CN113684310A - 一种快速鉴别新型冠状病毒型别的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速鉴别新型冠状病毒型别的试剂盒及方法，该试剂盒包括荧光标记探针和引物对：引物对包括用于扩增与新冠病毒ORF1ab区互补的cDNA的引物对1和用于扩增与新冠病毒ORF8区互补的cDNA的引物对2；荧光标记探针包括：FAM标记的探针1，FAM标记的探针2、VIC标记探针1和VIC标记探针2；本发明试剂盒可通过荧光RT‑PCR方法快速完成对新型冠状病毒病毒型别鉴定，可以推广至基层医疗机构和疾控机构，基层人员可及时、有效开展新型冠状病毒病毒型别鉴定工作；同时缩短了新型冠状病毒病毒型别鉴定的检测周期，利于疫情防控。
Description
技术领域
本发明涉及新型冠状病毒鉴别技术领域，具体涉及一种快速鉴别新型冠状病毒型别的试剂盒及方法。
背景技术
目前，新型冠状病毒实验室检测最主要的方法是实时荧光RT-PCR方法，主要针对新型冠状病毒基因组中开放阅读框1ab(ORF1ab)和核壳蛋白区(N)区保守基因，来判断待检标本是否含有新冠病毒基因。但是，这种real-time RT-PCR试剂盒只可判断待检标本是否为新冠病毒感染，而不能对病毒型别进行分型(L型和S型)检测。
目前对新型冠状病毒的型别鉴定，主要通过对病毒进行全基因组测序和分析来完成，测序后主要通过8782和28144两个位点的核苷酸序列，来判断病毒型别，目前各国研究者一致认为S型为8782T、28144C，L型为8782C、28144T。但全基因组测序要求具备基因测序仪等相关设备，设备价格昂贵；全基因组测序对人员要求高，无论是前期实验操作，还是后续下机数据分析，对人员要求很高，因此不能满足基层工作需要。而且测序周期长，不利于疫情的快速处置。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速鉴别新型冠状病毒型别的试剂盒及方法，该试剂盒能够通过荧光RT-PCR方法，完成对新型冠状病毒8782和28144两个位点核苷酸序列的识别，达到快速鉴定病毒型别的目的。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种快速鉴别新型冠状病毒型别的试剂盒，所述试剂盒包括荧光标记探针和引物对：
所述引物对包括：用于扩增与新冠病毒ORF1ab区互补的cDNA的引物对1和用于扩增与新冠病毒ORF8区互补的cDNA的引物对2；
所述荧光标记探针包括：FAM标记的探针1，FAM标记的探针2、VIC标记探针1和VIC标记探针2；
所述VIC标记的探针1的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述VIC标记的探针2的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述FAM标记探针1的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述FAM标记探针2的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明上述试剂盒中VIC标记的探针1和FAM标记探针1检测包括新冠病毒ORF1ab区互补的cDNA对应的8782位点在内的靶基因，VIC标记的探针1对应的8782位点为T，FAM标记探针1对应的8782位点为C；经PCR扩增后，可通过报告荧光信号FAM/VIC来判断新冠病毒ORF1ab区的8782位点为T/C；此外，VIC标记的探针2和FAM标记探针2检测包括新冠病毒ORF8区互补的cDNA对应的28144位点在内的靶基因，VIC标记的探针1对应的28144位点为C，FAM标记探针1对应的28144位点为T；经PCR扩增后，可通过报告荧光信号FAM/VIC来判断新冠病毒ORF8区的28144位点为C/T；从而达到病毒型别鉴定的目的。
优选地，所述引物对1包括正向引物1和反向引物1；
所述正向引物1序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物1序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述引物对2包括正向引物2和反向引物2；
所述正向引物2序列如SEQ ID NO.7所示，所述反向引物2序列如SEQ ID NO.8所示。
优选地，所述试剂盒还包括RT-PCR反应液和酶混合物。
优选地，所述酶混合物包括Taq DNA聚合酶、高热稳定性的M-MLV逆转录酶和RNA酶抑制剂。
优选地，所述RT-PCR反应液包括RT-PCR缓冲液、PCR增强剂、氯化镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物。
优选地，所述PCR缓冲液包括Tris-HCl(pH8.0)、硫酸铵、氯化钾和Triton X-100。
优选地，所述PCR增强剂选自四甲基氯化铵、肉碱、海藻糖和非离子去污剂NP-40中的至少一种。
本发明第二方面提供一种基于上述试剂盒鉴别新型冠状病毒型别的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)采集鼻咽拭子样本并提取病毒核酸RNA；
(b)将RNA分别置于第一反应体系和第二反应体系中进行RT-PCR扩增；
(c)待扩增结束进行荧光读取，并根据读取结果进行基因分型。
优选地，所述第一反应体系包括：
RT-PCR反应液、酶混合物、引物对1、VIC标记的探针1以及FAM标记探针1；
所述第二反应体系包括：
RT-PCR反应液、酶混合物、引物对2、VIC标记的探针2以及FAM标记探针2；
所述RT-PCR扩增程序如下：
50℃，30min；95℃，3min；(95℃，5s；60℃，20s)×45个循环。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明上述试剂盒中VIC标记的探针1和FAM标记探针1检测包括新冠病毒ORF1ab区互补的cDNA对应的8782位点在内的靶基因，VIC标记的探针1对应的8782位点为T，FAM标记探针1对应的8782位点为C；经PCR扩增后，可通过报告荧光信号FAM/VIC来判断新冠病毒ORF1ab区的8782位点为T/C；此外，VIC标记的探针2和FAM标记探针2检测包括新冠病毒ORF8区互补的cDNA对应的28144位点在内的靶基因，VIC标记的探针1对应的28144位点为C，FAM标记探针1对应的28144位点为T；经PCR扩增后，可通过报告荧光信号FAM/VIC来判断新冠病毒ORF8区的28144位点为C/T；从而达到病毒型别鉴定的目的；可见，本发明试剂盒可通过荧光RT-PCR方法，快速完成对新型冠状病毒病毒型别鉴定；本发明试剂盒可以推广至基层医疗机构和疾控机构，基层人员可及时、有效开展新型冠状病毒病毒型别鉴定工作；同时缩短了新型冠状病毒病毒型别鉴定的检测周期，利于疫情防控。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本实施例为一种快速鉴别新型冠状病毒型别的试剂盒，该试剂盒包括荧光标记探针、引物对、RT-PCR反应液和酶混合物：
引物对包括：用于扩增与新冠病毒ORF1ab区互补的cDNA的引物对1和用于扩增与新冠病毒ORF8区互补的cDNA的引物对2；
引物对1包括正向引物1和反向引物1；
正向引物1序列如SEQ ID NO.5所示，具体序列为5’-TGCTGATTTTGACACATGGTT-3’；反向引物1序列如SEQ ID NO.6所示，具体序列为5’-TGCAGCAATCAATGGGCAA-3’；
引物对2包括正向引物2和反向引物2；
正向引物2序列如SEQ ID NO.7所示，具体序列为5’-ATCACCCATTCAGTACATCG-3’；反向引物2序列如SEQ ID NO.8所示，具体序列为5’-TAGTTTGTTCGTTTAGATGA-3’；
荧光标记探针包括：VIC标记的探针1，CIV标记的探针2、FAM标记探针1和FAM标记探针2；
VIC标记的探针1的序列如SEQ ID NO.1所示，具体序列为5’-VIC-ACATGGTTTAGTCAGCGT-MGB；
VIC标记的探针2的序列如SEQ ID NO.2所示，具体序列为5’-VIC-CCTGTTCACCTTTTACAA-MGB；
FAM标记探针1的序列如SEQ ID NO.3所示，具体序列为5’-FAM-CATGGTTTAGCCAGCGT-MGB；
FAM标记探针2的序列如SEQ ID NO.4所示，具体序列为5’-FAM-CCTGTTTACCTTTTACAA-MGB；
酶混合物包括Taq DNA聚合酶、高热稳定性的M-MLV逆转录酶和RNA酶抑制剂。
RT-PCR反应液包括RT-PCR缓冲液、PCR增强剂、氯化镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物。
PCR缓冲液包括Tris-HCl(pH8.0)、硫酸铵、氯化钾和Triton X-100。
PCR增强剂选自四甲基氯化铵、肉碱、海藻糖和非离子去污剂NP-40中的至少一种。
实施例2
本实施例为一种基于实施例1试剂盒鉴别新型冠状病毒型别的方法，该方法包括如下步骤：
(a)样品处理，取鼻咽拭子标本放入2mL采样液中，充分震荡后，取200ul上清液提取病毒核酸RNA；
(b)将RNA分别置于第一反应体系和第二反应体系中进行RT-PCR扩增，其中，包括RNA的第一反应体系如下：
引物探针混合物①包括：引物对1、VIC标记的探针1以及FAM标记探针
包括RNA的第二反应体系如下：
引物探针混合物①包括：引物对2、VIC标记的探针2以及FAM标记探针2；
RT-PCR扩增程序如下：
50℃，30min；95℃，3min；(95℃，5s；60℃，20s)×45个循环；
(c)待扩增结束进行荧光读取，并根据读取结果进行基因分型，其中，根据读取结果进行基因分型包括：
FAM，VIC通道均无扩增曲线，结果判定为阴性；VIC通道Ct值≤35.0，且出现明显的指数增长期，表示样本S型新型冠状病毒为阳性；FAM通道Ct值≤35.0，且出现明显的指数增长期，表示样本L型新型冠状病毒为阳性；两个通道阳性对照品均无扩增曲线，说明扩增结果无效。病毒检测结果的Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，如果Ct值仍小于40，且曲线有明显的指数增长期，可报告样本阳性，否则报告样本阴性或者被检测样本核酸浓度含量低于该检测方法检测限。
目前，采用上述方法已对13例患者感染病毒进行分型，其分型结果与通过全基因组检测所得结果一致相同，其准确率达到100％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
Claims (10)
1.一种快速鉴别新型冠状病毒型别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括荧光标记探针和引物对：
所述引物对包括：用于扩增与新冠病毒ORF1ab区互补的cDNA的引物对1和用于扩增与新冠病毒ORF8区互补的cDNA的引物对2；
所述荧光标记探针包括：FAM标记的探针1，FAM标记的探针2、VIC标记探针1和VIC标记探针2；
所述VIC标记的探针1的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述VIC标记的探针2的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述FAM标记探针1的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述FAM标记探针2的序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对1包括正向引物1和反向引物1；
所述正向引物1序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物1序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对2包括正向引物2和反向引物2；
所述正向引物2序列如SEQ ID NO.7所示，所述反向引物2序列如SEQ ID NO.8所示。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-PCR反应液和酶混合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合物包括Taq DNA聚合酶、高热稳定性的M-MLV逆转录酶和RNA酶抑制剂。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液包括RT-PCR缓冲液、PCR增强剂、氯化镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包括Tris-HCl(pH8.0)、硫酸铵、氯化钾和Triton X-100。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR增强剂选自四甲基氯化铵、肉碱、海藻糖和非离子去污剂NP-40中的至少一种。
9.基于权利要求1～8任一所述试剂盒鉴别新型冠状病毒型别的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)采集鼻咽拭子样本并提取病毒核酸RNA；
(b)将RNA分别置于第一反应体系和第二反应体系中进行RT-PCR扩增；
(c)待扩增结束进行荧光读取，并根据读取结果进行基因分型。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一反应体系包括：
RT-PCR反应液、酶混合物、引物对1、VIC标记的探针1以及FAM标记探针1；
所述第二反应体系包括：
RT-PCR反应液、酶混合物、引物对2、VIC标记的探针2以及FAM标记探针2；
所述RT-PCR扩增程序如下：
50℃，30min；95℃，3min；(95℃，5s；60℃，20s)×45个循环。
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2021
- 2021-08-03 CN CN202110885506.5A patent/CN113684310A/zh active Pending
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