CN1940089A - 一种同时快速检测hbv、hcv、hiv、tp和rv的方法 - Google Patents

Abstract

一种同时快速检测HBV、HCV、HIV、TP和RV的方法，对于RNA病毒，依次包括病毒检测模板提取步骤、RNA病毒逆转录为cDNA步骤、在同一个反应体系内同时进行五种致病微生物基因的PCR扩增和通过琼脂糖凝胶电泳方法检测步骤；对于DNA病毒和细菌，依次包括病毒检测模板提取步骤、在同一个反应体系内同时进行五种致病微生物基因的PCR扩增和通过琼脂糖凝胶电泳方法检测步骤。通过定位以上几种致病微生物的敏感靶基因，设计多对PCR巢式或半巢式引物，在同一反应体系内，可快速敏感对上述病毒进行同步检测。可用于临床人体或畜类生物体血液和组织标本的检测。

Description

一种同时快速检测HBV、HCV、HIV、TP和RV的方法

技术领域

本发明属于检测诊断技术领域，特别涉及一种通过多聚酶链式反应技术、在一个反应体系内同时快速灵敏检测人或高等生物体内感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)、爱滋病病毒I型和II型(Human immunodeficiency virus type I and typeII，HIV-1 and HIV-2)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum，TP)和狂犬病病毒(Rabies virus，RV)的方法。

背景技术

乙型肝炎又称血清性肝炎，是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病。可通过血液、体液传播，还可通过性传播，具有慢性携带状态。本病在我国广泛流行，人群感染率高，部分地区感染率高达35％以上。最新的研究资料表明，全世界约有2亿多乙肝病毒携带者，HBV检测阳性的患者在我国已达1.89亿，而应就诊未就诊人数(携带者)将近4亿，而感染乙肝病毒者竟达整个人群的50％以上，是当前危害人民健康最严重的传染病，易发展为慢性肝炎和肝硬化，最终可能转变为肝癌，多见于儿童及青壮年。

丙型肝炎是丙型肝炎病毒(HCV)引起的传染病，传播途径与乙型肝炎相同，也是通过血液、体液及性传播途径传播。据世界卫生组织统计结果表明，全球丙肝感染率为3％，估计约有1.3亿人感染HCV，每年新发现丙肝病例3.5万人，在我国一般人群抗HCV阳性率为3.2％，丙肝患者约4000万，即每30人中就有一名为丙肝患者。HCV慢性感染可导致肝硬化和肝癌，对患者的健康和危害极大。

艾滋病是由艾滋病毒感染所引起的一种严重的传染病，艾滋病毒又称为人类免疫缺乏病毒(Human Immunodeficiency Virus)，简称HIV。它可通过性交、血液及母婴等途径进行传播。自1981年美国首次报道艾滋病(AIDS)后，艾滋病以传播迅速、病势凶险、预后差及危害严重而震惊世界，曾被人们喻为“世纪温疫”、“超级癌症”，目前全球已有210多个国家报告和发现AIDS。据中国预防医学科学院专家和熟悉中国艾滋病疫情的国内专家估计，如不采取积极有效的措施，到2010年，我国艾滋病病毒感染者将超过1000万人。若现在采取有效措施，则有可能把艾滋病的流行控制在较低水平，在2010年时感染者数量可能不会超过150万。在国务院印发的《中国预防与控制艾滋病中长期规划(1998-2010)》中提出，艾滋病防治工作总目标及近期和远期防治工作目标是：建立政府领导、多部门合作和全社会普及艾滋病、性病防治知识，控制艾滋病的流行与传播。

梅毒是由梅毒螺旋体感染所致的一种传染性疾病，传染源是梅毒患者，主要通过性交传染，也可以通过胎盘传给下一代而发生先天梅毒，少数通过其它途径受传染，医务人员在接触病人或含有梅毒螺旋体的标本时不小心也偶可受染，也可通过输血(早期梅毒患者作为供血者)发生传染。胎传梅毒是感染了梅毒的孕妇通过胎盘血将梅毒螺旋体传染给胎儿所致。目前比较常见的是一期梅毒、二期梅毒、潜伏梅毒和先天梅毒。一期梅毒的主要症状是硬下疳，多在生殖器部位出现无痛性溃疡，并有软骨样硬度，不经治疗可自然消失，并有腹股沟淋巴结肿大。二期梅毒主要表现为掌跖特征性的斑丘疹、全身皮疹以及肛门、外生殖器扁平湿疣，少数可出现梅毒性脱发、梅毒性白斑、粘膜损害、二期骨损害、眼损害和二期神经梅毒等。潜伏梅毒无临床症状，梅毒血清反应阳性，有传染性且难发现。当感染2年以上，约30％~40％患者可在皮肤、粘膜、骨骼上出现典型的树胶样肿，称三期梅毒，少数可出现心脏血管系统或神经系统梅毒，影响脏器功能，甚至危及生命。

狂犬病被医学界称为是只可预防、不可治疗的疾病。原因是狂犬病一旦发生，就是100％死亡，是目前死亡率最高的疾病。狂犬病在我国95％以上是由于被狂犬咬伤引起的，其余为猫或别的家养和野生动物咬伤、抓伤所致。由于近年来城市居民养宠物的人数逐年增多，宠物猫、狗、啮齿类宠物近年在城市中呈泛滥之势，包括当今政府官员在内，均没有引起足够的重视，致使狂犬病患者人数逐年增多。

我们的思路得益于对角膜移植材料是否感染有重大致病微生物的快速筛查。由于近些年城市建设的发展，患角膜外伤的人数越来越多，但可用于角膜移植的角膜供体材料却日见减少，由于从不同途径得来的角膜供体材料存在有感染重大致病微生物的可能，这就使患者存在有经医源性途径感染重大致病微生物的危险。鉴于此，从确保人民生命健康的角度出发，我们开展了对角膜移植组织中6种重大致病微生物的实验室联合同步快速检测技术的研究，以防止感染有以上几种致病微生物的角膜供体器官被植入角膜患者体内。

PCR是一种简单、专一、灵敏、快速的基因扩增方法。PCR的基本原理和方法是根据已知的基因序列设计引物，其中正向引物在模板序列的上游与模板DNA双链中的负链基因互补，反向引物位于模板序列的下游并与DNA双链中的正链互补。模板DNA在高温下可发生变性使双链打开成单链，当温度降至退火温度范围时，正向引物和反向引物可分别与模板的负链和正链结合，在dNTP、Mg²⁺、DNA聚合酶等的参与下，模板DNA链按照5’到3’端的方向开始延伸，完成一个循环的扩增。

根据PCR方法的基本原理设计一对具有高严谨性的、与目标基因序列完全互补的引物是扩增成功的关键。PCR反应体系中的模板DNA通常是基因组DNA或互补DNA，不仅其总的碱基序列高达几十亿，而且在变性后解开成单链至退火温度的过程中其立体结构十分复杂，空间位阻可能影响DNA聚合酶对引物与模板退火部位的接触。

器官移植迫切需要开发对供体器官材料进行灵敏、特异、快速、准确的实验室诊断的方法，这除了直接关系到器官移植的成功率，还对于病人的早期诊断、药物疗效的评价、治愈指标的确定及污染源等都有极为重要的意义。

发明内容：

本发明目的在于提供一种同时快速检测HBV、HCV、HIV、TP和RV的方法。

为达上述目的，本发明采用如下技术方案：一种同时快速检测HBV、HCV、HIV、TP和RV的方法，对于RNA病毒，依次包括病毒检测模板提取步骤、RNA病毒逆转录为cDNA步骤、在同一个反应体系内同时进行五种致病微生物基因的PCR扩增和通过琼脂糖凝胶电泳方法检测步骤；对于DNA病毒和细菌，依次包括病毒检测模板提取步骤、在同一个反应体系内同时进行五种致病微生物基因的PCR扩增和通过琼脂糖凝胶电泳方法检测步骤。

针对HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、TP和RV的核苷酸序列，设计的巢式或半巢式PCR引物序列为：

HBV(523bp)：  5’CAT CAG GAT TCC TAG GAC CCC T 3’(642-619bp)

              5’GGA AAG CCC TAC GAA CCA CTG AAC 3’(120-143bp)

              5’CGT GTT ACA GGC GGG GTT TTT CTT G 3’(590-615bp)

HCV(260bp)：  5’GGC GAC ACT CCA CCA TAG AT 3’(外套)(1-20bp)

              5’CAT GGT GCA CGG TCT ACG AGA 3’(外套)(327-308bp)

              5’GGA ACT ACT GTC TTC ACG CAG 3’(内套)(34-54bp)

              5’TCG CAA GCA CCC TAT CAG GCA 3’(内套)(293-273bp)

HIV-1(565bp)：5’GTT GAC TCA GAT TGG TTG CAC 3’(外套)(240-260bp)

              5’GTA TGT CAT TGA CAG TCC AGC 3’(外套)(1042-1022bp)

              5’GGA TGG CCC AAA AGT TAA AC 3’(内套)(318-337bp)

              5’TAT CAG GAT GGA GTT CAT AAC 3’(内套)(982-962bp)

HIV-2：       5’TGC TAG ACT CTC ACC AGT GC 3’(外套)(21-40bp)

              5’CAC TCC GTC GTG GTT TGT TCC 3’(外套)(338-318bp)

              5’GTG TGT GCT CCC ATC TCT CC 3’(内套)(121-140bp)

              5’CTT CAA GTC CCT GTT CGG GCG CCA ACC 3’(内套)(267-241bp)

probe         5’GCA GGT TGG CGC CCG AAC AGG GAC TTG 3’(238-264bp)

TP：((260bp)  5’GAA GTT TGT CCC AGT TGC GGT T 3’(564-585bp)(内)

              5’CAG AGC CAT CAG CCC TTT TCA 3’(883-863bp)(内)

              5’CTT CAT GGT TGA CAG CGA GG3’(509-529bp)(外)

5’GAC CGT GTT GAA GTT CAT CAC3’(873-853bp)(外)

RV(422bp)：   5’TGT GCG CTA ACT GGA GTA CCA3’(648-668bp)(内)

              5’CAC ATG TGG CAA TAA CAG TTG C3’(1070-1049bp)(内)

              5’ACA TTG CAG ATA GAA TAG AG3’(561-580bp)(外)

              5’AAC CTC CAA GGA CAG ACA TC3’(1100-1081bp)(外)

probe         5’CCG AAC TTC AGA TTC CTA GCT GGA ACC3’(671-697bp)。

病毒RNA逆转录为cDNA步骤中，在离心管中加入下列组分体系：

DEPC去离子水            10-30ul，

5×buffer               4-10ul，

每种2.5mmol dNTP        1-4ul，

5u/ul反转录酶(AMV)      0.5-3ul，

1.67ug/ul上下游引物     各0.1-1ul，

模板                    1-10ul；

42℃孵浴1小时，72℃变性10分钟。

PCR扩增步骤中，在扩增管中加入下列各组分体系：

DEPC去离子水            7-43ul，

10×buffer              2-10ul，

每种2.5mmol dNTP        1-10ul，

1.67ug/ul HBV上游引物   0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HBV下游引物   0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HCV上游引物   0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HCV下游引物   0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HIV1上游引物  0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HIV1下游引物  0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HIV2上游引物  0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HIV2下游引物  0.1-0.5ul，

1.67ug/ul TV上游引物    0.1-0.5ul，

1.67ug/ul TV下游引物    0.1-0.5ul，

1.67ug/ul RV上游引物    0.1-0.5ul，

1.67ug/ul RV下游引物    0.1-0.5ul，

5u/ul Taq DNA聚合酶     0.5-5ul，

模板                    各1-10ul，

逆转录产物              各1-10ul

共20～80ul混匀，离心。然后，94℃5min后按照94℃反应30sec～2min，48～60℃反应30sec～2min，72℃反应1min～2min的顺序重复进行30个循环，最后72℃延长3min～10min。

PCR巢式扩增后，取出1-10ul PCR产物进行电泳检测，目的条带分别出现于相应的bp区域。

本发明涉及的主要技术包括临床样本的处理，检测方法的建立以及检测结果的判定。临床样本包括病人或其它生物体的血清、组织、粪便、唾液等分泌物，以上标本通过裂解液提取病毒核酸，该病毒包括DNA和RNA，均为病毒检测模板。先将RNA病毒核酸外巢引物采用逆转录方法将病毒RNA逆转录为cDNA，然后通过PCR扩增的方法分别加入标本DNA模板和cDNA等进行扩增，扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳方法后进行检测。在进行PCR扩增检测引物选择时，针对HBV、HCV、HIV-1、HIV-2(HIV通用引物可根据需要进行选择使用)、TP和RV的核苷酸序列，利用Ω生物分析软件，针对以上每种微生物的保守区域各设计10对以上巢式或半巢式PCR引物，用临床阳性标本进行反复对比分析后确定最佳引物对。病毒检测模板提取包括：

1、总RNA的提取：

1.1、试剂：氯仿，异丙醇，75％乙醇(无RNA酶水配制)，0.5％SDS(无RNA酶水配制)，TRIZOL(Invitrogen公司产品)。

1.2、步骤：

(1)加入适量TRIZOL裂解病人及生物体标本，包括血清、组织、粪便、唾液、咽拭子等(组织标本需用无菌干烤过的研磨器研磨粉碎处理)；

(2)室温静置5min，按每1ml TRIZOL加入0.2ml氯仿，用手剧烈震荡15sec，室温静置2-3min，12000g离心15min，吸取RNA水相；

(3)水相与异丙醇混合，每1ml TRIZOL加入0.5ml异丙醇，室温静置10min，4℃12000g离心10min；

(4)吸取上清，按每1ml TRIZOL加入1ml75％乙醇，震荡器震荡，4℃12000g离心10min；

(5)弃上清，干燥，重溶于无RNA酶水配成的0.5％SDS液内，55℃-60℃水浴10min，-70℃保存。

2、mRNA提取：(Qiagen公司试剂盒提取)

2.1、在350ulRLT中加入3.5ulβ-巯基乙醇；

2.2、取适量的阳性标本(血清一般100ul；组织10mg左右，事先在无RNase酶的研磨器中研碎，并用80ulPBS稀释；粪便、唾液、咽拭子等需用PBS稀释)加到RLT中，混匀；

2.3、10000rpm离心5min，吸上清到一新的离心管中；

2.4、加入一倍体积(一般350ul或600ul)70％的乙醇，混合：

2.5、取700ul样品上柱(2ml-的柱子)，10000rpm离心15s；

2.6、弃去收集管中的废液后，加700ulRW1 Buffer，10000rpm离心15s；

2.7、弃去收集管中的废液后，加500ulRPE Buffer，10000rpm离心15s；

2.8、弃去收集管中的废液后，重复步骤2.7；

2.9、弃去收集管中的废液后，重新离心，以洗去不必要的液体；

2.10、将柱子放到一个新的无RNA酶的1.5ml的离心管中，加入30-50ul无RNA酶的去离子水，室温放置2min，10000rpm离心1min；洗脱得到的溶液即为mRNA溶液，可立即使用，也可存放于-20℃或-70℃冰箱中待用。

3、DNA提取：(Qiagen试剂盒提取)

3.1、吸取20ul Proteinase K到1.5ml的离心管的底部；

3.2、加200ul样品到离心管中，混匀；

3.3、加200ulBuffer AL到样品中，旋涡震荡器震荡15s混匀；

3.4、56℃孵浴10min；

3.5、稍加离心以除去粘在管盖上的液体；

3.6、加200ul无水乙醇到样品中，旋涡震荡器震荡15s混匀，稍加离心以除去粘在管盖上的液体；

3.7、小心将步骤6的样品转移到滤柱中，不要沾到柱壁上，盖紧盖子8000rpm离心1min；

3.8、弃去滤柱中的废液，加500ulBuffer AW1，盖紧盖子8000rpm离心1min；

3.9、弃去滤柱中的废液，加500ulBuffer AW2，盖紧盖子8000rpm离心1min；

3.10、重复步骤3.9；

3.11、将柱子放到一个新的无RNA酶的1.5ml的离心管中，加50ulBufferAE或蒸馏水，室温下放置2min，8000rpm离心1min；洗脱得到的溶液即为DNA溶液，可立即使用，也可存放于-20℃或-70℃冰箱中待用。

本发明通过定位以上几种致病微生物的敏感靶基因，设计多对PCR巢式或半巢式引物，利用多聚酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术，可以在一个反应体系内快速灵敏检测以上几种重大致病微生物。可用于临床人体或畜类生物体血液和组织标本的检测。

附图说明

图1为实施例1的电泳检测图。其中，M代表标准核酸分子量，1代表HBV核酸基因，分子量为523bp；2代表HCV核酸基因，分子量为260bp；3代表RV核酸基因，分子量为381bp。

图2为实施例2的电泳检测图。其中，M代表标准核酸分子量，1代表HIV-1核酸基因，分子量为565bp；2代表HIV-2核酸基因，分子量为101bp；3代表TP核酸基因，分子量为218bp。

图3为实施例3的电泳检测图。其中，M代表标准核酸分子量，1代表HBV核酸基因，分子量为523bp；2代表HCV核酸基因，分子量为260bp；3代表HIV-1核酸基因，分子量为565bp；4代表HIV-2核酸基因，分子量为101bp；5代表TP核酸基因，分子量为218bp；6代表RV核酸基因，分子量为381bp。

具体实施方式

实施例1、角膜携带病毒检测：

一、材料的收集

迅速切取供者角膜周边组织材料50mg左右，在无菌条件下用剪刀剪碎，放在研磨器中充分研磨，使组织裂解，细胞释放出来。

二、基因组DNA的提取(参照Qiagen试剂盒操作步骤提取)

1、加20ul蛋白酶K到1.5ml的离心管的底部；

2、加200ul样品到离心管中，混匀；

3、加200ulBuffer AL到样品中，旋涡震荡器震荡15s混匀；

4、56℃孵浴10min；

5、稍加离心以除去粘在管盖上的液体；

6、加200ul无水乙醇到样品中，旋涡震荡器震荡15s混匀，稍加离心以除去粘在管盖上的液体；

7、小心将步骤6的样品转移到滤柱中，，不要沾到柱壁上，盖紧盖子8000rpm离心1min；

8、弃去滤柱中的废液，加500ulBuffer AW1，盖紧盖子8000rpm离心1min；

9、弃去滤柱中的废液，加500ulBuffer AW2，盖紧盖子8000rpm离心1min；

10、重复步骤9；

11、将柱子放到一个新的无RNA酶的1.5ml的离心管中，加50ul BufferAE或蒸馏水，室温下放置2min，8000rpm离心1min；洗脱得到的溶液即为DNA溶液，可立即使用，也可存放于-20℃或-70℃冰箱中待用。

三、PCR半巢式扩增反应体系

第一次扩增：取提取的基因组DNA产物8ul，上游引物5’CAT CAG GAT TCCTAG GAC CCC T 3’(642-619bp)1ul，中间引物5’GGA AAG CCC TAC GAA CCACTG AAC 3’(120-143bp)1ul，10×Buffer 6ul，Taq DNA聚合酶0.8ul，浓度为10mmol的三磷酸脱氧核苷酸4.2ul，加水39ul，共60ul，混匀后，短暂离心。然后按95℃5分钟预变性，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共进行35个循环。最后于72℃终延伸10分钟。

第二次扩增：取第一轮扩增产物8ul，中间引物5’GGA AAG CCC TAC GAACCA CTG AAC 3’(120-143bp)1ul，下游引物5’CGT GTT ACA GGC GGG GTT TTTCTT G 3’1ul，10×Buffer 6ul，Taq DNA聚合酶0.8ul，浓度为10mmol的三磷酸脱氧核苷酸4.2，加水39，共60，混匀后，短暂离心。然后按95℃5分钟预变性，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共进行35个循环。最后于72℃终延伸10分钟。

四、电泳鉴定结果：

取第二轮扩增产物5ul，经2％的琼脂糖凝胶电泳后，所得结果如图示1中所示。

实施例2、角膜携带病毒检测

一、材料的收集

迅速切取供者角膜周边组织材料50mg左右，在无菌条件下用剪刀剪碎，放在研磨器中充分研磨，使组织裂解，细胞释放出来。

二、基因组RNA的提取(参照Qiagen试剂盒操作步骤提取)

1、在350ulRLT中加入3.5ulβ-巯基乙醇；

2、取适量的阳性标本(血清一般100ul；组织10mg左右，事先在无RNase酶的研磨器中研碎，并用80ulPBS稀释；粪便、唾液、咽拭子等需用PBS稀释)加到RLT中，混匀；

3、10000rpm离心5min，吸上清到一新的离心管中；

4、加入一倍体积(一般350ul或600ul)70％的乙醇，混合：

5、取700ul样品上柱(2ml-的柱子)，10000rpm离心15s；

6、弃去收集管中的废液后，加700ulRW1 Buffer，10000rpm离心15s；

7、弃去收集管中的废液后，加500ulRPE Buffer，10000rpm离心15s；

8、弃去收集管中的废液后，重复步骤7；

9、弃去收集管中的废液后，重新离心，以洗去不必要的液体；

10、将柱子放到一个新的无RNA酶的1.5ml的离心管中，加30-50ul无RNA酶的去离子水，室温放置2min，10000rpm离心1min；洗脱得到的溶液即为mRNA溶液，可立即使用，也可存放于-20℃或-70℃冰箱中待用。

三、将mRNA逆转录成cDNA

取提取的基因组RNA8ul，5×Buffer 12ul，浓度为10mmol的三磷酸脱氧核苷酸4.2ul，反转录酶1.8ul，外巢上游引物5’GGC GAC ACT CCA CCA TAGAT 3’(外套)(1-20bp)1ul，外巢下游引物5’CAT GGT GCA CGG TCT ACGAGA 3’(外套)(327-308bp)1ul，加水32ul，共60ul，42℃孵育30分钟，70℃变性10分钟。

四、PCR半巢式扩增反应体系

第一次外巢式扩增：取逆转录的cDNA8ul，外巢上游引物5’GGC GAC ACTCCA CCA TAG AT 3’(外套)(1-20bp)1ul，外巢下游引物5’CAT GGT GCACGG TCT ACG AGA 3’(外套)(327-308bp)1ul，10×Buffer 6ul，Taq DNA聚合酶0.8ul，浓度为10mmol的三磷酸脱氧核苷酸4.2ul，加水39ul，共60ul，混匀后，短暂离心。然后按95℃5分钟预变性，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共进行35个循环。最后于72℃终延伸10分钟。

第二次外巢式扩增：取第一轮扩增产物8ul，内巢上游引物5’GGA ACTACT GTC TTC ACG CAG 3’(内套)(34-54bp)1ul，内巢下游引物5’TCG CAAGCA CCC TAT CAG GCA 3’(内套)1ul，10×Buffer 6ul，Taq DNA聚合酶0.8ul，浓度为10mmol的三磷酸脱氧核苷酸4.2ul，加水39ul，共60ul，混匀后，短暂离心。然后按95℃5分钟预变性，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共进行35个循环。最后于72℃终延伸10分钟。

五、电泳鉴定结果

取第二轮扩增产物5ul，经2％的琼脂糖凝胶电泳后，所得结果如图2所示。

实施例3、角膜携带病毒检测

一、材料的收集

迅速切取供者角膜周边组织材料50mg左右，在无菌条件下用剪刀剪碎，放在研磨器中充分研磨，使组织裂解，细胞释放出来。

二、基因组RNA的提取(参照Qiagen试剂盒操作步骤提取)

1、在350ulRLT中加入3.5ulβ-巯基乙醇；

2、取适量的阳性标本(血清一般100ul；组织10mg左右，事先在无RNase酶的研磨器中研碎，并用80ulPBS稀释；粪便、唾液、咽拭子等需用PBS稀释)加到RLT中，混匀；

3、10000rpm离心5min，吸上清到一新的离心管中；

4、加入一倍体积(一般350ul或600ul)70％的乙醇，混合：

5、取700ul样品上柱(2ml-的柱子)，10000rpm离心15s；

6、弃去收集管中的废液后，加700ulRW1 Buffer，10000rpm离心15s；

7、弃去收集管中的废液后，加500ulRPE Buffer，10000rpm离心15s；

8、弃去收集管中的废液后，重复步骤7；

9、弃去收集管中的废液后，重新离心，以洗去不必要的液体；

10、将柱子放到一个新的无RNA酶的1.5ml的离心管中，加30-50ul无RNA酶的去离子水，室温放置2min，10000rpm离心1min；洗脱得到的溶液即为mRNA溶液，可立即使用，也可存放于-20℃或-70℃冰箱中待用。

三、将mRNA逆转录成cDNA

取提取的基因组RNA8ul，5×Buffer 12ul，浓度为10mmol的三磷酸脱氧核苷酸4.2ul，反转录酶1.8ul，外巢上游引物5’GTT GAC TCA GAT TGG TTGCAC 3’(外套)(240-260bp)1ul，外巢下游引物5’GTA TGT CAT TGA CAG TCCAGC 3’(外套)(1042-1022bp)1ul，加水32ul，共60ul，42℃孵育30分钟，70℃变性10分钟。

四、PCR半巢式扩增反应体系

第一次外巢式扩增：取逆转录的cDNA8ul，外巢上游引物5’GTT GAC TCAGAT TGG TTG CAC 3’(外套)(1-20bp)1ul，外巢下游引物5’GTA TGT CATTGA CAG TCC AGC 3’(外套)(327-308bp)1ul，10×Buffer 6ul，Taq DNA聚合酶0.8ul，浓度为10mmol的三磷酸脱氧核苷酸4.2ul，加水39ul，共60ul，混匀后，短暂离心。然后按95℃5分钟预变性，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共进行35个循环。最后于72℃终延伸10分钟。

第二次外巢式扩增：取第一轮扩增产物8ul，内巢上游引物5’GGA TGGCCC AAA AGT TAA AC 3’(内套)(318-337bp)1ul，内巢下游引物5’TAT CAGGAT GGA GTT CAT AAC 3’(内套)(982-962bp)1ul，10×Buffer 6ul，Taq DNA聚合酶0.8ul，浓度为10mmol的三磷酸脱氧核苷酸4.2ul，加水39ul，共60ul，混匀后，短暂离心。然后按95℃5分钟预变性，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共进行35个循环。最后于72℃终延伸10分钟。

五、电泳鉴定结果

取第二轮扩增产物5ul，经2％的琼脂糖凝胶电泳后，所得结果如图3所示。

Claims (4)

1、一种同时快速检测HBV、HCV、HIV、TP和RV的方法，其特征在于，对于RNA病毒，依次包括病毒检测模板提取步骤、RNA病毒逆转录为cDNA步骤、在同一个反应体系内同时进行五种致病微生物基因的PCR扩增和通过琼脂糖凝胶电泳方法检测步骤；对于DNA病毒和细菌，依次包括病毒检测模板提取步骤、在同一个反应体系内同时进行五种致病微生物基因的PCR扩增和通过琼脂糖凝胶电泳方法检测步骤。

2、如权利要求1所述的同时快速检测HBV、HCV、HIV、TP和RV的方法，其特征在于，针对HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、TP和RV的核苷酸序列，设计的巢式或半巢式PCR引物序列为：

HBV(523bp)：5’CAT CAG GAT TCC TAG GAC CCC T 3’(642-619bp)

            5’GGA AAG CCC TAC GAA CCA CTG AAC 3’(120-143bp)

            5’CGT GTT ACA GGC GGG GTT TTT CTT G 3’(590-615bp)

HCV(260bp)：5’GGC GAC ACT CCA CCA TAG AT 3’(外套)(1-20bp)

            5’CAT GGT GCA CGG TCT ACG AGA 3’(外套)(327-308bp)

            5’GGA ACT ACT GTC TTC ACG CAG 3’(内套)(34-54bp)

            5’TCG CAA GCA CCC TAT CAG GCA 3’(内套)(293-273bp)

HIV-1(565bp)：5’GTT GAC TCA GAT TGG TTG CAC 3’(外套)(240-260bp)

            5’GTA TGT CAT TGA CAG TCC AGC 3’(外套)(1042-1022bp)

            5’GGA TGG CCC AAA AGT TAA AC 3’(内套)(318-337bp)

            5’TAT CAG GAT GGA GTT CAT AAC 3’(内套)(982-962bp)

HIV-2：5’TGC TAG ACT CTC ACC AGT GC 3’(外套)(21-40bp)

            5’CAC TCC GTC GTG GTT TGT TCC 3’(外套)(338-318bp)

            5’GTG TGT GCT CCC ATC TCT CC 3’(内套)(121-140bp)

            5’CTT CAA GTC CCT GTT CGG GCG CCA ACC 3’(内套)(267-241bp)

probe  5’GCA GGT TGG CGC CCG AAC AGG GAC TTG 3’(238-264bp)

TP：((260bp)5’GAA GTT TGT CCC AGT TGC GGT T 3’(564-585bp)(内)

            5’CAG AGC CAT CAG CCC TTT TCA 3’(883-863bp)(内)

            5’CTT CAT GGT TGA CAG CGA GG3’(509-529bp)(外)

            5’GAC CGT GTT GAA GTT CAT CAC3’(873-853bp)(外)

RV(422bp)：5’TGT GCG CTA ACT GGA GTA CCA3’(648-668bp)(内)

            5’CAC ATG TGG CAA TAA CAG TTG C3’(1070-1049bp)(内)

            5’ACA TTG CAG ATA GAA TAG AG3’(561-580bp)(外)

            5’AAC CTC CAA GGA CAG ACA TC3’(1100-1081bp)(外)

probe  5’CCG AAC TTC AGA TTC CTA GCT GGA ACC3’(671-697bp)。

3、如权利要求1或2所述的同时快速检测HBV、HCV、HIV、TP和RV的方法，其特征在于，病毒RNA逆转录为cDNA步骤中，在离心管中加入下列组分体系：

DEPC去离子水             10-30ul，

5×buffer                4-10ul，

每种2.5mmol dNTP         1-4ul，

5u/ul反转录酶(AMV)       0.5-3ul，

1.67ug/ul上下游引物各    0.1-1ul，

模板                     1-10ul；

42℃孵浴1小时，72℃变性10分钟。

4、如权利要求3所述的同时快速检测HBV、HCV、HIV、TP和RV的方法，其特征在于，PCR扩增步骤中，在扩增管中加入下列各组分体系：

DEPC去离子水              7-43ul，

10×buffer                2-10ul，

每种2.5mmol dNTP          1-10ul，

1.67ug/ul HBV上游引物     0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HBV下游引物     0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HCV上游引物     0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HCV下游引物     0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HIV1上游引物    0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HIV1下游引物    0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HIV2上游引物    0.1-0.5ul，

1.67ug/ul HIV2下游引物    0.1-0.5ul，

1.67ug/ul TV上游引物      0.1-0.5ul，

1.67ug/ul TV下游引物      0.1-0.5ul，

1.67ug/ul RV上游引物      0.1-0.5ul，

1.67ug/ul RV下游引物      0.1-0.5ul，

5u/ul Taq DNA聚合酶       0.5-5ul，

模板                      各1-10ul，

逆转录产物                各1-10ul共20～80ul混匀，离心。然后，94℃5min后按照94℃反应30sec～2min，48～60℃反应30sec～2min，72℃反应1min～2min的顺序重复进行30个循环，最后72℃延长3min～10min。

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