CN116287425A - 一种进行hpv检测或分型的探针及其引物探针组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种进行HPV检测和/或分型的探针的具体序列;还提供了一种基于荧光实时定量PCR进行HPV检测和/或分型的引物与探针组合。该探针能提高整体扩增效率,减少二聚体、二级结构、非特异性扩增产物生成的概率,减少探针合成成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种HPV检测和/或分型方法,特别是涉及一种探针。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。根据临床数据显示,人乳头状瘤病毒(papillomavirus,HPV)与宫颈癌的发生存在明确的关系,在99.9%的宫颈癌患者中均可检测出人乳头状瘤病毒。
HPV是一种嗜上皮性病毒,在人和动物中分布广泛,有高度的特异性。HPV可引起人类良性的肿瘤和疣,如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。HPV属双链闭环的小DNA病毒,包含约8000个碱基对分为3个功能区。早期转录区(E区)主要控制病毒的复制和转化功能;晚期转录区(L区)编码病毒的衣壳蛋白;长控制区(LCR区)包含复制起始区和复制转录控制元件。20世纪80年代,德国病毒学家Harald zur Hausen教授首次提出HPV病毒与宫颈癌发病相关的假说之后,经过20多年的科学研究,国际癌症研究所在1995年正式确认,高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要病因。依照WHO国际癌症研究机构(IARC)的研究成果,HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73等15种基因型在2005年的专题讨论会议上被正式认定为高危型。
因此,检测宫颈细胞样本中人乳头瘤状病毒(HPV)的存在与具体基因型,成为宫颈癌预防及治疗的一种普遍早期诊断方法。目前检测人乳头瘤病毒DNA大多选择的靶点为E6、E7区或者L1区。其中L1区是区分不同亚型的主要依据根据L1区基因序列差异,可将HPV分为不同亚型。
荧光实时定量PCR是检测病原体核酸应用最广泛的方法,它利用特异性或通用引物对目的片段进行扩增并与特异性荧光标记的探针杂交或通过荧光染料与PCR产物结合,连续监测探针或荧光染料产生的荧光信号的变化,通过在PCR指数扩增其间的荧光信号强弱来测定特异性产物的量,从而推断目的基因的初始量。
其中用到的TaqMan荧光探针是一段序列特异的、荧光标记的寡核苷酸,其5’端标记一个报告荧光基团(Reporter,R),一般为FAM、VIC、HEX、TET等荧光基团,3’端标记一个淬灭荧光基团(Quencher,Q),一般为TAMRA、BHQ1或BHQ2等。TaqMan探针法qPCR的原理是在PCR扩增时加入一对引物的同时另外加入一条特异性的TaqMan荧光探针,该探针与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。当探针完整时,报告荧光基团和淬灭荧光基团的空间距离很近,报告荧光基团发射的荧光信号会被淬灭荧光基团吸收,使仪器检测不到荧光信号。在PCR延伸阶段,Taq DNA聚合酶沿着模板链从5’到3’的方向合成新链,当Taq DNA聚合酶到达探针结合位点时,Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性将探针5’端连接的报告荧光基团切割下来,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而发出荧光,切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比,因此,通过检测PCR反应体系中的荧光强度可以达到检测PCR产物扩增量的目的。
虽然TaqMan探针法有众多优点,但也有明显的局限性最关键的问题就是其探针的设计难度大,限制性因素多。各探针之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在。特别是在多重体系扩增的时候,各探针之间随着个数增多设计难度加大,整体扩增效率可能由于探针的设计不完美而大大降低。
另外,探针合成费用较贵,实验成本较高。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种进行HPV检测和/或分型的探针及其使用方法。该探针能提高整体扩增效率,减少二聚体、二级结构、非特异性扩增产物生成的概率,减少探针合成成本。
本发明是这样实现的:
本发明实施例提供一种进行HPV检测和/或分型的探针:包括以下探针的一种或多种:
探针1具有包含SEQ ID NO:1的核酸序列或其互补序列;
探针2具有包含SEQ ID NO:2的核酸序列或其互补序列;
探针3具有包含SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列;
探针4具有包含SEQ ID NO:4的核酸序列或其互补序列。
在一些实施方式中,上述探针还包括以下探针的一种或两种:
探针5具有包含SEQ ID NO:5的核酸序列或其互补序列;
探针6具有包含SEQ ID NO:6的核酸序列或其互补序列。
本发明实施例还提供了一种HPV检测和/或分型的引物与探针组合。
本发明实施例还提供了一种HPV检测和/或分型的试剂盒,包含上述的探针或引物与探针组合。
本发明实施例还提供了一种标记探针或标记探针与引物组合,包括上述的探针或探针与引物组合,探针5’端标记一个报告荧光基团,3’端标记一个淬灭荧光基团。具体地,所述报告荧光基团为FAM、VIC、HEX、TET、ROX、CY5或CY3,所述淬灭荧光基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2。
本发明实施例还提供了上述的探针、引物与探针组合、标记探针或标记探针与引物组合在制备HPV检测和/或分型的试剂盒中的应用。
可选地,HPV分型选自33、52、58、39、45、68、56、66、31、35、51或59;
可选地,HPV分型选自33、52、58;可选地,HPV分型选自39、45、68;可选地,HPV分型选自56、66;可选地,HPV分型选自31、35。
本发明实施例还提供了一种HPV检测和/或分型的方法,包含将上述的探针、引物与探针组合、标记探针或标记探针与引物组合,与待测核酸反应的步骤。
本发明实施例还提供了一种筛查或辅助诊断宫颈癌的试剂盒,其包括上述的探针、引物与探针组合、标记探针或标记探针与引物组合。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为探针设计软件上呈现的核酸探针与三个模板的配对的原理。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供了一种进行HPV检测和/或分型的探针,包括以下探针的一种或多种:
探针1具有包含SEQ ID NO:1的核酸序列或其互补序列;
探针2具有包含SEQ ID NO:2的核酸序列或其互补序列;
探针3具有包含SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列;
探针4具有包含SEQ ID NO:4的核酸序列或其互补序列。
在可选的实施方式中,探针还包括以下探针的一种或两种:
探针5具有包含SEQ ID NO:5的核酸序列或其互补序列;
探针6具有包含SEQ ID NO:6的核酸序列或其互补序列。
本发明实施例提供了一种核酸探针,该核酸探针可以结合两个以上的序列不同的靶序列,且与至少一个靶序列有一个以上的碱基错配。参考图1的原理,一条核酸探针可以和三个序列不同的靶序列结合,三个靶序列在序列上有一定相似性,从而该核酸探针可以通过几个碱基的错配与三个靶序列均结合。需要说明的是,靶序列可以是病毒不同亚型中可以作为分型依据的序列区段,通过核酸探针对靶序列的结合对病毒进行检测和/或分型。
其中,探针1可以检测高危型HPV的L1基因中33、52、58的分型,探针2可以检测高危型HPV的L1基因中39、45、68的分型,探针3可以检测高危型HPV的L1基因中56、66的分型,探针4可以检测高危型HPV的L1基因中31、35的分型,探针5可以检测高危型HPV的L1基因中51的分型,探针6可以检测高危型HPV的L1基因中59的分型。
术语“探针”是指合成或生物产生的核酸(DNA或RNA),其通过设计或选择而含有特定核苷酸序列,这允许其在限定的预定严格性下与“目标核酸”,在本文情况下,与高危型HPV的L1基因中的靶序列杂交。“探针”可以被称为“检测探针”,意指它检测目标核酸。
术语“其互补序列”是指与给定核酸是相同长度且准确互补的核酸
可以理解的是,只要靶序列包含探针的结合区域,就可以实现检测和/或分型。以利用PCR扩增获得靶序列为例,本发明实施例还提供HPV检测和/或分型的引物与探针组合,包括以下引物与探针组合的至少一种:
引物与探针组合1:探针1具有包含SEQ ID NO:1的核酸序列或其互补序列,以及包括引物对1-3,所述引物对1用于扩增靶序列1,靶序列1包含HPV 33型L1基因的第879~914位核苷酸,所述引物对2用于扩增靶序列2,靶序列2包含HPV 52型L1基因的第972~1008位核苷酸,所述引物对3用于扩增靶序列3,靶序列3包含HPV 58型L1基因的第958~993位核苷酸;
引物与探针组合2:探针2具有包含SEQ ID NO:2的核酸序列或其互补序列,以及包括引物对4-6,所述引物对4用于扩增靶序列4,靶序列4包含HPV 39型L1基因的第922~948位核苷酸,所述引物对5用于扩增靶序列5,靶序列5包含HPV 45型L1基因的第1010~1037位核苷酸,所述引物对6用于扩增靶序列6,靶序列6包含HPV 68型L1基因的第924~951位核苷酸;
引物与探针组合3:探针3具有包含SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列,以及包括引物对7-8,所述引物对7用于扩增靶序列7,靶序列7包含HPV 56型L1基因的第1025~1054位核苷酸,所述引物对8用于扩增靶序列8,靶序列8包含HPV 66型L1基因的第920~947位核苷酸;
引物与探针组合4:探针4具有包含SEQ ID NO:4的核酸序列或其互补序列,以及包括引物对9-10,所述引物对9用于扩增靶序列7,靶序列9包含HPV 31型L1基因的第885~914位核苷酸,所述引物对10用于扩增靶序列10,靶序列10包含HPV 35型L1基因的第876~905位核苷酸。
在可选的实施方式中,引物与探针组合还包括以下引物与探针组合的至少一种:
引物与探针组合5:探针5具有包含SEQ ID NO:5的核酸序列或其互补序列,以及包括引物对11,所述引物对11用于扩增靶序列11,靶序列11包含HPV 51型L1基因的第924~948位核苷酸;
引物与探针组合6:探针6具有包含SEQ ID NO:6的核酸序列或其互补序列,以及包括引物对12,所述引物对12用于扩增靶序列12,靶序列12包含HPV 59型L1基因的第924~954位核苷酸。
术语”引物”在本文中如本领域技术人员已知的使用,并且是指寡聚化合物,主要是寡核苷酸,但也指修饰的寡核苷酸,其能够通过模板依赖性DNA聚合酶”引发”DNA合成,即例如寡核苷酸的3'-末端提供游离3'-OH基团,在那里更多的”核苷酸”可以通过模板依赖性DNA聚合酶与之结合,建立3'至5'磷酸二酯键,由此使用脱氧核苷三磷酸,并且由此释放焦磷酸盐。
在一些实施方式中,为了获得靶序列,上述引物与探针组合中的引物对,可以是以下具体序列:
所述引物对1为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8;
所述引物对2为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10;
所述引物对3为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:8;
所述引物对4为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13;
所述引物对5为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15;
所述引物对6为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:13;
所述引物对7为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18;
所述引物对8为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:18;
所述引物对9为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21;
所述引物对10为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:21;
所述引物对11为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24;
所述引物对12为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。
本发明实施例还提供一种标记探针或标记探针与引物组合,包括上述的探针或探针与引物组合,探针5’端标记一个报告荧光基团,3’端标记一个淬灭荧光基团。
在可选的实施方式中,上述的探针其5’端标记一个报告荧光基团,3’端标记一个淬灭荧光基团。
在可选的实施方式中,所述报告荧光基团为FAM、VIC、HEX、TET、ROX、CY5或CY3,所述淬灭荧光基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2。
本发明实施例还提供了上述的探针、引物与探针组合、标记探针或标记探针与引物组合在制备HPV检测和/或分型的试剂盒中的应用。
在可选的实施方式中,HPV分型选自33、52、58、39、45、68、56、66、31、35、51或59;
在可选的实施方式中,HPV分型选自33、52、58;在可选的实施方式中,HPV分型选自39、45、68;在可选的实施方式中,HPV分型选自56、66;在可选的实施方式中,HPV分型选自31、35。
本发明实施例还提供了一种HPV检测和/或分型的试剂盒,其包括采用如前述任意实施例或实施方式所述的探针、引物与探针组合、标记探针或标记探针与引物组合。
本发明实施例还提供了一种HPV检测和/或分型的方法,其包括采用如前述任意实施例或实施方式所述的探针、引物与探针组合、标记探针或标记探针与引物组合,与待测核酸反应的步骤。
在可选的实施方式中,所述方法基于荧光实时定量PCR。
本发明实施例还提供了一种筛查或辅助诊断宫颈癌的试剂盒,其包括采用如前述任意实施例或实施方式所述的探针或引物与探针组合。
实施例
实施例1
通过分析基因区域以及市场调研,选择了高危型HPV的L1区基因序列作为靶序列,应用Primer Premier 5.0软件在选取的序列区域设计引物,建立和优化该检测方法。通过评价其准确性、灵敏度和特异性,建立一种荧光PCR方法,用于高危型HPV基因的检测或分型。
设计的引物对信息:
说明:56/66-R,31/35-R,39/68-R,33/58-R分别独立的表示如下意思,例如56/66-R表示这条序列既是56-R也是66-R,其余不在赘述。
实施例2
进行核酸探针的设计和获得:
使用Bioeidit软件进行核酸探针设计,在核酸探针结合L1扩增区段靠中间的区域,增加或者置换一些碱基,让一条探针序列可以通过不同的错配形式与几种亚型的目的条带相结合(参考图1所示的原理),得到以下探针序列,合成时带上合适的荧光基团FAM、以及淬灭基团BHQ1:
实施例3
单重扩增检测:针对不同型别的核酸探针和对应的一对引物,分别在单管中进行检测,每个实验组含有不同型别的阳性样本,且每个实验组设置两管平行实验:
1.1 检测样本核酸提取:样本使用10000CP/μL的人工合成阳性质粒样本,且含有10ng/μL人基因组,使用TIANGEN磁珠法病毒RNA/DNA提取试剂盒提取后,取5μL进行上机检测。
1.2 利用以上引物探针组合配制25μLPCR体系:
每个核酸探针和引物组设置两个复孔平行实验。
1.3 上机扩增程序:
95℃ 15min;(95℃ 10s;52℃ 40s收集ROX、HEX荧光数值;72℃ 20s)45 cycle;25℃ 25s
1.4 通过扩增曲线得到CT值,具体CT值数据将会和下个实施例一起汇总分析。
实施例4
多重扩增检测:所有型别的核酸探针和引物混合在同一管检测,但设置12个实验组,每个实验组含有不同型别的阳性样本,且每个实验组设置两管平行实验。
参照实施例3进行核酸提取、体系配置、设置上机程序。得到的结果和实施例3的单重检测进行合并分析。
从结果上看单重扩增和多重扩增最后扩增结果一致,且对于12种HPV亚型扩增效果差异不大。证明该引物探针组合可以使用且效果良好。各个引物探针之间并不会互相干扰。更重要的是,利用本发明的一条探针,可以同时与多个靶序列结合,实现HPV分型。由于在12重体系下能够实现分型检测,采用至少1条探针与对应的两或三对靶序列引物,同样能够检出相应的HPV分型。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东菲鹏生物有限公司
<120> 一种进行HPV检测或分型的探针及其引物探针组合物
<130> 2021
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
attgtgccaa cattaccatt gt 22
Claims (10)
1.一种进行HPV检测和/或分型的探针,其特征在于:包括以下探针的一种或多种:
探针1具有包含SEQ ID NO:1的核酸序列或其互补序列;
探针2具有包含SEQ ID NO:2的核酸序列或其互补序列;
探针3具有包含SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列;
探针4具有包含SEQ ID NO:4的核酸序列或其互补序列。
2.如权利要求1所述的探针,其特征在于:还包括以下探针的一种或两种:
探针5具有包含SEQ ID NO:5的核酸序列或其互补序列;
探针6具有包含SEQ ID NO:6的核酸序列或其互补序列。
3.一种HPV检测和/或分型的引物与探针组合,其特征在于:包括以下引物与探针组合的至少一种:
引物与探针组合1:探针1具有包含SEQ ID NO:1的核酸序列或其互补序列,以及包括引物对1-3,所述引物对1用于扩增靶序列1,靶序列1包含HPV 33型L1基因的第879~914位核苷酸,所述引物对2用于扩增靶序列2,靶序列2包含HPV 52型L1基因的第972~1008位核苷酸,所述引物对3用于扩增靶序列3,靶序列3包含HPV 58型L1基因的第958~993位核苷酸;
引物与探针组合2:探针2具有包含SEQ ID NO:2的核酸序列或其互补序列,以及包括引物对4-6,所述引物对4用于扩增靶序列4,靶序列4包含HPV 39型L1基因的第922~948位核苷酸,所述引物对5用于扩增靶序列5,靶序列5包含HPV 45型L1基因的第1010~1037位核苷酸,所述引物对6用于扩增靶序列6,靶序列6包含HPV 68型L1基因的第924~951位核苷酸;
引物与探针组合3:探针3具有包含SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列,以及包括引物对7-8,所述引物对7用于扩增靶序列7,靶序列7包含HPV 56型L1基因的第1025~1054位核苷酸,所述引物对8用于扩增靶序列8,靶序列8包含HPV 66型L1基因的第920~947位核苷酸;
引物与探针组合4:探针4具有包含SEQ ID NO:4的核酸序列或其互补序列,以及包括引物对9-10,所述引物对9用于扩增靶序列7,靶序列9包含HPV 31型L1基因的第885~914位核苷酸,所述引物对10用于扩增靶序列10,靶序列10包含HPV 35型L1基因的第876~905位核苷酸。
4.如权利要求3所述的引物与探针组合,其特征在于:还包括以下引物与探针组合的至少一种:
引物与探针组合5:探针5具有包含SEQ ID NO:5的核酸序列或其互补序列,以及包括引物对11,所述引物对11用于扩增靶序列11,靶序列11包含HPV 51型L1基因的第924~948位核苷酸;
引物与探针组合6:探针6具有包含SEQ ID NO:6的核酸序列或其互补序列,以及包括引物对12,所述引物对12用于扩增靶序列12,靶序列12包含HPV 59型L1基因的第924~954位核苷酸。
5.如权利要求3或4所述的引物与探针组合,其特征在于:
所述引物对1为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8;
所述引物对2为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10;
所述引物对3为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:8;
所述引物对4为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13;
所述引物对5为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15;
所述引物对6为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:13;
所述引物对7为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18;
所述引物对8为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:18;
所述引物对9为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21;
所述引物对10为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:21;
所述引物对11为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24;
所述引物对12为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。
6.标记探针或标记探针与引物组合,包括权利要求1或2所述的探针或如权利要求3-5任一项所述的探针与引物组合,其特征在于,探针5’端标记一个报告荧光基团,3’端标记一个淬灭荧光基团;
可选地,所述报告荧光基团为FAM、VIC、HEX、TET、ROX、CY5或CY3,所述淬灭荧光基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2。
7.如权利要求1或2所述的探针、权利要求3-5任一项所述的探针与引物组合、或权利要求6所述的标记探针或标记探针与引物组合在制备HPV检测和/或分型的试剂盒中的应用;
可选地,HPV分型选自33、52、58、39、45、68、56、66、31、35、51或59;
可选地,HPV分型选自33、52、58;可选地,HPV分型选自39、45、68;可选地,HPV分型选自56、66;可选地,HPV分型选自31、35。
8.一种HPV检测和/或分型的试剂盒,其特征在于,包含权利要求1或2所述的探针、权利要求3-5任一项所述的探针与引物组合、或权利要求6所述的标记探针或标记探针与引物组合。
9.一种HPV检测和/或分型的方法,其特征在于,包括将权利要求1或2所述的探针、权利要求3-5任一项所述的探针与引物组合、或权利要求6所述的标记探针或标记探针与引物组合,与待测核酸反应的步骤;
可选地,所述方法基于荧光实时定量PCR。
10.一种筛查或辅助诊断宫颈癌的试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1或2所述的探针、权利要求3-5任一项所述的探针与引物组合、或权利要求6所述的标记探针或标记探针与引物组合。
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