CN113398246B - eIF3I-PDL1-IRS4轴在制备难治性溃疡药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及eIF3I‑PDL1‑IRS4轴在制备难治性溃疡药物中的应用。本发明发现使用PDL1治疗伤口，可诱导组织形成、炎症消退、血管减少、加速上皮化和减轻炎症，帮助糖尿病溃疡(DU)创面愈合；在DU创面中，IRS4的表达增加，敲低HaCaT细胞IRS4表达，细胞的增殖和迁移增加；eIF3I在HaCaT细胞中过表达时，细胞的增殖和迁移显著增加，炎症浸润减轻。本发明提示靶向eIF3I‑PDL1‑IRS4轴可以作为一种新的治疗方法，用于治疗难治性溃疡、损伤后慢性炎症、感染和其他类型的伤口。

Description

eIF3I-PDL1-IRS4轴在制备难治性溃疡药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及eIF3I-PDL1-IRS4轴在制备难治性溃疡药物中的应用。

背景技术

皮肤是人体与环境接触最多的器官，并直接暴露在周围环境中，具有感觉和免疫保护等功能，同时也易受伤及感染。糖尿病、血管疾病和老年患者的伤口愈合能力减弱。随着糖尿病人口的增长，糖尿病溃疡(DU)对医疗费用的影响愈发重大。糖尿病溃疡是糖尿病的一种并发症，多发于患者脚部，因此又称为糖尿病足。长期糖尿病的患者，常有血管的病变及末稍神经炎的并发症。此类病人趾端的感觉因为神经炎的关系，常常丧失知觉，因此经常会碰撞至流血而仍不自知。此类的趾端或下肢的伤口再加上末梢血管的病变和胶原蛋白不正常，非常不容易愈合，而往往演变成慢性溃疡。DU的主要病理表现为：再上皮化进程受阻；慢性炎症和血管生成受损；神经病变。

DU难愈合的具体机制目前尚不清楚，且缺乏针对DU的有效治疗策略。角质形成细胞(KC)通过产生细胞因子和趋化因子与成纤维细胞、内皮细胞等多种细胞类型相互作用，对伤口愈合起重要作用。促进角质形成细胞介导的上皮化进程，缓解慢性炎症，对于克服难治性伤口缺损是至关重要的。

细胞程序性死亡配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PDL1)是一种易受促炎因子诱导的跨膜蛋白，常见于KC基底膜。有文献报道外用PDL1可以促进小鼠伤口愈合，这与改善持续性炎症有关。机制上，转化生长因子-β(TGF-β)诱导成纤维细胞表达PDL1，抑制T淋巴细胞增殖及促进成纤维细胞增殖。另有中国专利文献CN111724903A公开了将PDL1作为免疫标记测试受试者胃癌预后，中国专利文献CN110402892A公开了一种将PDL1作为靶点敲除后建立自发胰腺癌小鼠模型的方法。胰岛素受体底物4(Insulin receptor substrate-4，IRS4)是一种与多种酪氨酸激酶受体相互作用的信号传递器，它能增强IGF-1的表达，并将信号从胰岛素或相关受体诱导到下游效应器。胰岛素受体底物4(IRS4)是癌细胞中细胞迁移和侵袭的主要调节因子。此外，IRS4可以通过泛素化促进成肌细胞中Smad1的降解。然而，外源性PDL1是否能促进糖尿病溃疡愈合，PDL1、IRS4在糖尿病溃疡发病中的功能尚不清楚。

真核细胞起始因子3I(eukaryotic initiation factor 3I，eIF3I)可以通过发送细胞信息来促进肿瘤的进展。此外，eIF3I最初被鉴定为TGF-β2Ⅱ受体相互作用蛋白，负向调节TGF-β信号通路。eIF3I是细胞生物学过程(包括细胞分化、生长周期、增殖和侵袭)的调节器，并改善血管生成。然而，eIF3I愈创的功能尚不清楚。

目前血小板衍生生长因子PDGF-BB是FDA批准唯一用于慢性伤口治疗的药物，但是售价高昂，且长期使用有潜在的致癌风险；其他生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF)，表皮生长因子(EGF)疗效有限。因此开发新的慢性伤口治疗的药物是非常必要的。而目前未见eIF3I-PDL1-IRS4轴治疗难治性溃疡的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供eIF3I-PDL1-IRS4轴在制备难治性溃疡药物中的应用。

第一方面，提供PDL1或其上调剂在制备治疗难治性溃疡或损伤后慢性炎症的药物中的应用。

在一个优选例中，所述难治性溃疡为糖尿病溃疡。

在本发明的另一方面，提供IRS4或其抑制剂在制备治疗难治性溃疡或损伤后慢性炎症的药物中的应用。

在一个优选例中，所述难治性溃疡为糖尿病溃疡。

在本发明的另一方面，提供eIF3I或其上调剂在制备治疗难治性溃疡或损伤后慢性炎症的药物中的应用。

在一个优选例中，所述难治性溃疡为糖尿病溃疡。。

在本发明的另一方面，提供一种防治糖尿病溃疡的药物组合物，所述的药物组合物以细胞程序性死亡配体1(PDL1)或其上调剂为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述药物组合物的剂型为外用剂型或内用剂型。

更优选地，所述药物组合物的剂型为贴剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、巴布剂、喷雾剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。

在本发明的另一方面，提供一种防治糖尿病溃疡的药物组合物，所述的药物组合物以IRS4或其抑制剂为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述药物组合物的剂型为外用剂型或内用剂型。

更优选地，所述药物组合物的剂型为贴剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、巴布剂、喷雾剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。

在本发明的另一方面，提供一种防治糖尿病溃疡的药物组合物，所述的药物组合物以eIF3I或其上调剂为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述药物组合物的剂型为外用剂型或内用剂型。

更优选地，所述药物组合物的剂型为贴剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、巴布剂、喷雾剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。

在本发明的另一方面，提供细胞程序性死亡配体1(PDL1)、IRS4或eIF3I作为靶点在筛选制备防治糖尿病溃疡及防治糖尿病溃疡创面炎症药物中的应用。

本发明优点在于：

1、本发明实验证明，使用细胞PDL1蛋白治疗糖尿病溃疡(DU)伤口，发现愈合和再上皮化的速度比碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)治疗后更快。此外，过表达PDL1可以促进人角质形成细胞系HaCaT细胞的增殖/迁移，减轻炎症反应。这些结果表明，在未愈合的DU治疗中，PDL1比bFGF具有更好的促进上皮化和抗炎作用。并且，PDL1在体内和体外都可以通过减少持续的炎症和促进KC的增殖与迁移来克服DU的伤口愈合缺陷。目前用于慢性伤口治疗的药物，血小板衍生生长因子(PDGF-BB)价格昂贵，长期使用有潜在致癌风险，成纤维细胞生长因子(FGF)，表皮生长因子(EGF)疗效有限。PDL1在治疗糖尿病溃疡创口时，不仅疗效显著，并且能明显缓解炎症反应，经过毒理实验检测，无明显安全性问题。

2、通过转录谱分析，确定了胰岛素受体底物4(IRS4)为PDL1下调最明显的下游效应因子。在DU创面中，IRS4的表达增加，而在PDL1应用后，IRS4的表达降低，这表明了IRS4在DU创面中的一种新功能及其与PDL1的潜在相关性。此外，IRS4的过表达不仅减少了HaCaT细胞的增殖和迁移，还诱导了炎症，而PDL1的过表达挽救了IRS4过表达导致的表型缺陷。总之，PDL1-IRS4轴在HaCaT细胞的生物学过程中起着关键作用，这代表了DU病理中的一个新的分子特征，也是治疗难治性DU创面的一个有前途的靶点。

3、通过免疫沉淀-质谱联用(IP-MS)和免疫共沉淀(Co-IP)分析证实了PDL1与真核细胞起始因子3I(eIF3I)相互作用，通过实验验证发现eIF3I部分通过PDL1-IRS4轴发挥作用，表明eIF3I-PDL1-IRS4轴在难治性DU中具有新的作用。

总的来说，本发明结果证明，靶向eIF3I-PDL1-IRS4轴可以作为一种新的治疗方法，用于未来治疗难治性溃疡、损伤后慢性炎症、感染和其他类型的伤口。

附图说明

图1-图8.PDL1改善DU病理缺陷、促进HaCaT细胞增殖/迁移和炎症。图1.不同的小鼠治疗方案。图2.伤口愈合试验和定量，n＝5伤口/组/时间点。图3.组织学染色和定量图像。黑色的虚线代表伤口的边缘。比例尺＝500μm，n＝5个样本/组。图4.免疫组化标记伤后第7天PCNA、F4/80、CD31。比例尺＝100μm，n＝5个样本/组。图5a.qPCR检测损伤后第7天TNF-α、IL-6和PCNA表达的定量。图5b、图6、图7a.CCK-8和伤口愈合试验在指定时间测定细胞增殖/迁移能力。图7b.TNF-α、IL-6和PCNA表达的qPCR定量。数据代表平均数±标准差，来自三个独立的实验。图8.Transwell测定细胞在48h的迁移情况。***p<0.001,**p<0.01,*p<0.05。

图9-图10.PDL1过表达HaCaT细胞的转录谱分析。图9a.PDL1过表达(n＝3)和正常HaCaT细胞(n＝3)mRNA-seq数据中所有差异表达mRNA的热图，调整后p值≤0.05，|Log₂F-C|≥2。红点代表相对高表达的蛋白质编码基因，而蓝点代表低表达的基因表达式；图9b.火山图显示差异表达的mRNA。IRS4是最显著差异表达mRNA。图10.上调和下调的GO(a-b，top10)与KEGG路径(c-d，top 5)直方图。

图11-图12.PDL1直接和部分负调控IRS4的活性。图11a.Western blot检测创伤后第9天创面部位IRS4的表达；图11b-d.CCK-8和伤口愈合试验在指定时间测定细胞增殖/迁移能力；图11e，f.Transwell法测定48小时后细胞迁移；图11g.TNF-α、IL-6和PCNA表达的qPCR定量。图12a-e.CCK-8、伤口愈合试验和Transwell实验显示过表达IRS4部分抑制了过表达PDL1所促进的增殖/迁移活性；图12f.qPCR检测结果表明过表达IRS4部分调节了PDL1促进的TNF-α、IL-6和PCNA的表达。数据代表平均数±标准差，来自三个独立的实验。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图13.eIF3I与PDL1相互作用：(a)构建了一个PPI网络来鉴定PDL1相互作用组的中心蛋白，其中黄结点代表枢纽节点的位置。该网络使用11个数据库构建，包括BioGrid、entire、MINT、ebi-goa-nonentire、IMEx、nedb-all、iRefIndex、MatrixDB、Mentha、reactomi-fi和Spike；(b)Co-IP分析和IP-MS分析证实了在过表达PDL1的HaCaT细胞中，PDL1与eIF3I相互作用。

图14-图15.eIF3I通过调节PDL1-IRS4轴促进细胞增殖/迁移并减轻炎症。图14a，b.CCK-8和创面愈合试验测定了细胞在指定时间的增殖/迁移能力；图14c，d.Transwell实验测定48h时细胞的迁移；图14e.TNF-α、IL-6和PCNA表达的qPCR定量。图15a.Western blot检测eIF3I、PDL1和IRS4的表达；图15b-e.CCK-8、伤口愈合试验和Transwell实验显示，过表达eIF3I部分克服了PDL1消耗的负面影响，过表达IRS4部分减弱了过表达eIF3I所促进的增殖/迁移活性；图15f.TNF-α、IL-6和PCNA表达的qPCR定量。数据代表平均数±标准差，来自三个独立的实验。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图16.DU患者组织中eIF3I、PDL1、IRS4的相关性：(a)正常人类皮肤(n＝4个样本/组)和糖尿病溃疡(n＝4个样本/组)中CD45+(白细胞)、MPO+(中性粒细胞)和CD68+(巨噬细胞)表达的代表性细胞质染色。比例尺＝100μm；(b，c)eIF3I、PDL1、IRS4蛋白在正常人类皮肤(n＝4个样本/组)和糖尿病溃疡(n＝4个样本/组)中的代表性细胞质染色。虚线表示表皮-基质边界。比例尺＝100μm。***p<0.001。

图17-图18.PDL1体内外检测及模型小鼠应用PDL1后各项指标的变化。

图19-图22.RNA-seq数据质量评估和PDL1干扰检测。

图23.IRS4和PDL1的检测。

图24.eIF3I敲低/过表达检测。

图25.岳阳医院伦理委员会批件。

图26.动物实验批件。

具体实施方式

本申请发明人经过广泛而深入的研究，发现eIF3I-PDL1-IRS4轴是难治性DU的重要靶标。

PDL1、IRS4、eIF3I

细胞程序性死亡配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PDL1)也称为表面抗原分化簇274(cluster of differentiation 274，CD274)或B7同源体(B7 homolog 1，B7-H1)，是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码。PDL1是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白。

胰岛素受体底物4(Insulin receptor substrate-4，IRS4)是一种与多种酪氨酸激酶受体相互作用的信号传递器。

真核细胞起始因子3I(eukaryotic initiation factor 3I，eIF3I)可以通过发送细胞信息来促进肿瘤的进展。

在本发明中，所用的PDL1 IRS4、eIF3I可以是天然存在的，比如其可以倍分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的PDL1、IRS4、eIF3I也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组PDL1、IRS4、eIF3I。优选的，本发明可采用重组的PDL1、IRS4、eIF3I。

任何适合的PDL1、IRS4、eIF3I均可用于本发明。所述的PDL1、IRS4、eIF3I包括全长的PDL1或其生物活性片段。优选的所述的PDL1的氨基酸序列为NM_014143.4；优选的所述的IRS4的氨基酸序列为RefSeq NM_003604.2；优选的所述的eIF3I的氨基酸序列为RefSeqNM_003757.3。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、或添加而形成的PDL1、IRS4、eIF3I的氨基酸序列也包括在本发明中。PDL1、IRS4、eIF3I或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域技术人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种PDL1的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，PDL1、IRS4、eIF3I的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的PDL1、IRS4、eIF3I的全部或部分功能。优选的，所述的生物活性片段至少保持50％的全长PDL1、IRS4、eIF3I的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长PDL1、IRS4、eIF3I的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的PDL1、IRS4、eIF3I，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的PDL1、IRS4、eIF3I。所述经过修饰或改良的PDL1、IRS4、eIF3I可以是一种PDL1、IRS4、eIF3I的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的PDL1、IRS4、eIF3I可以是与天然存在的PDL1、IRS4、eIF3I具有较小的共同点，但也能缓解糖尿病溃疡创面或缓解糖尿病溃疡创面炎症，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响PDL1、IRS4、eIF3I的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

根据PDL1、IRS4、eIF3I的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。

用途

本发明提供PDL1、IRS4、eIF3I在制备防治糖尿病溃疡的药物中的用途。

糖尿病溃疡是糖尿病的一种并发症，多发于患者脚部，因此又称为糖尿病足。长期糖尿病的患者，常有血管的病变及末稍神经炎的并发症。此类病人趾端的感觉因为神经炎的关系，常常丧失知觉，因此经常会碰撞至流血而仍不自知。此类的趾端或下肢的伤口再加上末梢血管的病变和胶原蛋白不正常，非常不容易愈合，而往往演变成慢性溃疡。DU的主要病理表现为：再上皮化进程受阻；慢性炎症和血管生成受损；神经病变。

药物组合物

本发明的药物组合物可含有本文所述的活性试剂和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常是安全、无毒的，包括各种赋形剂和稀释剂等。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如乳化剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、促渗透剂、着色剂、助溶剂等。以上，所述的乳化剂诸如乙酰化单甘油脂肪酸酯、乙酰化双甘油脂肪酸酯、蔗糖酯、山梨糖醇脂、大豆磷脂、月桂酸单甘油酯、丙二醇脂肪酸酯、硬脂酰乳酸钙、双乙酰酒石酸、单硬脂酸甘油酯、改性大豆磷脂等。所述的赋形剂诸如硬脂酸镁、微晶纤维素、乳糖、奶糖、高分子量的聚乙二醇等。所述的填充剂诸如淀粉、甘露醇、硅酸、糊精、磷酸氢钙、纤维素等。所述的粘合剂诸如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶、淀粉浆、羟丙基淀粉、改良淀粉、预胶化淀粉、糊精、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮胶浆、明胶浆。所述的润湿剂诸如甘油等。所述的崩解剂诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉、木薯淀粉、海藻酸、羟丙基淀粉、改良淀粉、羧甲基淀粉钠、微晶纤维素、瓜耳胶、苍耳胶、黄原胶等。所述的促渗透剂诸如薄荷脑、月桂氮酮、冰片等。所述的着色剂可以是植物着色剂、动物着色剂或者微生物着色剂，诸如甜菜红、姜黄、叶绿素、紫胶红、胭脂虫红、红曲着色剂等。所述的助溶剂诸如β-环糊精、麦芽糊精、吐温、乙醇、司盘类、十二烷基硫酸钠、丙二醇、聚乙二醇、甘油等。但对于本领域技术人员而言，还知晓可用于本发明的药用载体不仅限于上述类型。

剂型

对于本发明所述药物组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于外用的剂型，包括但不限于贴剂、糊剂软膏剂、凝胶剂、涂膜剂或巴布剂。也可以是任何适用于内用的剂型，包括但不限于胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液等。

治疗方法

本发明提供一种防治糖尿病溃疡或糖尿病溃疡创面炎症的方法，所述方法包括给予需要的对象PDL1；IRS4的抑制剂；或eIF3I。给予的量为治疗有效量，可根据个体的年龄、体重、性别、疾病种类和严重程度加以确定。对象可以是哺乳动物，尤其是人、鼠、兔子、猪、羊和狗等。给药方法是本领域常规的方法，例如涂抹、敷贴等，并可针对不同的试剂进行调整。

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、方法和材料

1.临床样本

临床样本由患者提供书面知情同意书，并经岳阳医院伦理委员会批准(图25)。所有患者均于2019年4月至2020年2月在外科接受手术治疗。DU样本是在外科清创手术中未愈合伤口的边缘采集的，正常皮肤样本采集于整容手术期间收集的多余皮肤。切取组织后立即用70％福尔马林固定，石蜡包埋。临床病人特征见表1。

表1临床患者特征

2.细胞培养与转染

人角质形成细胞系HaCaT购自德国埃佩尔海姆的细胞系服务公司(Cell LinesService，Eppelheim)。细胞培养在DMEM-高糖(4.5g/L，Gibco，Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，含10％(v/v)胎牛血清(HyClone，Logan，UT，美国)和1％(v/v)链霉素-青霉素溶液(10000U/mL，Gibco，Life Technologies)中，加或不加20ng/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子，ThermoFisher Science，#13256029)，在37℃下恒温培养。

使用从OriGene购买的人质粒(OriGene，RC201833)建立eIF3I高表达HaCaT细胞，并根据制造商的说明使用电穿孔器(BTX，ECM830)将其转染到细胞中。利用慢病毒介导的PDL1表达系统(上海GeneChem有限公司)，构建了PDL1过表达的HaCaT细胞和空白对照细胞。将人IRS4基因的编码区(RefSeq NM_001379150.1)克隆到pFLAG-CMV-4(Sigma，E1775)的HindⅢ(酵母菌，ER0505)和EcoRI(酵母菌，ER0271)位点。然后对克隆的序列进行Sanger测序证实。

购买商品化siRNA，在HaCaT细胞中下调eIF3I、PDL1和IRS4的表达。根据制造商的说明，使用电穿孔器(BTX，ECM830)将siRNA转染到细胞中。用于后续实验的细胞通过Western blot进行蛋白质表达验证。使用了以下引物：

Human si-eIF3I上游：5’UCA GUG CUU UGU GAG CUU TT 3’(SEQ ID NO:1)；下游：5’AAG AAG CUC ACA AAG CAC UGA TT 3’(SEQ ID NO:2)；

Human si-PDL1上游：5’CUG GGA GCC AUC UUA UUA UTT 3’(SEQ ID NO:3)；下游：5’AUA AUA AGA UGG CUC CCA GTT 3’(SEQ ID NO:4)；

Human si-IRS4上游：5’CCA CGA AAG AAU GCA AAG ATT 3’(SEQ ID NO:5)；下游：5’UCU UUG CAU UCU UUC GUG GTT 3’(SEQ ID NO:6)。

以上序列中“TT”为保护碱基。

3.IP-MS/MS

注射靶向PDL1或对照细胞的shRNA的IP-MS分析由上海生物芯片有限公司完成，3次生物学重复。简单地说，用SDS-PAGE分离30μL总IP样品，然后进行凝胶内消化和纳米HPLC-MS/MS分析。纳米HPLC-MS/MS分析使用Q-Exactive复合四极杆轨道质谱仪(美国马萨诸塞州Thermo Fisher Science)，连接到75μm×25cm Acrave PepMap C18色谱柱。使用PEAKS Studio Version X+(生物信息解决方案公司，滑铁卢，加拿大)对人类UniProt数据库进行肽域搜索。峰面积在PEAKS软件中自动计算，质谱数据见表2。

表2 PDL1过表达与正常HaCaT细胞中前20个差异表达的基因

4.Western blot分析

进行Western blot分析。用于蛋白质印迹分析的主要抗体有抗PDL1(1:1000，17952-1-AP，Proteintech)抗体、抗IRS4(1:1000，sc-393207，Santa Cruz)抗体、抗eIF3I(1:1000，11287-1-AP，Proteintech)抗体和抗β-肌动蛋白(1:1000，14395-1-AP，Proteintech)抗体。β-肌动蛋白作为内源性对照。

5.免疫共沉淀(Co-IP)试验

根据制造商的协议使用试剂盒(

Plus超声染色质染色质IP试剂盒，CST56383)进行Co-IP分析。柱子根据工具箱的建议进行了调整。细胞裂解物(100μg)用对照琼脂糖预纯化，4℃孵育过夜(抗PDL1；正常兔IgG，稀释1:100，108070001，HarO)。洗涤去除非特异性结合蛋白后，用洗脱缓冲液洗脱保留的蛋白，然后用Western blot分析蛋白复合物。IgG为阴性对照。

6.实时定量聚合酶链反应(qPCR)

使用标准的TRIzol方案从HaCaT细胞中提取总mRNA。用2^-ΔΔCT方法对相关定量数据进行分析，并将差异倍数与空白对照以mRNA的表达水平来表示。引物的详细信息如表3所示。

表3qPCR引物

7.转录图谱检测

进行mRNA微阵列分析。用RNeasy Mini Kit(Cat#74106，Qiagen)根据制造商的方案从有或没有shPDL1过表达的HaCaT细胞中提取总mRNA。RNA完整性用安捷伦生物分析仪4200(Agilent Technologies，nta Clara，CA，US)进行评估。用TruSeq链mRNA LT样品制备试剂盒(RS-122-2103，Illumina)构建cDNA文库。RNA测序由上海生物芯片有限公司完成。

根据p值＜0.05和|Log₂F-C|≥2，鉴定PDL1过表达细胞和正常HaCaT细胞中的差异mRNA，并进行GO和KEGG分析。

8.细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测

CCK-8(Dojindo，Tokyo，Japan)根据制造商的说明用于评估HaCaT细胞的增殖。简单地说，细胞以2000个细胞/100μL的密度接种于96孔板，分三次接种，在指定的时间点加入CCK-8溶液检测450nm处的吸光度。将吸光度值归一化，与对照细胞的吸光度值一致。3个独立实验的数据作为平均标准差。

9.划痕和Transwell实验

将细胞以1×10⁶个/孔的密度接种到6孔板中，形成贴壁培养物。37℃孵育24h后，用10μL无菌吸头刮除平板上的单层细胞。然后，用1mL 1×PBS洗涤细胞单层两次，然后加入全培养液。分别于创伤后0、6、12、24h观察创面愈合程度。进行了三个独立的实验。图像分析采用ImageJ2x软件。

伤口覆盖率(％)＝100-(治疗伤口宽度/对照伤口宽度×100)

将5×10⁴个细胞悬浮于无血清培养基中，接种于24孔Transwell板(Corning，NY，USA)上腔。下室培养基含10％胎牛血清。37℃、5％CO₂条件下孵育48h，去除附着于上表面的细胞。迁移到下室的细胞用0.6mL甲醇(100％)室温固定10min，0.1％结晶紫染色60min。随后，在光学显微镜下通过计数来确定迁移的细胞数量。3个独立实验的数据作为平均标准差。

10.小鼠模型及治疗

C57BL/6雄性小鼠50只(8周龄)，体重22～24g，由上海SLAC实验动物有限公司提供(合格证号：2013001838336；许可证号：SCXK(Hu)2018-0003；中国上海)(图26)。动物饲养在23±2℃的标准温度下，每笼5只小鼠，按SPF级12h光照/12h暗处理。动物可以自由获得高脂肪或标准饮食和水。

2型糖尿病模型是通过高脂饮食(HFD)和链脲佐菌素建立的[Kuai L,Zhang JT,Deng Y,et al.Sheng-ji Hua-yu formula promotes diabetic wound healing of re-epithelization via Activin/Follistatin regulation.BMC Complement AlternMed.2018；18(1):32.]。简而言之，给模型小鼠喂饲高脂饮食2周。2周后，禁食12h，隔日腹腔注射溶于0.1M柠檬酸钠缓冲液中的链脲佐菌素0.2mL两次。7天后空腹血糖＞300.6mg/dL的小鼠视为糖尿病，用于后续实验。如果未达到这一标准，则重新注射链脲佐菌素，直到空腹血糖＞300.6mg/dL。糖尿病模型建立后，用异氟醚麻醉小鼠，创伤前从背部取下4cm×4cm的毛发。用打孔器制作4个6mm宽、2mm深的圆形伤口。像我们之前的研究中描述的那样，实验是在无菌条件下进行的。

创伤后将糖尿病小鼠随机分为3组(n＝12只)，并且立即用含30ng rb-bFGF/鼠/天(珠海益生生物制药有限公司，S10980077)的生理盐水或200μg PDL1-Fc/鼠/天(北京义翘神州生物技术有限公司，50010-M03H-200)皮下注射，每日1次，直至创面完全愈合。此外，治疗前每天用0.9％生理盐水清洗伤口(图1)，并对创面面积进行定量分析[Kuai L,ZhangJT,Deng Y,et al.Sheng-ji Hua-yu formula promotes diabetic wound healing ofre-epithelization via Activin/Follistatin regulation.BMC Complement AlternMed.2018；18(1):32.]。

11.组织病理学和免疫组织化学染色

在组织病理学检查中，通过创面的纵向做最大横截面。皮肤标本保存在10％中性福尔马林缓冲液中，石蜡包埋制成病理标本，苏木精-伊红染色。组织切片在200倍显微镜下观察细胞形态和数量。

我们采用PCNA(稀释1:6400，Abcam，ab29)、F4/80(稀释1:1200，Cell SignallingTechnology，70076)、CD31(稀释1:600，Cell Signalling Technology，77699)、CD45(稀释1:200，Thermo Fisher Science，MS-355-P)、MPO(稀释1:100，Abcam，ab93665)、CD68(稀释1:600，Abcam，ab955)、eIF3I(稀释1:1600，Proteintech，11287-1-AP)、PDL1(稀释1:2800，Proteintech，17952-1-AP)和IRS4(稀释1:50，Santa Cruz Biotechnology，sc393207)进行免疫组化染色。图像是由两名实验人员在奥林巴斯BH2立式冶金显微镜下拍摄的。在4～5幅图像中计数阳性细胞数，平均计数每张切片的阳性细胞数。

12.酶联免疫吸附试验

我们在创伤形成后第9天，检测各组小鼠血清中的肝肾指标[Ru Y,Li H,Zhang R,et al.Role of keratinocytes and immune cells in the anti-inflammatory effectsof Tripterygium wilfordii Hook.f.in a murine model ofpsoriasis.Phytomedicine.2020；77:153299.]。试剂盒购自建城生物工程研究所(中国南京)。

13.统计分析

实验数据用GraphPad Prism 8进行分析，所有数据均表示为平均值±标准误差(S.E.M.)。用T检验或方差分析比较组间差异。p≤0.05和p≤0.01的值分别被认为有显著或非常显著的差异。

二、结果

1.PDL1对DU相关缺陷的体内治疗作用

为了研究表皮KC中的PDL1是否与伤口愈合延迟有关，我们建立了DU小鼠模型(图1)，并通过蛋白质印迹分析比较了DU创面、PDL1治疗的DU创面和正常组织中PDL1的水平。如图17a所示，与正常部位相比，PDL1在DU创面的表达明显下调，并在使用PDL1后恢复，提示PDL1缺陷可能与延迟愈合有关。为了进一步评估这种可能性，我们局部应用了PDL1或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，阳性对照药物)，在第3天和第5天观察到PDL1组比bFGF组更显著的伤口愈合效果(图2、3)。通过分析DU伤口延迟愈合的基本特征，免疫组织化学染色显示在第7天细胞增殖不良(PCNA所示)，炎症反应严重(F4/80所示)，血管生成丰富(CD31所示)(图4、图17b)。值得注意的是，每天使用PDL1治疗伤口，可诱导组织形成、炎症消退、血管减少，这与bFGF治疗的效果相似(图4)。在PDL1处理的创面中，PCNA(表示增殖)的表达水平是DU组的4倍，而促炎性细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平在PDL1处理的创面中分别比DU组低4倍和2.5倍(图5a)。此外，我们还发现PDL1在第9天的伤口上也有类似的效果(图17c)。在这些实验中，PDL1在促进伤口愈合和改善疗效方面优于bFGF。为了在初步疗效的基础上进一步评估PDL1的安全性，在DU模型建立9天后检测肝肾功能，没有发现明显的安全性问题(图18a)。这些数据表明，外用PDL1可加速上皮化和减轻炎症，DU愈合障碍可能一部分是由于内源性PDL1缺乏所致。

2.PDL1促进HaCaT细胞增殖/迁移并减轻炎症

已知PDL1在KC的再上皮化中起作用，我们使用慢病毒来上调HaCaT细胞中PDL1的表达(PDL1过表达载体购自HarOLife,CVhPDL101)(图18b)。接下来，我们通过CCK-8、划痕实验和Transwell检测，比较了PDL1过表达的HaCaT细胞和bFGF处理的HaCaT细胞的效果。CCK-8检测显示，PDL1过表达细胞在48h和72h的增殖能力明显高于bFGF处理的细胞(图5b)。在迁移实验中，过表达PDL1的细胞在6h时迁移增加，并且随着时间的推移效果增加；在12h和24h时，PDL1过表达的细胞与bFGF处理的细胞相比差异显著(图6、图7a)。Transwell实验在48h时显示，过表达PDL1的细胞可明显增加细胞迁移，且幅度大于bFGF诱导的细胞迁移(图8)。与未处理的HaCaT细胞相比，过表达PDL1的细胞PCNA表达明显高于bFGF(图7b)。以上结果证实PLD1有助于促进HaCaT细胞的再上皮化。为了更好地了解PDL1在炎症调节中的意义，对三组的促炎细胞因子TNF-α和IL-6进行了检测。与体内实验结果一致，PDL1过表达细胞的TNF-α略有改善，IL-6的表达比正常细胞低2倍，且PDL1的抗炎作用略好于bFGF(图7b)。综上所述，这些结果表明PDL1在体内和体外都可以通过减少持续的炎症和促进KC的增殖与迁移来克服DU的伤口愈合缺陷。

3.PDL1过表达HaCaT细胞的转录谱分析

为了进一步确定PDL1在创伤修复中的作用，我们检测了PDL1过表达的HaCaT细胞和正常HaCaT细胞的转录谱，并基于RNA测序进行了比较。在对测序数据进行初步质量控制后，共保留了25835个基因，其中474个基因被鉴定为DE mRNAs，且93个基因(19.45％)上调，381个基因(80.55％)下调(图9)。这一结果提示PDL1过表达的细胞与正常细胞的mRNAs表达状态有很大的不同，PDL1可能通过调节DE mRNA的表达，从而促进伤口愈合。

此外，我们进行了GO和KEGG途径富集分析。下调的差异mRNA相关的前10位GO术语主要与B细胞受体信号通路、免疫球蛋白复合物、适应性免疫反应、免疫球蛋白受体结合、免疫球蛋白介导的免疫反应、血液微粒、补体激活、B细胞介导的免疫、通过循环免疫球蛋白和吞噬作用介导的体液免疫反应(图10a)。上调的差异mRNA前10位主要与凝血、凝血、止血、细胞外空间、蛋白分泌调节、辐射反应、蛋白分泌、体液水平调节、伤口愈合、小分子结合有关(图10b)。这些结果表明，PDL1在HaCaT细胞中的过表达上调了参与伤口愈合和凝血的DEmRNAs，这有利于组织重建，而它下调了参与免疫反应的DE mRNAs，这些与炎症机制和皮肤功能密切相关。

KEGG通路分析(TOP5)显示，上调的差异mRNA主要与糖尿病并发症、血小板活化、阿米巴病、趋化因子信号通路和Rap1信号通路中的AGE-RAGE信号通路有关(图10c)。此外，下调的DE mRNA富集在B细胞受体信号通路、免疫球蛋白复合物、适应性免疫反应、免疫球蛋白受体结合和免疫球蛋白介导的免疫反应中(图10d)。有趣的是，这些信号通路显示出与糖尿病密切的相关性，这表明信号通路尤其与炎症和伤口愈合有关。

4.IRS4是PDL1下游效应分子，加重DU缺陷

值得注意的是，IRS4是PDL1过表达下调最显著的差异mRNA(图9b、图23)。因此，我们首先通过比较IRS4在DU创面、PDL1干扰的DU伤口和正常组织中的表达来确定IRS4在DU缺陷中的功能。我们发现IRS4的高表达与DU中PDL1的缺失有关(图11a)，IRS4可能对DU的恢复起抑制作用。为了进一步验证IRS4在HaCaT细胞中的生物学功能，使用针对siRNA敲低IRS4表达(图23a，三个针对IRS4的小干扰RNA被电穿孔到HaCaT细胞中；选择si-IRS4#3：上游:5’CCA CGA AAG AAU GCA AAG ATT 3’(SEQ ID NO:27)；下游:5’UCU UUG CAU UCU UUC GUGGTT 3’(SEQ ID NO:28)进行后续实验)，并使用过表达质粒上调IRS4(图23b)。在IRS4基因敲低的细胞中，检测到增殖和迁移增加，而IRS4过表达的细胞则显示相反的结果(图11b-f)。此外，与正常细胞相比，IRS4基因敲除细胞中TNF-α和IL-6的表达降低，而IRS4过表达导致促炎细胞因子的表达显著增加(图11g)。综上所述，IRS4通过减少细胞增殖和迁移，以及加重炎症浸润，损害了愈创的生物学过程。

为了确定PDL1和IRS4之间的调控关系，用针对人PDL1的siRNA来敲除PDL1(图23c，将三个针对PDL1的小干扰RNA电穿孔到HaCaT细胞中，并选择si-PDL1#2用于后续实验)。在PDL1基因敲低的细胞中检测到IRS4的高表达，而PDL1过表达导致IRS4的表达降低(图23d)。这些结果表明，IRS4是PDL1的下游效应因子。此外，我们进行了挽救实验，以进一步验证PDL1和IRS4之间的功能关系(图12a-f)。IRS4过表达可部分逆转PDL1过表达介导的细胞增殖和迁移的增加以及炎症的减轻(图12a-f)。总之，这些发现表明PDL1至少部分通过抑制IRS4的表达来改善创面愈合表型。

5.eIF3I与PDL1相互作用

为了确定与PDL1相互作用的细胞蛋白，我们使用PDL1过表达的细胞进行了IP-MS实验。质谱分析确定了107个可以与PDL1特异结合的蛋白质。表4列出了最丰富的20个蛋白质。此外，通过利用蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，我们发现eIF3I可能在PDL1引导的翻译调控中发挥核心作用(图13a)。此外，我们应用Co-IP实验证实了eIF3I和PDL1之间的相互作用(图13b)。

表4 IP-MS鉴定PDL1相互作用蛋白(前20位)

6.eIF3I通过PDL1-IRS4轴改变DU相关的疾病表型

由于eIF3I可以与PDL1相互作用，我们接下来研究eIF3I是否在DU愈合的调节中起关键作用。使用针对人eIF3I的siRNA敲低eIF3I(图24a，三个针对eIF3I的小干扰RNA被电穿孔到HaCaT细胞，选择si-eIF3I#2进行后续实验)，并使用过表达质粒(购自HarOLife，CVhEIF3I01)上调eIF3I(HarOLife，CVhEIF3I01)在HaCaT细胞中的表达(图24b)。eIF3I基因敲除可显著抑制细胞增殖和迁移，增加炎症浸润(图14a-e)。另一方面，当eIF3I在HaCaT细胞中过表达时，细胞的增殖和迁移显著增加，炎症浸润减轻(图14a-e)。这些结果表明eIF3I对DU的愈合有积极作用，可能通过PDL1介导的生物学过程发挥作用。

此外，我们通过评估eIF3I对PDL1和IRS4的影响来验证eIF3I通过PDL1-IRS4轴调节下游进程的假设。Western blot分析显示，eIF3I基因敲低可降低PDL1的表达，增加IRS4的表达，而eIF3I过表达的细胞则表现出相反的结果(图15a)。在进一步研究eIF3I在调节PDL1-IRS4轴中的功能时，我们发现eIF3I过表达显著促进了细胞的增殖和迁移，并减轻了PDL1基因敲低引起的炎症变化(图15e-f)。此外，上调的IRS4部分抵消了eIF3I过表达和PDL1基因敲低引起的表型(图15e-f)。综上所述，eIF3I至少部分地通过PDL1-IRS4轴加速增殖、迁移和抗炎。

7.eIF3I、PDL1和IRS4在人DU中的表达

为验证eIF3I/PDL1/IRS4在临床中的作用，我们分别以糖尿病创面皮肤和正常皮肤样本，选取创面边缘的DU组织，研究eIF3I、PDL1和IRS4的激活状态。先前的研究报道，糖尿病愈合区域的特征是在自由基和炎症介质存在的情况下持续免疫细胞(如白细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)浸润，导致广泛的组织损伤。因此，我们检测了皮肤样本中的免疫细胞，包括白细胞(以CD45+细胞表示)、激活的中性粒细胞(以MPO+细胞表示)和巨噬细胞(以CD68+细胞表示)。在糖尿病创面样本中，CD45+、MPO+和CD68+细胞的免疫染色各不相同，但总体来说，它们的染色强度高于正常皮肤(图16a)。值得注意的是，与正常皮肤样本相比，糖尿病创面皮肤样本中eIF3I和PDL1的胞浆染色减少，而IRS4染色在糖尿病创面皮肤样本中表达上调(图16b-c)。综上所述，eIF3I-PDL1-IRS4轴是治疗DU的潜在靶点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市皮肤病医院

<120> eIF3I-PDL1-IRS4轴在制备难治性溃疡药物中的应用

<130> /

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<212> RNA

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<212> RNA

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<212> RNA

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tgggctacag gcttgtcact 20

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<212> RNA

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ucuuugcauu cuuucgugg 19

Claims (9)

1.PDL1或其上调剂在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用。

2.IRS4抑制剂在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用。

3.eIF3I或其上调剂在制备治疗糖尿病溃疡药物中的应用。

4.一种防治糖尿病溃疡的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物以PDL1或其上调剂为活性成分，并包含药学上可接受的载体。

5.一种防治糖尿病溃疡的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物以IRS4抑制剂为活性成分，并包含药学上可接受的载体。

6.一种防治糖尿病溃疡的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物以eIF3I或其上调剂为活性成分，并包含药学上可接受的载体。

7.根据权利要求4-6任一所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为外用剂型或内用剂型。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为贴剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、巴布剂、喷雾剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。

9.PDL1、IRS4或eIF3I作为靶点在筛选防治糖尿病溃疡或缓解糖尿病溃疡创面炎症的药物中的应用。

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