMPRSS2的存在是必須要的，因此由上述結果來看，可認為STC1對冠狀病毒感染的預防及治療有效。又，由如上述肺損傷會使ACE2及TMPRSS2的表現增強這點來看，可認為肺損傷使ACE2及TMPRSS2的表現增強，如此一來會使冠狀病毒更容易經由ACE2及TMPRSS2進入細胞內，進而會使冠狀病毒傳染病重症化這般的惡性循環發生。根據本發明，能夠透過抑制ACE2及TMPRSS2的表現來抑制上述的惡性循環發展，因此本發明有用。

實施例2 利用代謝體分析來調查STC1改變代謝之效果 關於STC1對於SMAD2、3、7的影響 將STC1對粒線體之TCA循環及其周邊代謝造成的影響顯示於圖3。

針對STC1對TGFβ/SMAD訊號傳遞系統造成的影響，以西方墨點法與定量PCR進行分析。具體而言，於添加有重組STC1(50ng/ml)之細胞培養液或不添加之細胞培養液中，將人類肺泡上皮細胞株A549、H1299；人類纖維母細胞株MRC5、HFL1培養24小時。抗體係使用SantaCruz公司的抗SMAD7抗體(B8)與Cell Signaling Technology公司的Phospho-Smad Andibody Sampler Kit。定量PCR係使用Applied Biosystem公司的ABI 7500 Real Time PCR system。並將結果顯示於圖4A~D。

如圖4所示，STC1抑制了在肺損傷與肺纖維化中必須之SMAD2/3磷酸化。此效果係由STC1誘導抑制性SMAD之SMAD7而來。TGFbeta的過剩且持續分泌會經由SMAD2/3活化而引發慢性抗氧化壓力與促發炎細胞激素。此等與COVID19等的冠狀病毒傳染病重症化(肺損傷等)相關的細胞激素風暴有關。據此，由上述結果來看可認為，利用STC1抑制SMAD2/3磷酸化以抑制促發炎細胞激素的持續分泌，藉此能夠避免冠狀病毒傳染病與重症肺炎之肺損傷。 將STC1對SMAD7基因啟動子區的甲基化造成的影響顯示於圖5。針對STC1對SMAD7基因啟動子區的甲基化造成的影響，以定量甲基化特異性PCR(qMSP)進行分析。具體而言，將從各細胞萃取的基因體DNA作亞硫酸氫鹽處理(Fujifilm-Wako，EpiSight^TM Bisulfite Conversion Kit Ver.2)，並使用甲基化特異性PCR用的聚合酶(Takara Episcope MSP kit)與ABI 7500 Real Time PCR system進行。如圖5所示，STC1也誘導了SMAD7的去甲基化。 將STC1對SMAD7蛋白的乙醯化造成的影響顯示於圖6。針對STC1對小鼠肺的SMAD7造成的影響，是對從小鼠取出的肺以螢光免疫染色進行分析。具體而言，薄切實施例1中使用的肺，將其固定於玻片，並於SMAD7抗體(SantaCruz公司B8)、抗乙醯化離胺酸抗體(Cell Signaling Technology公司(Ac-K-103)、核染色(DACO公司DAPI)組合Molecular Device公司的Alexa-488抗體、Alexa594抗體，使用位相差顯微鏡來探討。 將結果顯示於圖6。如圖6所示，STC1也誘導了SMAD7離胺酸基的乙醯化。SMAD7係經乙醯化而能夠穩定表現。即，顯然STC1透過SMAD7在表觀遺傳學上的調整來加強SMAD7的表現。

實施例3 又，使用在實施例1中獲得的從各組小鼠取出的肺標本，進行蘇木精-伊紅染色。將結果顯示於圖7。如圖7所示，STC1抑制了博萊黴素所致之肺的發炎、纖維化。

實施例4 STC1對STAT3磷酸化、IL-6AMP等之影響的評估 ＜方法＞ ・細胞實驗 將人類來源單核細胞THP1細胞在含有10%胎牛血清(Nichirei)及1%青黴素鏈黴素(Sigma)之RPMI培養基(Sigma)培養24小時後，藉由添加佛波醇12肉豆蔻醯13乙酸酯(PMA)10uM使其分化為巨噬細胞。添加PMA的24小時後，準備不添加人類重組IL6組、添加10ng/ml之IL6組、添加50ng/ml之IL6組這3組，再於其等準備不添加、添加50ng/ml之STC1組，即準備3×2之6組。在該等條件下培養24小時後，進行西方墨點法、免疫沉澱法、PCR、甲基化特異性PCR、使用siRNA之特異性基因轉錄抑制。 ・動物實驗 在本實施例中，使用小鼠的經氣管投予博萊黴素(BLM)肺損傷模式。 具體而言，依照實施例1記載之方法，準備經氣管投予博萊黴素(BLM)肺損傷模式之小鼠，並在Day3及Day14，從各組各3隻的小鼠將肺取出。 ・西方墨點法之方法 將利用RIPA緩衝液之THP1細胞全萃取液或從小鼠取出的肺之萃取液經SDS-PAGE膠體電泳後，將細胞或組織來源之蛋白轉印於PVDF膜，並經一級抗體及HRP結合之二級抗體培育後，以呈色基質使其呈色，並以化學發光計測定蛋白的表現。 使用於西方墨點法的一級抗體如下。 抗STAT3抗體(Cell Signaling Technology公司(CST)，12640)、抗pSTAT3抗體(CST，9145)、抗SOCS1抗體(CST，3950)、抗IL6抗體(CST，12153)、抗JAK1抗體(CST，3344)、抗pJAK1抗體(CST，74129)抗體、抗泛素(Ubiquitin)抗體(CST，58395)、抗ACE2抗體(SantaCruz公司(SC)，390851)、抗TMPRSS2抗體(SC，515727)、抗β肌動蛋白抗體(R&D，MAB8929)。二級抗體係使用分別適合各動物種的HRP結合抗體。 ・免疫沉澱法之方法 使Protein A/G plus agarose(SC，2003)與抗JAK1抗體(SC，1677)結合後，添加利用RIPA緩衝液之THP1細胞全萃取液或從小鼠取出的肺之萃取液，藉此回收此等萃取液之JAK1及結合JAK1之蛋白。並藉由與還原液一同煮沸，將JAK1蛋白與結合JAK1之蛋白分離。 ・半定量PCR 使用RNeasy mini kit(QIAGEN)，從THP1細胞及小鼠肺組織分離出mRNA後，以high capacity cdna kit(applied biosystems)由mRNA逆轉錄作成cDNA。引子是使用primer blast(NCBI)來設計，並使用SYBR Green PCR Master Mix及ABI7500即時PCR系統(Applied Biosystems)進行半定量PCR。 ・甲基化特異性PCR 使用Methyl Primer Express軟體(Applied Biosystems)設計SOCS1基因啟動子區的甲基化及去甲基化引子。使用DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN)從THP1細胞萃取基因體DNA，並將其作亞硫酸氫鹽處理(Fujifilm-Wako，EpiSight^TM Bisulfite Conversion Kit Ver.2)，並使用甲基化特異性PCR用的聚合酶(Takara Episcope MSP kit)與ABI 7500 Real Time PCR system進行。 ・siRNA SOCS1特異性siRNA及控制組siRNA係使用Predesigned siRNA(Ambion)。轉染試劑係使用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)。

＜結果＞ (THP1細胞數據) 1)STC1強力抑制THP1細胞中的IL6誘導性之STAT3磷酸化 依上述方法，將添加IL6(10ng/ml)、IL6(50ng/ml)及/或STC1(50ng/ml)之THP1細胞以及不添加此等的THP1細胞(控制組)之細胞全萃取液，以西方墨點法測定其中有無STAT3及磷酸化STAT3，並將其結果顯示於圖9。如圖9所示，STC1抑制了IL6誘導之STAT3磷酸化。 即，STC1藉由抑制IL6誘導性之STAT3磷酸化，而對細胞激素症候群及各種自體免疫性疾病之治療有幫助。

2)STC1抑制THP1細胞中的IL6誘導性之IL6生成加強(IL6放大器) 依上述方法，將添加IL6(10ng/ml)、IL6(50ng/ml)及/或STC1(50ng/ml)之THP1細胞以及不添加此等的THP1細胞(控制組)之細胞全萃取液，以西方墨點法測定其中有無IL6，並將其結果顯示於圖10。如圖10所示，STC1抑制了IL6誘導之IL6生成加強(IL6放大器)。 即，STC1藉由抑制IL6誘導性之IL6放大(IL6放大器)，而對細胞激素症候群及各種自體免疫性疾病之治療有幫助。

3)STC1在THP1細胞中誘導SOCS1 依上述方法，將添加IL6(10ng/ml)、IL6(50ng/ml)及/或STC1(50ng/ml)之THP1細胞以及不添加此等的THP1細胞(控制組)，以西方墨點法測定其細胞全萃取液中的SOCS1(圖11A)、使用其細胞全萃取液mRNA並以半定量PCR法測定SOCS1 mRNA(圖11B)、使用其細胞全萃取液DNA並以甲基化特異性PCR法測定SOCS1基因啟動子區的甲基化程度(圖11C)，並顯示其結果。 如圖11A所示，STC1加強了SOCS1蛋白的生成。又，如圖11B所示，STC1加強了SOCS1之mRNA生成。如圖11C所示，STC1抑制了SOCS1基因啟動子區的甲基化。圖11A-C的結果皆意表STC1所致SOCS1蛋白之生成增強。 即，STC1藉由誘導具有抑制JAK作用的SOCS1，而對細胞激素症候群及各種自體免疫性疾病之治療有幫助。

4)STC1抑制在THP1細胞中JAK1之表現及磷酸化 依上述方法，將添加IL6(10ng/ml)、IL6(50ng/ml)及/或STC1(50ng/ml)之THP1細胞以及不添加此等的THP1細胞(控制組)之細胞全萃取液，以西方墨點法測定其中有無JAK1及磷酸化JAK1，並將其結果顯示於圖12。如圖12所示，STC1抑制了JAK1之表現及磷酸化。

5)STC1於IL6的存在下，促進THP1細胞中SOCS1與JAK1的結合，並促進JAK1的泛素化(免疫沉澱法) 依上述方法，將添加IL6(10ng/ml)、IL6(50ng/ml)及/或STC1(50ng/ml)之THP1細胞以及不添加此等的THP1細胞(控制組)進行原位鄰位連接分析(in situ proximity ligation assay)，並將其結果顯示於圖13A。在此分析中，僅於針對SOCS1的抗體與針對JAK1的抗體以1分子級距接近時，兩個抗體才會結合，紅色色素才能夠呈色(橘色螢光)。如圖13A所示，在添加STC1的組中橘色的呈色增加。即，圖13A顯示，將STC1添加於THP1細胞時，SOCS1分子與JAK1分子會結合(結合會增加)。 再者，將此等細胞全萃取液進行免疫沉澱法的結果顯示於圖13B。免疫沉澱法係使用THP1全細胞溶解物，並使用JAK1抗體與A/G瓊脂糖凝膠，將JAK1與結合JAK1之蛋白質回收，添加還原劑並煮沸後進行西方墨點法。又，除了使用SOCS1抗體或泛素抗體取代JAK1抗體之外，進行與上述同樣的操作。如圖13B所示，在IL6的存在之下，結合上JAK1之SOCS1會減少，但當STC1存在時，結合上JAK1之SOCS1會增加。據此，顯然也會促進JAK1的泛素化。即，STC1促進JAK1與SOCS1之結合，並增強JAK1的泛素化(JAK1的分解)。

6)STC1在THP1細胞中抑制IL6誘導之ACE2、TMPRSS2的表現。 依上述方法，將添加IL6(10ng/ml)、IL6(50ng/ml)及/或STC1(50ng/ml)之THP1細胞以及不添加此等的THP1細胞(控制組)之細胞全萃取液進行西方墨點法，並將其結果顯示於圖14。如圖14所示，STC1抑制了ACE2與TMPRSS2的表現。據此，STC1藉由抑制ACE2與TMPRSS2的表現，而有可能減少SARS-CoV2感染到細胞之機會。

7)STC1具SOCS1依存性地抑制ACE2、TMPRSS2之表現。 依上述方法，於添加IL6(10ng/ml)、IL6(50ng/ml)及/或STC1(50ng/ml)之THP1細胞以及不添加此等的THP1細胞(控制組)中使用siRNA抑制SOCS1，並將此狀況下的西方墨點法結果顯示於圖15。siCTR為控制組，顯示SOCS1同正常時的舉動。如圖15所示，STC1於THP1細胞誘導之ACE2、TMPRSS2誘導抑制效果，當使用siRNA將SOCS1減弱(knockdown)時會消失。由此可見，STC1之ACE2、TMPRSS2抑制作用具SOCS1依存性。 (動物模式：小鼠，經氣管投予博萊黴素肺損傷模式，肺發生發炎之狀態)

8)STC1抑制經氣管投予博萊黴素在小鼠肺所誘導之JAK1表現誘導、JAK1之磷酸化、ACE2、TMPRSS2表現上升。 依上述方法，對動物(C57BL6小鼠)經氣管投予生理食鹽水或溶解博萊黴素之生理食鹽水，對於經氣管投予溶解博萊黴素之生理食鹽水組，在次日經氣管投予生理食鹽水或溶解STC1之生理食鹽水，在3日後、14日後回收肺組織並進行西方墨點法，並將其結果顯示於圖16。如圖16所示，STC1抑制了由博萊黴素引起之發炎所致JAK1之磷酸化、STAT3之磷酸化、ACE2之表現上升、TMPRSS2之表現上升。據此，STC1之經氣管投予在抑制JAK/STAT3路徑時，同時抑制ACE2、TMPRSS2之表現。即，針對COVID19，藉由抑制細胞激素釋放症候群，並抑制ACE2、TMPRSS2之表現，而有抑制COVID19之感染及重症化的可能性。 於圖17彙整本次闡明之STC1作用機制。

圖1顯示實施例中小鼠的經氣管投予博萊黴素(BLM)肺損傷模式之概要。 圖2顯示實施例1之西方墨點法(Western Blotting)及定量PCR的結果。 圖3顯示STC1對粒線體的TCA循環及其周邊代謝造成影響之概要。 圖4顯示實施例2之西方墨點法的結果。 圖5顯示實施例2之半定量甲基化特異性PCR的結果。 圖6顯示實施例2中SMAD7蛋白的乙醯化程度之測定結果。 圖7顯示實施例3之蘇木精-伊紅染色的結果。 圖8於序列編號1顯示登錄為登錄編號NP_003146.1之人類STC1胺基酸序列。 圖9顯示實施例4-1)之西方墨點法的結果。 圖10顯示實施例4-2)之西方墨點法的結果。 圖11顯示實施例4-3)之西方墨點法(A)、半定量PCR(B)、半定量甲基化特異性PCR的結果。 圖12顯示實施例4-4)之西方墨點法的結果。 圖13顯示實施例4-5)之免疫沉澱法的結果。圖13A，原位鄰位連接分析(in situ proximity ligation assay)(SigmaAldrich)。使用共軛焦顯微鏡Leica TSP8拍攝。 圖14顯示實施例4-6)之西方墨點法的結果。 圖15顯示實施例4-7)之西方墨點法的結果。 圖16顯示實施例4-8)之動物實驗的結果。 圖17顯示在實施例中所闡明之見解之概念圖。

Claims (10)

1. 一種司坦尼氏降鈣素1(Stanniocalcin-1, STC1)之用途，係用於製造STAT3之磷酸化抑制劑。
2. 一種司坦尼氏降鈣素1之用途，係用於製造JAK之表現或磷酸化抑制劑。
3. 一種司坦尼氏降鈣素1之用途，係用於製造自體免疫疾病之預防或治療劑。
4. 一種司坦尼氏降鈣素1之用途，係用於製造流行性感冒病毒傳染病之預防或治療劑。
5. 一種司坦尼氏降鈣素1之用途，係用於製造冠狀病毒傳染病之預防或治療劑。
6. 如請求項5之用途，其中前述冠狀病毒具有能夠與ACE2結合之S蛋白質。
7. 如請求項5或6之用途，其中前述冠狀病毒係SARS相關冠狀病毒。
8. 一種司坦尼氏降鈣素1之用途，係用於製造ACE2及TMPRSS2之表現抑制劑。
9. 一種司坦尼氏降鈣素1之用途，係用於製造IL6AMP之抑制劑。
10. 如請求項1至6、8及9中任一項之用途，其中前述劑係吸入劑。

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