CN106834547B

CN106834547B - 一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒e6/e7基因检测的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN106834547B
Application number: CN201710186202.3A
Authority: CN
Inventors: 任绪义; 吕江峰; 潘彩霞
Original assignee: Hangzhou Dian Medical Examination Center Co ltd; Hangzhou Dian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xi'an Dean medical laboratory Co.,Ltd.
Priority date: 2017-03-27
Filing date: 2017-03-27
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2037-03-27
Also published as: CN106834547A

Abstract

本发明公开了一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒及其应用，本发明针对14种高危型HPV设计的引物和探针，可特异性的实现快速对HPV E6/E7 mRNA的检测与鉴别。本发明的试剂盒具有快速、高效、敏感特异和实时检测分析等特点，为HPV的普查和宫颈癌防治提供了快速准确的分子检测方法，同时大大降低了检验成本，具有重要的推广应用价值。

Description

一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于实时核酸序列依赖性扩增(Nucleicacid sequence-basedamplification，NASBA)技术和分子信标熔解曲线技术的人乳头瘤病毒E6/E7基因检测技术。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)属乳头多瘤空泡病毒科，是一种嗜上皮性病毒。它对表皮和粘膜鳞状上皮具有特殊嗜性，为无包膜的双链环状DNA病毒，具有高度的特异性，且在人和动物中分布广泛。HPV基因组共由3个基因区组成，包括早期区(EarlyRegion，E区)、晚期区(Late Region，L区)和与非编码区(Uncoding Region，UCR)或上游调控区(URR)。E区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。L区主要有编码衣壳蛋白的L1和编码次要衣壳蛋白的L2。L1高度保守，特异性强；L2编码的衣壳蛋白较小，但变异多。UCR含有HPV基因组DNA的复制起点和调控HPV病毒的转录与复制表达所必需的元件。

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)经过完全测序后可归类成120多种基因型，其中有50余种定向感染人体生殖道皮肤及粘膜的复层鳞状上皮，导致尖锐湿疣糜烂，甚至可能引起癌症的发生。根据其是否可以引起癌变，HPV亚型可分为“低危”型和“高危”型，前者主要引起良性的生殖器疣和低度的宫颈上皮坏死(CIN)；后者的感染是引发宫颈癌的主要致病因素。在大多数情况下，免疫系统能在HPV造成伤害之前将其清除，95％以上的生殖道HPV感染能在3-5年内痊愈，但也有少数HPV感染不能被清除，经过多年的一系列的病变发展为宫颈癌。研究发现，中国妇女HPV感染率的年龄组分布曲线呈现出两个高峰(20-24岁和40-44岁)，HPV的感染正日益普遍的影响着中国妇女的生活质量和身心健康。

宫颈癌是危害女性健康的第二大恶性肿瘤，而高危型HPV的持续性感染是宫颈癌发生的必要条件。HPV的感染使得宫颈癌的相对危险性增加了250倍，而从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。事实上，约99.7％的宫颈癌都是由高危型HPV造成，尤其是HPV 16、18、31、33、35的反复或持续感染所致。因此，高危HPV病毒是目前最为明确的致癌病毒，有针对性地对高危型HPV进行全面检测，对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。

临床上HPV分型检测是应用分子生物学的方法检测病毒的核酸，主要集中在以靶序列扩增为基础的检测技术(如荧光-PCR法)和以信号放大为基础的检测技术(如杂交捕获法)。国内市场上HPV核酸检测试剂盒检测的靶序列主要针对HPV的L1基因序列和全基因组序列，这些方法是以病毒基因组DNA作为靶序列，检测样本载有的病毒类型及负荷量。实际上宫颈细胞的病变程度不仅与病毒类型以及负荷量相关，也与致癌基因的活动程度密切相关。HPV E6/E7信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)是病毒癌基因的转录产物，它在宫颈组织中表现出癌基因的活性，HPV E6/E7mRNA水平与病变的严重程度相关。研究表明，与HPVDNA检测相比，HPV E6/E7mRNA检测可能是一种更有效的方式，为感染高危型HPV的妇女提供了更准确的风险预测。

2006年欧洲生殖器感染及肿瘤研究组织认为HPV E6/E7mRNA检测可以作为HPV相关的分子标记物之一进行研究。而随着分子生物学与生物信息学的快速发展和有机结合，基于核酸扩增的技术也得到了快速的发展。如逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是一种检测RNA的简便、准确的常规技术。但是，基于PCR的技术是终点法分析，需要反复升降温的循环扩增和PCR后的凝胶电泳分析结果，耗时较长，且灵敏度仍有待提高。接着无需电泳分析的实时荧光RT-PCR成为更快捷的一种核酸扩增和RNA检测技术。该技术利用荧光探针实现对靶核酸的特异性检测，利用荧光信号的积累实现实时监测PCR扩增反应的全过程从而能实时分析检测结果。由于实时荧光RT-PCR仍需要有反转录步骤和变性、退火及延伸等三个温度点进行几十次升降温循环，每个温度点和时间也需精确设定，整个反应仍需耗时2-2.5小时以上。

近年来，一种新型的核酸扩增技术—等温扩增技术实现在恒温条件下的检测。如DNA环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA，LAMP)应用的比较广泛，也有相关专利申请，但LAMP技术需要使用4条引物，一共识别靶DNA的6个不同区域，虽然提高了特异性，但针对变异大的病毒核酸分子在设计上非常困难。而另一种快速等温扩增技术，核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)技术克服了以往核酸扩增的不足，更为简便高效，尤其适用于RNA的检测。与PCR的区别在于，NASBA是在AMV反转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶等三种酶的共同协作下，在41-42℃，由一对引物指导的连续均一的体外特异核苷酸序列等温扩增酶促过程。其中一条引物其5’端具有被T7RNA聚合酶识别的启动子序列。在NASBA基础

上结合分子信标(molecular beacon)探针可以建立实时NASBA等温扩增技术。该技术具有以下优点：(1)等温扩增：反应在同一恒温体系条件下进行；(2)快速高效、灵敏度高：实时NASBA反应是一种无需升降温的连续快速扩增，也不需要反转录过程，整个反应时间短、单链RNA产物积累迅速，可以在60-90分钟内完成检测，并使模板RNA扩增109倍以上，灵敏度甚至可以达到检测拷贝数为个位的模板RNA，比常规PCR方法更加敏感；(3)特异性高、实时检测：反应不需高温变性，即使有双链DNA污染也不会被扩增，而通过分子信标探针的检测进一步提高了特异性和灵敏度，也实现了实时检测和结果分析；(4)设计简单：只需设计1对引物和1条探针来识别靶RNA的一段区域内序列，对于检测变异度高的病毒核酸来说，设计上相对LAMP技术更为容易。

高分辨率熔解曲线分析技术(HRM)是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。HRM技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。其中，主要的研究方向集中在基因未知突变以及SNP的扫描、已知突变及SNP的基因分型、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定、法医鉴定、亲子鉴定、HLA的配型和甲基化的研究等方面。HRM技术的主要原理是基于核酸分子物理性质的不同。不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。HRM技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒及其检测方法，以弥补现有检测方法的不足。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的引物及探针，包括如下引物对和分子信标探针探针：

(1)检测HPV16的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，检测HPV16的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)检测HPV18的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5所示，检测HPV18的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

(3)检测HPV31的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示，检测HPV31的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

(4)检测HPV33的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示，检测HPV33的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

(5)检测HPV35的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14示，检测HPV35的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

(6)检测HPV39的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16～17示，检测HPV39的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

(7)检测HPV45的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20示，检测HPV16的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

(8)检测HPV51的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22～23示，检测HPV51的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；

(9)检测HPV52的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25～26示，检测HPV52的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；

(10)检测HPV56的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.28～29示，检测HPV16的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；

(11)检测HPV58的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31～32示，检测HPV16的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；

(12)检测HPV59的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.34～35示，检测HPV59的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；

(13)检测HPV66的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.37～38示，检测HPV66的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；

(14)检测HPV68的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.40～41示，检测HPV68的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示。

所述分子信标探针的5’端和3’端的4个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的30～40个碱基是与HPV病毒E6/E7ORF反义链互补的特异性序列。

作为优选，

检测HPV16、HPV18、HPV33、HPV39分子信标探针5’端为吲哚二羧菁Cy5标记；

检测HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58分子信标探针5’端为羧基荧光素FAM标记；

检测HPV31、HPV35、HPV59、HPV66、HPV68分子信标探针5’端为六氯荧光素HEX标记。

一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒，包括4×实时NASBA反应液和5×酶混合液，所述4×实时NASBA反应液中溶解有权利要求1所述的引物对和分子信标探针，其浓度分别为0.8μM。

作为优选，所述4×实时NASBA反应液的配方如下：Tris-HCl 160mM、MgCl₂ 48mM、KCl 280mM、DTT 20mM、DMSO 60％(v/v)、dNTP 4mM、NTPs 8mM、甜菜碱200mM、权利要求1所述的引物对和分子信标探针0.8μM，4×实时NASBA反应液的pH为8.0。

其中，所述的5×酶混合液的配方如下：RevertAid反转录酶2U/μL、T7RNA聚合酶10U/μL、BSA 0.55mg/ml、RNA酶抑制剂5U/μL。

作为优选，该试剂盒包括阳性对照、阴性对照和空白对照。

其中，所述阳性对照为人乳头瘤病毒含有E6/E7基因片段的假病毒，如SEQ IDNO.43～56所示。

其中，阴性对照为在核酸提取时与标本同时平行提取的无菌生理盐水。

其中，所述空白对照为无核酸酶的纯水。

上述基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的引物及探针在人乳头瘤病毒E6/E7基因检测中的应用在本发明的保护范围之内。

有益效果：

本发明所述检测试剂盒经试验反复验证和优化，具有以下优点：

(1)等温扩增：避免了普通PCR对温度循环的特殊要求所带来的种种不便；

(2)特异性强：通过精心设计并结合临床样本筛查优化选择出的特异性正向引物、反向引物和分子信标探针，根据产物与探针的特异性结合可以确保检测的特异性；

(3)灵敏高效：由于NASBA自身的扩增特点，使得检测灵敏度进一步提高；

(4)扩增效率高：可以在60～90分钟内完成检测，并使模板RNA扩增约109倍。

附图说明

图1 HPV16与Tm值的对应关系。

图2 HPV18与Tm值的对应关系。

图3 HPV31与Tm值的对应关系。

图4 HPV33与Tm值的对应关系。

图5 HPV35与Tm值的对应关系。

图6 HPV39与Tm值的对应关系。

图7 HPV45与Tm值的对应关系。

图8 HPV51与Tm值的对应关系。

图9 HPV52与Tm值的对应关系。

图10 HPV56与Tm值的对应关系。

图11 HPV58与Tm值的对应关系。

图12 HPV59与Tm值的对应关系。

图13 HPV66与Tm值的对应关系。

图14 HPV68与Tm值的对应关系。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。

实施例1：本发明实时NASBA检测高危型HPV E6/E7mRNA的试剂盒的组成及主要组成成分如下：

实施例2：实时NASBA引物和探针的设计

首先从美国NCBI的基因库下载14种高危型HPV全基因组DNA序列，同时找到E6/E7基因序列并结合软件Oligo 7.56(Molecular Biology Insights,Inc.USA)进行引物和探针的设计。设计思想是：综合考虑对14种高危型HPV E6/E7基因检测的特异性和通用性(在病毒核酸变异位点用简并碱基处理)、引物和探针设计应遵循的普遍性原则(如Tm值、3’末端自由能、GC含量、避免出现内部结构及形成二聚体等)，以及反向引物加上能被T7RNA聚合酶识别的启动子序列后的影响等。对于设计出的引物和探针合成回来后，以构建的质粒为模板通过qPCR实验和NASBA实验进行筛选验证，最后本发明选出最优的引物和探针，序列如下。

实施例3：阳性质控品和阴性质控品的制备

1、阳性质控品的制备

采用市售商品化核酸提取试剂盒提取感染单型HPV病毒标本中的病毒RNA，进行PCR扩增。回收扩增的目的条带，将其与经改造的pET32-MS3his载体进行连接反应，4℃连接过夜，将连接产物转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞，抗性筛选、摇菌、PCR鉴定阳性者，提取重组质粒，测序验证。获得含目的片段的克隆菌液通过IPTG诱导剂进行诱导表达，收集诱导完的菌液进行超声破碎分离上清和沉淀，收集的上清为假病毒溶液，即阳性质控品。

2、阴性对照品的制备

配制0.9％的生理盐水，进行121℃高压灭菌20min，灭菌生理盐水即为阴性质控品。

实施例4：样本处理与RNA提取

1、样本处理

取5ml宫颈脱落细胞和生殖泌尿道分泌物，12000rpm离心2min，收集沉淀，并用灭菌生理盐水洗涤2次，最后加入250μl灭菌生理盐水，吹打悬浮沉淀；

2、RNA提取

通过型号为NP968的天隆科技核酸自动提取仪及其配套的试剂盒，对临床标本、阳性质控和阴性质控同时进行RNA的提取，提取获得的RNA即为模板核酸。核酸自动提取仪的运行程序如下：

实施例5：HPV E6/E7基因实时NASBA检测试剂盒的检测

1、实时NASBA扩增反应

每个反应管中分别加入5μL待测样本核酸模板、5μL 4×实时NASBA反应液和6μL经灭菌的超纯水，瞬时离心后置于罗氏LightCycler480上，运行程序参数为：65℃，5min；41℃，5min。运行结束后，取出反应管并向其中加入4μL 5×酶混合液，瞬时离心后置于罗氏LightCycler480上，运行程序参数为：41℃，2h；40-80℃，melting curve；37，1sec。荧光通道同时选择Cy5、Fam、VIC三种通道。

2、结果判定

14种高危型别HPV扩增的特异性片段与所设计的分子信标探针杂交，收集荧光信号，通过相应的Tm值及荧光信号判断HPV的型别。每种型别HPV所对应的的Tm值范围如下表所示：

实施例6：HPV E6/E7基因实时NASBA检测试剂盒的灵敏度分析

将阳性质控提取的模板RNA依次做10倍梯度稀释，选取低浓度的9个梯度进行实验，每个浓度梯度各取5μL作为模板用于扩增，9个浓度梯度的拷贝数分别为：1×10⁸至1×10⁰。按照实施例四进行实时NASBA扩增及检测。本发明实时NASBA试剂盒对14种高危型HPV病毒的RNA模板都可成功检测到1×10²拷贝/ul。

实施例7：HPV E6/E7基因实时NASBA检测试剂盒的特异性分析

1.样本：选择一组HPV病毒DNA的临床阳性样本，分别感染14种高危型中的一种，以及分别感染HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44五种低危型HPV病毒。阳性质控、阴性质控、空白对照(H2O)，均由试剂盒提供。

2.方法：使用本发明所述实时NASBA检测试剂盒，采用实施例五所述方法对以上临床样本进行检测，观察该试剂盒是否会发生非特异性的检测结果。

3.结果：根据实时NASBA扩增的荧光图谱分析，本发明所述试剂盒仅对14种高危型人乳头瘤病毒的检测为阳性，对5种低危型人乳头瘤病毒以及阴性对照、空白对照的检测均为阴性，证明该方法有较好的特异性。结果见附图1～14。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州迪安生物技术有限公司杭州迪安医学检验中心有限公司

<120> 一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒及其应

用

<130> SG20170228

<160> 56

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N16F

<400> 1

gagatacacc tacattgcat ga 22

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N16R

<400> 2

aattctaata cgactcacta tagggagaag gctggaccat ctatttcatc ctc 53

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N16P

<400> 3

gcgcgatttg caaccagaga caactgatct ctactgttat gagcgcgc 48

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N18F

<400> 4

cattgtattg catttagagc cc 22

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N18R

<400> 5

aattctaata cgactcacta tagggagaag gctactacta gctcaattct ggc 53

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N18P

<400> 6

gcgccattta ccagcccgac gagccgaacc acaacgtcac acaagcgc 48

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N31F

<400> 7

cctccactgt tatgagcaat ta 22

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N31R

<400> 8

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggtgtagact tacactgaca aca 53

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N31P

<400> 9

gcgcacaagc agaaccggac acatccaatt acaatatcgt taccgcgc 48

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N33F

<400> 10

ccaactgacc tatactgcta tg 22

<210> 11

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N33R

<400> 11

aattctaata cgactcacta tagggagaag gctgttgaca cataaacgaa ctg 53

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N33P

<400> 12

gcgcaagcac aaccagccac agctgattac tacattgtaa cctggcgc 48

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N35F

<400> 13

gaagatacta ttgacggtcc ag 22

<210> 14

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N35R

<400> 14

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcacatttac aacaggacgt tac 53

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N35P

<400> 15

gcgcagcaaa accagacacc tccaattata atattgtaac gtccgcgc 48

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N39F

<400> 16

ttaggagagt cagaggatga aa 22

<210> 17

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N39R

<400> 17

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggttacactt acaacacgaa cac 53

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N39P

<400> 18

gcgccaacat caactactag ccagacggga cgaaccacag cgtcgcgc 48

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N45F

<400> 19

gtagggaaac acaagtatag ca 22

<210> 20

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N45R

<400> 20

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcaacaggtc aacaggatct aat 53

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N45P

<400> 21

gcgcggaaac actgcaagaa attgtattgc atttggaacc tcaggcgc 48

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N51F

<400> 22

tgtcatagat gtcaaagacc ac 22

<210> 23

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N51R

<400> 23

aattctaata cgactcacta tagggagaag gggctttatt acacttgggt ttc 53

<210> 24

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N51P

<400> 24

gcgccggggc aatgcgctaa ttgctggcaa cgtacacgac aacggcgc 48

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N52F

<400> 25

cgtggagaca aagcaactat aa 22

<210> 26

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N52R

<400> 26

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtaattgctc atagcagtgt agg 53

<210> 27

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N52P

<400> 27

gcgcgatctg caacctgaaa caactgacct acactgctat gagcgcgc 48

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N56F

<400> 28

atgaggatga ggatgaagta ga 22

<210> 29

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N56R

<400> 29

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcaaacttac actcacaaca agg 53

<210> 30

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N56P

<400> 30

gcgcggagcg gccacagcaa gctagacaag ctaaacaaca tacggcgc 48

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N58F

<400> 31

ctgaaccaac tgacctattc tgc 23

<210> 32

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N58R

<400> 32

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggctgtggcc ggttgtgctt g 51

<210> 33

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N58P

<400> 33

gcgcgtgaca gctcagacga ggatgaaata ggcttggacg ggcgcgc 47

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N59F

<400> 34

acgagcaatt acctgactcc gac 23

<210> 35

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N59R

<400> 35

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggttgtgacg ctgtggttca g 51

<210> 36

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N59P

<400> 36

gcgcgatgaa ccagatggag ttaatcatcc tttgctacta gctagcgc 48

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N66F

<400> 37

catacgagta gacaagctac ag 22

<210> 38

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N66R

<400> 38

aattctaata cgactcacta tagggagaag gggtacgtga attaggtaac act 53

<210> 39

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N66P

<400> 39

gcgcggatga aatagaccat ttgctggagc ggccacagca agcgcgc 47

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N68F

<400> 40

gttaatcacc accaacatca ac 22

<210> 41

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N68R

<400> 41

aattctaata cgactcacta tagggagaag gttagtgagt ccataaacag cag 53

<210> 42

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N68P

<400> 42

gcgccaacta gtagtagaag cgtcgcggga gaacctgcgg aagcgcgc 48

<210> 43

<211> 305

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段1

<400> 43

taggtgtatt aactgtcaaa agccactgtg tcctgaagaa aagcaaagac atctggacaa 60

aaagcaaaga ttccataata taaggggtcg gtggaccggt cgatgtatgt cttgttgcag 120

atcatcaaga acacgtagag aaacccagct gtaatcatgc atggagatac acctacattg 180

catgaatata tgttagattt gcaaccagag acaactgatc tctactgtta tgagcaatta 240

aatgacagct cagaggagga ggatgaaata gatggtccag ctggacaagc agaaccggac 300

agagc 305

<210> 44

<211> 291

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段2

<400> 44

gcctgcggtg ccagaaaccg ttgaatccag cagaaaaact tagacacctt aatgaaaaac 60

gacgatttca caacatagct gggcactata gaggccagtg ccattcgtgc tgcaaccgag 120

cacgacagga acgactccaa cgacgcagag aaacacaagt ataatattaa gtatgcatgg 180

acctaaggca acattgcaag acattgtatt gcatttagag ccccaaaatg aaattccggt 240

tgaccttcta tgtcacgagc aattaagcga ctcagaggaa gaaaacgatg a 291

<210> 45

<211> 422

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段3

<400> 45

acaaaggtat atgtgatttg ttaattaggt gtataacgtg tcaaagaccg ttgtgtccag 60

aagaaaaaca aagacatttg gataaaaaga aacgattcca caacatagga ggaaggtgga 120

caggacgttg catagcatgt tggagaagac ctcgtactga aacccaagtg taaacatgcg 180

tggagaaaca cctacgttgc aagactatgt gttagatttg caacctgagg caactgacct 240

ccactgttat gagcaattac ccgacagctc agatgaggag gatgtcatag acagtccagc 300

tggacaagca gaaccggaca catccaatta caatatcgtt accttttgtt gtcagtgtaa 360

gtctacactt cgtttgtgtg tacagagcac acaagtagat attcgcatat tgcaagagct 420

gt 422

<210> 46

<211> 380

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段4

<400> 46

acaaacgatt tcataatatt tcgggtcgtt gggcagggcg ctgtgcggcg tgttggaggt 60

cccgacgtag agaaactgca ctgtgacgtg taaaaacgcc atgagaggac acaagccaac 120

gttaaaggaa tatgttttag atttatatcc tgaaccaact gacctatact gctatgagca 180

attaagtgac agctcagatg aggatgaagg cttggaccgg ccagatggac aagcacaacc 240

agccacagct gattactaca ttgtaacctg ttgtcacact tgtaacacca cagttcgttt 300

atgtgtcaac agtacagcaa gtgacctacg aaccatacag caactactta tgggcacagt 360

gaatattgtg tgccctacct 380

<210> 47

<211> 433

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段5

<400> 47

tacagagttg tataatttgt taataaggtg cctgcggtgc cagaaaccat tgaacccagc 60

agaaaaacgt agacacctta aggacaaacg aagatttcac agcatagctg gacagtaccg 120

agggcagtgt aatacatgtt gtgaccaggc acggcaagaa agacttcgca gacgtaggga 180

aacacaagta tagcaataag tatgcatgga ccccgggaaa cactgcaaga aattgtattg 240

catttggaac ctcagaatga attagatcct gttgacctgt tgtgttacga gcaattaagc 300

gagtcagagg aggaaaacga tgaagcagat ggagttagtc atgcacaact accagcccga 360

cgagccgaac cacagcgtca caaaattttg tgtgtatgtt gtaagtgtga cggcagaatt 420

gagcttacag tag 433

<210> 48

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段6

<400> 48

ggacagggcg ctgtgcagtg tgttggagac cccgacgtag acaaacacaa gtgtaacctg 60

taacaacgcc atgagaggaa acaacccaac gctaagagaa tatattttag atttacatcc 120

tgaaccaact gacctattct gctatgagca attatgtgac agctcagacg aggatgaaat 180

aggcttggac gggccagatg gacaagcaca accggccaca gctaattact acattgtaac 240

ttgttgttac acttgtggca ccacggttcg tttgtgtatc aacagtacaa caaccgacgt 300

acgaacccta cagcagctgc ttatgggcac atgtac 336

<210> 49

<211> 370

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段7

<400> 49

ggagaaacgt tagaaaaaca atgcaacaaa cagttatgtc atttattaat taggtgtatt 60

acatgtcaaa aaccgctgtg tccagttgaa aagcaaagac atttagaaga aaaaaaacga 120

ttccataaca tcggtggacg gtggacaggt cggtgtatgt cctgttggaa accaacacgt 180

agagaaaccg aggtgtaatc atgcatggag aaataactac attgcaagac tatgttttag 240

atttggaacc cgaggcaact gacctatact gttatgagca attgtgtgac agctcagagg 300

aggaggaaga tactattgac ggtccagctg gacaagcaaa accagacacc tccaattata 360

atattgtaac 370

<210> 50

<211> 420

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段8

<400> 50

atacaaagtt atataattta tcaataaggt gcatgtgttg tctgaaaccg ctgtgtccag 60

cagaaaaatt aagacaccta aatagcaaac gaagatttca taaaatagca ggaagctata 120

caggacagtg tcgacggtgc tggaccacaa aacgggagga ccgcagactg acacgaagag 180

aaacccaagt ataacatcag atatgcgtgg accaaagccc accttgcagg aaattgtatt 240

agatctatgt ccttacaatg aaatacagcc ggttgacctt gtatgtcacg agcaattagg 300

agagtcagag gatgaaatag atgaacccga ccatgcagtt aatcaccaac atcaactact 360

agccagacgg gacgaaccac agcgtcacac aatacagtgt tcgtgttgta agtgtaacaa 420

<210> 51

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段9

<400> 51

atatgattta tcgataaggt gtcatagatg tcaaagacca cttgggcctg aagaaaagca 60

aaaattggtg gacgaaaaaa aaaggttcca tgaaatagcg ggacgttgga cggggcaatg 120

cgctaattgc tggcaacgta cacgacaacg taacgaaacc caagtgtaat aaagccatgc 180

gtggtaatgt accacaatta aaagatgtag tattgcattt aacaccacag actgaaattg 240

acttgcaatg ctacgagcaa tttgacagct cagaggagga ggatgaagta gataatatgc 300

gtgaccagct accagaaaga cgggctggac aggctacgtg ttacagaatt gaagctccgt 360

gttgcaggtg ttcaagtgta gtacaactgg cagtggaaag cagtggagac acccttcgcg 420

ttgta 425

<210> 52

<211> 380

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段10

<400> 52

aacaagcgat ttcataatat tatgggtcgt tggacagggc gctgttcaga gtgttggaga 60

ccccgacctg tgacccaagt gtaacgtcat gcgtggagac aaagcaacta taaaagatta 120

tatattagat ctgcaacctg aaacaactga cctacactgc tatgagcaat taggtgacag 180

ctcagatgag gaggatacag atggtgtgga ccggccagat ggacaagcag aacaagccac 240

aagcaattac tacattgtga catattgtca cagttgtgat agcacactac ggctatgcat 300

tcatagcact gcgacggacc ttcgtactct acagcaaatg ctgttgggca cattacaagt 360

tgtgtgcccc ggctgtgcac 380

<210> 53

<211> 431

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段11

<400> 53

gagctacact agaaagtata actaaaaaac agttatgtga tttattaata aggtgctaca 60

gatgtcaaag tccgttaact ccggaggaaa agcaattgca ttgtgacaga aaaagacgat 120

ttcatctaat agcacatggt tggaccgggt catgtttggg gtgctggaga caaacatcta 180

gagaacctag agaatctaca gtataatcat gcatggtaaa gtaccaacgc tgcaagacgt 240

tgtattagaa ctaacacctc aaacagaaat tgacctacag tgcaatgagc aattggacag 300

ctcagaggat gaggatgagg atgaagtaga ccatttgcag gagcggccac agcaagctag 360

acaagctaaa caacatacgt gttacctaat acacgtacct tgttgtgagt gtaagtttgt 420

ggtgcagttg g 431

<210> 54

<211> 380

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段12

<400> 54

cctaagacag caacgacaag cgcgtagtga aacactggtg taaaacaatg catggaccaa 60

aagcaacact ttgtgacatt gttttagatt tggaaccaca aaattatgag gaagttgacc 120

ttgtgtgcta cgagcaatta cctgactccg actccgagaa tgaaaaagat gaaccagatg 180

gagttaatca tcctttgcta ctagctagac gagctgaacc acagcgtcac aacattgtgt 240

gtgtgtgttg taagtgtaat aatcaacttc agctagtagt agaaacctcg caagacggat 300

tgcgagcctt acagcagctg tttatggaca cactatcctt tgtgtgtcct ttgtgtgcag 360

caaaccagta acctgcaatg 380

<210> 55

<211> 432

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段13

<400> 55

ggggcaacat tagaaagtat aactaaaaaa cagttatctg atttatcaat aaggtgctac 60

cgatgtcaat gtccgttaac accggaggaa aaacaattgc actgtgaaca taaaagacga 120

tttcattata tagcatatgc atggaccggg tcatgtttgc agtgttggag acatacgagt 180

agacaagcta cagaatctac agtataacca tgcatggtaa agtaccaacg ttgcaagagg 240

ttatattaga acttgcaccg caaacggaaa ttgacctaca atgcaatgag caattggaca 300

gctcagagga tgaggatgag gatgaaatag accatttgct ggagcggcca cagcaagcta 360

gacaagctga acaacataag tgttacctaa ttcacgtacc ttgttgtaag tgtgagttgg 420

tggtgcagtt gg 432

<210> 56

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 假病毒片段14

<400> 56

cgccactgct ggaccagtaa gcgagaggac cgcagacgca cacggcaaga gacacaagta 60

taaactaact atgcatggac caaagcccac cgtgcaggaa attgtgttag agttatgtcc 120

atgcaatgaa atagagccgg ttgaccttgt atgtcacgag caattaggag attcagacga 180

tgaaatagat gaacccgacc atgcagttaa tcaccaccaa catcaactac tagccagacg 240

ggacgaacaa cagcgtcaca gaattcagtg tatgtgttgt aagtgtaaca acccactgca 300

actagtagta gaagcgtcgc gggagaacct gcggaagcta caactgctgt ttatggactc 360

act 363

Claims

1.一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的引物及探针，其特征在于，包括如下引物对和分子信标探针：

(1) 检测HPV16 的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~2所示，检测HPV16 的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2) 检测HPV18 的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4~5所示，检测HPV18 的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

(3) 检测HPV31的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7~8所示，检测HPV31 的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

(4) 检测HPV33的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10~11所示，检测HPV33 的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

(5) 检测HPV35 的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13~14示，检测HPV35 的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

(6) 检测HPV39 的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16~17示，检测HPV39 的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

(7) 检测HPV45的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19~20示，检测HPV45的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

(8) 检测HPV51的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22~23示，检测HPV51的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；

(9) 检测HPV52的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25~26示，检测HPV52的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；

(10) 检测HPV56的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.28~29示，检测HPV56的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；

(11) 检测HPV58的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31~32示，检测HPV58的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；

(12) 检测HPV59的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.34~35示，检测HPV59 的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；

(13) 检测HPV66的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.37~38示，检测HPV66 的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；

(14) 检测HPV68的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.40~41示，检测HPV68 的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示。

2.根据权利要求1所述的基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的引物及探针，其特征在于，

检测HPV16、HPV18、HPV33、HPV39分子信标探针5’ 端为吲哚二羧菁Cy5标记；

检测HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58分子信标探针5’ 端为羧基荧光素FAM标记；

检测HPV31、HPV35、HPV59、HPV66、HPV68分子信标探针5’ 端为六氯荧光素HEX标记。

3.一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒，其特征在于，包括4×实时NASBA 反应液和5×酶混合液，所述4×实时NASBA 反应液中溶解有权利要求1所述的基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的引物及探针，各引物、分子信标的浓度分别为0.8μM。

4.根据权利要求3所述的基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒，其特征在于，所述4×实时NASBA 反应液包括如下组分：Tris-HCl 160 mM、MgCl₂ 48mM、KCl 280 mM、DTT 20 mM、DMSO 60%（v/v）、dNTP 4 mM、NTPs 8 mM、甜菜碱 200 mM和权利要求1所述的基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的引物及探针，各引物、分子信标的浓度分别为0.8μM，4×实时NASBA 反应液的pH为8.0。

5.根据权利要求3所述的基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒，其特征在于，所述的5× 酶混合液包括如下组分：RevertAid反转录酶 2 U/μL、T7RNA聚合酶 10 U/μL、BSA 0.55mg/ml和RNA酶抑制剂5 U/μL。

6.根据权利要求3所述基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括阳性对照、阴性对照和空白对照。

7.根据权利要求6所述基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有人乳头瘤病毒E6/E7基因片段的假病毒，其核苷酸序列包括SEQ ID NO.43~56所示的序列。

8.根据权利要求6所述基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒，其特征在于，阴性对照为在核酸提取时与标本同时平行提取的无菌生理盐水。

9.根据权利要求6所述基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒，其特征在于，所述空白对照为无核酸酶的纯水。

10.权利要求1或2所述基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的引物及探针在制备人乳头瘤病毒E6/E7基因检测试剂中的应用。