CN114164305A - 一种检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合及其应用,所述检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合包括扩增人乳头瘤病毒基因组晚期区L1区的通用引物对和分型探针;所述通用引物对包括上游引物组和下游引物组;所述上游引物组包括上游引物1、上游引物2和上游引物3;所述上游引物组包括SEQ ID No.1~3所示的核苷酸序列;所述下游引物组包括下游引物1、下游引物2和下游引物3;所述下游引物组包括SEQ ID No.4~6所示的核苷酸序列。所述检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合能检测区分28种HPV亚型,优于当前国内同类产品,覆盖面更广,更具代表性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合及其应用。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,且其发病有年轻化的趋势,宫颈癌的早期筛查、发现及治疗是有效防治宫颈癌的关键。研究表明,人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)的感染与宫颈癌的发生直接相关。HPV属于乳头瘤病毒科,是一种小分子、无被膜包被的环状双链DNA病毒,能引起人体皮肤黏膜鳞状上皮增殖。目前已经确定的HPV亚型有190余种,约50余种定向感染人体生殖道皮肤及黏膜的复层鳞状上皮。
在临床上根据HPV不同亚型的致病力大小将HPV分为高危型、中危型和低危型三大类,国家药品监督管理局将HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59以及HPV68型定义为高危型别,将HPV26、HPV53、HPV66、HPV73以及HPV82型定义为中危型别,另外常见的低危型别HPV包括HPV6、HPV11、HPV40、HPV43、HPV54、HPV61、HPV81以及HPV83等。中、高危型HPV除可引起生殖器疣外,还可引起生殖器癌和宫颈癌,中、高危型HPV是造成宫颈癌的主要病原体,约99%的宫颈癌是由高危型HPV持续或反复感染所致;而低危型HPV主要引起男女外生殖器的尖锐湿疣等良性病变,但如不及时诊断和治疗也有可能发展成癌症。尤其是HPV16和HPV18与宫颈癌的关系非常密切,HPV16主要引发鳞癌,HPV18主要与腺癌相关。因此对HPV亚型的准确分型检测对宫颈癌和其他疣类病变的早期诊断和治疗具有重要意义。
由于HPV不能在体外培养,故不能用简便的血清检测进行HPV的诊断和分型。临床上用于检测HPV的方法包括细胞学检测、免疫组化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹和PCR等,其中PCR检测方法的敏感性最高,具有简便、高效和价廉的优点,是目前应用最多的方法。目前国内临床上进行HPV检测的主要方法包括实时荧光PCR法、基因芯片法以及杂交捕获法(Hybrid Capture 2,HC-2)。
实时荧光PCR技术在常规PCR的基础上加入荧光标记探针,从PCR扩增到得出结果都是在完全封闭的系统中运行,无需PCR后处理,从而避免了扩增产物污染和交叉污染的可能性。同时在扩增时与特异探针杂交,进一步提高了实验的敏感性和特异性,而且可以实时监测扩增过程。
HC-2的本质是基因杂交信号放大技术,采用分子杂交和化学发光信号放大的原理,所述信号放大属于线性级数放大,无需基因扩增。该技术采用全长8000个碱基的RNA探针,将靶DNA变性为单链后与RNA探针杂交,形成DNA-RNA杂交体,再被包被了抗DNA-RNA杂交体抗体的微孔板捕获,DNA-RNA杂交体与标有多个碱性磷酸酶的第二抗体结合,通过酶化学发光测定信号强度,与标准品比较,由软件计算出样本中靶核酸的浓度。
目前,国内通过基因芯片法检测HPV都是采用PCR扩增和DNA反向点杂交(ReverseDot Blot,RDB)相结合的DNA芯片技术。目前国内的HPV基因分型检测试剂盒,均利用HPV的基因特点设计特异性引物,最多可以同时扩增出28种HPV基因型的目标片段。
实时荧光PCR技术目前仍存在无法规避的缺陷,具体包括:仅能检测样本是否感染了相应基因型的HPV,但不具有具体分型功能,单独亚型的检测耗时长,多个亚型的同时检测时,引物之间的干扰会导致检测灵敏度降低;实时荧光PCR的前期一般都需要经过步骤繁琐的核酸提取过程;需要较为昂贵的荧光定量PCR仪。
HC-2技术也存固有缺陷,具体包括:检测特异性较低,约为85%,略低于液基细胞学;HC-2技术属于核酸杂交、免疫反应和化学发光技术的综合运用,检测复杂度以及成本均较高;无法精确进行HPV基因分型;RNA探针稳定性较差,且对实验条件和操作技术的要求也较高;容易引起交叉反应并导致假阳性结果,且高危型与低危型存在一定的交叉反应。
基因芯片RDB技术也存在其缺陷,包括:前期需要设计针对于不同基因型的HPV的多组引物,PCR反应体系比较复杂,在实际扩增中因为引物之间的干扰而导致检测灵敏度降低甚至漏检;由于用到引物众多,相应的产品生产工艺复杂,大大增加了成本。
因此,目前仍需要寻求新型的通用引物对,并开发更为高效的HPV基因分型检测方法,更加敏感、特异性地检测不同亚型的HPV,从而在早期阶段筛查宫颈癌及前期病变中发挥作用。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明的目的在于提供一种检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合及其应用。所述检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合能检测区分28种HPV亚型,普遍多于当前国内同类产品,覆盖面更广,更具代表性。所述分型探针的特异性好,可对样本中28种亚型的HPV实现精准基因分型;所述分型探针的灵敏度高;可有效检出HPV低拷贝数阳性样本;所述分型探针的准确度高,可有效地检出HPV复合型别阳性样本,显著降低多重PCR检测体系中存在的扩增偏倚。本发明所提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒检测靶基因片段的扩增效率高,体系简单,检测成本低。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合,所述检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合包括扩增人乳头瘤病毒基因组晚期区L1区的通用引物对和分型探针;
所述通用引物对包括上游引物组和下游引物组;
所述上游引物组包括上游引物1、上游引物2和上游引物3;
所述上游引物组包括SEQ ID No.1~3所示的核苷酸序列;
所述下游引物组包括下游引物1、下游引物2和下游引物3;
所述下游引物组包括SEQ ID No.4~6所示的核苷酸序列。
本发明中,所述通用引物对是经众多亚型HPV基因组比对,取不同序列保守区,筛选、开发得到新型的通用引物对。所述通用引物对的上游引物组和下游引物组有如下特点:
(1)GC含量较高(对应Tm值较高);
(2)序列更为保守;
(3)上游引物和下游引物均采用多条设计,避免简并碱基的使用,确保引物组的3’端与不同亚型的HPV序列均能有效匹配;
(4)上游引物和下游引物中碱基差异大的位点采用通用碱基3-硝基吡咯替代,可有效减少该位点碱基错配造成的引物与目标序列结合不稳定性,提高扩增效率。
本发明中,所述通用引物对的引物数量显著减少,检测靶基因片段的扩增效率显著提升,体系简单,检测成本低。
优选地,所述通用引物对中含有通用碱基,所述通用碱基包括3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、3-甲酰胺基-5-硝基吲哚或4-硝基-1-氢咪唑中任意一种或至少两种的组合。
优选地,所述通用碱基为3-硝基吡咯。
本发明中,在通用引物对中添加3-硝基吡咯时,其扩增效果最好。
本发明中,所述上游引物1的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1,所述上游引物2的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2,所述上游引物3的核苷酸序列包括SEQ ID NO.3,所述下游引物1的核苷酸序列包括SEQ ID NO.4,所述下游引物2的核苷酸序列包括SEQ ID NO.5,所述下游引物3的核苷酸序列包括SEQ ID NO.6。
SEQ ID NO.1:AATAGGGCPGGTGCTPTTGGTGA。
SEQ ID NO.2:AATAGGGCPGGCACTPTGGGCGA。
SEQ ID NO.3:AATAGGGCPGGTGCTPTGGGGGA。
SEQ ID NO.4:CCCTGPGCCCGTTGPAACCA。
SEQ ID NO.5:CCCTGPGCCTTTTGPAGCCA。
SEQ ID NO.6:CCCTGPGCCCGTTGPATCCA。
优选地,所述分型探针包括探针1~28。
优选地,所述分型探针包括SEQ ID No.7~34所示的核苷酸序列。
优选地,所述分型探针中探针1~28的5’端标记了NH2基团。
优选地,所述分型探针中探针1~28检测的人乳头瘤病毒的亚型包括:HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82、HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV61、HPV81和HPV83。
本发明中,28种分型探针可对样本中28种亚型的HPV实现精准基因分型,特异性好;可有效地检出HPV低拷贝数阳性样本,灵敏度高;可有效检出HPV复合型别阳性样本,显著降低多重PCR检测体系中存在的扩增偏倚,提升检测准确度。
第二方面,本发明提供一种人乳头瘤病毒分型杂交膜条,所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条包括基底和固定于基底上的探针,所述探针包括第一方面所述的分型探针。
优选地,所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条包括至少一个HPV亚型检测点和阳性质控点。
优选地,所述阳性质控点包括显色控制点和内参基因点。
优选地,所述显色控制点的探针包括SEQ ID No.103所示的核苷酸序列。
优选地,所述显色控制点的探针的3’端标记biotin基团。
优选地,所述内参基因点的探针包括SEQ ID No.104所示的核苷酸序列。
优选地,所述内参基因点检测β-actin基因。
优选地,扩增所述β-actin基因的上游引物包括SEQ ID No.105所示的核苷酸序列。
优选地,扩增所述β-actin基因的下游引物包括SEQ ID No.106所示的核苷酸序列。
优选地,所述内参基因点和显色控制点的探针的5’端标记NH2基团。
SEQ ID No.103:ATGCTGAGCTCACTGTCAGTCACAC。
SEQ ID No.104:CGAGGAGCACCCCGTGCTGCT。
SEQ ID No.105:GCACCACACCTTCTACAATG。
SEQ ID No.106:ATCTGGGTCATCTTCTCGCG。
本发明中,所述膜条中的内参基因点显色表示采样、DNA提取和PCR过程正常,所述显色控制点显色表示杂交过程均正常,膜条中其余各点分别代表28种亚型HPV,不同点显色表示该点对应亚型HPV的检出。
优选地,所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条的基底包括硝酸纤维素膜和/或尼龙膜。
第三方面,本发明提供一种人乳头瘤病毒分型检测试剂盒,所述人乳头瘤病毒分型检测试剂盒包括第一方面所述的通用引物对和第二方面所述的人乳头瘤病毒分型杂交膜条。
优选地,所述人乳头瘤病毒分型检测试剂盒还包括反向点杂交试剂和PCR扩增试剂。
优选地,所述PCR扩增试剂包括Taq酶和PCR缓冲液。
本发明中,所述反向点杂交试剂包括杂交液Ⅰ浓缩液、杂交液Ⅱ浓缩液、溶液Ⅰ浓缩液、溶液Ⅱ浓缩液、溶液Ⅲ浓缩液和溶液Ⅳ浓缩液。
所述杂交液Ⅰ浓缩液为含有0.35wt%~0.65wt%SDS的10×SSC缓冲液,SDS的浓度例如可以是0.35wt%、0.45wt%、0.55wt%或0.65wt%等。
和杂交液Ⅱ浓缩液为含有0.25wt%~0.45wt%SDS的2.5×SSC缓冲液,SDS的浓度例如可以是0.25wt%、0.3wt%、0.35wt%、0.4wt%或0.45wt%等。
所述溶液Ⅰ浓缩液为含POD的水溶液,所述溶液Ⅰ浓缩液中POD的浓度为8Vol%~16Vol%,例如可以是8Vol%、10Vol%、12Vol%、14Vol%或16Vol%等。
所述溶液Ⅱ浓缩液包括柠檬酸三钠溶液,所述柠檬酸三钠溶液的浓度为0.2~0.3M,例如可以是0.2M、0.22M、0.24M、0.26M、0.28M或0.3M等。
所述溶液Ⅲ浓缩液包括TMB和DMSO,所述溶液Ⅲ浓缩液中TMB的浓度为4.5~5.5mg/mL,例如可以是4.5mg/mL、4.8mg/mL、5.0mg/mL、5.2mg/mL或5.5mg/mL等,所述DMSO的浓度为4Vol%~8Vol%,例如可以是4Vol%、5Vol%、6Vol%、7Vol%或8Vol%等。
所述溶液Ⅳ浓缩液包括H2O2溶液,所述H2O2溶液的浓度为10wt%~30wt%,例如可以是10wt%、15wt%、20wt%、25wt%或30wt%等。
第四方面,本发明提供一种第三方面所述的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法,所述使用方法包括以下步骤:
(1)采集并处理待测核酸样品,将待测核酸样品和所述通用引物对加入PCR扩增试剂中,混合,得到PCR体系;
(2)对PCR体系进行扩增;
(3)将PCR产物变性,并使用所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条进行反向点杂交;
(4)根据显色点的位置判断待测核酸样品的亚型。
优选地,所述PCR体系中上游引物1、上游引物2、上游引物3、下游引物1、下游引物2和下游引物3的终浓度各自独立地为0.4~1pmol/μL,例如可以是0.4pmol/μL、0.5pmol/μL、0.6pmol/μL、0.7pmol/μL、0.8pmol/μL、0.9pmol/μL或1pmol/μL等。
优选地,所述PCR体系中Taq酶的终浓度为0.05~0.20U/μL,例如可以是0.05U/μL、0.08U/μL、0.10U/μL、0.15U/μL或0.20U/μL等。
优选地,步骤(3)中所述变性的温度为95~100℃,例如可以是95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃等。
优选地,所述使用方法还包括使用扩增内参基因的引物进行扩增和检测的步骤。
本发明中,所述扩增的PCR体系中包括Taq酶、UDG酶、上游引物1、上游引物2、上游引物3、下游引物1、下游引物2、下游引物3、dNTPs和PCR缓冲液。
所述UDG酶的终浓度为0.02~0.1U/μL,例如可以是0.02U/μL、0.04U/μL、0.06U/μL、0.08U/μL或0.1U/μL等。
所述dNTPs的终浓度为0.4~0.7mM,例如可以是0.4mM、0.45mM、0.5mM、0.55mM、0.6mM、0.65mM或0.7mM等。
本发明中所述扩增的程序为:
47~53℃孵育2~5min,温度例如可以是47℃、49℃、50℃、51℃或53℃等,时间例如可以是2min、3min、4min或5min等。
93~97℃孵育3~8min,温度例如可以是93℃、93.5℃、94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃或97℃等,时间例如可以是3min、5min或8min等。
92~96℃孵育1~2s,温度例如可以是92℃、93℃、94℃、95℃或96℃等,时间例如可以是1s或2s等;
53~58℃孵育1~2s,温度例如可以是53℃、54℃、55℃、56℃、57℃或58℃等,时间例如可以是1s或2s等;
70~74℃孵育35~45s,温度例如可以是70℃、71℃、72℃、73℃或74℃等,时间例如可以是35s、38s、40s、42s或45s等;
循环数为38~42,例如可以是38、39、40、41或42。
70~74℃孵育3~8min,温度例如可以是70℃、71℃、72℃、73℃或74℃等,时间例如可以是3min、5min或8min等。
作为本发明的优选技术方案,所述的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法包括以下步骤:
(1)采集并处理待测核酸样品,将待测核酸样品和通用引物对加入扩增试剂中,混合,得到PCR体系;
所述扩增的PCR体系中包括Taq酶、UDG酶、上游引物1、上游引物2、上游引物3、下游引物1、下游引物2、下游引物3、dNTPs和PCR缓冲液。
所述扩增的PCR体系中上游引物1、上游引物2、上游引物3、下游引物1、下游引物2和下游引物3的终浓度各自独立地为0.4~1pmol/μL;所述Taq酶的终浓度为0.05~0.20U/μL;所述UDG酶的终浓度为0.02~0.1U/μL;所述dNTPs的终浓度为0.4~0.7mM。
(2)对PCR体系进行扩增:
所述扩增的程序为如下所示:
47~53℃孵育2~5min;
93~97℃孵育3~8min;
92~96℃孵育1~2s,53~58℃孵育1~2s,70~74℃孵育35~45s,38~42个循环;
70~74℃孵育3~8min。
(3)将PCR产物在95~100℃变性,并使用人乳头瘤病毒分型杂交膜条和反向点杂交试剂进行反向点杂交。
(4)根据显色点的位置判断待测核酸样品的亚型:
所述膜条中的内参基因点显色表示采样、DNA提取和PCR过程正常,所述显色控制点显色表示杂交过程均正常,膜条中其余各点分别代表28种亚型HPV,不同点显色表示该点对应亚型HPV的检出。
第五方面,本发明提供一种人乳头瘤病毒分型检测系统,所述人乳头瘤病毒分型检测系统包括:
(1)样品制备模块:采集并处理待测核酸样品,将待测核酸样品和所述通用引物对加入PCR扩增试剂中,混合,配制PCR体系;
(2)扩增模块:对PCR体系进行扩增;
(3)检测模块:将PCR产物变性,并使用所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条进行反向点杂交;
(4)分析模块:根据显色点的位置判断待测核酸样品的亚型。
第六方面,本发明提供第一方面所述的检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合、第二方面所述的人乳头瘤病毒分型杂交膜条、第三方面所述的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒或第五方面所述的人乳头瘤病毒分型检测系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测人乳头瘤病毒的产品中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值,还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值,限于篇幅及出于简明的考虑,本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明中所提供的检测人乳头瘤病毒的通用引物数量较少,靶基因片段扩增效率显著提升,体系简单,检测成本低。
(2)本发明中的所提供的检测人乳头瘤病毒的分型探针对应区分28种亚型HPV(HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82、HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV61、HPV81和HPV83),可对样本中28种亚型HPV实现精准基因分型,特异性好;可有效检出HPV低拷贝数阳性样本,灵敏度高;可有效检出HPV复合型别阳性样本,显著降低该多重PCR检测体系中存在的扩增偏倚,提升检测准确度。
(3)本发明中所述人乳头瘤病毒分型检测试剂盒所检测的HPV亚型普遍多于当前国内同类产品,覆盖面更广,更具代表性。
附图说明
图1是测试例1和测试例2中不同扩增情况的示意图,其中,-表示无目的扩增条带,+表示较弱的目的扩增条带,++表示较亮的目的扩增条带,M表示标准DNA分子量Marker。
图2是测试例3中实施例1所述的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对的扩增产物电泳图,依次为HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58和HPV59的扩增产物,M-DL500 DNA Marker。
图3是测试例3中实施例1所述的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对的扩增产物电泳图,依次为HPV66、HPV68、HPV73、HPV82、HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV61、HPV81、HPV83和HPV阴性对照的扩增产物,M-DL500 DNA Marker。
图4是测试例3中GP5+/GP6+引物组的扩增产物电泳图,依次为HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58和HPV59的扩增产物,M-DL500 DNA Marker。
图5是测试例3中GP5+/GP6+引物组的扩增产物电泳图,依次为HPV66、HPV68、HPV73、HPV82、HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV61、HPV81、HPV83和HPV阴性对照的扩增产物,M-DL500 DNA Marker。
图6是测试例3中MY11/MY09引物组扩增产物电泳图,依次为HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58和HPV59的扩增产物,M-DL500 DNA Marker。
图7是测试例3中MY11/MY09引物组扩增产物电泳图,依次为HPV66、HPV68、HPV73、HPV82、HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV61、HPV81、HPV83和HPV阴性对照的扩增产物,M-DL500 DNA Marker。
图8是测试例4中人乳头瘤病毒分型检测试剂盒的检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
以下具体实施方式中的材料来源如下:
POD:CAS号9003-99-0,货号P8021,品牌Solarbio。
柠檬酸三钠:CAS号6132-04-3,GR级,沪试。
TMB:CAS号54827-17-7,生化试剂级,沃凯。
DMSO:CAS号67-68-5,沃凯。
Taq酶:货号TAQ-I033,北京博尔迈生物技术有限公司。
实施例1
本实施例提供一种扩增人乳头瘤病毒的通用引物对,所述通用引物对扩增人乳头瘤病毒基因组晚期区L1区的基因,所述扩增人乳头瘤病毒的通用引物对包括上游引物组和下游引物组;所述上游引物组包括上游引物1、上游引物2和上游引物3;所述下游引物组包括下游引物1、下游引物2和下游引物3。
上游引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,上游引物2的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示,上游引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,下游引物1的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示,下游引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,下游引物3的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示,所述通用引物对的序列如表1所示。
表1
引物种类 | 序号 | 序列 |
上游引物1 | SEQ ID NO.1 | AATAGGGCPGGTGCTPTTGGTGA |
上游引物2 | SEQ ID NO.2 | AATAGGGCPGGCACTPTGGGCGA |
上游引物3 | SEQ ID NO.3 | AATAGGGCPGGTGCTPTGGGGGA |
下游引物1 | SEQ ID NO.4 | CCCTGPGCCCGTTGPAACCA |
下游引物2 | SEQ ID NO.5 | CCCTGPGCCTTTTGPAGCCA |
下游引物3 | SEQ ID NO.6 | CCCTGPGCCCGTTGPATCCA |
其中,P表示碱基3-硝基吡咯。
对比例1
本对比例提供一种检测人乳头瘤病毒的通用引物对,所述通用引物对扩增人乳头瘤病毒基因组晚期区L1区的基因。
所述通用引物对包括上游引物组和下游引物组,所述上游引物组包括上游引物4、上游引物5和上游引物6,所述下游引物组包括下游引物4、下游引物5和下游引物6。所述通用引物对的序列如表2所示。
表2
引物种类 | 序号 | 序列 |
上游引物4 | SEQ ID No.7 | AATAGGGCPGGCGCTPTGGGTGA |
上游引物5 | SEQ ID No.8 | AATAGGGCPGGCACTPTGGGCGA |
上游引物6 | SEQ ID No.9 | AATAGGGCPGGTGCTPTTGGGGA |
下游引物4 | SEQ ID No.10 | CCCTGPGCACGTTGPAACCA |
下游引物5 | SEQ ID No.11 | CCCTGPGCCCGTTGPAGCCA |
下游引物6 | SEQ ID No.12 | CCCTGPGCCTTTTGPATCCA |
对比例2
本对比例提供一种检测人乳头瘤病毒的通用引物对,所述通用引物对扩增人乳头瘤病毒基因组晚期区L1区的基因。
所述通用引物对包括上游引物组和下游引物组,所述上游引物组包括上游引物7、上游引物8和上游引物9,所述下游引物组包括下游引物7、下游引物8和下游引物9。所述通用引物对的序列如表3所示。
表3
引物种类 | 序号 | 序列 |
上游引物7 | SEQ ID No.13 | AATAGGGCPGGCACTPTGGGTGA |
上游引物8 | SEQ ID No.14 | AATAGGGCPGGTGCTPTTGGCGA |
上游引物9 | SEQ ID No.15 | AATAGGGCPGGCACTPTGGGGGA |
下游引物7 | SEQ ID No.16 | CCCTGPGCCCGTTGPAACCA |
下游引物8 | SEQ ID No.17 | CCCTGPGCCTTTTGPAGCCA |
下游引物9 | SEQ ID No.18 | CCCTGPGCACGTTGPATCCA |
对比例3
本对比例提供一种检测人乳头瘤病毒的通用引物对,所述通用引物对包括简并碱基通用引物对、B通用引物对、F通用引物对和H通用引物对,所述通用引物对的序列如表4所示。
表4
注:P、B、F、H分别表示3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、3-甲酰胺基-5-硝基吲哚以及4-硝基-1-氢咪唑分别记作;简并碱基分别标识为,D表示G或A或T,R表示A或G,N表示A或T或G或C,Y表示C或T。
对比例4
本对比例提供一种检测人乳头瘤病毒的通用引物对,所述通用引物对为GP5+/GP6+引物组,所述GP5+/GP6+引物组的序列如表5所示。
表5
对比例5
本对比例提供一种检测人乳头瘤病毒的通用引物对,所述通用引物对为MY11/MY09引物组,所述MY11/MY09引物组的序列如表6所示。
表6
注:简并碱基分别标识为,M表示A或C,W表示A或T,Y表示C或T,R表示A或G。
测试例1
使用实施例1中所述的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对、对比例1和对比例2所述的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对,对人乳头瘤病毒的样品进行扩增,所述样品包括28种亚型HPV阳性临床样本。
所述扩增的PCR体系如下所示:
所述扩增的程序为如下所示:
50℃孵育3min;
95℃孵育5min;
94℃孵育1s,55℃孵育1s,72℃孵育40s,40个循环;
72℃孵育5min。
扩增结束后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示,实施例1中所述的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对均能对28种亚型HPV临床样本扩增出较亮的目的条带(目的扩增条带大小为170bp),对比例1和对比例2所述的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对无法扩增出部分亚型的HPV临床样本的目的条带或者只能扩增出较弱的目的条带,对琼脂糖凝胶电泳的结果进行统计,具体统计结果如表7所示,结果表明实施例1中所述的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对的扩增效率更高。
表7
注:-表示无目的扩增条带;+表示较弱的目的扩增条带;++表示较亮的目的扩增条带;不同扩增情况的示意图如图1所示。
测试例2
使用实施例1中的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对与对比例3中的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对分别对人乳头瘤病毒的样品进行扩增,所述样品包括28种亚型HPV阳性临床样本。
对比例3中的检测人乳头瘤病毒的通用引物对包括简并碱基通用引物对(简称简并碱基)、B通用引物对(简称B)、F通用引物对(简称F)和H通用引物对(简称H)。
所述扩增的PCR体系与测试例1中一致;所述扩增的程序与测试例1中一致。
扩增结束后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果显示,实施例1中所述的人乳头瘤病毒的引物均能对28种亚型HPV临床样本扩增出较亮的目的条带,而其他通用引物对对应体系对部分亚型HPV临床样本无法扩增出目的条带或者只能扩增出较弱的目的条带,对琼脂糖凝胶电泳的结果进行统计,具体统计结果如表8所示。实施例1中所述的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对的扩增效率更高,表明通用碱基3-硝基吡咯的效果最优。
表8
注:-表示无目的扩增条带;+表示较弱的目的扩增条带;++表示较亮的目的扩增条带;不同扩增情况的示意图如图1所示。
测试例3
对实施例1中所述的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对、对比例4和对比例5中扩增人乳头瘤病毒的通用引物对进行序列分析,并使用实施例1、对比例4和对比例5中的通用引物对分别对人乳头瘤病毒的样品进行扩增,所述样品包括28种亚型HPV阳性临床样本和1份HPV阴性临床样本。
(1)序列分析
使用BioEdit 5.0.6(分析软件)对实施例1、对比例4和对比例5中的引物进行序列分析,经序列分析,结果表明,GP5+/GP6+引物组和MY11/MY09引物组存在明显的不足:
GP5+/GP6+和MY11/MY09引物组序列中GC含量均较低、对应Tm值均较低(50℃左右),尤其是GP5+/GP6+引物组,其Tm值为46℃,因此在实际扩增程序中,退火温度会较低(文献中报道的GP5+/GP6+引物组对应的退火温度为40℃,而一般PCR扩增时的退火温度范围为53~60℃),造成过多的非特异性扩增,影响目的产物的扩增效率;
引物组序列与具体亚型的HPV序列均存在碱基错配,尤其是GP5+/GP6+引物组的3’端存在明显的错配;
MY11/MY09引物组中存在多个简并碱基,造成引物在该简并碱基位点有多种碱基类型,因此进一步增加了该引物组序列与具体亚型的HPV序列出现碱基错配的几率;
在引物合成时,简并碱基是以随机加入的形式合成,MY11/MY09引物组中存在多个简并碱基,所述简并碱基组成的具体序列存在随机性,因此不同批次合成的MY11/MY09引物组会存在较大差异,具有不确定性,大大降低了检测稳定性;
MY11/MY09引物组对应的扩增体系中目的扩增产物(扩增子)的大小为450bp,相较于一般PCR检测方法中100~200bp的扩增子,其明显偏大,也会造成实际扩增效率降低;
总体上,采用GP5+/GP6+引物组和MY11/MY09引物组扩增28种亚型HPV的靶基因片段时,会大大降低其扩增效率。
实施例1中的上游引物组和下游引物组有如下特点:
GC含量较高(对应Tm值较高);序列更为保守;上游引物组和下游引物组均采用多条设计,避免简并碱基的使用,确保引物组的3’端与不同亚型的HPV序列均能有效匹配;上游引物组和下游引物中碱基差异大的位点采用通用碱基3-硝基吡咯替代,可有效降低该位点碱基错配造成的引物与目标序列结合的不稳定性,提高扩增的效率。
(2)样品扩增
对比例4中扩增人乳头瘤病毒的通用引物对为GP5+/GP6+引物组;对比例5中扩增人乳头瘤病毒的通用引物对为MY11/MY09引物组。
三种不同的通用引物对扩增的PCR体系与测试例1中一致。
使用实施例1中所述的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对扩增样品时,PCR程序与测试例1中一致。
使用GP5+/GP6+引物组扩增样品时,PCR程序如下所示:
50℃孵育3min;
95℃孵育4min;
94℃孵育1min,40℃孵育2min,72℃孵育1.5min,40个循环;
72℃孵育4min。
使用MY11/MY09引物组扩增样品时,PCR程序如下所示:
50℃孵育3min;
95℃孵育9min;
94℃孵育1min,55℃孵育1min,72℃孵育1min,40个循环;
72℃孵育5min。
将三种PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳,实施例1所述的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对的扩增产物的电泳图如图2和图3所示,其中图2为HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58和HPV59的扩增产物的电泳图;其中图3为HPV66、HPV68、HPV73、HPV82、HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV61、HPV81、HPV83和HPV阴性对照的扩增产物的电泳图;图2和图3中M泳道为DL500 DNAMarker。
GP5+/GP6+引物组的扩增产物的电泳图如图4和图5所示,其中图4为HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58和HPV59的扩增产物的电泳图;其中图5为HPV66、HPV68、HPV73、HPV82、HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV61、HPV81、HPV83和HPV阴性对照的扩增产物的电泳图;图4和图5中M泳道为DL500 DNA Marker。
MY11/MY09引物组扩增产物的电泳图如图6和图7所示,其中图6为HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58和HPV59的扩增产物的电泳图;其中图7为HPV66、HPV68、HPV73、HPV82、HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV61、HPV81、HPV83和HPV阴性对照的扩增产物的电泳图;图6和图7中M泳道为DL500 DNA Marker。
经GP5+/GP6+引物组、MY11/MY09引物组以及实施例1中所述的扩增人乳头瘤病毒的通用引物对扩增后,对28种亚型的HPV阳性临床样本和1份HPV阴性临床样本的扩增产物经电泳后,对电泳结果进行对比观察,可以看出GP5+/GP6+引物组对应的目的扩增产物条带大小为140bp;MY11/MY09引物组对应的目的扩增产物条带大小为450bp;实施例1中的引物对应的目的扩增产物条带大小为170bp。结果显示,GP5+/GP6+引物组、MY11/MY09引物组对部分亚型样本的扩增条带弱,且有些样本的扩增产物也有较多的非特异性条带,实施例1中的通用引物对的目的扩增产物条带明显较亮,且未见明显的非特异性条带,表明实施例1中的通用引物对扩增效率更高。
实施例2
本实施例提供一种检测人乳头瘤病毒的分型探针,所述分型探针包括探针1~28,所述探针1~28的5’端标记了NH2基团。所述分型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.47~74所示,所述分型探针的序列如表9所示。
表9
探针 | HPV亚型 | 序号 | 序列(NH<sub>2</sub>-5’→3’) |
1 | HPV16 | SEQ ID No.47 | TGTGCCTGATACTCTTATAATTAAGGGTAGTGG |
2 | HPV18 | SEQ ID No.48 | GGGTAATAACAGATCATCTGTAGCTAGTAGT |
3 | HPV26 | SEQ ID No.49 | CAGGTACATCTGGTCGGACTCCTATTGCAG |
4 | HPV31 | SEQ ID No.50 | TGCATCTGGCAGACATAATTTAGGTAGTAGTA |
5 | HPV33 | SEQ ID No.51 | GCTGGCTCTAATACCAGGTCCAAAATTGCAG |
6 | HPV35 | SEQ ID No.52 | GTGCTAGTAAAAATACTGTTCCTAATGCTATAT |
7 | HPV39 | SEQ ID No.53 | CATTAAGAAATCCTCAGGTAACCTTGACAGTTCT |
8 | HPV45 | SEQ ID No.54 | AGGGTGCGAATGACAAGGCGGCCCCTGGTAGT |
9 | HPV51 | SEQ ID No.55 | GAAGGGTGCTGCAGGCAGTGACAGAATAAC |
10 | HPV52 | SEQ ID No.56 | CTAATAGTAGGAACACTCTTACCAGCTACATC |
11 | HPV53 | SEQ ID No.57 | CTCTGGGTCTACTGCAAATTTAGCCAGTTCAAAT |
12 | HPV56 | SEQ ID No.58 | CACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCT |
13 | HPV58 | SEQ ID No.59 | TGAATCAGGCAGGGAGCCCCCTACATCTTCT |
14 | HPV59 | SEQ ID No.60 | CTCCGGTTCAACAGCTACTTTAGCTAACAG |
15 | HPV66 | SEQ ID No.61 | AGGAACTACTGCCTCTATTCAAAGCAGTG |
16 | HPV68 | SEQ ID No.62 | TACCACTGGCACATTGCCTAGTACTAGTTAT |
17 | HPV73 | SEQ ID No.63 | CACAGATATACGTGCAACCCCCGGTAGTTCT |
18 | HPV82 | SEQ ID No.64 | CACTAGCGCTAATATGCGTGAAACCCCTG |
19 | HPV6 | SEQ ID No.65 | TAGTGGTAATGGCCGTGACCCTATAGAAAGT |
20 | HPV11 | SEQ ID No.66 | AGGGTCTAACTCTGGCAATACTGCCACTG |
21 | HPV40 | SEQ ID No.67 | TAGTAATGGCAGGGACCCGCCCCCTAGCT |
22 | HPV42 | SEQ ID No.68 | TAGCAATGGTAGAGAACCCCCTCCTAGTTCT |
23 | HPV43 | SEQ ID No.69 | GTCCGGTAATACTGCAGTTATCCAAAGTAGTG |
24 | HPV44 | SEQ ID No.70 | TACTGACATACGTGCCAACCCAGGCAGTTATT |
25 | HPV54 | SEQ ID No.71 | GTGGCAATGGCAGGGACCCTCCTCCCAGTT |
26 | HPV61 | SEQ ID No.72 | CACTGACATACGTGACAGTCCTAGTAGTTATG |
27 | HPV81 | SEQ ID No.73 | CACAGGCAATACTGCAACACCATCCAGTTGT |
28 | HPV83 | SEQ ID No.74 | TGGTGCTGGCCGCGACCCTATTAGTAGTTAT |
对比例6
本对比例提供一种检测人乳头瘤病毒的分型探针,所述分型探针包括探针29~56,所述探针29~56的5’端标记了NH2基团。所述分型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.75~102所示,所述分型探针的序列如表10所示。
表10
实施例3
本实施例提供一种人乳头瘤病毒分型杂交膜条,所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条包括基底和固定于基底上的探针,所述探针为实施例2所述的检测人乳头瘤病毒的分型探针。
所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条包括28个HPV亚型检测点和两个阳性质控点;所述阳性质控点包括显色控制点和内参基因点,所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条的基底为硝酸纤维素膜。所述显色控制点的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.103所示,所述显色控制点的探针的3’端标记biotin基团。所述内参基因点的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.104所示。
SEQ ID No.103:ATGCTGAGCTCACTGTCAGTCACAC。
SEQ ID No.104:CGAGGAGCACCCCGTGCTGCT。
对比例7
本对比例提供一种人乳头瘤病毒分型杂交膜条,所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条包括基底和固定于基底上的探针,所述探针为对比例6所述的检测人乳头瘤病毒的分型探针。
所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条包括28个HPV亚型检测点和两个阳性质控点;所述阳性质控点包括显色控制点和内参基因点,所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条的基底为硝酸纤维素膜。所述显色控制点的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.103所示,所述显色控制点的探针的3’端标记biotin基团。所述内参基因点的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.104所示。
实施例4
本实施例提供一种人乳头瘤病毒分型检测试剂盒,所述人乳头瘤病毒分型检测试剂盒包括实施例1所述的通用引物对和实施例3所述的人乳头瘤病毒分型杂交膜条,所述试剂盒还包括反向点杂交试剂和PCR扩增试剂。
所述反向点杂交试剂包括杂交液Ⅰ浓缩液、杂交液Ⅱ浓缩液、溶液Ⅰ浓缩液、溶液Ⅱ浓缩液、溶液Ⅲ浓缩液和溶液Ⅳ浓缩液。
所述杂交液Ⅰ浓缩液(1000mL)包括如下组分:
所述杂交液Ⅱ浓缩液(1000mL)包括如下组分:
所述溶液Ⅰ浓缩液(20mL)包括如下组分:
组分 体积(mL)
POD溶液 3.2mL
灭菌纯化水 16.8mL
所述溶液Ⅱ浓缩液(1000mL)包括如下组分:
组分 体积(mL)
柠檬酸三钠 65g
灭菌纯化水 1000mL
所述溶液Ⅲ浓缩液(1000mL)包括如下组分:
所述溶液Ⅳ浓缩液为20wt%的H2O2溶液。
所述PCR扩增试剂包括Taq酶和PCR缓冲液。
所述的20×SSC缓冲液含有浓度为3M的氯化钠和浓度为0.3M柠檬酸钠。
对比例8
本对比例提供一种人乳头瘤病毒分型检测试剂盒,所述人乳头瘤病毒分型检测试剂盒包括实施例1所述的通用引物对和对比例7所述的人乳头瘤病毒分型杂交膜条,所述试剂盒还包括反向点杂交试剂和PCR扩增试剂。
所述反向点杂交试剂和PCR扩增试剂同实施例4。
测试例4
使用实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒和对比例8提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒对28种亚型的HPV临床样本进行检测。
(1)采集并处理待测核酸样品,将待测核酸样品和通用引物对加入PCR扩增试剂中,混合,得到PCR体系;所述PCR体系与测试例1中一致。
配制检测内参基因的PCR体系,扩增所述内参基因β-actin的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.105所示;扩增所述内参基因β-actin的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.106所示;所述PCR体系参照测试例1中的PCR体系。
SEQ ID No.105:GCACCACACCTTCTACAATG。
SEQ ID No.106:ATCTGGGTCATCTTCTCGCG。
(2)对PCR体系进行扩增。
所述扩增的程序与测试例1中一致。
(3)将PCR产物变性,并使用人乳头瘤病毒分型杂交膜条进行反向点杂交。
将步骤(2)中的PCR产物于98℃孵育8min,使PCR产物变性,后立即置于冰水混合物中2min以上。
配制反向点杂交的试剂:
杂交液I:100mL杂交液I浓缩液+300mL灭菌纯化水;
杂交液II:100mL杂交液II浓缩液+300mL灭菌纯化水;
溶液II:100mL溶液II浓缩液+300mL灭菌纯化水;
溶液IV:200μL溶液IV浓缩液+1800μL灭菌纯化水;
结合液:60mL杂交液II+60μL溶液I;
显色液:40mL溶液II+4mL溶液III+20μL溶液IV;
将变性后的PCR产物与人乳头瘤病毒分型杂交膜条进行反向点杂交:
取28个15mL干净的塑料管,置于离心管架中;用镊子夹取人乳头瘤病毒分型杂交膜条,并在膜条的边缘标记上待检样本号;将每张膜条分别放入一支15mL塑料管中,每个塑料管中加入8mL杂交液Ⅰ,备用。
杂交:将将变性后的PCR产物加入对应样本号的15mL塑料管中,盖紧管盖;并将离心管平放入42℃水浴摇床中,低速转动(100rpm)杂交1h;将杂交液Ⅱ放入水浴摇床中预热至42℃,备用。
结合:弃去杂交液I,将膜条转入50mL离心管中。加入现配的结合液,放入42℃水浴摇床中,低速转动(120rpm)结合10min。
洗膜:弃去结合液,取出膜条,转入50mL离心管中,加入预热至42℃的杂交液Ⅱ,置42℃水浴摇床中,低速转动(120rpm)洗膜10min。
显色:弃去杂交液Ⅱ,取出膜条,转入50mL离心管中,加入现配的显色液,在20℃中轻摇、避光显色10min。
终止:取出膜条放入20mL溶液Ⅱ中,终止显色2min。
(4)根据显色点的位置判断待测核酸样品的亚型。
膜条中CC点为显色控制点,显色表示杂交过程正常;PC点为内参基因点,显色表示采样、DNA提取和PCR扩增过程正常;其余各点分别代表28种亚型HPV,不同点显色表示该点对应亚型HPV的检出。
经过扩增、杂交和显色,结果显示,实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒中的人乳头瘤病毒分型杂交膜条上对应的各个亚型显色点明显,且无其他点显色,人乳头瘤病毒分型杂交膜条的检测结果图如图8所示,表明实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒可有效检出临床样本中存在的28种亚型HPV,检测特异性好。
与实施例4进行对比,对比例8提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒中人乳头瘤病毒分型杂交膜条上对应的各个亚型显色点不明显,HPV26、HPV33、HPV52、HPV73、HPV42、HPV54和HPV81的样本未见显色点,结果表明对比例8提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒无法对28种亚型的HPV实现全部检出。
测试例5
使用实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒和国内同类产品对28种亚型的HPV临床样本进行检测。
(1)不同稀释倍数的临床样本检测对比
取28种亚型HPV临床样本,分别经样本稀释液稀释101、102、103、104和105倍,使用实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒和国内同类产品,所述国内同类产品为产品A,产品A的名称为人乳头瘤病毒基因分型(23型)检测试剂盒(PCR-反向点杂交法),国食药监械(准)字2012第3400059号,检测上述稀释样本。
使用实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒的检测步骤参考测试例4,所述产品A的检测步骤参考产品A的说明书。
检测结果表明结果,实施例4的试剂盒可检测到稀释103~105倍的不同亚型HPV临床样本,而产品A只能检测到稀释102~104倍的不同亚型HPV临床样本,检测结果统计如表11所示,从表11中可以看出实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒的灵敏度更高。
表11
注:-表示无显色点;+表示有显色点;*表示产品A不具备检测到该亚型HPV的功能。
(2)HPV阴性和HPV阳性的不同临床样本检测对比
采用300份女性宫颈脱落细胞临床样本,经核酸提取得到对应的核酸样本,分别经实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒和产品A检测,检测结果统计数据如表12所示,检测结果表明,实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒检测的中、高危型HPV阳性比例为52.0%,明显高于产品A检测结果;实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒检测的HPV阴性比例为26.3%,明显低于产品A检测结果;实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒共检出中、高危型HPV复合型别阳性样本32例,占比10.7%,明显高于产品A检测结果,检出中、高危型HPV复合型别阳性样本14例,占比4.7%。
表12
注:单型别阳性表示检测样本为单个亚型HPV感染;复合型别阳性表示检测样本为2个或者2个以上亚型的HPV感染。
另外将实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒检测结果为中、高危型HPV阳性的156例临床样本经基因序列测序法验证,测序结果与实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒检测结果完全符合,表明实施例4提供的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒更灵敏,准确度更高。
综上,本发提供的检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合能检测区分28种亚型的HPV,普遍多于当前国内同类产品,覆盖面更广,更具代表性。所述分型探针对应区分28种HPV亚型,所述分型探针的特异性好,可对样本中28种亚型的HPV实现精准基因分型;所述分型探针的灵敏度高;可有效检出HPV低拷贝数阳性样本;所述分型探针的准确度高,可有效检出HPV复合型别阳性样本,显著降低多重PCR检测体系中存在的扩增偏倚。
申请人声明,以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,所属技术领域的技术人员应该明了,任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 广州安必平医药科技股份有限公司
<120> 一种检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合及其应用
<130> 2021
<160> 106
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
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<212> DNA
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<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
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<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 40
ccctghgccc gttghaacca 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 41
ccctghgcct tttghagcca 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 42
ccctghgccc gttghatcca 20
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 43
tttgttactg tggtagatac tac 23
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 44
gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 45
gcmcagggwc ataayaatgg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 46
cgtccmarrg gawactgatc 20
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 47
tgtgcctgat actcttataa ttaagggtag tgg 33
<210> 48
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 48
gggtaataac agatcatctg tagctagtag t 31
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 49
caggtacatc tggtcggact cctattgcag 30
<210> 50
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 50
tgcatctggc agacataatt taggtagtag ta 32
<210> 51
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 51
gctggctcta ataccaggtc caaaattgca g 31
<210> 52
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 52
gtgctagtaa aaatactgtt cctaatgcta tat 33
<210> 53
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 53
cattaagaaa tcctcaggta accttgacag ttct 34
<210> 54
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 54
agggtgcgaa tgacaaggcg gcccctggta gt 32
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 55
gaagggtgct gcaggcagtg acagaataac 30
<210> 56
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 56
ctaatagtag gaacactctt accagctaca tc 32
<210> 57
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 57
ctctgggtct actgcaaatt tagccagttc aaat 34
<210> 58
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 58
cacaggtatg cgtgcttcac ctggcagct 29
<210> 59
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 59
tgaatcaggc agggagcccc ctacatcttc t 31
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 60
ctccggttca acagctactt tagctaacag 30
<210> 61
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 61
aggaactact gcctctattc aaagcagtg 29
<210> 62
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 62
taccactggc acattgccta gtactagtta t 31
<210> 63
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 63
cacagatata cgtgcaaccc ccggtagttc t 31
<210> 64
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 64
cactagcgct aatatgcgtg aaacccctg 29
<210> 65
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 65
tagtggtaat ggccgtgacc ctatagaaag t 31
<210> 66
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 66
agggtctaac tctggcaata ctgccactg 29
<210> 67
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 67
tagtaatggc agggacccgc cccctagct 29
<210> 68
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 68
tagcaatggt agagaacccc ctcctagttc t 31
<210> 69
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 69
gtccggtaat actgcagtta tccaaagtag tg 32
<210> 70
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 70
tactgacata cgtgccaacc caggcagtta tt 32
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 71
gtggcaatgg cagggaccct cctcccagtt 30
<210> 72
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 72
cactgacata cgtgacagtc ctagtagtta tg 32
<210> 73
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 73
cacaggcaat actgcaacac catccagttg t 31
<210> 74
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 74
tggtgctggc cgcgacccta ttagtagtta t 31
<210> 75
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 75
aagggtagtg gaaatcgaac gtctgtaggg a 31
<210> 76
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 76
tgtgcctgat gacctgttgg taaaagg 27
<210> 77
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 77
gtgtcccaac tgacttatat ataacaggta catc 34
<210> 78
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 78
tgatgaactg tataccaagg ctgctaataa tgca 34
<210> 79
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 79
tgtgccttcc gatatgtata ttgctggctc t 31
<210> 80
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 80
ccaggatctg gttattaaaa gtgctagtaa a 31
<210> 81
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 81
ctgtacctaa tgacttatac attaagaaat cctcag 36
<210> 82
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 82
ctgcctgact cttattatct taagggtgcg aatg 34
<210> 83
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 83
ccttacctgc agacttatat atgaagggtg ctg 33
<210> 84
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 84
tacctcttat tatattccag gcacatctgc t 31
<210> 85
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 85
gtaccagacg atttatacat taaaggctct gggt 34
<210> 86
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 86
gcctcaatcc ttatatatta aaggcacagg tatg 34
<210> 87
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 87
caccactttg tatattaaag gtgctgaatc agg 33
<210> 88
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 88
gtccctactg acttatatat taaaggctcc g 31
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 89
tgttcccgat gacctgtaca ttaaaggttc 30
<210> 90
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 90
cagtacctgc agacctatat attaagggta cca 33
<210> 91
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 91
ctgcccaatt gtatattaag ggcacagata tacg 34
<210> 92
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 92
cagtacctac agacctatat attaaaggca ctagcg 36
<210> 93
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 93
cattcctaac gattattata ttaagggtag tg 32
<210> 94
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 94
tgtgccaagt gatttatata tacaagggtc t 31
<210> 95
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 95
atacctaatg acttatatat taagggtagt aatggc 36
<210> 96
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 96
caatacctgc agagttatat ttaaagggta gc 32
<210> 97
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 97
tgtcccggat gacctttata ttaaagggtc cg 32
<210> 98
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 98
acttcctgaa tcactatata ttaaaggtac tga 33
<210> 99
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 99
ccattcctac agatttgtat tggaagggtg g 31
<210> 100
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 100
ctattcctac tgaattgtat attaagggca ctga 34
<210> 101
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 101
atcccagatg aactaatgat taaaggcaca gg 32
<210> 102
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 102
cattccagac aaggcttata ttaagggtac tg 32
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 103
atgctgagct cactgtcagt cacac 25
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 104
cgaggagcac cccgtgctgc t 21
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 105
gcaccacacc ttctacaatg 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 106
atctgggtca tcttctcgcg 20
Claims (10)
1.一种检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合,其特征在于,所述检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合包括扩增人乳头瘤病毒基因组晚期区L1区的通用引物对和分型探针;
所述通用引物对包括上游引物组和下游引物组;
所述上游引物组包括上游引物1、上游引物2和上游引物3;
所述上游引物组包括SEQ ID No.1~3所示的核苷酸序列;
所述下游引物组包括下游引物1、下游引物2和下游引物3;
所述下游引物组包括SEQ ID No.4~6所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合,其特征在于,所述通用引物对中含有通用碱基,所述通用碱基包括3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、3-甲酰胺基-5-硝基吲哚或4-硝基-1-氢咪唑中任意一种或至少两种的组合;
优选地,所述通用碱基为3-硝基吡咯;
优选地,所述分型探针包括探针1~28;
优选地,所述分型探针包括SEQ ID No.7~34所示的核苷酸序列;
优选地,所述分型探针中探针1~28的5’端标记了NH2基团;
优选地,所述分型探针中探针1~28检测的人乳头瘤病毒的亚型包括:HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82、HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV61、HPV81和HPV83。
3.一种人乳头瘤病毒分型杂交膜条,其特征在于,所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条包括基底和固定于基底上的探针,所述探针包括权利要求1或2中所述的分型探针。
4.根据权利要求3所述的人乳头瘤病毒分型杂交膜条,其特征在于,所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条包括至少一个HPV亚型检测点和阳性质控点;
优选地,所述阳性质控点包括显色控制点和内参基因点;
优选地,所述显色控制点的探针包括SEQ ID No.103所示的核苷酸序列;
优选地,所述显色控制点的探针的3’端标记biotin基团;
优选地,所述内参基因点的探针包括SEQ ID No.104所示的核苷酸序列;
优选地,所述内参基因点检测β-actin基因;
优选地,扩增所述β-actin基因的上游引物包括SEQ ID No.105所示的核苷酸序列;
优选地,扩增所述β-actin基因的下游引物包括SEQ ID No.106所示的核苷酸序列;
优选地,所述内参基因点和显色控制点的探针的5’端标记NH2基团;
优选地,所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条的基底包括硝酸纤维素膜和/或尼龙膜。
5.一种人乳头瘤病毒分型检测试剂盒,其特征在于,所述人乳头瘤病毒分型检测试剂盒包括权利要求1或2中所述的通用引物对和权利要求3或4所述的人乳头瘤病毒分型杂交膜条。
6.根据权利要求5所述的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒,其特征在于,所述人乳头瘤病毒分型检测试剂盒还包括反向点杂交试剂和PCR扩增试剂;
优选地,所述PCR扩增试剂包括Taq酶和PCR缓冲液。
7.一种权利要求5或6所述的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法,其特征在于,所述使用方法包括以下步骤:
(1)采集并处理待测核酸样品,将待测核酸样品和所述通用引物对加入PCR扩增试剂中,混合,得到PCR体系;
(2)对PCR体系进行扩增;
(3)将PCR产物变性,并使用所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条进行反向点杂交;
(4)根据显色点的位置判断待测核酸样品的亚型。
8.根据权利要求7所述的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法,其特征在于,所述PCR体系中上游引物1、上游引物2、上游引物3、下游引物1、下游引物2和下游引物3的终浓度各自独立地为0.4~1pmol/μL;
优选地,所述PCR体系中Taq酶的终浓度为0.05~0.20U/μL;
优选地,步骤(3)中所述变性的温度为95~100℃;
优选地,所述使用方法还包括使用扩增内参基因的引物进行扩增和检测的步骤。
9.一种人乳头瘤病毒分型检测系统,其特征在于,所述人乳头瘤病毒分型检测系统包括:
(1)样品制备模块:采集并处理待测核酸样品,将待测核酸样品和所述通用引物对加入PCR扩增试剂中配制PCR体系;
(2)扩增模块:对PCR体系进行扩增;
(3)检测模块:将PCR产物变性,并使用所述人乳头瘤病毒分型杂交膜条进行反向点杂交;
(4)分析模块:根据显色点的位置判断待测核酸样品的亚型。
10.权利要求1或2所述的检测人乳头瘤病毒的引物和分型探针组合、权利要求3或4所述的人乳头瘤病毒分型杂交膜条、权利要求5或6所述的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒或权利要求9所述的人乳头瘤病毒分型检测系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测人乳头瘤病毒的产品中的应用。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115161415A (zh) * | 2022-08-16 | 2022-10-11 | 苏州康唯纳思生物科技有限公司 | 一种引物和探针的组合及其在hpv分型检测中的应用 |
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-
2021
- 2021-12-30 CN CN202111653988.8A patent/CN114164305A/zh active Pending
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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