CN111206123A

CN111206123A - 用于血液筛查的核酸组合物和试剂盒

Info

Publication number: CN111206123A
Application number: CN202010314918.9A
Authority: CN
Inventors: 勾宏娜; 吴燕; 欧格; 宋冰燕; 邓京; 林艳
Original assignee: Zhuhai Livzon Diagnostics Inc
Current assignee: Zhuhai Livzon Diagnostics Inc
Priority date: 2020-04-21
Filing date: 2020-04-21
Publication date: 2020-05-29
Anticipated expiration: 2040-04-21
Also published as: CN111206123B

Abstract

本发明涉及病毒分子检验领域，具体而言，提供了一种用于血液筛查的核酸组合物和试剂盒。本发明提供的血液筛查中使用的核酸组合物，包括检测HBV、HCV、HIV以及2019新型冠状病毒的核酸组合物。发明人经研究证明本发明提供的核酸组合物特异性强，灵敏度高，抗干扰强，可实现血液筛查中HBV/HCV/HIV‑1/HIV‑2/SARS‑Cov‑2的快速检出。针对HIV‑1及HBV基因组均进行了特异性的双区段核酸组合设计，大幅度降低因病毒基因突变导致的漏检情况，极大地提高了检出率，降低输血感染的残余风险，针对SARS‑Cov‑2基因组进行了筛选，明显降低了对组合中的HBV、HCV检出的干扰。本发明提供的含有上述核酸组合的血液筛查检测试剂盒，具有上述优势，检出率高、特异性好及抗干扰强。

Description

用于血液筛查的核酸组合物和试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒分子检测领域，具体而言，涉及一种用于血液筛查的核酸组合物及包括该核酸组合物的试剂盒。

背景技术

随着我国人民生活水平提高和医疗改革的深化，百姓看病求医的需求不断增加，随之而来的是对于临床用血需求的迅速增加。血液可以挽救病人的生命，但同时输血或血液制品又有传播疾病的危险。世界卫生组织（WHO）已正式将血液安全列为全球重点卫生工作之一。

目前血液安全的检验主要是采用免疫学和临床生化的检验方法，酶联免疫试剂检测的是人体受病毒感染后产生的抗体，窗口期较长（从人体受病毒感染到产生诊断标志物的这段时间被称为“窗口期”）；而且酶联免试测试针对病毒变异株可能会出现假阴性，对免疫水平低下感染者可能漏检，这些都是输血安全的隐患，不是简单通过改良免疫学技术就可以解决的。

PCR作为一种高灵敏、高度简便、自动化程度高的新技术，在各个领域中都广泛的应用起来，随着技术的发展，逐渐成为了核酸检测的金标准，在血液筛查中也是如此。实现高特异性、高灵敏度、高自动化的病毒分子检测流程是现阶段主要的市场需求，以实现在确保输血安全的同时，不增加因为特异性差导致的血液报废，因此，精确合理的引物探针设计一直是血液筛查分子诊断试剂研发的核心重点。乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV1、HIV2）为熟知的可通过血液传播的病毒，2019新型冠状病毒（SARS-Cov-2）目前虽未有明确的血液传播证据，但从可引起病毒血症的病毒传播规律分析，其存在通过血液传播的风险。从公开的报道来看，尚未有能够同时检测HBV/HCV/HIV-1/HIV-2/ SARS-Cov-2的多重核酸检测试剂盒。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以同时检测血液中乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）以及2019新型冠状病毒的核酸组合物，以提高筛查经血液传播疾病分子检测试剂的灵敏度、特异性和抗干扰能力。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种用于血液筛查的核酸组合物，所述核酸组合物包括以下引物对及其对应的探针：

（a）：第一引物组如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，第一探针的核酸序列如SEQ IDNO.3所示；第二引物组如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，第二探针的核酸序列如SEQ IDNO.6所示；

（b）：第三引物组如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，第三探针的核酸序列如SEQ IDNO.9所示；

（c）：第四引物组如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，第四探针的核酸序列如SEQ IDNO.12所示；第五引物组如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，第五探针的核酸序列如SEQID NO.15所示；第六引物组如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，第六探针的核酸序列如SEQ ID NO.18所示；

（d）：第八引物组如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示，第八探针的核酸序列如SEQ IDNO.22所示。

本发明提供的第一核酸组合（第一引物组和第一探针）和第二核酸组合（第二引物组和第二探针）是根据乙型肝炎病毒（HBV）保守且特异的两个基因片段（S基因片段和C基因片段）进行特异设计而成；第一核酸组合可特异性检测HBV的S基因片段，第二核酸组合可以特异性检测HBV的C基因片段，采用双区段分别进行特异性检测可有效降低因病毒基因突变导致的漏检风险；第三核酸组合（第三引物组和第三探针）根据丙型肝炎病毒保守特异的基因片段（5′UTR基因片段）设计而成；第四核酸组合（第四引物组和第四探针）和第五核酸组合（第五引物组和第五探针）根据人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）保守且特异的两个基因片段（LTR基因片段和POL基因片段）进行特异设计而成，采用双区段分别进行特异性检测可有效降低因病毒基因突变导致的漏检风险；第四核酸组合可特异性检测HIV-1的POL基因片段，第五核酸组合可特异性检测HIV-1的LTR基因片段；第六核酸组合（第六引物组和第六探针）根据人类免疫缺陷病毒2型（HIV-2）保守且特异的POL基因片段设计而成；第八核酸组合（第八引物组和第八探针）针对2019新型冠状病毒（SARS-Cov-2）保守且特异的ORF1ab基因片段设计而成，并通过筛选明显降低了对组合中的HBV、HCV检出的干扰。该核酸组合物与多种血液传播病原体无交叉反应，仅能检出相应病毒，且几种病毒的最低检出浓度分别为HBV为2.5IU/mL、HCV为10 IU/mL、HIV-1为50 IU/mL、HIV-2为50 IU/mL以及SARS-Cov-2为20copies/mL。

可选地，在本发明的一些实施案例中，所述核酸组合还包括第七探针核酸序列（SEQ ID NO.19）；第七探针序列为针对内对照（植物基因）片段设计的特异性探针，检测提取和扩增的整个过程的有效性，且与其他核酸组合相互间没有干扰。通过选取非动物源性基因极大程度降低非特异性扩增，能够确保检测结果的可靠性。

可选的是，所述探针均为自身淬灭探针。

可选的是，所述自身淬灭探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。

可选的是，（a）、（b）、（c）和（d）中探针的5’端标记的所述荧光报告基团彼此不同。

可选的是，所述荧光报告基团包括选自FAM、HEX、ROX、JOE、CY3、VIC、TET、TAXASRED、NED、ALEXA、TAMRA、Quasar705、CY5.5和CY5中的一种；所述荧光淬灭基团包括选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB和DABCYL中的任意一种。

在优选的实施方式中，（a）中探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；

（b）中探针的5’端标记的荧光报告基团为CY5，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；

（c）中探针的5’端标记的荧光报告基团为HEX，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；

（d）中探针的5’端标记的荧光报告基团为Quasar705，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ3。

此外，第七探针的5’端标记的荧光报告基团为ROX，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。

本发明的目的还在于提供一种用于血液筛查的试剂盒，所述试剂盒包括上述的核酸组合物。由此，可采用单一类型试剂盒即可同时检测多种类型的病毒，节约检测成本，采用上述核酸组合制成的试剂盒灵敏度高，同时对HBV、HIV-1采取双区段的方式，有效地降低了漏检风险。

本发明的目的还在于提供一种非诊断目的检测血液样品中病毒的方法，所述方法利用上述用于血液筛查的试剂盒检测血液样品中的以下病毒中的至少之一：HBV、HCV、HIV-1、HIV-2和SARS-Cov-2。采用上述方法进行血液筛查，灵敏度高，特异性好，抗干扰能力强，相对于单检来说，可一次性检出多种可能存在血液中的病毒，降低了医护人员劳动强度和患者的成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明核酸组合中不同浓度的HBV荧光定量PCR实验结果图；

图2为本发明核酸组合中不同浓度的HIV-1荧光定量PCR实验结果图；

图3为本发明核酸组合中不同浓度的HIV-2荧光定量PCR实验结果图;

图4为本发明核酸组合中不同浓度的HCV荧光定量PCR实验结果图;

图5为本发明核酸组合中不同浓度的SARS-Cov-2荧光定量PCR实验结果图；

图6为本发明PCR反应液配方1和配方2的HBV荧光定量PCR实验结果图；

图7为本发明PCR反应液配方1和配方2的HIV-1荧光定量PCR实验结果图；

图8为本发明PCR反应液配方1和配方2的HCV荧光定量PCR实验结果图；

图9为SARS-Cov-2的ORF1ab基因片段的pUC57载体的载体图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的血液筛查核酸组合物包括：

第一引物组如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，第一探针的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，第一探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

第二引物组如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，第二探针的核酸序列如SEQ ID NO.6所示；其中，第二探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

第三引物组如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，第三探针的核酸序列如SEQ ID NO.9所示；其中，第三探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

第四引物组如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，第四探针的核酸序列如SEQ IDNO.12所示；其中，第四探针的5’端标记有荧光报告基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

第五引物组如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，第五探针的核酸序列如SEQ IDNO.15所示；其中，第五探针的5’端标记有荧光报告基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

第六引物组如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，第六探针的核酸序列如SEQ IDNO.18所示；其中，第六探针的5’端标记有荧光报告基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

第七探针核酸序列SEQ ID NO.19，该探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

第八引物组如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示，第八探针的核酸序列如SEQ IDNO.22所示；其中，第八探针的5’端标记有荧光报告基团Quasar705，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3。

上述的核酸序列具体如下表：

表1 核酸序列表

表1中CV-F序列中n为次黄嘌呤，次黄嘌呤是A和G生成过程中的一个中间产物，具有一定的简并性，能够增加引物探针对突变的容忍度。

本实施例还提供采用上述核酸组合物检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）以及2019新型冠状病毒的方法，该方法包括：

（1）PCR扩增：

取50μL待检测核酸样本与PCR反应试剂混合，混匀后放到宏石荧光定量PCR仪（SLAN-96）上进行扩增检测，PCR程序如下：

表2 PCR扩增程序

其中，上述待检测核酸样本可以通过如下方法提取：

取500 μL待测样本，参考本申请人提出的《一种通用型核酸提取试剂盒及其使用方法》（公布号 CN 109880824A）中公开的方法提取待测样本中的核酸；

所提取的核酸可以是RNA和/或DNA；

其中，上述PCR反应试剂通过如下方法制备：

单人份PCR反应试剂：

（a）分别采用中国疾病预防控制中心推荐的针对SARS-Cov-2的ORF1ab区段的特异性引物探针(SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24/SEQ ID NO.25)和本发明筛选的相应引物探针(SEQID NO.20/ SEQ ID NO.21/ SEQ ID NO.22)按下表配制PCR反应液配方2和配方1，混匀后30μL/管分装到PCR管中：

表3 PCR反应液配方表

其中，反应液A、B按照以下配方配置：

反应液A：Tris-HCl(pH 7 at 25℃) 5mmol/L、Tth酶30U/mL、UNG酶1U/mL、Mn²⁺100mmol/L、甘油20% V甘油/V反应液A；

反应液B：缓冲液（pH为9）、dATP（脱氧核糖核苷三磷酸）3mol/mL、dGTP（脱氧鸟苷三磷酸） 5 mol /mL、dCTP（脱氧胞嘧啶核苷酸） 3 mol /mL、dUTP（脱氧尿嘧啶）10 mol /mL、DTT（二硫苏糖醇） 0.1mmol/L、BSA（牛血清白蛋白） 5mmol/L和Mn²⁺ 40mmol/L；以反应液B的总体积计，缓冲液包括bicine/KOH 80 mmol/L、K-acetate 80 mmol/L和甘油12% V甘油/V反应液B；

（2）结果判读：

按下表判读方法，根据Ct值进行判读：

表4 判读结果汇总表

实验例1

验证实施例1的核酸组合物的灵敏度

检测方法如下：

分别将HCV 国家参考品（340016-201701），HBV国家参考品（300022-201601），HIV-1WHO标准品（16/194）HIV-2 WHO 标准品（16/296）以及含有SARS-Cov-2的ORF1ab基因片段（SEQID NO.23）的阳性质粒（其骨架为pUC57载体，载体图谱见图9）稀释到表5浓度进行核酸提取（提取方法参考实施例1的待测核酸样本的提取方法，本实验例中对SARS-Cov-2的ORF1ab质粒进行提取，主要是为了模拟SARS-Cov-2样本经过本发明使用的提取方法提取后用本发明的试剂盒进行检测的灵敏度），每个浓度各3管，每管中加入10μL内对照RNA假病毒（含有第七探针核酸序列SEQ ID NO.19）。提取体积为0.5mL，洗脱体积60μL，提取完后取50μL加入到根据实施例1的方法制备的PCR反应液配方1中，混匀后放到PCR仪上进行扩增检测，扩增程序按照实施例1的PCR扩增程序进行。

表5

SARS-Cov-2的ORF1ab基因序列（SEQ ID NO.26）如下：

5’-ATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGATTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGTTTTGCTAAATTCCTAAAAACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAAAAGGACGAAGATGACAATTTAATTGATTCTTACTTTGTAGTTAAGAGACACACTTTCTCTAACTACCAACATGAAGAAACAATTTATAATTTACTTAAGGATTGTCCAGCTGTTGCTAAACAT-3’（SEQ ID NO.26）。

结果如图1~图5和表6：

表6 灵敏度检测的Ct值

从图1~图5和（图1中，圆形标记●为HBV100IU/mL的扩增曲线，三角形标记▲为HBV10IU/mL的扩增曲线，叉型标记×为HBV2.5IU/mL，虚线为内对照的扩增曲线；图2中，圆形标记为HIV-1 500IU/mL的扩增曲线，三角形标记为HIV-1 100IU/mL的扩增曲线，叉型标记为HIV-1 50IU/mL，虚线为内对照的扩增曲线；图3中，圆形标记为HIV-2 500IU/mL的扩增曲线，三角形标记为HIV-2 100IU/mL的扩增曲线，叉型标记为HIV-2 50IU/mL，虚线为内对照的扩增曲线；图4中，圆形标记为HCV 100IU/mL的扩增曲线，三角形标记为HCV 20IU/mL的扩增曲线，叉型标记为HCV 10IU/mL，虚线为内对照的扩增曲线；图5中，圆形标记为SARS-Cov-2 1000CP/mL的扩增曲线，三角形标记为SARS-Cov-2 100CP/mL的扩增曲线，叉型标记为SARS-Cov-2 20CP/mL，虚线为内对照的扩增曲线；）和表2中可以看出：采用实施例1的核酸组合物，在五种病毒同时检测的8重实时定量PCR体系中，针对五种病原体的特异性核酸组合（其中包含14条引物，8条探针）在同一反应体系下，互不干扰，HBV能稳定检出浓度低至2.5IU/mL，HIV-1/HIV-2能稳定检出浓度低至50IU/ mL，HCV能稳定检出浓度低至10IU/mL，SARS-Cov-2能稳定检测出浓度低至20copies/mL检出限低，灵敏度高。

实验例2

验证实施例1的核酸组合物的特异性

检测人巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、梅毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、白色念珠菌，呼吸道合胞病毒A型、呼吸道病毒B型，甲型流感病毒H1N1，甲型流感病毒H3N2，甲型流感病毒H1N1（2009），乙型流感病毒Yamagata和乙型流感病毒Victoria病毒以及金黄色葡萄球菌培养物，验证是否与实施例的核酸组合物有交叉反应。

将上述8种病毒的标本或是培养物及对照品（HBV/HCV/HIV-1阳性对照、HIV-2阳性对照、SARS-Cov-2阳性对照品中含有ORF1ab的质粒）按照实施例1中的提取方法进行提取，每管中加入10μL内对照RNA假病毒，提取体积为0.5mL，洗脱体积60μL，提取完后取50μL加入到按照实施例1的方法制备得到的PCR反应液配方1中，混匀后放到PCR仪上进行扩增检测，按照实施例1的PCR扩增程序扩增。

结果如表7所示：

表7特异性检测的Ct值

由表3的结果可知，本发明的核酸组合物的检测特异性良好，能够将乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）以及2019新型冠状病毒特异性地检测出，与上述14种血液及呼吸道常见的病原体无交叉反应。

试验例3

验证实施例1的核酸组合物的组间干扰性

用阴性血浆将HBV/HCV/HIV-1阳性血浆分别稀释至50IU/mL/50IU/mL/100IU/mL，取提取好的核酸50μL分别加入根据实施例1的方法制备的PCR反应液配方1和PCR反应液配方2中，总反应体积为80μL。将PCR反应管放到荧光定量PCR仪中进行扩增检测，按照实施例1的PCR扩增程序进行扩增。

结果如图6、图7、图8及表8：

表8 灵敏度检测的Ct值

实验结果如图6-8所示（图中所有圆形标记●为配方1的扩增曲线，三角形标记▲为配方2的扩增曲线），从中可以看出，配方1和配方2相比，HBC和HCV的Ct值均有提前，也即针对这两个项目，本发明提出的配方1的荧光信号值明显提高，说明国家 CDC推荐的针对SARS-Cov-2的ORF1ab区段的特异性引物探针相对于本发明筛选的针对SARS-Cov-2的ORF1ab区段的特异性引物探针对HBV和HCV有明显的干扰。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海丽珠试剂股份有限公司

<120> 用于血液筛查的核酸组合物和试剂盒

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caacctccaa tcactcacca acct 24

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaagtagag gacaaacggg caacat 26

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<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgctgcta tgcctcatct tcttgttgg 29

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaccaccaaa tgcccctatc ct 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atcttcggcg acgcggaga 19

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

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ctgcgaggcg agggagttct tcttcg 26

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

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gagtagagtt gggtngcgaa 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtgcacggta tacgagacct c 21

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgcctgatag ggtgcttgcg agtgc 25

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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ggtttattac agggacagca gaga 24

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tttgcttttc ttcttggcac tac 23

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gagacctttc cacttccccg tcatcatta 29

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctggtaacta gagatccctc agacc 25

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctctcgacgc aggactcggc tt 22

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctagcagtgg cgcccgaaca gggac 25

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gagaaactcc gtcttgtcag ggaa 24

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccaacaggct ctctgccaat c 21

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<212> DNA

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<400> 18

tacggcccgg cggaaagaaa 20

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<212> DNA

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acgtcggagc agcctaagcg tactagcgac gt 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cagtaaaaca actgtagcgt cacttatc 28

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctcatatacc gagcagcttc ttcc 24

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccatgtgtta catagccaag tggcattg 28

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28

<210> 26

<211> 500

<212> DNA

<213> SARS-Cov-2（Coronavirus）

<400> 26

atcgtgttgt ctgtactgcc gttgccacat agatcatcca aatcctaaag gatttgtgac 60

ttaaaaggta agtatgtaca aatacctaca acttgtgcta atgaccctgt gggttttaca 120

cttaaaaaca cagtctgtac cgtctgcggt atgtggaaag gttatggctg tagttgtgat 180

caactccgcg aacccatgct tcagtcagct gatgcacaat cgtttttaaa cgggtttgcg 240

gtgtaagtgc agcccgtctt acaccgtgcg gcacaggcac tagtactgat gtcgtataca 300

gggcttttga catctacaat gataaagtag ctggttttgc taaattccta aaaactaatt 360

gttgtcgctt ccaagaaaag gacgaagatg acaatttaat tgattcttac tttgtagtta 420

agagacacac tttctctaac taccaacatg aagaaacaat ttataattta cttaaggatt 480

gtccagctgt tgctaaacat 500

Claims

1.一种用于血液筛查的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物包括如下引物对及其对应探针：

2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物还包括第七探针，所述第七探针序列如SEQ ID NO.19所示。

3.根据权利要求1或2所述的核酸组合物，其特征在于，所述探针均为自身淬灭探针。

4.根据权利要求3所述的核酸组合物，其特征在于，所述自身淬灭探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。

5.根据权利要求4所述的核酸组合物，其特征在于，（a）、（b）、（c）和（d）中探针的5’端标记的所述荧光报告基团彼此不同。

6.根据权利要求4或5所述的核酸组合物，其特征在于，所述荧光报告基团包括选自FAM、HEX、ROX、JOE、CY3、VIC、TET、TAXAS RED、NED、ALEXA、TAMRA、Quasar705、CY5.5和CY5中的一种；所述荧光淬灭基团包括选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB和DABCYL中的任意一种。

7.根据权利要求6所述的核酸组合物，其特征在于，（a）中探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；

8.一种用于血液筛查的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-7任一项所述的核酸组合物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，血液筛查包括以下病毒中的至少之一：HBV、HCV、HIV-1、HIV-2和SARS-Cov-2。

10.一种非诊断目的检测血液样品中病毒的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求7所述用于血液筛查的试剂盒检测血液样品中的以下病毒中的至少之一：HBV、HCV、HIV-1、HIV-2和SARS-Cov-2。