CN114369649A - 一种特异的选择扩增及多重pcr方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种特异的选择扩增及多重PCR方法和应用，涉及生物技术领域。本发明所述的特异的选择扩增及多重PCR方法包括：以核酸内切酶Ⅳ为介导，识别脱碱基位点并切割特定引物，得到可延伸引物，将可延伸引物用于PCR扩增；所述的特定引物是中间引入THF为脱碱基位点，THF两侧序列与模板互补，3’端封闭，无自由羟基，不能延伸。本发明提供的多重PCR方法可用于对生物基因组进行多重PCR扩增、扩增子建库的多重靶标扩增、同时检测多种病原体，以及制备同时检测多种病原体的试剂盒等。很好地解决了多重PCR引物之间的干扰及非特异延伸等关键问题，实现多重检测，灵敏度高，快捷方便，可实现对样本进行批量检测。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种特异的选择扩增及多重PCR方法和应用。
背景技术：
多聚酶链式反应(PCR)是以两段寡核苷酸为引物，由DNA聚合酶催化扩增位于两段引物之间的DNA片段的一项分子生物学技术。该技术自1983年建立以来，因其高灵敏度、高效率、高特异性的特点，已经成为当前生命科学研究与相关领域中的主体与关键方法。目前已经发展了一系列相关技术，如巢式PCR、实时定量PCR、免疫PCR、多重PCR等。其中多重PCR因其高特异性、高效率、低成本的优势，迅速渗透至生命科学的各个领域。
多重PCR(multiplex PCR)或称复合PCR，是在常规PCR基础上发展起来，可在同一PCR体系中通过加入两对或两对以上的引物同时扩增多个靶目标片段。其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。多重PCR在一次反应中就能同时扩增一个基因的多个靶序列。因此，利用能扩增每种靶序列的引物集，就可通过单次PCR扩增多个靶序列。相对于单重PCR，多重PCR具有检测效率高、节约成本的优点，也是二代测序(NGS)中扩增子建库方法的基础。通常多重PCR在4-5对引物范围内可以获得与单重PCR一样的灵敏度，对于多于5重的PCR较难优化，而且特异性大幅降低，产生非特异产物，20对引物以上的多重PCR，即便是通过大量的引物序列筛选，也很难避免非特异反应，只能将扩增循环数限制在一定范围之内，但这样的多重PCR，灵敏度较低。
引物之间的干扰是造成多重PCR系统灵敏度下降最主要的因素，并且造成大量的假阳性，这是因为引物其实浓度较高，在微摩尔级，远远高于模板浓度(至少比最高模板浓度还高万倍)，大量引物消耗在相互之间的部分结合、延伸，并可能与探针进行部分结合，导致灵敏度和特异性大幅度下降。通过不断尝试可以找到适合多重PCR的引物与探针，但极具挑战性，并且对于30对引物以上的多重PCR，挑选引物的工作量再大，也可能在现实实验中无能为力，除非对灵敏度与特异性的要求不高。大量数据表明，只有通过消除引物之间的错误引发聚合，不形成难以预测的二聚体，多重PCR才能获得较好的灵敏度与特异性，例如采用热启动Taq酶显著提高了PCR尤其是多重PCR的灵敏度和稳定性，引物3’端的苄甲基(Roche专利)修饰减少了非特异反应，耐热型RNaaseHⅡ介导的RH PCR(IDT专利)技术等解决了多重PCR特异性上的难题。然而，这些技术还不够，其中以RH PCR最具特色，但需要一个较长时间特定温度下的处理，且RNaaseHⅡ的工作液与多重PCR体系兼容性不够好。因此，本领域亟需一种通用的、简单的、操作方便的、特异性与灵敏度不打折的多重PCR方法。
发明内容：
本发明的目的在于提供了一种特异的选择扩增及多重PCR方法和应用，本发明提供的多重PCR方法很好地解决了多重PCR引物之间的干扰及非特异延伸等关键问题，实现多重检测，灵敏度高，快捷方便，可实现对样本进行批量检测。
本发明一方面提供了一种特异的选择扩增及多重PCR方法，所述的方法包括：以核酸内切酶Ⅳ为介导，识别脱碱基位点并切割特定引物，得到可延伸引物，将可延伸引物用于PCR扩增；
所述的特定引物是中间引入四氢呋喃(THF)为脱碱基位点，THF两侧序列与模板互补，3’端封闭，无自由羟基，不能延伸。
优选地，所述特定引物的THF的3’方向延长了1-N个碱基；更优选地，所述特定引物的THF的3’方向延长了3-9个碱基。
优选地，所述3’端封闭是C3 Spacer封闭或磷酸化封闭。
优选地，所述的核酸内切酶Ⅳ为耐热型核酸内切酶Ⅳ；更优选地，所述的核酸内切酶Ⅳ为Tth nfo酶。
本发明另一方面提供了一种上述特异的选择扩增及多重PCR方法在对生物基因组进行多重PCR扩增中的应用。
本发明还提供了上述特异的选择扩增及多重PCR方法在扩增子建库的多重靶标扩增中的应用。
本发明还提供了上述特异的选择扩增及多重PCR方法在同时检测多种病原体中的应用。比如血液筛查HBV-HCV-HIV1-HIV2等的检测、呼吸道病毒联检、呼吸道8-24种病原体的检测等。
本发明还提供了上述特异的选择扩增及多重PCR方法在制备同时检测多种病原体的试剂盒中的应用。
本发明原理如图1所示，本发明通过封闭引物的3’端达到不会延伸的目标，无法形成引物二聚体，即便引物间部分结合，也无法消耗引物。修饰引物能否延伸取决于多重PCR体系中THF两侧序列与模板的匹配度，以及AP酶对核酸的特异性，例如核酸内切酶Ⅳ只能切割双链DNA上的AP位点，对互补双链的长度及AP位点位于何处并无特殊要求，所以便于设计修饰引物，当然修饰引物之间的THF两端序列尽量避免形成引物二聚体，否则可能引发AP酶的切割，这种可能性很低，其切割发生可以检验，用本发明的修饰引物多重PCR体系进行无模板扩增，不产生引物二聚体，即修饰引物设计无重大缺陷。需要强调本发明采用的是耐热的核酸内切酶Ⅳ如Tth nfo酶(NEB等公司有售)，在每个PCR循环的退火延伸阶段，与DNA模板匹配的封闭修饰引物均可为内切酶切割THF位点，形成可自由延伸的引物，有效扩增模板。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种特异的选择扩增及多重PCR方法和应用，本发明提供的方法很好地解决了多重PCR引物之间的干扰及非特异延伸等关键问题，实现多重检测，灵敏度高，可实现对样本进行批量检测。还解决了临床上常见易感染的病原微生物同时检测方面的诸多技术问题。
另外，该方法操作方便、快捷、稳定。实际操作中不用改变原有多重PCR系统甚至PCR程序，核酸内切酶Ⅳ发生作用很迅速，对AP位点的切割通常几秒钟足够，一个多重PCR体系中0.1-5U足够，而且核酸内切酶在PCR系统中足够稳定且可共用PCR缓冲盐系统。
附图说明
图1为本发明原理示意图；
图2为实施例1中常规组和修饰组扩增纯水得到的扩增曲线；
图3为实施例1中常规组和修饰组扩增人类基因组DNA得到的扩增曲线；
图4为实施例1中常规组扩增人类基因组DNA得到的熔解曲线；
图5为实施例1中修饰组扩增人类基因组DNA得到的熔解曲线；
图6为实施例2中常规组和修饰组中HBV、HCV、HIV-1、HIV-2和内标(IC)单独的扩增后的扩增曲线；
图7为实施例2中常规组和修饰组中HBV、HCV、HIV-1、HIV-2和内标(IC)一起扩增后的扩增曲线。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
用PCR染料法来比较常规PCR中本发明的非特异扩增与特异性扩增
合成常规引物对RNaseP1(seq1)、RNaseP2(seq2)及修饰引物对RNaseP1M(seq3)、RNaseP2M(seq4)，分别采用常规qPCR体系及加有核酸内切酶Ⅳ的qPCR体系测试。
PCR反应体系具体为：
a)常规组：10mM Tris-HCL(pH8.7)、50mM KCL、1×EvaGreen(Biotium)、40U/mLHotstart Taq DNA聚合酶(Wethink)、2U/mL UDG(Roche)、0.2mM dATP、0.2mM dCTP、0.2mMdGTP、0.4mM dUTP,0.2μM RNaseP1,0.2μM RNaseP2。
b)修饰组：10mM Tris-HCL(pH8.7)、50mM KCL、1×EvaGreen(Biotium)、40U/mLHotstart Taq DNA聚合酶(Wethink)、2U/mL UDG(Roche)、0.2mM dATP、0.2mM dCTP、0.2mMdGTP、0.4mM dUTP、0.2μM RNaseP1M、0.2μM RNaseP2M、20U/mL Tth nfo酶(NEB)
引物序列具体如下：
Seq1(RNaseP1):AGA TTT GGA CCT GCG AGC G
Seq2(RNaseP2):GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT
Seq3(RNaseP1M):AGA TTT GGA CCT GCG AGC G-THF-G TTC T-C3 Spacer
Seq4(RNaseP2M):GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT-THF CGC-C3 Spacer
分别以上述体系按照37℃2min，95℃2min，95℃5sec，60℃30sec，循环60次扩增8孔纯水，结果如图2所示。
同样地，按上述操作扩增人类基因组DNA(模板DNA10ng/mL)，结果如图3-5所示。
由图2可以看出，常规组扩增8孔水均出现检测Ct且不统一，修饰组扩增8孔水为一条直线。常规组因为产生引物二聚体而出现检测Ct，由于二聚体的随机性，同样的加样量下，Ct值还呈现较大离散性；而修饰组因为3’端封闭，历经60次循环无检测Ct。
由图3-5可以看出，常规组与修饰组均有效扩增，检测Ct无明显差异，而熔解曲线上常规组的峰形不如修饰组锐利，整齐。这说明本发明的方法，特异性选择与引物完全匹配的模板，进行有效扩增，而无非特异扩增。
综上，本发明提供的方法能够有效避免引物二聚体的形成，特异性强，扩增效果好。
实施例2
血液筛查HBV/HCV/HIV-1/HIV-2/内标(IC)5色荧光8重RT-PCR系统
具体为：
HBV两对引物两条FAM探针，分别针对S基因与C基因，HCV一对引物一条CY5探针，HIV-1两对引物两条ROX探针，分别针对GAG基因与POL基因，HIV-2两对引物两条VIC探针，分别针对GAG基因与LTR区，内标采用外源性假病毒，一对引物一条TAMRA探针。共计8对引物(引物中有兼并碱基)及8条TaqMan探针(探针中有兼并碱基)，共24条寡核苷酸，探针为两端修饰，不能延伸，只具备特异性杂交结合，被耐热聚合酶切割后引起荧光变化功能。探针不变，8对引物分别用常规引物组及修饰组，修饰组每人份加有2U Tth nfo酶，使用相同的RT-PCR程序，对提取后的同一份核酸模板进行检测，标本含康彻斯坦HBV、HCV、HIV定量标本稀释物、NIBSC HIV2标准品稀释物，及正常献血员(助血员)。
扩增反应程序为：
步骤1：逆转录步骤，温度为55℃，反应时间为5-15min，循环1次；
步骤2：预变性，温度为95℃，反应时间为1-2min，循环1次；
步骤3：变性，温度为95℃，时间为1-5s，退火、延伸及荧光检测，温度为60℃，10-30s，此步骤要循环45次，且60℃读荧光。
检测的荧光信号：HBV靶标为FAM荧光、HIV-1靶标为ROX荧光、HIV-2靶标为VIC荧光、HCV靶标为CY5荧光、IC靶标为TAMRA荧光。
扩增检测实时荧光PCR仪为：Q5或ABI7500。
HBV-C靶标：
tctgtgcagt tactctcgtt tttgcctgtt gacttttttc cttccgtacg agatcttctagataccgcct cagctctctt tcgggacgcc ttagagtctc ctgaacattg ttcacctcac catactgcaatcaggcaggt agttctttgc tggggggacc taatgaatct agccacctgg
HBV-S靶标：
catcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtctggctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctt
HCV靶标：
gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgcccccgcaagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg gtgcttgcgagtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catgagcacgaatcctaaac
HIV1-GAG靶标：
aaatgcgtgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaataggatagagtgcatccagtgcatgc
HIV1-POL靶标：
tgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccaaagtagcatgacaagaatcttagatccttttagaaaacaaaatccagacctagttatctatcaatacatggatgatttgta
HIV2-LTR靶标：
cagtcgctctgcggagaggctggcagatcgagccctgagaggttctctccagcactagcaggtagagcctgggtgttccctgctggactctcaccag
HIV2-GAG靶标：
gtgggagatgggcgcgagaaactccgtcttgagagggaaaaaagcagacgaattagaaaaagttaggttacggcccggcggaaagaaaaagtacaggttaaaacatattgtgtgggcagcgaatgaattggataaattcggattggcagagagcctgttgga
外源性内标靶标：
catgcttgctgtggtactgtctacactcctcgcttcgacacctgttcttcgaatatctgtgtgttacagattcttgtgccttcgtcttcgttgttcact ttgttgctggc
所用引物如下：
常规组采用山东见微生物的一步法多重RT-PCR扩增体系，修饰组在该体系中加有2U Tth nfo酶，并使用修饰引物，除此外并无任何不同。实验结果如图6-7所示。
由图6-7实验结果表明，修饰组与常规组相比，检测灵敏度有明显提高，并且在后续实验中有效降低了多重PCR的假阳性，这对筛查性的实验十分重要，否则技术人员需要花费大量时间复测排除假阳性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种特异的选择扩增及多重PCR方法，其特征在于，所述的方法包括：以核酸内切酶Ⅳ为介导，识别脱碱基位点并切割特定引物，得到可延伸引物，将可延伸引物用于PCR扩增；
所述的特定引物是中间引入THF为脱碱基位点，THF两侧序列与模板互补，3’端封闭，无自由羟基，不能延伸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特定引物的THF的3’方向延长了1-N个碱基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特定引物的THF的3’方向延长了3-9个碱基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述3’端封闭是C3 Spacer封闭或磷酸化封闭。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸内切酶Ⅳ为耐热型核酸内切酶Ⅳ。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸内切酶Ⅳ为Tth nfo酶。
7.一种权利要求1-6任意一项所述的方法在对生物基因组进行多重PCR扩增中的应用。
8.一种权利要求1-6任意一项所述的方法在扩增子建库的多重靶标扩增中的应用。
9.一种权利要求1-6任意一项所述的方法在同时检测多种病原体中的应用。
10.一种权利要求1-6任意一项所述的方法在制备同时检测多种病原体的试剂盒中的应用。
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