CN115927760A

CN115927760A - 一种用于检测人乳头瘤病毒高危亚型的引物组、检测方法和应用

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Publication number: CN115927760A
Application number: CN202211612030.9A
Authority: CN
Inventors: 翁伟绩; 苏斐; 李虹; 高鹏
Original assignee: Yixin Diagnostic Technology Suzhou Co ltd
Current assignee: Yixin Diagnostic Technology Suzhou Co ltd
Priority date: 2022-12-14
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明提供了一种用于检测人乳头瘤病毒高危亚型的引物组，包括4条上游引物和3条下游引物；其序列如SEQ ID NO.1‑7所示。通过采用本发明的技术方案，上游引物和下游引物均采用多条设计，避免简并碱基的使用，确保引物组与不同亚型的HPV序列均能有效匹配，并提高了引物检测效果的稳定性。同时，采用7条引物来实现HPV高危亚型的检测，覆盖面广，尤其是能够大幅提高HPV33和HPV58亚型的灵敏度和扩增效果。

Description

一种用于检测人乳头瘤病毒高危亚型的引物组、检测方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种检测人乳头瘤病毒高危亚型的引物组、检测方法和应用。

背景技术

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，且其发病有年轻化的趋势，宫颈癌的早期筛查、发现及治疗是有效防治宫颈癌的关键，而研究表明人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)的感染与宫颈癌的发生直接相关，其属于乳头瘤病毒科，是一种由DNA核心和蛋白衣壳组成的无包膜双链环状DNA病毒，可引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤，持续性的高危型HPV感染则是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。目前已经确定的HPV亚型有190余种，约50余种定向感染人体生殖道皮肤及黏膜的复层鳞状上皮。

在临床上根据HPV不同亚型的致病力大小将HPV分为高危型、中危型和低危型三大类，国家药品监督管理局将HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59以及HPV68型定义为高危型别，高危型HPV除可引起生殖器疣外，还可引起生殖器癌和宫颈癌，高危型HPV是造成宫颈癌的主要病原体，约99％的宫颈癌是由高危型HPV持续或反复感染所致，尤其是HPV16和HPV18与宫颈癌的关系非常密切，HPV16主要引发鳞癌，HPV18主要与腺癌相关。因此对HPV亚型的准确分型检测对宫颈癌和其他疣类病变的早期诊断和治疗具有重要意义。

由于HPV不能在体外培养，故不能用简便的血清检测进行HPV的诊断和分型。临床上用于检测HPV的方法包括细胞学检测、免疫组化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹和PCR等，其中PCR检测方法的敏感性最高，具有简便、高效和价廉的优点，是目前应用最多的方法。PCR检测方法中，荧光定量PCR法和PCR反向点杂交法作为现有技术中主流的检测方法主要依赖于对HPV的引物。当前常用的HPV扩增引物如GP5/6、GP5+/6+、MY11/09、PGMY11/09、SPF1/2等。这些传统的引物可实现HPV多种亚型的同时扩增，但也存在各自的局限。其中雅培公司推出的引物基于GP5+/6+而修改，能够对14种高危亚型进行扩增，但33和58亚型的扩增效果不佳，灵敏度较低。因此，现有技术尚缺少对14种HPV高危亚型均能表现出较佳的扩增效果和灵敏度的引物。

发明内容

针对现有技术存在的技术问题，本发明公开了一种用于检测人乳头瘤病毒高危亚型的引物组、检测方法和应用，采用7条引物实现对人乳头瘤病毒的高危亚型的检测的同时，能够大幅度地提高对HPV33和HPV58亚型检测的灵敏度和扩增效果。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案，一种检测高危亚型人乳头瘤病毒的引物组，包括上游引物组和下游引物组；其中，所述上游引物组包括

第一上游引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；

第二上游引物，其序列如SEQ ID NO.2所示；

第三上游引物，其序列如SEQ ID NO.3所示；

第四上游引物，其序列如SEQ ID NO.4所示；

所述下游引物组包括

第一下游引物，其序列如SEQ ID NO.5所示；

第二下游引物，其序列如SEQ ID NO.6所示；

第三下游引物，其序列如SEQ ID NO.7所示。

上述技术方案提供的所述引物组用于检测的人乳头瘤病毒高危亚型包括：HPV16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 58、HPV59、HPV 66、HPV 68a和HPV 68b。

本发明的实施例还提供了一种用于人乳头瘤病毒高危亚型筛查的引物组和探针组的组合物，包括上述技术方案提供的检测人乳头瘤病毒的引物组和探针组；所述探针组包括探针1～15中的至少一条；所述探针1～15的序列如SEQ ID NO.11～25所示。其中，所述探针1～14的包括荧光标记基因VIC-BHQ1、ROX-BHQ2或FAM-BHQ1。

且，引物组和探针组的组合物中，

用于检测HPV16亚型的探针序列为SEQ ID NO.11所示；

用于检测HPV18亚型的探针序列为SEQ ID NO.12所示；

用于检测HPV31亚型的探针序列为SEQ ID NO.13所示；

用于检测HPV33亚型的探针序列为SEQ ID NO.14所示；

用于检测HPV35亚型的探针序列为SEQ ID NO.15所示；

用于检测HPV39亚型的探针序列为SEQ ID NO.16所示；

用于检测HPV45亚型的探针序列为SEQ ID NO.17所示；

用于检测HPV51亚型的探针序列为SEQ ID NO.18所示；

用于检测HPV52亚型的探针序列为SEQ ID NO.19所示；

用于检测HPV56亚型的探针序列为SEQ ID NO.20所示；

用于检测HPV58亚型的探针序列为SEQ ID NO.21所示；

用于检测HPV59亚型的探针序列为SEQ ID NO.22所示；

用于检测HPV66亚型的探针序列为SEQ ID NO.23所示；

用于检测HPV68a亚型的探针序列为SEQ ID NO.24所示；

用于检测HPV68b亚型的探针序列为SEQ ID NO.25所示。

本发明的实施例还提供了一种人乳头瘤病毒高危亚型的检测方法，采用上述技术方案提供的引物组，添加荧光染料或荧光探针，或引物组和探针组的组合物，结合荧光定量PCR法或PCR-反向点杂交法，对HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 66、HPV 68a和HPV 68b的核酸靶标进行检测。

具体地，包括以下步骤：

S1.提取待测样品总DNA；

S2.制备2份反应液，每份所述反应液包括PCR扩增预混液；

S3.在S2制备的所述反应液中加入人工合成的HPV片段、引物组混合液、探针组混合液和内参引物探针混合液；

S4.PCR扩增和检测。

其中，S2中，所述PCR扩增预混液包括Taq Pro U+Multiple Probe qPCR混合液。

S3中，内参引物探针混合液中包括：内参上游引物，其序列如SEQ ID NO.8所示；内参下游引物，其序列如SEQ ID NO.9所示；内参探针，其序列如SEQ ID NO.10所示，荧光报告基因为Cy5，荧光淬灭基团为BHQ2。

S4中，PCR扩增参数包括37℃消化120秒，95℃变性120秒；然后进入第一组循环：95℃8秒、54℃30秒，循环4次，进入第二组循环：95℃8秒、52℃30秒(每个循环+1秒)、50℃40秒，循环38次。

本发明的实施例还提供了一种用于检测人乳头瘤病毒的高危亚型的试剂盒，至少包括上述技术方案提供的引物组或引物组和探针组的组合物。

本发明技术方案的技术效果：

1.通过采用本发明的技术方案，上游引物和下游引物均采用多条设计，避免简并碱基的使用，确保引物组与不同亚型的HPV序列均能有效匹配，并提高了引物检测效果的稳定性。

2.通过采用本发明的技术方案，采用7条引物来实现14种HPV高危亚型的检测，覆盖面广，尤其是能够大幅提高HPV33和HPV58亚型的灵敏度和扩增效果。

3.通过采用本发明的技术方案，采用特定的7条引物能够减少上游引物和下游引物中碱基位点错配造成的引物与目标序列结合不稳定性，提高扩增效率。

4.通过采用本发明的技术方案，采用的7条引物可灵活应用于不同的检测方法，如荧光定量PCR法、PCR-反向点杂交法。

附图说明

图1为本发明实施例1的HPV58亚型的S型对数扩增曲线。

图2为本发明实施例2的HPV33亚型的S型对数扩增曲线

图3为本发明实施例3的HPV16亚型的S型对数扩增曲线。

图4为本发明实施例4的HPV18亚型的S型对数扩增曲线。

图5为本发明实施例5的HPV31亚型的S型对数扩增曲线。

图6为本发明实施例6的HPV35亚型的S型对数扩增曲线。

图7为本发明实施例7的HPV39亚型的S型对数扩增曲线。

图8为本发明实施例8的HPV45亚型的S型对数扩增曲线。

图9为本发明实施例9的HPV51亚型的S型对数扩增曲线。

图10为本发明实施例10的HPV52亚型的S型对数扩增曲线。

图11为本发明实施例11的HPV56亚型的S型对数扩增曲线。

图12为本发明实施例12的HPV59亚型的S型对数扩增曲线。

图13为本发明实施例13的HPV66亚型的S型对数扩增曲线。

图14为本发明实施例14的HPV68a亚型的S型对数扩增曲线。

图15为本发明实施例14的HPV68b亚型的S型对数扩增曲线。

图16为本发明实施例16的HPV58亚型的S型对数扩增曲线。

图17为本发明实施例17的HPV58亚型的S型对数扩增曲线。

图18为本发明实施例18的HPV33亚型的S型对数扩增曲线。

图19为本发明实施例19的HPV33亚型的S型对数扩增曲线。

图20为本发明实施例1中的内参引物S型对数扩增曲线。

图21为本发明对照例1的HPV58亚型的S型对数扩增曲线。

图22为本发明对照例2的HPV58亚型的S型对数扩增曲线。

图23为本发明对照例3的HPV58亚型的S型对数扩增曲线。

图24为本发明对照例4的HPV33亚型的S型对数扩增曲线。

图25为本发明对照例5的HPV33亚型的S型对数扩增曲线。

图26为本发明对照例6的HPV33亚型的S型对数扩增曲线。

具体实施方式

使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种检测高危亚型人乳头瘤病毒的引物组，包括上游引物组和下游引物组；其中，所述上游引物组包括：

第一上游引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；

第二上游引物，其序列如SEQ ID NO.2所示；

第三上游引物，其序列如SEQ ID NO.3所示；

第四上游引物，其序列如SEQ ID NO.4所示；

下游引物组包括：

第一下游引物，其序列如SEQ ID NO.5所示；

第二下游引物，其序列如SEQ ID NO.6所示；

第三下游引物，其序列如SEQ ID NO.7所示。

上述技术方案提供的引物组用于检测的高危亚型人乳头瘤病毒包括：HPV 16、HPV18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV66和HPV 68a/b。

本发明的实施例还提供了一种用于人乳头瘤病毒高危亚型筛查的引物组和探针组的组合物，包括上述技术方案提供的检测人乳头瘤病毒的引物组和探针组；探针组包括探针1～15中的至少一条；探针1～15的序列如SEQ ID NO.11～25所示。其中，所述探针1～14中，探针序列的5’端标记有荧光报告基团VIC、ROX或FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1或BHQ2。

本发明的实施例还提供了一种用于检测人乳头瘤病毒的高危亚型的检测方法，采用上述技术方案提供的引物组，或引物组和探针组的组合物，结合荧光定量PCR法或PCR-反向点杂交法，对HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68a/b的核酸靶标进行检测。

具体地，包括以下步骤：

S1.提取待测样品总DNA；

S2.制备扩增反应液，每份所述反应液包括PCR扩增预混液、如权利要求1所述的引物组或如权利要求3所述的引物组和探针组的组合物；

S3.在S2制备的所述反应液中加入人工合成的HPV片段；

S4.加入探针组混合液和内参引物探针混合液；

S5.PCR扩增和检测。

其中，S2中，PCR扩增预混液为Taq Pro U+Multiple Probe qPCR混合液。

S4中，内参引物探针混合液中阳性对照引物包括

内参上游引物，其序列如SEQ ID NO.8所示；

内参下游引物，其序列如SEQ ID NO.9所示

内参探针，其序列如SEQ ID NO.10所示；所述内参探针包括荧光标记基因Cy5-BHQ2。

S5中，PCR扩增参数包括37℃消化120秒，95℃变性120秒；然后进入第一组循环：95℃8秒、54℃30秒，循环4次，进入第二组循环：95℃8秒、52℃30秒(每个循环+1秒)、50℃40秒，循环38次。

下面通过具体的实施例来进一步详细说明本发明的技术方案。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

本实施例用来说明本发明的第一个方面，提供的用于检测人乳头瘤病毒高危16亚型的引物和探针及其在人乳头瘤病毒高危型筛查中的应用。

1.样本处理与DNA提取

(1)充分洗脱宫颈刷上的标本，并在管壁上挤干后，丢弃宫颈刷。将200μL洗液转移到1.5ml微量离心管中，依次加入40μL蛋白酶k，400μL裂解液，200μL异丙醇和20μL磁珠(海狸生物病毒核酸提取试剂盒)。

(2)震荡混匀，55℃水浴15分钟(每隔5分钟颠倒数次)；然后将离心管置于磁性分离器上静置1min，用移液器吸去上清液，洗涤：加入600μL 40％异丙醇作为洗涤液，用移液器缓慢吹打磁珠10次或漩涡震荡10s，使磁珠充分重悬，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。

(3)加入600μL 70％乙醇作为洗涤液，用移液器缓慢吹打磁珠10次或漩涡震荡10s，使磁珠充分重悬，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。

(4)步骤(3)重复至少一次。

2.核酸扩增

(1)将步骤1提取的样本中加入人工合成的HPV片段模版，包括HPV58亚型，200拷贝/反应。采用人为添加人乳头瘤病毒人工合成片段的方式模拟样本感染或污染HPV病毒情形，从而验证本方法检测样本中HPV感染情况的可行性。

(2)加入引物，引物的核苷酸序列参见表1。

其中，包括上游引物组和下游引物组，上游引物组包括4条上游引物，下游引物组包括3条下游引物；其中，各引物均等摩尔比添加。上游引物组包括：

第一上游引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；

第二上游引物，其序列如SEQ ID NO.2所示；

第三上游引物，其序列如SEQ ID NO.3所示；

第四上游引物，其序列如SEQ ID NO.4所示；

所述下游引物组包括：

第一下游引物，其序列如SEQ ID NO.5所示；

第二下游引物，其序列如SEQ ID NO.6所示；

第三下游引物，其序列如SEQ ID NO.7所示。

(3)配置PCR体系，包括PCR扩增预混液、引物组混合液、探针混合液、内参引物探针混合液、样本和水。其中，PCR扩增预混液为Taq Pro U+Multiple Probe qPCR Mix(品牌：诺唯赞)。

样本为宫颈细胞提取物+人工合成质粒(HPV58亚型)，探针的核苷酸序列(参阅表2，SEQ NO.21)。

采用的探针序列参见表2，其中，探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。本实施例中的探针序列为SEQ NO.21所示。

PCR反应体系的各组分浓度和添加量参见表4。

(4)盖上光学透明盖，2000rpm离心1分钟，转移至扩增检测区。

(5)PCR扩增和检测

PCR扩增参数为：37℃消化120秒，95℃变性120秒；然后进入第一组循环：95℃8秒、54℃30秒，循环4次，进入第二组循环：95℃8秒、52℃30秒(每个循环+1秒)、50℃40秒，循环38次。

在50℃时测定荧光值，根据荧光值变化曲线即S型对数扩增曲线读取Ct值结果。

探针混合液和内参引物探针混合液的序列参见表2和表3。

表1实施例1采用的引物的核苷酸序列表

序列编号	序列(从左到右，5’→3’)	引物类型
			SEQ NO.1	TATTTGTTACTGTGGTAGATACTAC	上游引物1
SEQ NO.2	CAATTGTTTGTTACTGTTGTGGATACTAC	上游引物2
			SEQ NO.3	TTTTTATTACCTGTGTTGATACTAC	上游引物3
SEQ NO.4	gcacaaggtcataacaatgg	上游引物4
			SEQ NO.5	GAAAAATAAACTGTAAATCATATTCCTC	下游引物1
SEQ NO.6	GAAAAATAAATTGCAATTCATACTCTTC	下游引物2
			SEQ NO.7	gaaaaacaaactgtaagtcatattc	下游引物3

表2实施例1-15采用的探针的核苷酸序列表

表3 Beta-globin引物与探针的核苷酸序列

序列编号	序列(5’→3’)	类型
			SEQ NO.8	GGCAGGTTGGTATCAAGGTTAC	上游引物
SEQ NO.9	CCTAAGGGTGGGAAAATAGACC	下游引物
			SEQ NO.10	actgggcatgtggagacaga	探针，Cy5-BHQ2

表4实施例和对照例中PCR体系组分对比表

参阅图1，为HPV58亚型经本实施例优化后的S型对数扩增曲线(即荧光曲线)。

图20为内参引物(即，内部阳性对照引物为β-globin)的S型对数扩增曲线。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV33亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.14)。参阅图2为HPV33亚型的S型对数扩增曲线。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV16亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.11)。参阅图3为HPV16亚型的S型对数扩增曲线。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV18亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.12)。参阅图4为HPV18亚型的S型对数扩增曲线。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV31亚型探针的核苷酸序列(SEQ NO.13)。参阅图5为HPV31亚型的S型对数扩增曲线。

实施例6

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV35亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.15)。参阅图6为HPV35亚型的S型对数扩增曲线。

实施例7

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV39亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.16)。参阅图7为HPV39亚型的S型对数扩增曲线。

实施例8

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV45亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.17)。参阅图8为HPV45亚型的S型对数扩增曲线。

实施例9

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV51亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.18)。参阅图9为HPV51亚型的S型对数扩增曲线。

实施例10

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV52亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.19)。参阅图10为HPV52亚型的S型对数扩增曲线。

实施例11

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV56亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.20)。参阅图11为HPV56亚型的S型对数扩增曲线。

实施例12

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV59亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.22)。参阅图12为HPV59亚型的S型对数扩增曲线。

实施例13

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV66亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.23)。参阅图13为HPV66亚型的S型对数扩增曲线。

实施例14

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV68a亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.24)。参阅图14为HPV68a亚型的S型对数扩增曲线。

实施例15

本实施例与实施例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV68b亚型，探针的核苷酸序列(SEQ NO.25)。参阅图15为HPV68a亚型的S型对数扩增曲线。

实施例16

本实施例与实施例1的区别在于，人工合成质粒为HPV58亚型，浓度为1000拷贝/反应。参阅图16为HPV58亚型的人工合成质粒浓度为1000拷贝/反应的S型对数扩增曲线。

实施例17

本实施例与实施例1的区别在于，人工合成质粒为HPV58亚型，浓度为10000拷贝/反应。参阅图17为HPV58亚型的人工合成质粒浓度为10000拷贝/反应的S型对数扩增曲线。

实施例18

本实施例与实施例2的区别在于，人工合成质粒为HPV33亚型，浓度为1000拷贝/反应。参阅图18为HPV33亚型的S型对数扩增曲线。

实施例19

本实施例与实施例2的区别在于，人工合成质粒为HPV33亚型，浓度为10000拷贝/反应。参阅图19为HPV33亚型的S型对数扩增曲线。

对照例1

本对照例中人工合成质粒为HPV58亚型，浓度为1000拷贝/反应。与实施例1的区别在于引物组仅添加：

第一上游引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；

第二上游引物，其序列如SEQ ID NO.2所示；

第三上游引物，其序列如SEQ ID NO.3所示；

第一下游引物，其序列如SEQ ID NO.5所示；

第二下游引物，其序列如SEQ ID NO.6所示。

其它与实施例1相同。

具体地，将上述实施例和对照例的PCR检测结果进行分析。参见图21为人工合成质粒HPV58亚型浓度为200拷贝/反应下的S型对数扩增曲线。

对照例2

本对照例与对照例1的区别在于，人工合成质粒HPV58亚型浓度为1000拷贝/反应。S型对数扩增曲线参见图22。

对照例3

本对照例与对照例1的区别在于，人工合成质粒HPV58亚型浓度为10000拷贝/反应，其S型对数扩增曲线参见图23。

对照例4

本对照例与对照例1的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV33亚型，人工合成质粒浓度为200拷贝/反应，探针的核苷酸序列(SEQ NO.14)，其它相同。，其PCR的对数扩增曲线参见图24。

对照例5

本对照例与对照例4的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV33亚型，人工合成质粒浓度为1000拷贝/反应，其S型对数扩增曲线参见图25。

对照例6

本对照例与对照例4的区别在于，样本中加入的人工合成质粒为HPV33亚型，人工合成质粒浓度为1000拷贝/反应，其S型对数扩增曲线参见图26。

表5实施例和对照例中HPV58亚型的不同质粒浓度的Ct值

表6实施例2和对照例4中HPV33亚型不同引物条件的Ct值

通过图1-15可见，采用本发明提供的引物组能够很明显地对HPV高危亚型均具有明显的扩增效果。

为了说明本发明提供的引物序列对HPV高危亚型，尤其是HPV 33和HPV 58亚型的灵敏度和扩增效率，通过对照例进行了对比。分别通过实施例1-2与对照例1-6进行对比，HPV 33和HPV58亚型经本发明提供的7条引物组进行优化后的S型对数扩增曲线，同时结合对Ct值的对比分析可以得出，本发明的技术方案对HPV 33和HPV 58亚型的扩增效果和灵敏度具有明显的提升，参见表5和表6。

表5中，分别给出了实施例1、实施例16、实施例17和对照例1-3分别为HPV58亚型在不同引物组条件下和人工合成质粒不同浓度的响应情况对照，HPV58亚型选用实施例1、实施例16、实施例17的引物组仅在200拷贝/反应(实施例1)即可响应，读取Ct值。当选用对比例1-3的引物组条件下，需要10000拷贝/反应的条件下才能读取到Ct值，显然采用实施例1的引物组序列能够明显地提高HPV58亚型的分析灵敏度。也即，同等模板浓度下，扩增HPV58亚型在200拷贝/反应浓度下可正常检出，而对照例引物则无法检出，表明实施例显著提高了灵敏度。同时，实施例1在200拷贝/反应浓度下扩增58亚型的Ct值远低于对照例，说明具有更高的扩增效率。

同样地，通过表6可见，实施例2、实施例18、实施例19和对比例4-6分别在200拷贝/反应、1000拷贝/反应和10000拷贝/反应的人工合成质粒浓度下，实施例扩增33亚型的Ct值远低于对照例，表明实施例具有更高的扩增效率，也即，选用实施例的引物组具有更高的扩增效率和灵敏度。

通过上述实施例和对照例的结果分析得知，显而易见地，通过采用本发明提供的7条引物进行HPV高危亚型进行PCR扩增，均能表现出极佳的扩增效果，具有灵敏度高的特点。

将上述技术方案提供的引物组和探针组应用于试剂盒中，进行快速的高危亚型的HPV病毒的检测。还包括其它常规组件，例如，包括热启动快速Taq酶缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、热启动快速Taq酶、RNA逆转录酶。

以上仅为本发明的优选实施例而已，其并非因此限制本发明的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，通过常规的替代或者能够实现相同的功能在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行变化、修改、替换、整合和参数变更均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种用于检测人乳头瘤病毒高危亚型的引物组，其特征在于，包括上游引物组和下游引物组；其中，所述上游引物组包括：

第一上游引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；

第二上游引物，其序列如SEQ ID NO.2所示；

第三上游引物，其序列如SEQ ID NO.3所示；

第四上游引物，其序列如SEQ ID NO.4所示；

所述下游引物组包括：

第一下游引物，其序列如SEQ ID NO.5所示；

第二下游引物，其序列如SEQ ID NO.6所示；

第三下游引物，其序列如SEQ ID NO.7所示。

2.如权利要求1所述的用于检测高危亚型人乳头瘤病毒的引物组，其特征在于，所述引物组用于检测的人乳头瘤病毒高危亚型包括：HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 66、HPV 68a/b。

3.一种用于检测人乳头瘤病毒高危亚型筛查的引物组和探针组的组合物，其特征在于，包括采用如权利要求1或2所述的检测人乳头瘤病毒的引物组和探针组；所述探针组包括探针1～15中的至少一条；所述探针1～15的序列如SEQ ID NO.11～25所示。

4.如权利要求3所述的用于检测人乳头瘤病毒高危亚型的引物组和探针组的组合物，其特征在于，所述引物组和探针组的组合物中，

用于检测HPV16亚型的探针序列为SEQ ID NO.11所示；

用于检测HPV18亚型的探针序列为SEQ ID NO.12所示；

用于检测HPV31亚型的探针序列为SEQ ID NO.13所示；

用于检测HPV33亚型的探针序列为SEQ ID NO.14所示；

用于检测HPV35亚型的探针序列为SEQ ID NO.15所示；

用于检测HPV39亚型的探针序列为SEQ ID NO.16所示；

用于检测HPV45亚型的探针序列为SEQ ID NO.17所示；

用于检测HPV51亚型的探针序列为SEQ ID NO.18所示；

用于检测HPV52亚型的探针序列为SEQ ID NO.19所示；

用于检测HPV56亚型的探针序列为SEQ ID NO.20所示；

用于检测HPV58亚型的探针序列为SEQ ID NO.21所示；

用于检测HPV59亚型的探针序列为SEQ ID NO.22所示；

用于检测HPV66亚型的探针序列为SEQ ID NO.23所示；

用于检测HPV68a亚型的探针序列为SEQ ID NO.24所示；

用于检测HPV68b亚型的探针序列为SEQ ID NO.25所示。

5.如权利要求4所述的用于检测人乳头瘤病毒高危亚型的引物组和探针组的组合物，其特征在于，所述引物组和探针组的组合物中，探针序列为SEQ ID NO.11上标记荧光报告基团是VIC；探针序列为SEQ ID NO.12上标记荧光报告基团是ROX；探针序列为SEQ IDNO.13～25上标记荧光报告基团是FAM；探针序列SEQ ID NO.11～25上的荧光淬灭基团是BHQ1或BHQ2。

6.一种用于检测人乳头瘤病毒高危亚型的检测方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的引物组，或如权利要求3-5任一项所述的引物组和探针组的组合物，结合荧光定量PCR法或PCR-反向点杂交法，对HPV病毒高危亚型的核酸靶标进行检测。

7.如权利要求6所述的用于检测人乳头瘤病毒的高危亚型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.提取待测样品总DNA；

S2.制备反应液，所述反应液中包括PCR扩增预混液、如权利要求1或2所述的引物组或如权利要求3-5任一项所述的引物组和探针组的组合物；

S3.在S2制备的所述反应液中加入人工合成的HPV片段和内参基因的引物探针混合液；

S4.PCR扩增和检测。

8.如权利要求7所述的用于检测人乳头瘤病毒的高危亚型的检测方法，其特征在于，S2中，所述PCR扩增预混液包括Taq Pro U+Multiple Probe qPCR混合液；和/或，

S3中，所述内参基因的引物探针混合液包括：

内参上游引物，其序列如SEQ ID NO.8所示；

内参下游引物，其序列如SEQ ID NO.9所示

内参探针，其序列如SEQ ID NO.10所示；

和/或，所述内参探针包括荧光报告基团为Cy5，荧光淬灭基团是BHQ2。

9.如权利要求8所述的用于检测人乳头瘤病毒高危亚型的检测方法，其特征在于，S4中，PCR扩增参数包括37℃消化120秒，95℃变性120秒；然后进入第一组循环：95℃8秒、54℃30秒，循环4次，进入第二组循环：95℃8秒、52℃30秒(每个循环+1秒)、50℃40秒，循环38次。

10.一种用于检测人乳头瘤病毒的高危亚型的试剂盒，其特征在于，至少包括如权利要求1或2所述的引物组或包括如权利要求3-5任一项所述的引物组和探针组的组合物。