KR20230022002A - miR-16-5p 및 소마토스타틴 유사체를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소마토스타틴 수용체(SSTR) 발현을 조절하는 miR-16-5p 및 소마토스타틴 유사체를 포함하는, 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
상기 miR-16-5P가 소마토스타틴 수용체의 발현을 유도하고, 소마토스타틴 유사체가 소마토스타틴 수용체와 결합하여 종양의 성장을 억제함으로써 종양의 예방 및 치료효과가 크게 증진하고 내성에 강해지는 효과가 나타난다.

Description

miR-16-5p 및 소마토스타틴 유사체를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for preventing or treating tumors comprising miR-16-5p and somatostatin analogs}

본 발명은 miR-16-5p 및 소마토스타틴 유사체를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 소마토스타틴 수용체 2의 발현 증가를 통해 소마토스타틴 유사체의 항종양 활성을 증진시키는 miR-16-5p를 유효성분으로 포함하는 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

시상하부에서 생성되는 성장호르몬분비억제호르몬 (somatotropin release-inhibiting hormone)인 소마토스타틴 (somatostatin, SST)은 작은 폴리펩티드 호르몬으로, 주로 호르몬과 신경 전달 물질의 분비를 억제하여 내분비 기능을 조절하고, 종양 세포의 생존 및 혈관 신생을 조절하여 종양 성장을 억제한다. 소마토스타틴은 세포 표면에 존재하는 특정 G 단백질 결합 수용체인 소마토스타틴 수용체들 (somatostatin receptors, SSTR1-5)과 높은 친화력으로 결합한다.

한편, 특정 임상 증후군을 유발하는 호르몬을 분비하여 심각한 장애를 야기하고 삶의 질을 저하시키는 종양(예를 들어, 신경내분비종양 (neuroendocrine tumors, NET))과 관련하여 소마토스타틴 수용체 mRNA 및 단백질 발현 패턴은 광범위하게 연구되어 왔으며, 소마토스타틴 수용체는 잠재적인 종양 진단 및 치료용 표적으로 사용되었다.

옥트레오타이드(Octreotide)와 란레오타이드(lanreotide)와 같은 소마토스타틴 유사체 (SST analogs, SSA)는 자연 소마토스타틴에 비해 반감기가 상당히 증가된 유사체로, 임상 적용에 적합하다. 자연 소마토스타틴과 유사하게 소마토스타틴 유사체는 소마토스타틴 수용체에 결합하지만, 다양한 수용체에 대해 서로 다른 결합 친화성을 가진다. 예컨대, 옥트레오타이드와 란레오타이드는 소마토스타틴 수용체 2(SSTR2)에 높은 친화력으로 결합한 후 소마토스타틴 수용체 5(SSTR5)에 결합하여 억제 신호를 활성화시킨다.

따라서, 소마토스타틴 유사체의 항종양 효능과 소마토스타틴 수용체 2 발현 사이 양의 상관 관계가 존재한다. 그러나 소마토스타틴 수용체 발현을 향상시켜 항종양 효과를 증가시키는 메커니즘을 조사한 연구는 제한적이다.

소마토스타틴의 급성 투여는 다양한 억제 신호의 활성화를 유도하지만 소마토스타틴 유사체에 대한 초기 반응을 감소시킨다. 소마토스타틴 유사체에 지속적으로 노출되면 소마토스타틴 유사체의 분해, 내재화 및 인산화와 같은 과정을 통해 초기 약물 효과가 감소한다. (J Biol Chem. 1997; 272(39):24448-54.)

MicroRNA (miRNA)는 21 ~ 25 개의 뉴클레오티드로 구성된 비코딩 RNA의 한 종류로서, miRNA는 다양한 신호 전달 경로의 조절 및 세포 증식, 분화, 생존 및 대사를 포함한 여러 생물학적 기능과 밀접한 관련이 있다. miRNA는 상보적인 표적 mRNA에 결합하여 기능하고, mRNA 번역 억제 또는 분해를 초래한다.

최근에 성장 호르몬을 분비하는 뇌하수체 선종에서 소마토스타틴 유사체 반응자와 비반응자 간에 다르게 발현되는 miRNA가 확인되었다. (Diagn Pathol. 2010; 5:79.)

그러나, 현재 소마토스타틴 수용체 2 발현의 miRNA 매개 제어의 효과와 종양에서의 소마토스타틴 약물 감도에 대한 후속 효과에 대해서는 추가적인 연구가 필요한 실정이다.

예컨대, 종래 신경내분비종양 (neuroendocrine tumors, NET)의 치료제인 옥트레오타이드 (octreotide)는 소마토스타틴 수용체 (somatotropin receptor)와 결합하여 종양의 성장을 억제하나, 환자에 따라 소마토스타틴 수용체의 발현이 감소되어 있어 치료 효과가 감소하는 문제점이 존재하였다.

따라서, 본 발명자들은 소마토스타틴 유사체에 대한 치료 효과가 감소되어 있는 환자에도 효과적으로 작용할 수 있는 신규한 종양 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, miR-16-5p가 소마토스타틴 수용체의 발현을 증가시키고 소마토스타틴 유사체의 반응성을 개선할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

Hofland LJ, Lamberts SW. The pathophysiological consequences of somatostatin receptor internalization and resistance. Endocr Rev. 2003; 24(1):28-47. Epub 2003/02/18. https://doi.org/10.1210/er. 2000-0001 PMID: 12588807. Mao ZG, He DS, Zhou J, Yao B, Xiao WW, Chen CH, et al. Differential expression of microRNAs in GHsecreting pituitary adenomas. Diagn Pathol. 2010; 5:79. Epub 2010/12/09. https://doi.org/10.1186/1746-1596-5-79 PMID: 21138567; PubMed Central PMCID: PMC3017030.

본 발명의 목적은 miR-16-5p 및 소마토스타틴 유사체를 포함하는 신종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 종양의 예방 또는 치료를 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miR-16-5p 및 소마토스타틴 유사체(SST analogs, SSA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 소마토스타틴 유사체는 옥트레오타이드(Octreotide)와 란레오타이드(lanreotide) 및 파시레오타이드 (Pasireotide)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 종양은 소마토스타틴 수용체 2가 발현하는 암, 신경내분비종양(neuroendocrine tumor), 소세포폐암(small cell lung cancer), 유방암(breast cancer, prostate cancer), 전립선암(prostate cancer) 또는 결직장암(colorectal carcinoma)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-16-5p는 pri-miRNA, precursor miRNA, 플라스미드 형태의 miRNA 및 mature miRNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-16-5p는 miR-16-5p 유도체인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-16-5p는 내에서 자연적으로 만들어진 것을 분리하여 주입하거나, 세포 내에서 상기 miR-16-5p의 생성을 유도할 수 있고, 인공적으로 합성한 후 생체 내 주입할 수도 있을 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-16-5p 유도체는 (i) RNA 인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)를 다른 원소(예컨대 황 등)로 치환한 형태인 포스포로사이오에이트 (phosphorothiolate) 구조를 부분적으로 포함하거나 (ii) RNA가 DNA, PNA(petide nucleic acids) 및/또는 LNA(locked nucleic acid) 분자로 전체 또는 부분적으로 치환되어 있거나 RNA 내 당의 2' 수산화기가 기능성 구조(예컨대 메틸화, 메톡시화, 플르오르화)로 치환되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-16-5p는 소마토스타틴 수용체 2의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 종양이 있는 옥트레오타이드 비반응 환자에서 항종양 활성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 (i) 옥트레오타이드에 대한 내성 및/또는 (ii) 소마토스타틴 수용체 발현이 감소되어 있는 환자에서 항종양 활성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한 (a) 환자로부터 분리된 샘플로부터 옥트레오타이드 반응성을 측정하는 단계 (b) 상기 반응성을 정상 대조군의 옥트레오타이드 반응성과 비교하는 단계 및 (c) 상기 환자의 옥트레오타이드에 대한 반응성이 정상 대조군의 옥트레오타이드에 대한 반응성과 비교하여 감소되어 있는 경우, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물 투여가 적합한 환자로 평가하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료를 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 환자는 (i) 옥트레오타이드에 대한 내성; 및/또는 (ii) 소마토스타틴 수용체 발현이 감소되어 있는 환자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 따른 miR-16-5p 및 소마토스타틴 유사체 (예를 들어, 옥트레오타이드)를 포함하는 약학적 조성물은 소마토스타틴 수용체 2의 발현을 상향 조절하여 소마토스타틴 유사체에 대한 감수성을 증진시키는 바, 소마토스타틴 유사체 치료에 반응성이 감소되어 있는 종양 환자 또는 소마토스타틴 수용체 발현이 감소되어 있는 종양 환자에서 항종양 효과를 향상시켜, 종래 치료 효과가 발휘되지 않는 소마토스타틴 유사체 비반응 환자에의 적용이 가능한 장점이 있다.

도 1은 INS-1 세포에서 옥트레오타이드(octreotide) 처리 후 소마토스타틴 수용체 2(SSTR2)의 발현을 나타내는 결과이다. 도 1A는 INS-1 세포를 1 μmol/ L 옥 트레오타이드와 함께 배양하고, 표시된 시간 후 소마토스타틴 수용체 2 및 β액틴 수준을 웨스턴 블롯팅으로 분석한 것이다. 도 1B는 INS-1 세포를 24-웰플레이트의 커버슬립(coverslips in 24-well plates)에 플레이팅하고, 익일 상기 세포를 표시된 시간 동안 1 μmol/L 옥트레오타이드와 함께 배양한 후 세포를 고정하고 소마토스타틴 수용체 2 단백질의 면역형광 염색한 것이다. (스케일 바: 20μm)
도 2는 miRNA 발현을 마이크로어레이 (Microarray)로 분석한 결과이다. 도 2A는 miRNA 프로파일링을 통해 차등적으로(differentially) 발현된 miRNA의 수를 나타내고, 도 2B는 miRNA 프로파일링을 통해 차등적으로 발현된 miRNA의 프로파일을 나타낸다. 빨간색은 유의하게 상향 조절된 miRNA를, 녹색은 하향 조절된 miRNA를 나타낸다. 도 2C는 1μmol/L 옥트레오타이드와 함께 배양한 INS-1 세포에서 표시된 배양 시간 후 total RNA를 분리 한 후, miR-16-5p 수준을 qRT-PCR로 측정한 결과를 나타내고, 도 2D는 1μmol/L 옥트레오타이드와 함께 배양한 GH3 세포에서 표시된 배양 시간 후 total RNA를 분리 한 후, miR-16-5p 수준을 qRT-PCR로 측정한 결과를 나타낸다. 대조군 miRNA (U87)를 사용하여 2^-△△Ct 방법으로 input RNA에 대해 정규화했으며, 각 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. (*p <0.05, **p <0.01)
도 3은 INS-1 세포에서 miR-16-5p mimic 또는 억제제 처리 후 소마토스타틴 수용체 2(SSTR2)의 발현을 나타내는 결과이다. INS-1 세포를 50 또는 100pmol의 mimic miR-16-5p 또는 대조군 miRNA의 으로 형질 감염시켰다. 도 3A는 형질 감염 후 48 시간에 RT-qPCR로 miR-16-5p 수준을 측정한 결과를 나타낸다. 표적 유전자의 miRNA 발현은 내인성 대조군 miRNA(U87)를 사용하여 2^-△△Ct방법으로 계산하여 입력 RNA에 대해 정규화하였다. 도 3B는 웨스턴 블롯팅으로 소마토스타틴 수용체 2, phospho-ERK (Thr202 / Tyr204), ERK 및 β액틴 수준을 분석한 결과를 나타낸다. 도 3C는 INS-1 세포를 24-웰플레이트의 커버슬립에(coverslips in 24-well plates) 플레이팅하고, 100pmol의 mimic miR-16-5p 또는 대조군 miRNA로 형질 감염시키고, 48 시간 후 세포를 고정한 후 소마토스타틴 수용체 2 단백질의 면역 형광 염색한 결과를 나타낸다. (스케일 바: 20 μm) 도 3D는 IMT i-Solution Industrial Image Analysis Software를 사용하여 측정한 소마토스타틴 수용체 2의 형광 강도를 나타낸다. 도 3E는 INS-1 세포를 1 또는 10 nmol/ L의 miR-16-5p 억제제 또는 음성 대조군으로 처리하고, 24 시간 후 qRT-PCR에 의해 miR-16-5p 수준은 측정한 결과를 나타낸다. 도 3F는 웨스턴 블롯팅으로 소마토스타틴 수용체 2, phospho-ERK (Thr202 / Tyr204), ERK 및 β액틴 수준을 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 mimic miR-16-5p와 함께 옥트레오타이드를 처리 후, INS-1 세포에서 소마토스타틴 수용체 2 발현의 상향 조절을 확인한 결과이다. 도 4A는 INS-1 세포를 100 pmol의 mimic miR-16-5p 또는 대조군 miRNA로 24 시간 동안 형질 감염시킨 다음 표시된 기간 동안 1 μmol / L 옥트레오타이드로 처리한 후 세포를 고정하고 소마토스타틴 수용체 2 단백질의 면역 형광 염색한 결과를 나타낸다. (스케일 바: 20 μm) 도 4B는 IMT i-Solution Industrial Image Analysis Software로 측정한 소마토스타틴 수용체 2의 형광 강도를 나타낸다.
도 5는 mimic miR-16-5p와 함께 옥트레오타이드를 처리 후, INS-1 세포의 옥트레오타이드에 대한 민감도를 확인한 결과이다. 도 5A는 INS-1 세포를 2.5 pmol의 mimic miR-16-5p 또는 대조군 miRNA로 24 시간 동안 형질 감염시키고 표시된 농도의 옥트레오타이드로 24 시간 동안 처리한 결과를 나타낸다. 세포 증식은 CCK-8 분석으로 측정하였다. 도 5B는 mimic miR-16-5p 또는 대조군 형질 감염된 INS-1 세포의 스페로이드(Spheroids)를 옥트레오타이드로 48시간 동안 처리한 결과를 나타낸다. 6개의 스페로이드의 증식은 CellTiter-Glo13D Cell Viability Assay에 의해 측정하였다. 각 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ±SD를 나타낸다. (*p <0.05, **p <0.01)
도 6은 INS1 및 GH3 세포에서 소마토스타틴 수용체 2의 발현을 나타내는 결과이다. 도 6A는 INS1 및 GH3 세포를 커버슬립에 플레이팅하고, 24시간 후 세포를 고정한 후 소마토스타틴 수용체 2 단백질의 면역형광 염색한 결과이고, 도 6B는 DAPI로 대조 염색한 결과이다.
도 7은 사람의 소마토스타틴 수용체 2 (human somatostatin receptor 2, hSSTR2)가 형질 감염된 HeLa 세포에서 has-miR-16-5p 억제제 처리 후 소마토스타틴 수용체 2의 발현을 확인한 결과이다. HeLa 세포를 1㎍의 hSSTR2 또는 대조군 플라스미드로 24시간 동안 형질감염시킨 다음, 표시된 농도의 has-miR16-5p 억제제로 처리하였다. 도 7A는 세포를 고정하고 소마토스타틴 수용체2 단백질의 면역형광 염색한 결과를 나타낸다 (스케일 바: 50μm). 도 7B는 24시간 처리 후 qRT-PCR로 측정한 has-miR-16-5p의 발현 수준을 나타낸다. 각 데이터는 3 회의 독립적인 실험의 평균± SD 를 나타낸다.
도 8은 INS1 세포에서 miR-16-5p 처리 후 ARRB1의 발현을 확인한 결과이다. 도 8A는 Ins1 세포를 mimic miR-16-5p 또는 대조군으로 형질 감염시키고 24시간 처리 후 qRT-PCR로 측정한 ARRB1 발현 수준을 나타낸다. 도 8B는 도8A의 Ins1 세포를 miR16-5p 억제제 또는 대조군으로 처리하고, 24시간 후 qRT-PCR로 측정한 ARRB1 발현 수준을 나타낸다. 각 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균± SD를 나타낸다.
도 9는 표시된 조건으로 옥트레오타이드와 mimic miR-16-5p를 처리 후 INS1 세포의 Annexin V-APC/propidium iodide (PI) 이중 염색에 의한 세포 사멸 분석 결과이다. 2색 유세포 분석 도트 플롯(Two-color flow cytometry dot plots)은 annexin V 및 PI에 모두 음성(negative)으로, 살아있는 세포의 백분율을 보여준다. 초기 세포사멸 세포는 Annexin V-양성 및 PI-음성이었고, 후기 세포사멸/괴사 세포는 이중 양성 세포였다.
도 10은 INS-1 세포를 100pmol의 mimic miR-16-5p 또는 대조군 miRNA로 24시간 동안 형질감염시키고 24시간 동안 10nmol/L 옥트레오타이드를 처리한 결과이다. 스페로이드(Spheroids)를 4℃에서 밤새 4% PFA로 고정한 후 소마토스타틴 수용체 2 단백질의 면역형광 염색을 하였다. (스케일 바: 100μm)

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

소마토스타틴 유사체(SST analogs, SSA)는 종양 치료, 호르몬 분비 억제 또는 종양 수축 촉진에 사용된다.

한편, 신경내분비종양에서 소마토스타틴 수용체의 부재 또는 낮은 발현은 소마토스타틴 유사체에 대한 신경내분비종양 내성의 주요 원인이 되지만, 소마토스타틴 유사체와 관련한 miRNA의 발현 패턴 및 소마토스타틴 유사체에 대한 초기 반응 동안 miRNA의 조절장애에 대해서는 현재까지 알려진 바가 거의 없다.

이에 본 발명에서는 miRNA 프로파일링을 통해 소마토스타틴 유사체인 옥트레오타이드 처리에 대한 초기 반응과 관련된 miRNA를 확인하였고, 그 결과 miR-16-5p 수준의 조절이 소마토스타틴 수용체 2 발현 및 소마토스타틴 유사체에 대한 세포 민감성에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.

구체적으로, miR-16-5p의 발현이 소마토스타틴 수용체 2 발현의 조절과 관련성 여부 및 INS-1 세포에서 miR-16-5p 발현이 옥트레오타이드 민감도에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여 in vitro 실험을 진행하였다. 형질 감염된 소마토스타틴 유사체에 의한 miR-16-5p의 과발현은 소마토스타틴 수용체 2 발현의 상향 조절을 유도하였다. 또한, miR-16-5p의 발현은 INS-1 세포의 2차원 및 3차원 배양 모두에서 세포 증식을 유도하는 옥트레오타이드 비반응성을 개선시켰다.

단기간동안 소마토스타틴 유사체로 세포를 처리한 후 miRNA 발현 패턴을 확인하였고, 옥트레오타이드와 짧은 인큐베이션 후 KEGG 분석을 통해 항종양 효과와 관련된 miRNA의 상향 조절을 확인하였다.

9개의 경로와 관련된 30개의 차등적으로 발현된 miRNA를 확인할 수 있었다. 그 중 "암 관련 마이크로RNA" 및 "MAPK 신호 전달 경로"가 가장 두드러졌다. 소마토스타틴 수용체를 통한 소마토스타틴 유사체의 세포 증식 억제는 ERK/MAPK 경로의 제어를 포함한 여러 신호 전달 경로를 포함하였다. miR-16-5p에 의한 소마토스타틴 수용체 2의 상향 조절에 의한 ERK/MAPK 경로 활성화의 유도는 miR-16-5p에 의한 소마토스타틴 수용체 2의 조절이 다운스트림 신호 전달(downstream signaling)에 영향을 미친다는 것을 시사한다.

따라서 본 발명자들은 소마토스타틴 수용체 2 발현의 조기 조절과 옥트레오타이드의 항종양 효과 모두에 관여하는 miRNA를 확인할 수 있었다.

소마토스타틴 수용체 2의 내재화와 세포 내 교환은 소마토스타틴 수용체 탈감작화에 관여한다. 면역염색 결과, miR-16-5p의 과발현은 대조군과 비교하여 옥트레오타이드에 노출된 상태에서 기초(basal) 소마토스타틴 수용체 2 발현의 증가 뿐만 아니라 소마토스타틴 수용체 2의 내재화를 유도할 수 있었다. 실제로, INS-1 세포의 miR-16-5p 조절은 Arrb1 mRNA의 수준에도 영향을 미쳤으며, 이는 miR-16-5p가 SSTR2 내재화 및 탈감작에 관여함을 시사한다 (도 8).

본 발명에서는 종양 세포에서 소마토스타틴 수용체 2의 발현을 조절하는 miR-16-5p의 새로운 역할을 확인하고 miR-16-5p의 상향 조절이 INS-1 세포에서 소마토스타틴 유사체의 감수성을 향상시켜 종양 치료를 위한 새로운 조합 요법으로 miR-16-5p와 소마토스타틴 유사체를 사용할 가능성을 확인하였다. 또한, 소마토스타틴 유사체 치료 후 소마토스타틴 수용체 2의 탈감작 및 하향 조절이 임상적으로 중요한 바, 종양 환자에서 miR-16-5p를 통해 소마토스타틴 수용체 발현을 조절하는 능력은 종양 예방 및 치료에 임상적으로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 miR-16-5p 및 소마토스타틴 유사체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 함체와 함께 제제화 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 소마토스타틴 유사체는 옥트레오타이드, 란레오타이드, 및 파시레오타이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 종양은 소마토스타틴 수용체 2가 발현하는 암, 신경내분비종양(neuroendocrine tumor), 소세포폐암(small cell lung cancer), 유방암(breast cancer, prostate cancer), 전립선암(prostate cancer) 또는 결직장암(colorectal carcinoma)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-16-5p는 pri-miRNA, precursor miRNA, 플라스미드 형태의 miRNA 및 mature miRNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-16-5p는 miR-16-5p 유도체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 miR-16-5p는 내에서 자연적으로 만들어진 것을 분리하여 주입하거나, 세포 내에서 상기 miR-16-5p의 생성을 유도할 수 있고, 인공적으로 합성한 후 생체 내 주입할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-16-5p 유도체는 (i) RNA 인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)를 다른 원소(예컨대 황 등)로 치환한 형태인 포스포로사이오에이트 (phosphorothiolate) 구조를 부분적으로 포함하거나; (ii) RNA가 DNA, PNA(petide nucleic acids) 및/또는 LNA(locked nucleic acid) 분자로 전체 또는 부분적으로 치환되어 있거나; RNA 내 당의 2' 수산화기가 기능성 구조(예컨대 메틸화, 메톡시화, 플르오르화)로 치환되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-16-5p는 소마토스타틴 수용체 2의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 신경내분비종양이 있는 옥트레오타이드 비반응 환자에서 항종양 활성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 “항종양 활성”은 “항종양 효과의 증진”과 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 일 양태로서 본 발명에 따른 miRNA의 사용에 의한 항종양 효과의 증진은 옥트레오타이드 단독 사용에 비해 항종양 활성이 증가하였음을 의미할 수 있으며, 특히 옥트레오타이드 비반응성 환자에 있어서, 옥트레오타이드의 치료 효과를 발휘시키거나 낮은 치료 효과를 추가로 향상시킬 수 있음을 의미할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 항종양 효과의 증진은, 옥트레오타이드 단독 사용에 비해 항종양 효과가 10 내지 500%, 예컨대, 10% 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450% 또는 500% 이상 증진된 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 (i) 옥트레오타이드에 대한 내성; 및/또는 (ii) 소마토스타틴 수용체 발현이 감소되어 있는 환자에서 항종양 활성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서 “소마토스타틴 수용체 발현이 감소”되었다는 것은 소마토스타틴 수용체가 전혀 발현되지 않거나, 옥트레오타이드 반응 환자에 비해 소마토스타틴 수용체 발현량이 감소된 것을 의미한다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 환자로부터 분리된 샘플로부터 옥트레오타이드 반응성을 측정하는 단계, (b) 상기 반응성을 정상 대조군의 옥트레오타이드 반응성과 비교하는 단계 및 (c) 상기 환자의 옥트레오타이드에 대한 반응성이 정상 대조군의 옥트레오타이드에 대한 반응성과 비교하여 감소되어 있는 경우, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물 투여가 적합한 환자로 평가하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료를 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 환자는 (i) 옥트레오타이드에 대한 내성 및/또는 (ii) 소마토스타틴 수용체 발현이 감소되어 있는 환자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 용어 “예방”은 질병을 축소시키는 방지(averting), 지연(delaying), 방해(impeding) 또는 저해(hindering)와 관련된 것이다.

본 발명에서 용어 “치료”는 질병의 증상을 개선, 치유 또는 감소 또는 질병의 진행을 감소 또는 정지시키기 위해 질병에 걸린 피험자를 돌보는 것과 관련된 것이다..

본 발명에서, 용어 “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”은 본 발명에 따른 miR-16-5p 및/또는 옥트레오타이드 또는 이의 허용 가능한 염에 희석제 또는 담체와 같은 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 혼합물을 의미한다. 약학적 조성물은 치료 용도를 위한 조성물뿐만 아니라 화장품 조성물을 포함한다. 일부 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 그 필요에 따라 대상체에게 투여하는 방법이 제공되어 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물은 인간에게 투여할 수 있다.

본 발명에서, 약학적 조성물의 설명은 원칙적으로 인간에게 투여하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이지만, 통상의 기술자는 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물에게 투여하기 적합함을 이해하게 될 것이다. 다양한 동물에게 투여하기 위한 약학적 조성물의 변형을 잘 이해하고, 숙련된 수의학 약리학자는 필요하다면 단순히 통상적인 실험으로 이러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다.

본 발명에서, 약학적 조성물은 약리학 분야에 알려져 있거나 이후 내용에서 전개되는 임의의 방법에 의해 제조될 수도 있다. 일반적으로, 이러한 정제용 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 연관시키는 단계를 포함하고, 이어서 필요하거나 원하는 경우 생성물을 원하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.

본 발명에서, 약학적 조성물은 단일 단위 용량 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조, 포장, 및/또는 포장하지 않은 채로 판매될 수도 있다. 본원에서 사용하는 바와 같이, "단위 용량"은 사전 설정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 개별적인 양이다. 활성 성분의 양은 대상체에게 투여되는 활성 성분의 투여량 및/또는 그러한 투여량의 편리한 분획 예컨대 투여량의 1/2 또는 1/3과 일반적으로 동일하다.

본 발명에서, 약학적 조성물 내 활성 성분, 제약상 허용되는 부형제, 및/또는 임의의 추가 성분의 상대량은 치료 대상체의 동일성, 크기, 및/또는 장애에 따라 그리고 조성물이 투여되는 경로에 따라 변할 것이다. 예로서, 조성물은 0.1％ 내지 100％ (w/w) 활성 성분을 포함할 수도 있다.

본 발명에서, 제약상 허용되는 부형제는 특정한 투여 형태 목적에 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 다른 액체 비히클, 분산액 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함한다. 레밍턴(Remington)의 문헌[The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD, 2006]은 약학적 조성물 조제에 사용된 다양한 부형제 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 개시한다. 임의의 통상적인 담체 배지가 예컨대 임의의 원하지 않는 생물학적 효과를 제공하거나 다르게는 약학적 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용함으로써 물질 또는 그 유도체와 공존할 수 없는 것을 제외하고, 그 용도는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려한다. 제약상 허용되는 부형제는 적어도 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 순수하다.

상기 부형제는 인간 및 수의학적 용도에서 승인되어 있다. 일부 실시예에서, 부형제는 미국식품의 약품국에 의해 승인되어 있다. 일부 실시예에서, 부형제는 제약 등급이다. 일부 실시예에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전, 및/또는 국제 약전(EP)의 표준을 충족한다.

일부 실시예에서, 부형제는 인간 및 수의학적 용도에서 승인되어 있다. 일부 실시예에서, 부형제는 미국식품의 약품국에 의해 승인되어 있다. 일부 실시예에서, 부형제는 제약 등급이다. 일부 실시예에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전, 및/또는 국제 약전(EP)의 표준을 충족한다.

약학적 조성물의 제조에 사용된 제약상 허용되는 부형제는 불활성 희석제, 분산제 및/또는 과립화제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 보존제, 완충제, 윤활제, 및/또는 오일을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

이러한 부형제는 임의로 본 발명의 제제에 포함될 수도 있다. 부형제 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스, 착색제, 코팅제, 감미제, 향미제, 및 퍼퓸제는 조제사의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.

예시적인 희석제는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 인산칼슘, 인산이칼슘, 황산칼슘, 칼슘 히드로겐 포스페이트, 인산나트륨 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 염화나트륨, 건조 전분, 옥수수 전분, 분말형 당, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 과립화제 및/또는 분산제는 감자 전분, 옥수수 전분, 타피오카 전분, 소듐 스타치 글리콜레이트, 점토, 알긴산, 구아 검, 시트러스 펄프, 한천, 벤토나이트, 셀룰로스 및 목재 생성물, 천연 스폰지, 양이온-교환 수지, 탄산칼슘, 규산염, 탄산나트륨, 가교-결합형 폴리(비닐-피롤리돈) (크로스포비돈), 소듐 카르복시메틸전분 (소듐 스타치 글리콜레이트), 카르복시메틸 셀룰로스, 가교-결합형 소듐 카르복시메틸 셀룰로스 (크로스카르멜로스), 메틸셀룰로스, 예비젤라틴화 전분 (전분 1500), 미세결정질 전분, 수불용성 전분, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로스, 규산알루미늄마그네슘 (비검), 소듐 라우릴 술페이트, 4급 암모늄 화합물, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 표면 활성제 및/또는 유화제는 천연 유화제 (예를 들어 아카시아, 한천, 알긴산, 알긴산나트륨, 트라가칸트, 촌드럭스(chondrux), 콜레스테롤, 크산탄, 펙틴, 젤라틴, 난황, 카세인, 양모 지방, 콜레스테롤, 왁스, 및 레시틴), 콜로이드성 점토 (예를 들어 벤토나이트 [규산알루미늄] 및 비검 [규산알루미늄마그네슘]), 장쇄 아미노산 유도체, 고분자량 알콜 (예를 들어 스테아릴 알콜, 세틸 알콜, 올레일 알콜, 트리아세틴 모노스테아레이트, 에틸렌 글리콜 디스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 및 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리비닐 알콜), 카르보머 (예를 들어 카르복시 폴리메틸렌, 폴리아크릴산, 아크릴산 중합체, 및 카르복시비닐 중합체), 카라기난, 셀룰로스 유도체 (예를 들어 카르복시메틸셀룰로스 소듐, 분말화 셀룰로스, 히드록시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스), 소르비탄 지방산 에스테르 (예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 [트윈 20], 폴리옥시에틸렌 소르비탄 [트윈 60], 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 [트윈 80], 소르비탄 모노팔미테이트 [스팬 40], 소르비탄 모노스테아레이트 [스팬 60], 소르비탄 트리스테아레이트 [스팬 65], 글리세릴 모노올레에이트, 소르비탄 모노올레에이트 [스팬80]), 폴리옥시에틸렌 에스테르 (예를 들어 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트 [미르즈 45], 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자 오일, 폴리에톡실화 피마자 오일, 폴리옥시메틸렌 스테아레이트, 및 솔루톨), 수크로스 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르 (예를 들어 크레모포르), 폴리옥시에틸렌 에테르, (예를 들어 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 [브리즈 30]), 폴리(비닐-피롤리돈), 디에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 올레산나트륨, 칼륨 올레에이트, 에틸 올레에이트, 올레산, 에틸 라우레이, 소듐 라우릴 술페이트, 플루로닉 F 68, 폴록사머 188, 세트리모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 벤즈알코늄클로라이드, 도큐세이트 소듐, 및/또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 결합제는 전분 (예를 들어 옥수수 전분 및 전분 페이스트); 젤라틴; 당 (예를 들어 수크로스, 글루코스, 덱스트로스, 덱스트린, 당밀, 락토스, 락티톨, 만니톨); 천연 및 합성 검 (예를 들어 아카시아, 알긴산나트륨, 아이리쉬 모스의 추출물, 판워 검, 섀티 검, 이사폴 후스크스의 점액, 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리(비닐-피롤리돈), 규산알루미늄마그네슘 (비검), 및 라치 아라보갈락탄); 알기네이트; 폴리에틸렌 옥시드; 폴리에틸렌 글리콜; 무기 칼슘 염; 규산; 폴리메타크릴레이트; 왁스; 물; 알콜; 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 보존제는 항산화제, 킬레이트화제, 항미생물 보존제, 항진균 보존제, 알콜 보존제, 산성 보존제, 및 다른 보존제를 포함할 수도 있다. 예시적인 항산화제는 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 모노티오글리세롤, 메타중아황산칼륨, 프로피온산, 프로필 갈레이트, 아스코르브산나트륨, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 및 아황산나트륨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 킬레이트화제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 시트르산 1수화물, 이나트륨 에데테이트, 이칼륨 에데테이트, 에데트산, 푸마르산, 말산, 인산, 소듐 에데테이트, 타르타르산, 및 트리소듐 에데테이트를 포함한다. 예시적인 항미생물 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 브로노폴, 세트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로크실레놀, 크레졸, 에틸 알콜, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알콜, 페닐질산수은 (phenylmercuric nitrate), 프로필렌 글리콜, 및 티메로살을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 항진균 보존제는 부틸 파라벤, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 히드록시벤조산, 칼륨 벤조에이트, 소르브산칼륨, 벤조산나트륨, 프로피온산나트륨, 및 소르브산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 알콜 보존제는 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 페놀, 페놀계 화합물, 비스페놀, 클로로부탄올, 히드록시벤조에이트, 및 페닐에틸 알콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 산성 보존제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 베타-카로틴, 시트르산, 아세트산, 데히드로아세트산, 아스코르브산, 소르브산, 및 피트산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 보존제는 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 데테록시메 메실레이트, 세트리미드, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔드 (BHT), 에틸렌디아민, 소듐 라우릴 술페이트 (SLS), 소듐 라우릴 에테르 술페이트 (SLES), 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 칼륨 술파이트, 메타중아황산칼륨, 글리단트 플러스, 페노닙, 메틸파라벤, 저몰 115, 게르마벤 II, 네올론, 카톤, 및 에욱실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시예에서, 보존제는 항-산화제이다. 다른 실시예에서, 보존제는 킬레이트화제이다.

예시적인 완충제는 시트레이트 완충 용액, 아세테이트 완충 용액, 포스페이트 완충제 용액, 염화암모늄, 탄산칼슘, 염화칼슘, 칼슘 시트레이트, 칼슘 글루비오네이트, 칼슘 글루셉테이트, 칼슘 글루코네이트, D-글루콘산, 글리세로인산칼슘, 락트산칼슘, 프로판산, 칼슘 레불리네이트, 펜탄산, 이염기성 인산칼슘, 인산, 삼염기성 인산칼슘, 수산화칼슘 포스페이트, 아세트산칼륨, 염화칼륨, 글루콘산칼륨, 칼륨 혼합물, 이염기성 인산칼륨, 일염기성 인산칼륨, 인산칼륨 혼합물, 아세트산나트륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 락트산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 일염기성 인산나트륨, 인산나트륨 혼합물, 트로메타민, 수산화마그네슘, 수산화알루미늄, 알긴산, 피로겐-자유수, 등장성 염수, 링거(Ringer's) 용액, 에틸 알콜, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 윤활제는 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 스테아르산, 실리카, 활석, 맥아, 글리세릴 베하네이트, 수소화 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 류신, 마그네슘 라우릴 술페이트, 소듐 라우릴 술페이트, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 오일은 아몬드, 살구 커넬, 아보카도, 바바수야자, 베르가모트, 흑색 커런트 종자, 보리지, 케이드, 카모마일, 카놀라, 카라웨이, 카르나우바, 카스토르, 시나몬, 코코아 버터, 코코넛, 대구 간, 커피, 옥수수, 목화 종자, 에뮤, 유칼립투스, 달맞이꽃, 생선, 아마 씨, 게라니올, 호박, 포도 종자, 개암, 히솝, 이소프로필 미리스테이트, 호호바, 쿠쿠이 넛, 라반딘, 라벤더, 레몬, 리트세아 쿠베바, 마카데미아 넛, 아욱, 망고 종자, 메도우폼 종자, 밍크, 넛멕, 올리브, 오렌지색의 오렌지색 라피, 팜, 팜핵, 복숭아 커넬, 땅콩, 양귀비 종자, 호박 종자, 평지씨, 쌀겨, 로즈마리, 홍화, 샌달우드, 사스쿠아나, 세이보리, 산자나무, 참깨, 시어 버터, 실리콘, 대두, 해바라기, 티트리, 엉겅퀴, 쓰바키, 베티버, 호두, 및 밀 배아 오일을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 오일은 부틸 스테아레이트, 카프릴산 트리글리세리드, 카프르산 트리글리세리드, 시클로메티콘, 디에틸 세바케이트, 디메티콘 360, 이소프로필 미리스테이트, 미네랄 오일, 옥틸도데칸올, 올레일 알콜, 실리콘 오일, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

경구 및 비경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 제약상 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 활성 성분 외에, 액체 투여 형태는 본 기술분야에 공동으로 사용된 불활성 희석제 예컨대, 예를 들어, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일 (특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 싹, 올리브, 아주까리, 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 소르비탄의 폴리에틸렌 글리콜 및 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 포함할 수도 있다. 불활성 희석제 외에, 경구 조성물은 아주반트 예컨대 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미제, 및 퍼퓸제를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 miR-16-5p 및/또는 옥트레오타이드 또는 이의 허용 가능한 염은 가용화제 예컨대 크레모포르, 알콜, 오일, 변성 오일, 글리콜, 폴리소르베이트, 시클로덱스트린, 중합체, 및 이들의 조합과 혼합된다.

주사가능한 제제, 예를 들어, 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액은 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 기술 분야에 따라 조제될 수도 있다. 멸균 주사가능한 제제는 비독성 비경구 허용되는 희석제 또는 용매, 예를 들어, 1,3-부탄디올 내 용액에서의 멸균 주사가능한 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수도 있다. 허용되는 비히클 및 용매 중에서 채택될 수도 있는 것은 물, 링거(Ringer's) 용액, U.S.P. 및 등장성 염화나트륨용액이다. 또한, 멸균, 고정 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 채택되고 있다. 이를 위하여 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 무자극 고정 오일이 채택될 수 있다. 또한, 지방산 예컨대 올레산이 주사제의 제조에 사용되고 있다.

주사가능한 제제는 예를 들어 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해, 또는 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사가능한 배지에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태인 멸균제를 포함시킴으로써 멸균될 수 있다.

약물의 효과를 연장하기 위하여, 흔히 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 느리게 하는 것이 바람직하다. 이는 낮은 수용해도를 갖는 결정질 또는 무정형 물질의 액체 현탁액을 사용함으로써 이루어진다. 그러면 약물의 흡수율은 결국 결정 크기 및 결정질 형태에 좌우될 수 있는 용해율에 좌우된다. 대안으로, 비경구 투여 약물의 지연된 흡수는 오일 비히클에서 약물을 용해 또는 현탁화함으로써 이루어진다.

본 발명에 따른 miR-16-5p 및/또는 옥트레오타이드 또는 이의 허용 가능한 염의 국소 및/또는 경피 투여를 위한 투여 형태는 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 및/또는 패치를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 활성 성분은 멸균 장애하에서 제약상 허용되는 담체 및/또는 임의의 필요한 보존제 및/또는 요구될 수도 있는 완충제와 혼합되어 있다. 추가로, 본 발명은 흔히 활성 성분의 몸체로의 제어된 전달을 제공하는 추가 장점을 갖는 경피 패치의 사용을 고려한다. 이러한 투여 형태는 예를 들어 활성 성분을 적당한 배지에 융해 및/또는 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 비율 제어 막을 제공하고/거나 활성 성분을 중합체 매트릭스 및/또는 겔에 분산시킴으로써 비율이 제어될 수도 있다.

국소 투여를 위한 제제는 액체 및/또는 세미 액체 제제 예컨대 도찰제, 로션, 수중유 및/또는 유중수 에멀젼 예컨대 크림, 연고/또는 페이스트, 및/또는 용액 및/또는 현탁액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 활성 성분의 농축이 용매 내 활성 성분의 용해도 한계만큼 높을 수도 있지만, 국소-투여가능한 제제는 예를 들어 약 1％ 내지 약 10％ (w/w) 활성 성분을 포함할 수도 있다. 국소 투여를 위한 제제는 본원에서 기술한 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명에 따른 miR-16-5p 및/또는 옥트레오타이드 또는 이의 허용 가능한 염은 전형적으로 쉬운 투여 및 균일한 투여를 위하여 투여 단위 형태로 제조된다. 그러나 본 발명의 조성물의 total 일일 용법은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 담당의에 의해 결정될 것임을 이해하게 될 것이다. 임의의 특정 대상체에 대한 특정한 치료 유효 용량 수준은 질환, 장애, 또는 치료 중인 장애 및 장애의 심각도를 포함하는 다양한 인자; 채택된 특정 활성 성분의 활성; 채택된 특정 조성물; 대상체의 나이, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 다이어트; 채택된 특정 활성 성분의 투여 시간, 투여 경로, 및 배설율; 치료 기간; 채택된 특정 활성 성분과 조합하거나 동시에 사용한 약물; 및 의료 분야에 잘 알려진 인자 등에 좌우될 것이다.

본 발명에 따른 miR-16-5p 및/또는 옥트레오타이드 또는 이의 허용 가능한 염은 임의의 경로로 투여될 수도 있다. 일부 실시예에서, miR-16-5p 및/또는 옥트레오타이드 또는 이의 허용 가능한 염은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척수강내, 피하, 뇌실내, 경피, 피내, 직장, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 크림, 및/또는 액적에 의함), 점막, 코, 입, 경장, 설하; 기관내 점적주입, 기관지 점적주입, 및/또는 흡입; 및/또는 경구 스프레이, 비강 스프레이, 및/또는 에어로졸을 포함하는 다양한 경로에 의해 투여된다. 구체적으로 고려되는 경로는 침투성 정맥내 주사, 혈액 및/또는 림프 공급을 통한 국부 투여, 및/또는 환부 부위에 대한 직접 투여이다. 일반적으로 투여의 가장 적합한 경로는 작용제의 특성(예를 들어, 위장관의 환경에서의 안정성), 및 대상체의 장애(예를 들어 대상체가 경구 투여를 참을 수 있는지 여부)를 포함하는 다양한 인자에 좌우될 것이다. 현재 경구 및/또는 비강 스프레이 및/또는 에어로졸 경로가 치료제를 폐 및/또는 호흡기계에 직접 전달하기 위하여 가장 공통으로 이용되고 있다. 그러나 본 발명은 약물 전달 분야에서의 진전을 고려하는 임의의 적절한 경로에 의한 본 발명에 따른 약학적 조성물의 전달을 포함한다.

특정 실시예에서, 본 발명에 따른 miR-16-5p 및/또는 옥트레오타이드 또는 이의 허용 가능한 염은 매일 대상체 체중의 약 0.001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg을 하루에 1회 이상 전달하기 충분한 투여량 수준으로 투여하여 원하는 치료 효과를 얻을 수도 있다. 목적 투여량은 하루에 세 번, 하루에 두 번, 하루마다, 이틀마다, 삼일마다, 매주마다, 2주마다, 3주마다, 또는 4주마다 전달될 수도 있다. 특정 실시양태에서, 목적 투여량은 다중 투여(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 회 이상의 투여)를 통해 전달될 수도 있다.

본 발명에서, 용량 범위는 성인에게 제공된 약학적 조성물의 투여에 대한 가이던스를 제공함을 이해하게 될 것이다. 예를 들어 어린이 또는 청소년에게 투여되는 양은 전문의 또는 본 기술분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있고, 성인에게 투여되는 것보다 적거나 동일할 수 있다. 유효량을 달성하는 데 요구되는 본 발명에 따른 펩타이드의 정확한 양은 예를 들어 대상체의 종, 나이, 및 전반적인 장애, 부작용 또는 장애의 심각도, 특성 화합물의 동일성, 투여 방식 등에 따라 대상체마다 다를 것이다.

본 발명에 따른 miR-16-5p 및/또는 옥트레오타이드 또는 이의 허용 가능한 염은 조합 요법으로 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 조합 요법에 사용되기 위한 치료의 특정한 조합(치료제 또는 절차)은 달성될 목적 치료 효과 및 목적 치료제 및/또는 절차의 적합성을 고려할 것이다.

본 발명에서, 약학적 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 치료 활성제와 조합하여 투여될 수 있다. "조합"의 경우, 다음 전달 방법이 본 발명의 범위에 속하긴 하지만, 작용제가 꼭 동일한 시간에 투여되어야 하고/하거나 같이 전달되기 위해 제형화되어야 한다는 것을 시사하도록 의도되진 않는다. 조성물은 하나 이상의 다른 목적 치료제 또는 의료 절차와 동시에, 그보다 먼저, 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 각 작용제는 그 작용제에 대해 정해진 투여량 및/또는 시간 스케쥴로 투여될 것이다. 추가로, 본 발명은 신체 내에서 그의 생체이용률을 개선시키고, 그의 대사를 감소 및/또는 수정하고, 그의 분비를 억제하고, 및/또는 그의 분포를 수정할 수 있는 작용제와 조합하여 본 발명의 약학적 조성물을 전달하는 것을 아우른다. 이 조합에서 사용되는 본 발명에 따른 miR-16-5p 및/또는 옥트레오타이드 또는 이의 허용 가능한 염 및 치료 활성제는 단일 조성물로 같이 투여되거나 상이한 조성물로 별도로 투여될 수 있다는 것이 더 이해될 것이다.

조합 요법에 사용되는 특정한 조합은 달성될 목적 치료 효과 및/또는 치료 활성제의 적합성을 고려할 것이다. 사용되는 조합은 동일한 장애에 대해 목적 효과를 달성할 수 있고(예를 들어, 본 발명에 따른 miR-16-5p 및/또는 옥트레오타이드 또는 이의 허용 가능한 염은 동일한 장애를 치료하는 데 사용되는 또 다른 치료 활성제와 병용하여 투여될 수 있다), 및/또는 이것들은 상이한 효과를 달성할 수 있다(예를 들어, 임의의 부작용 제어)는 것이 이해될 것이다.

본 발명에서, "치료 활성제"는 장애를 치료, 예방, 지연, 환원 또는 개선시키기 위한 의약으로서 사용되는 임의의 물질을 가리키고, 예방적 및 치유적 치료를 포함하는, 치료에 사용되는 물질을 가리킨다.

일부 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 증상 또는 암 특징을 치료, 경감, 개선, 완화시키고, 그 개시를 지연시키고, 그 진행을 억제시키고, 그 중증도를 감소시키고, 및/또는 그 발생률을 감소시키는 데 유용한 임의의 치료 활성제 또는 절차 (예를 들어, 수술, 방사선 요법)와 조합하여 투여될 수 있다.

본 발명에서 용어 “약학적으로 허용가능한 염”이란, 모(parent) 화합물의 바람직한 약리(pharmacological) 활성을 갖는, 화합물의 염을 가리키며, 비록 “약학적으로”라고 기재하고는 있으나, 식품에 사용가능한 염 또한 포함한다. 이들은 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 가리키며, 상기 염으로는 당업계에 널리 알려진 염들을 사용하면 되며, 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 miR-16-5p 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 신경내분비종양 예방 또는 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로

펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않은 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.

[실시예]

재료 및 방법

1-1 세포 배양

INS-1 쥐 인슐린종 세포주와 GH3 쥐 뇌하수체 GH 및 PRL 생산 세포주는 각각 Addexbio (San Diego, CA, USA)와 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 두 세포주 모두 소마토스타틴 수용체 2(SSTR2)를 발현한다(도 6). INS-1 세포 및 GH3 세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 0.05mmol/L 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 100U/mL 페니실린(penicillin) 및 100μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)이 보충되고, 5% CO₂ 및 37˚에서 유지되는 RPMI-1640(Gibco, Grand Island, NY, USA) 및 DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA) 에서 배양하였다. HeLa 세포는 한국 세포주 은행에서 구입하여 10%(v/v) 태아소혈청과 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 성장하였다. 옥트레오타이드(Octreotide)는 TOCRIS Bioscience (Bristol, UK)에서 구입하고 탈이온수에 용해시켜 1mM 스톡 용액을 제조하였다. 3차원 배양을 위해 Costar®Ultra-Low 부착 다중 웰 플레이트는 Sigma-Aldrich Korea(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

1-2 RNA 추출 및 miRNA 합성

제조업체의 지침에 따라 TRIzol 시약 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 Total RNA를 추출하였다. RNA 농도는 NanoDrop 분광 광도계 (DeNovix, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 측정하였다. 제조업체의 지침에 따라 miScript II RT Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 500ng의 total RNA에서 miRNA를 합성하였다.

1-3 라이브러리 준비, 시퀀싱 및 데이터 분석

대조군 및 테스트 RNA의 경우 제조업체의 지침에 따라 NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 라이브러리를 구성하였다. 각 샘플에서 1μg의 total RNA를 사용하여 어댑터를 연결한 후 어댑터 특이적 프라이머와 함께 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 라이브러리 증폭을 위해 PCR을 한 다음 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) 및 AMPure XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 라이브러리를 정제하였다. Small RNA 라이브러리의 수율과 크기 분포는 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에서 고감도 DNA 분석으로 평가하였다. High-throughput 시퀀스는 NextSeq 500 시스템 (Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하여 단일-종단(single-end) 75 시퀀싱으로 생성하였다. BAM 파일 (정렬 파일)을 얻기 위해 Bowtie 2 소프트웨어 도구를 사용하여 시퀀스 읽기를 매핑하였다. 성숙(mature) miRNA 서열을 매핑을 위한 참조로 사용하였다. 성숙 miRNA 서열에 매핑된 Read count는 bedtools (v2.25.0) 및 R (버전 3.2.2) 통계 프로그래밍 언어를 사용하는 Bioconductor (R development Core Team, 2011)를 사용하여 정렬 파일에서 추출하였다. 그 후 상기 read count를 사용하여 miRNA의 발현 수준을 결정하였다. 샘플을 비교하기 위해 분위 수 정규화 (quantile normalization) 방법을 사용하였다. miRWalk 2.0은 miRNA 표적 분석에 사용하였다. 기능적 유전자 분류는 DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)를 사용하였다.

1-4 형질 감염 및 치료

HeLa 세포 (1 x 10⁵cells / well)를 6-웰 플레이트에 플레이팅 하였다. 24 시간 후, 1μg hSSTR2 또는 대조군 플라스미드 (Sino Biological, Inc., Eschborn, Germany)를 RNAiMAX 형질 감염 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 형질 감염시켰다. 추가 24 시간의 배양 후, miRNA 억제제를 HeLa 세포에 처리하였다. INS1 세포(1 x 10⁵ 세포 / 웰)를 6- 웰 플레이트에서 배양하였다. 상업용 mimic miR-16-5p( 한국 서울 제놀루션에서 합성) 센스 (S, sense) 5'-UAGCAGCACGUAAAUUGGCG-3' 및 안티센스 (A, antisense), 5'-CGCCAAUAUUUACGUGCUGCUA-3' 또는 음성 대조군 siRNA (Genolution)를 INS1 세포로 형질 감염시켰다. RNAiMAX 형질 감염 시약 (Invitrogen)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 형질 감염시켰다. 24-48 시간 배양 후 추가 분석하였다.

1-5 실시간 정량 PCR (RT-qPCR)

miRNA 발현을 분석하기 위해 miScript miRNA PCR Arrays (Qiagen)가 있는 miScript SYBR Green PCR Kit를 사용하여 C1000 ™Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에서 RT-qPCR을 수행하였다. 유전자 발현 수준은 해당 miRNA 샘플에 대한 miRTC 발현 수준으로 정규화하였다. 다음 표적 miRNA는 miScript Primer assay (Qiagen), rno-miR-16-5p (cat no. MS00033229, UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 서열을 가진 mature miRNA 및 miRTC (MS00000001))로 정량화하였다. cDNA는 gDNA Remover (Toyobo, Osaka, Japan)와 함께 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix를 사용하여 500ng의 total RNA로부터 합성하였다. 정량적 RT-PCR은 SYBG Green Real-time PCR Master Mix (Toyobo)를 사용하였다. 유전자 발현 수준은 해당 cDNA 샘플의 베타 -2 마이크로 글로불린 (B2M) mRNA 발현 수준으로 정규화하였다. 모든 PCR primer는 Bioneer (대한민국 대전)에서 구입했고, rARRB1(forward 5'-ACCTGGATGTCTTGGGTCTG-3' -reverse3'-TAGCCGAGTCAGTG GCTTCT-5', hSSTR2 (forward 5'-TGAGAAGAAGGTCACCCGAAT-3', reverse 3'-AGGACC ACCACAAAGTCAAAC-') 및 hB2M (forward '-TTACTCACGTCATCCAGCAGA-3', reverse 3'-AGAAAGACCAGTCCTTGCTGA-' 프라이머를 사용하였다.

1-6 세포 생존력 분석 및 유세포 분석

CCK8 분석을 사용하여 세포 생존력을 평가하였다. INS1 세포를 96-웰 플레이트에 1 x 10⁵ 세포/ml로 접종하고 24 시간 동안 배양한 후 다양한 조건에서 처리하였다. 세포 생존력을 측정하기 위해 10 μL/웰의 CCK8 시약 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 가습 배양기에서 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 440 및 640 nm에서의 흡광도는 Spectra Max190 마이크로 플레이트 리더 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다. 3D 스페로이드(spheroid)에 대한 세포 생존력은 CellTiter-Glo13D 세포 생존력 분석 (Promega, Madison, WI, USA)으로 평가하였다. 세포사멸(apoptosis)를 정량화하기 위해, Annexin V-FITC 아폽토시스 검출 키트 (BD Pharmingen ™Franklin Lakes, NJ, USA)에서 설명하는 프로토콜에 따라 이중 염색을 하였다. miR-15-5p 유사체 및 옥트레오타이드와 함께 배양한 후 INS1 세포를 수집하고 분석하였다.

1-7 면역 세포 화학(Immunocytochemistry)

4 % 파라포름알데히드에 고정된 세포를 실온 (25-27 ℃)에서 30 분 동안 3 % 소 혈청 알부민으로 차단하고 SSTR2 1 차 항체 (클론 UMBI; 1:500; Abcam, 영국 캠브리지)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세포를 세척하고, 적절한 형광 접합 2 차 항체 (1: 200; Invitrogen)와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하고 Hoechst (Invitrogen)로 대조 염색하였다. 이후 커버 슬립을 장착하고 세포를 광학 현미경으로 관찰하였다. Olympus Cell Sens 소프트웨어 (일본 도쿄)와 함께 Olympus BX53 현미경을 사용하여 이미지를 기록하였다.

1-8 웨스턴 블롯팅(Western blotting)

SSTR2 (클론 UMBI; 1: 500; Abcam) 및 β액틴 (C4; 1 : 5000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 1 차 항체를 사용하였다. 2 차 항체로서 홀스래디쉬 과산화 효소 표지(horseradish perocidase-labeled) 토끼 IgG 및 마우스 IgG 항체를 사용하였다 (GeneTex, Irvine, CA, USA). 단백질 수준은 Image Lab 소프트웨어 (Bio-Rad Laboratories)로 블롯을 분석하여 밀도계를 통해 반정량화하였다.

1-9 통계 분석

쌍을 이루는 양측 스튜던트 t- 검정을 사용하여 두 데이터 세트 간의 유의한 차이를 알아냈다. 차이는 p 값이 <0.05 일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주한다.

옥트레오타이드 처리에 대한 초기 반응 동안 INS-1 세포에서 차등적으로 발현된 miRNA 확인

본 발명자들은 소마토스타틴 수용체 2(SSTR 2)의 옥트레오타이드(octreotide) 처리에 따른 초기 반응에 관여하는 miRNA를 확인하기 위하여 INS-1 세포에 다양한 배양 시간 동안 1μM 옥트레오타이드를 처리하였다.

그 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이, 소마토스타틴 수용체 2 발현은 1 μM 옥트레오타이드로 5 분 처리 후 하향 조절되었다.

면역세포화학법 (Immunocytochemistry)으로 확인한 결과, 막성 소마토스타틴 수용체 2 발현이 감소하고, 세포질에서 소마토스타틴 수용체 2의 핵 주위 염색이 관찰되어 소마토스타틴 수용체 2의 초기 약물 반응과 관련된 miRNA를 확인하는 데 5분 배양이 충분한 시간임을 확인하였다 (도 1B).

따라서, 본 발명자들은 옥트레오타이드 5분 처리 후 miRNA의 변화를 분석하였다. miRNA 어레이 분석은 0분 처리와 비교하여 옥트레오타이드로 5분 처리한 INS-1 세포에서 21 개의 miRNA가 하향 조절되었고 9 개가 상향 조절되었다. (absolute fold change> 1.5; 도 2A 및 도 2B).

나아가, KEGG 경로 농축 분석은 이러한 miRNA의 표적이 암, MAPK (mitogen-activated protein kinase) 신호 전달 경로, 내분비 및 기타 요인 조절 칼슘 재흡수와 연관이 있음을 확인하였다.(표 1)

qPCR로 확인한 결과, 30 개의 차등적으로 발현된 miRNA 중 miR-16-5p이 가장 많은 표적 유전자를 나타내었다. miRNA 어레이 결과와 유사하게, miR-16-5p는 INS-1 세포에서 옥트리오타이드 5분 처리 후 상향 조절되었다. (도 2C) 이러한 결과를 확인하기 위해 다른 신경 내분비 세포 (GH3 세포)를 사용한 결과, 도 3D에 나타난 바와 같이, miR-16-5p는 옥트레오타이드와 함께 5분 배양한 후 GH3 세포에서도 상향 조절됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 옥트레오타이드가 miR-16-5p의 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다.

이후 본 발명자들은 옥트레오타이드를 처리 후 소마토스타틴 수용체 2 발현에 대한 miR-16-5p의 기능을 조사하였다.

KEGG pathway	p-value	#genes	#miRNAs
MicroRNAs in cancer	1.28E-06	46	19
MAPK signaling pathway	3.38E-05	69	23
FoxO signaling pathway	0.000114	39	18
Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption	0.000366	12	9
Vasopressin-regulated water reabsorption	0.000413	15	10
Gap junction	0.000413	25	11
Proteoglycans in cancer	0.000498	50	20
Transcriptional misregulation in cancer	0.000795	44	19
Wnt signaling pathway	0.001226	39	17
Pathways in cancer	0.001711	83	23
Mucin type O-Glycan biosynthesis	0.004161	6	6
Sphingolipid metabolism	0.004161	15	11

miR-16-5p의 소마토스타틴 수용체 2 발현 조절 효과 확인

본 발명자들은 SSTR2 발현에 대한 miR-16-5p의 효과를 조사하기 위해, INS-1 세포를 mimic miR-16-5p로 형질 감염시켜 miR-16-5p의 발현을 상향 조절을 RT-qPCR로 확인하고자 하였다 (도 3A).

그 결과 흥미롭게도, total SSTR2 발현은 miR-16-5p 수준의 증가에 따라 상당히 상향 조절되었고 (도 3B), pERK/ERK 비율은 miR-16-5p- 과발현 INS-1 세포에서 상향 조절되었다 (도 3B). ERK1/2의 인산화는 주로 SSTR2 활성화와 관련이 있다.

증가된 소마토스타틴 수용체 2의 국소화(localization)를 면역세포화학법을 통해 조사하였다. 그 결과 소마토스타틴 수용체 2의 막 및 세포질 발현은 모두 mimic miR-16-5p 형질 감염된 세포에서 상향 조절되었다 (도 3C 및 도 3D).

본 발명자들은 miR-16-5p 억제제를 추가로 사용하여 INS-1 세포에서 miR-16-5p 발현을 하향 조절하였고 (도 3E), 그 결과 SSTR2 발현이 하향 조절됨을 확인하였다(도 3F).

또한, SSTR2 과발현 HeLa 세포에 has-miR16-5p 억제제를 처리한 후 면역 염색을 하여 SSTR2가 하향 조절됨을 확인하였다 (도 7). 이로써 억제제 처리 후 pERK/ERK 비율이 감소하여 SSTR2 활성화가 감소되었음을 확인하였다(도 3F). 이러한 결과는 miR-16-5p가 소마토스타틴 수용체 2 발현 조절과 관련이 있음을 나타낸다.

옥트레오타이드 처리 후 소마토스타틴 수용체 2 발현에 대한 miR-16-5p의 효과 확인

실시예 3에서는 miR-16-5p에 의해 소마토스타틴 수용체 2의 발현이 조절되는 것을 확인하였다. 이에 옥트레오타이드 처리 후 소마토스타틴 수용체 2의 발현에 대한 miR-16-5p의 효과를 평가하고자 하였다. 따라서, mimic miR-16-5p 또는 대조군 miRNA로 형질 감염된 INS-1 세포를 5분 내지 30분 동안 옥트레오타이드로 처리하였다.

그 결과 대조군 miRNA로 형질 감염된 INS-1 세포와 비교하여, miR-16-5p로 형질 감염된 INS-1 세포에서 옥트레오타이드처리 전과 후 모두에서 더 높은 소마토스타틴 수용체 2 수준을 나타냈다 (도 4A 및 4B).

다음으로 본 발명에서는 mimic miR-16-5에 의해 증가된 SSTR2 수준이 실제로 옥트레오타이드의 항종양 특성에 영향을 미치는지 평가하였다.

그 결과 Mimic miR-16-5p로 형질 감염된 INS-1 세포는 옥트레오타이드 처리 후 세포 증식이 감소되었음을 확인하였다. (도4 5A).

또한, 병용 치료제의 항종양 시너지 효과를 확인하기 위해, 아넥신(Annexin) V-PI 염색을 하였다. 아넥신 V-PI 염색 결과, mimic miR-16-5p와 옥트레오타이드를 결합한 치료제가 초기 및 후기 세포 사멸을 증가시키는 것으로 확인하였다 (도 9).

약물 민감도를 평가하기 위하여, 3차원 (3D) 배양 시스템의 스페로이드를 사용하는 바, 본 발명에서는 상기 스페로이드를 사용하여 옥테리오타이드 감도에서 miR-16-5p의 역할을 조사하였다.

그 결과 대조군 miRNA 형질감형된 INS-1 세포의 스페로이드와 비교하여, mimic miR-16-5p 형질 감염된 INS-1 세포의 스페로이드는 48시간 옥트레오타이드 처리 후 현저하게 감소하여, mimic miR-16-5p가 옥트레오타이드의소마토스타틴 수용체 2에 대한 민감도를 증가시켜 항종양효과를 증대시킨다는 점을 입증하였다 (도 5B).

본 발명자들은 소마토스타틴 수용체 2에 대한 면역 염색을 병행해본 결과소마토스타틴 수용체 2 발현은 mimic miR-16-5p 형질 감염된 INS-1 세포의 스페로이드에서 상향 조절되어 유지됨을 확인하였다. (도 10).

이와 같은 결과로부터 miR-16-5p가 신경내분비종양 관련하여 옥트레오타이드의 항증식 작용을 효과적으로 발휘함을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> INCHEON NATIONAL UNIVERSITY RESEARCH ＆ BUSINESS FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating tumors comprising miR-16-5p and somatostatin analogs <130> 1069477 <160> 9 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mimic miR-16-5p S <400> 1 uagcagcacg uaaauuggcg 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mimic miR-16-5p A <400> 2 cgccaauauu uacgugcugc ua 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> rno-miR-16-5p <400> 3 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> rARRB1 F <400> 4 acctggatgt cttgggtctg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> rARRB1 R <400> 5 tagccgagtc agtggcttct 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hSSTR2 F <400> 6 tgagaagaag gtcacccgaa t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hSSTR2 R <400> 7 aggaccacca caaagtcaaa c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hB2M F <400> 8 ttactcacgt catccagcag a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hB2M R <400> 9 agaaagacca gtccttgctg a 21

Claims (11)

1. miR-16-5p 및 소마토스타틴 유사체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제2항에 있어서, 상기 소마토스타틴 유사체는 옥트레오타이드, 란레오타이드 및 파시레오타이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 종양은 소마토스타틴 수용체 2가 발현하는 암, 신경내분비종양(neuroendocrine tumor), 소세포폐암(small cell lung cancer), 유방암(breast cancer, prostate cancer), 전립선암(prostate cancer) 또는 결직장암(colorectal carcinoma)인 것을 특징으로 하는, 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 miR-16-5p는 pri-miRNA, precursor miRNA, 플라스미드 형태의 miRNA 및 mature miRNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제5항에 있어서, 상기 miR-16-5p는 miR-16-5p 유도체인 것을 특징으로 하는, 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 제6항에 있어서, 상기 miR-16-5p 유도체는
   (i) RNA 인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)를 다른 원소로 치환한 형태인 포스포로사이오에이트 (phosphorothiolate) 구조를 부분적으로 포함하거나;
   (ii) RNA가 DNA, PNA(petide nucleic acids) 및/또는 LNA(locked nucleic acid) 분자로 전체 또는 부분적으로 치환되어 있거나; RNA 내 당의 2' 수산화기가 기능성 구조로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는, 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 miR-16-5p는 소마토스타틴 수용체 2의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 종양이 있는 옥트레오타이드 비반응 환자에서 항종양 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
9. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 (i) 옥트레오타이드에 대한 내성; 및/또는 (ii) 소마토스타틴 수용체 발현이 감소되어 있는 환자에서 항종양 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
10. 다음 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료를 위한 정보를 제공하는 방법:
    (a) 환자로부터 분리된 샘플로부터 옥트레오타이드 반응성을 측정하는 단계;
    (b) 상기 반응성을 정상 대조군의 옥트레오타이드 반응성과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 환자의 옥트레오타이드에 대한 반응성이 정상 대조군의 옥트레오타이드에 대한 반응성과 비교하여 감소되어 있는 경우, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물 투여가 적합한 환자로 평가하는 단계.
    
11. 제 10항에 있어서, 상기 환자는 (i) 옥트레오타이드에 대한 내성; 및/또는 (ii) 소마토스타틴 수용체 발현이 감소되어 있는 환자인 것을 특징으로 하는, 종양의 예방 또는 치료를 위한 정보를 제공하는 방법.
    

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