CN114891922A - 用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的引物探针组合物、试剂盒及检测方法。本发明通过在HPV基因序列E6和L1两个不同区域分别设计水解探针和分子信标探针、并将扩增阶段的荧光采集点设置于高温变性阶段，使得扩增阶段和熔解曲线两个阶段的检测相互独立而互不干扰，从而实现了实时荧光PCR扩增检测技术与熔解曲线技术的联合使用；该技术提高了荧光PCR分析技术的单孔检测目标通量，降低了检测成本，为HPV多重荧光PCR分型检测提供一个更优的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的引物探针组合物、试剂盒及检测方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)属于乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳头瘤病毒属，HPV主要通过直接或间接接触污染物或性传播感染人类。HPV不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多重乳头瘤或疣以及粘膜生殖道上皮增生性损伤。持续HPV感染是导致宫颈癌和一些生殖器瘤样病变的主要原因。
对于感染生殖道和肛门的HPV，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性分为高危型与低危型两大类。感染高危型HPV是发生宫颈鳞状细胞癌必要但不充分条件。因此，仅有很少一部分感染HPV的女性会发展为明确的宫颈病变或宫颈癌。在小于 30岁的女性中，虽然HPV感染率很高，但自主清除率也很高，因此对细胞学检查正常但HPV检测结果阳性的女性不建议做过多治疗，避免负面后果，如花费增加，并有影响生育的可能。实际上大多数HPV感染是一过性的，进展的风险很小，仅有一少部分感染是持续性的。目前对于决定HPV持续感染的因素尚无充分的认识，但无论年龄因素，持续感染高危型1年或2年则预计有显著的后续发生宫颈上皮内瘤变 (CIN)3级或宫颈癌风险。研究表明：HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52， 56，58，59和68为HPV高危型别，HPV26，53，66，73，82为中等风险型别，其中HPV16型和宫颈癌发生的相关性最大，HPV18次之。目前已知增加HPV持续感染机会的协同因素包括吸烟、免疫系统受损、HIV病毒感染等。由HPV感染引起的相关性宫颈肿瘤的进展比较缓慢，重度不典型增生进展为宫颈浸润癌，平均需要3-7 年，因此HPV感染的患者适于进行频率较低的检查。此外，HPV在体外不能增殖，故不能用培养法检测。传统方法主要是通过形态学与免疫学方法对其进行检测，但特异性和灵敏度不够理想，且不能对HPV进行分型，因而分子生物学的方法是目前 HPV分型检测的主要技术。
目前HPV基因分型检测方法，如1)原位杂交技术：以核酸探针(DNA或RNA) 与样本进行原位杂交反应，原位杂交的优点是可对可疑细胞进行定位，同时具备半定量的功能；不足之处为敏感性低、样本质量要求高、劳动量大、花费较大，而且每种类型HPV都需要相应的探针。2)PCR-反向点杂交法：采用PCR体外扩增和DNA 反向点杂交相结合。利用HPV的基因特点设计特异引物，可以扩增出包含HPV基因型的目的片段，再将扩增产物与固定在膜条上的分型探针进行杂交，依据杂交信号的有无来判断是否有这些HPV基因型的存在，可用于临床HPV感染的辅助诊断。本法最大的缺点是杂交过程中容易出现污染，从而影响结果判断。3)流式荧光杂交法：该技术将PCR扩增产物和微球上交联的荧光标记物探针杂交，最后在多功能流式点阵仪上检测荧光信号。目前商品化试剂盒可以一次性检测分型27种型别的 HPV，缺点是扩增产物需开盖易污染，并且检测耗时6小时。4)熔解曲线法：在PCR 体系中加入标记有荧光基团与淬灭基团的探针，在PCR过程中扩增出与探针序列互补的单链寡核苷酸序列，在扩增完后增加熔解曲线分析过程，获得熔解曲线，并得出各型别熔点(Tm值)，但缺点为各个目标物之间的熔解峰的熔点范围间隔较近，容易邻近熔解峰互相干扰，出现融合峰等情况。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测方法，以解决现有检测技术中存在的PCR检测时间偏长、分型数量不足、分型不清晰等缺点。
本发明还提供一种用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的引物探针组合物。
基于上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的引物探针组合物，该组合物包括引物组和探针组；所述引物组包括：引物1：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，引物2：如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，引物3：如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，引物4：如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，引物5：如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，引物6：如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，引物7：如SEQ ID NO.10 所示的核苷酸序列，引物8：如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，引物9：如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，引物10：如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列，引物11：如SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列，引物12：如SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列，引物13：如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列，引物14：如SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列，引物15：如SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，引物16：如SEQ ID NO.23 所示的核苷酸序列，引物17：如SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列，引物18：如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列，引物19：如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列，引物20：如SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列，引物21：如SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列，引物22：如SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列，引物23：如SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列，引物24：如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列，引物25：如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列，引物26：如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列，引物27：如SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列，引物28：如SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列，引物29：如SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列，引物30：如SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列，引物31：如SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列，引物32：如SEQ ID NO.43 所示的核苷酸序列，引物33：如SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列，引物34：如SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列，引物35：如SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列，引物 36：如SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列，引物37：如SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列，引物38：如SEQ ID NO.51所示的核苷酸序列，引物39：如SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列，引物40：如SEQ ID NO.53所示的核苷酸序列，引物41：如SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列，引物42：如SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列，引物43：如SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列，引物44：如SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列，引物45：如SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列，引物46：如SEQ ID NO.61所示的核苷酸序列，
所述探针组包括：探针A：如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针B：如SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列，探针c：如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，探针D：如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，探针E：如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列，探针F：如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，探针G：如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列，探针H：如SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列，探针I：如SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列，探针G：如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列，探针K：如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列，探针L：如SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列，探针M：如SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列，探针N：如SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列，探针O：如SEQ ID NO.59所示的核苷酸序列，探针P：如SEQ ID NO.62所示的核苷酸序列。
作为优选，所述23种人乳头瘤病毒是HPV52、HPV39、HPV18、HPV16、HPV31、 HPV26、HPV35、HPV45、HPV68、HPV59、HPV33、HPV58、HPV43、HPV53、HPV81、 HPV6、HPV11、HPV51、HPV82、HPV73、HPV42、HPV56、HPV66。
作为优选，HPV52、HPV39、HPV18、HPV16、HPV31、HPV26、HPV35、HPV45 在E6/E7区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列，用于对称PCR扩增并分型检测的线性荧光探针分别为如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、 SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列，
HPV68和HPV59在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27 所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列，
HPV33和HPV58在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32 所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列，
HPV53和HPV43在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37 所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列，
HPV6和HP11在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42 所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列，
HPV51和HPV82在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47 所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列，
HPV73和HPV42在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52 所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列，
HPV56和HPV66在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57 所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.59所示的核苷酸序列，
HPV81在L1区对应的上、下游引物分别为如SEQ ID NO.60、SEC ID NO.61所示的核苷酸序列，用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ IDNO.62所示的核苷酸序列。
作为优选，所述探针组中的探针分别标记不同的荧光发光基团。
一种用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的试剂盒，该试剂盒包含本发明所述的引物探针组合物。
一种用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的方法，该方法用于非疾病诊断目的，该方法包括如下步骤：
S1、取宫颈脱落细胞样本进行DNA提取，
S2、配制荧光PCR试剂，该荧光PCR试剂包含权利要求1所述的引物探针组合物，以及DNA聚合酶和PCR缓冲液，
S3、将提取的样本核酸加入荧光PCR试剂中，
S4、荧光PCR检测，根据检测结果判断样品中是否含有23种人乳头瘤病毒型别。
本发明针对不同型别的HPV的扩增区域分别位于人乳头瘤病毒基因组中不同的功能取区(E区和L区)，在E区采用单型别特异性引物和水解探针进行对称荧光PCR 检测分型，在L区采用采用单型别特异性引物和分子信标进行不对称PCR-熔解曲线检测分型。
常规的HPV基因分型检测技术，往往采用单纯的实时荧光PCR扩增检测技术或单纯熔解曲线检测技术。单纯的实时荧光PCR扩增检测技术只能通过增加检测孔数量来实现多重检测，而单纯熔解曲线检测技术在检测靶标过多时容易导致各靶标之间的相互干扰；本发明将熔解曲线检测技术与实时荧光PCR扩增检测技术相结合，在扩增阶段除了扩增DNA模板以外，同时对部分靶序列进行检测，提高了荧光PCR 分析技术的单孔检测目标物通量；同时优化各个目标物熔解曲线在熔解温度上的分布，更好的避免各目标物之间的相互干扰。为多重荧光PCR分型检测提供一个更优的检测方法。
作为优选，S4中荧光PCR检测的具体参数设定：95℃预变性15分钟；95℃变性30秒(变性时采集荧光)，55℃变性20秒，58℃变性20秒，重复50个循环； PCR结束后进行熔解曲线分析，95℃10分钟，37℃5分钟，37℃-75℃进行熔解曲线分析(采集荧光)，升温速率0.04℃/秒。
作为优选，对称荧光PCR扩增引物终浓度为0.1μM-0.5μM，线性荧光探针终浓度在0.01μM-0.5μM。
作为优选，不对称PCR扩增的上游引物(与探针同向)的终浓度为下游引物(与探针反向)的1/50-1/10，上游引物终浓度为0.01μM-0.05μM，下游引物终浓度为 0.1μM-1μM，熔解曲线探针终浓度为0.05μM-0.5μM。
作为优选，S4中荧光PCR检测，在扩增阶段和熔解曲线阶段同时进行多色荧光采集检测；扩增阶段中的收集荧光是在循环扩增内高温变性这一步进行。
相对于现有HPV荧光PCR分型检测技术，本发明的有益效果在于：
通过在HPV基因序列E6和L1两个不同区域分别设计水解探针和分子信标探针、并将扩增阶段的荧光采集点设置于高温变性阶段，使得扩增阶段和熔解曲线两个阶段的检测相互独立而互不干扰，从而实现了实时荧光PCR扩增检测技术与熔解曲线技术的联合使用；该技术提高了荧光PCR分析技术的单孔检测目标通量，降低了检测成本，为HPV多重荧光PCR分型检测提供一个更优的检测方法。
附图说明
图1为本发明的流程示意图；
图2为实施例1中23种HPV型别的分型检测结果图，其中图2-1至图2-23依次为HPV16，18，39，52，33，58，59，68，43，53，81，31，35，26，45，6，11， 73，42，51，82，56，66型的阳性结果图；
图3为实施例1中检测范围型别之外的其他HPV型别检测结果图，其中图3-1 至图3-10依次为HPV40，44，54，61，67，69，70，71，72，83型检测结果图；
图4为实施例2中代表性临床样本分型检测结果图其中图4-1至图4-23依次为HPV16，18，39，52，33，58，59，68，43，53，81，31，35，26，45，6，11， 73，42，51，82，56，66型检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种用于23种人乳头瘤病毒分型检测的引物探针设计，具体步骤是：
1、扩增区域的选择
在NCBI数据库中，搜索HPV52、HPV39、HPV18、HPV16、HPV31、HPV26、 HPV35、HPV45、HPV68、HPV59、HPV33、HPV58、HPV43、HPV53、HPV81、HPV6、 HPV11、HPV51、HPV82、HPV73、HPV42、HPV56、HPV66的基因组全长序列。进行比对分析。
确定HPV52、HPV39、HPV18、HPV16、HPV31、HPV26、HPV35、HPV45在E6/E7 区设计各自特异性的引物探针，采用线性荧光探针进行对称PCR扩增并分型检测。
通过序列比较确定HPV68型别和HPV59型别选择L1区域作为目的扩增片段，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测。
通过序列比较确定HPV33型别和HPV58型别选择L1区域作为目的扩增片段，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测。
通过序列比较确定HPV53型别和HPV43型别选择L1区域作为目的扩增片段，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测。
通过序列比较确定HPV81型别选择L1区域作为目的扩增片段，用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测。
通过序列比较确定HPV6型别和HP11型别选择L1区域作为目的扩增片段，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测。
通过序列比较确定HPV51型别和HPV82型别选择L1区域作为目的扩增片段，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测。
通过序列比较确定HPV73型别和HPV42型别选择L1区域作为目的扩增片段，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测。
通过序列比较确定HPV56型别和HPV66型别选择L1区域作为目的扩增片段，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测。
设计好的引物探针序列如表1所示：
表1
2、设计好的引物探针验证
2.1阳性质粒的构建
在NCBI数据库中，搜索HPV31、HPV26、HPV35、HPV45、HPV52、HPV39、HPV18、HPV16型别的E6/E7区域全长DNA序列，HPV68、HPV59、HPV33、HPV58、HPV43、 HPV53、HPV81、HPV6、HPV11、HPV51、HPV82、HPV73、HPV42、HPV56、HPV66 型别的L1区域全长DNA序列，提交质粒合成公司(南京擎科生物科技有限公司) 插入至pUC57质粒载体中进行质粒合成。
2.2阳性质粒的浓度确定
采用新羿制造科技(北京)有限公司的数字PCR仪(A300/Drop Mark M1/ChipReader R1)进行浓度标定。
2.3设计的引物探针检测有效性确认
1)检测体系
PCR缓冲液(包含3mM氯化镁、2U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP)、引物探针 (包含对称上游引物浓度在0.2μM，对称下游引物浓度在0.2μM，线性荧光探针浓度在0.01μM；不对称上游引物浓度在0.02μM，对称下游引物浓度在0.5μM，熔解曲线探针浓度在0.08μM)。
2)配制PCR反应体系
体系中，A代表其中11种型别的引物探针，B代表另外12种型别的引物探针， A+B共检测23种型别(下同)。
3)加样品
将配制好的PCR反应体系分装到PCR管中，每个反应体系中加入10μL上述构建定标好的浓度为1×105copies/mL的HPV52、HPV39、HPV18、HPV16、HPV68、 HPV59、HPV33、HPV58、HPV43、HPV53、HPV81、HPV52、HPV39、HPV18、HPV16、 HPV68、HPV59、HPV33、HPV58、HPV43、HPV53、HPV81的阳性质粒。
4)设置荧光PCR检测程序
95℃预变性15分钟；95℃变性30秒(变性时采集荧光)，55℃变性20秒，58℃变性20秒，重复50个循环；PCR结束后进行熔解曲线分析，95℃10分钟，37℃5 分钟，37℃-75℃进行熔解曲线分析(采集荧光)，升温速率0.04℃/秒。
5)结果判读
按照表2进行判读，根据每种HPV特定的检测方法和检测通道即可判定样品中所存在的HPV型别，如果没有检测信号，说明样品中没有检测用途中的23种HPV 型别。
表2 23种HPV型别判定表
6)检测结果
各型别的结果如图2所示。
2.4设计的引物探针特异性确认
1)检测体系
PCR缓冲液(包含3mM氯化镁、2U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP)、引物探针 (包含对称上游引物浓度在0.2μM，对称下游引物浓度在0.2μM，线性荧光探针浓度在0.01μM；不对称上游引物浓度在0.02μM，对称下游引物浓度在0.5μM，熔解曲线探针浓度在0.08μM)。
2)配制PCR反应体系
2)加样品
选取人乳头瘤病毒L1基因分型参考品和全基因分型参考品中的本发明之外的型别(HPV52、HPV39、HPV18、HPV16、HPV68、HPV59、HPV33、HPV58、HPV43、 HPV53、HPV81、HPV52、HPV39、HPV18、HPV16、HPV68、HPV59、HPV33、HPV58、 HPV43、HPV53、HPV81除外)，对引物探针的特异性进行确认。
选取HPV40、HPV44、HPV54、HPV61、HPV67、HPV69、HPV70、HPV71、HPV72、 HPV83型别的国家参考品，浓度为1×107copies/mL。
将配制好的PCR反应体系分装到PCR管中，每个反应体系中加入10μL的浓度为1×107copies/mL的HPV40、HPV44、HPV54、HPV61、HPV67、HPV69、HPV70、HPV71、HPV72、HPV83型别的国家参考品。
3)设置荧光PCR检测程序
95℃预变性15分钟；95℃变性30秒(变性时采集荧光)，55℃变性20秒，58℃变性20秒，重复50个循环；PCR结束后进行熔解曲线分析，95℃10分钟，37℃5 分钟，37℃-75℃进行熔解曲线分析(采集荧光)，升温速率0.04℃/秒。
4)结果判读
按照表2进行判读，根据每种HPV特定的检测方法和检测通道即可判定样品中所存在的HPV型别，如果没有检测信号，说明样品中没有检测用途中的23种HPV 型别。
5)检测结果
检测范围型别之外的其他HPV型别检测结果如图3所示。
实施例2
23种人乳头瘤病毒分型检测方法的应用，具体步骤是：
1、检测体系
PCR缓冲液(包含3mM氯化镁、2U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP)、引物探针 (包含对称上游引物浓度在0.2μM，对称下游引物浓度在0.2μM，线性荧光探针浓度在0.01μM；不对称上游引物浓度在0.02μM，对称下游引物浓度在0.5μM，熔解曲线探针浓度在0.08μM)。
2、检测程序
95℃预变性15分钟；95℃变性30秒(变性时采集荧光)，55℃变性20秒，58℃变性20秒，重复50个循环；PCR结束后进行熔解曲线分析，95℃10分钟，37℃5 分钟，37℃-75℃进行熔解曲线分析(采集荧光)，升温速率0.04℃/秒。
3、临床样本验证
3.1配制PCR反应体系
3.2核酸提取
取200μL宫颈分泌物样本(经过亚能生物技术有限公司生产的人乳头瘤病毒基因分型(23型)检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)进行HPV分型检测)，按照杭州丹威生物科技有限公司生产的病毒核酸提取试剂盒(产品备案号：浙杭械备 20190045号)进行核酸提取，收集提取产物。
3.3加样
将配制好的PCR反应体系分装到PCR管中，每个反应体系中加入10μL上述样本的提取产物进行检测，检测程序如上所述。
3.4设置荧光PCR检测程序
95℃预变性15分钟；95℃变性30秒(变性时采集荧光)，55℃变性20秒，58℃变性20秒，重复50个循环；PCR结束后进行熔解曲线分析，95℃10分钟，37℃5 分钟，37℃-75℃进行熔解曲线分析(采集荧光)，升温速率0.04℃/秒。
3.5结果判读
按照表2进行判读。
3.6结果汇总
上述试验结果证明，通过临床各个型别的HPV样本的检测，本发明的人乳头瘤病毒检测分型方法可准确检测分型23种型别的人乳头瘤病毒，且各型别熔解曲线峰之间相离较远，不会相互干扰。
代表型临床样本的检测结果如图4所示。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
以上对本发明所提供的一种用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的引物探针组合物、试剂盒及检测方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 杭州丹威生物科技有限公司
<120> 用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
<130> DWSW2022-03
<160> 62
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 1
agagacaatr atccatatg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 2
acagtgaata tygataatgc 20
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<211> 22
<212> DNA
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<400> 3
ggcgtgtgta ttatgtgcct ac 22
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 4
acaccacctt gcagg 15
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 5
acctcrgttt gctgta 16
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
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atagcctgtg tctattgcag 20
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<211> 18
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<400> 7
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<211> 17
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<211> 20
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<211> 20
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aacaaaccgt tgtgtgtgat ttg 23
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<211> 20
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caatagtata tagggacgac 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
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acggtctttg acacgtta 18
<210> 15
<211> 24
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<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 15
cggagtgtgt acaaaatgtt taag 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
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gacctaagag tagtatatat agag 24
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<211> 21
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<400> 17
gccttggtct ccaacaattt g 21
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tggtgcaaca ttagaagcct ta 22
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
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aactgcatga tttgtgc 17
<210> 20
<211> 17
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ctcactccgc tgtaatt 17
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<211> 22
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<400> 21
gcatccatga aatttgtttg aa 22
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gacagtaggg acaatgtt 18
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cattggtagg cttacaag 18
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<211> 20
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catctgctgt tgataccaaa 20
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aattctagtg gaggacaat 19
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<211> 21
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tgcacaaggt cataacaatg g 21
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<211> 22
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catattagtg stacgagtgg ta 22
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tgcacaaggt cataataatg g 21
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catattggta ctgcgagtgg ta 22
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<211> 34
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ggttacttct gattctca 18
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gtatctacca cagtaacaaa ca 22
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tcgaattgtg aatacagaag 20
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gcaccggcat atattatta 19
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ccggcactaa taacattagg acatccctat tgccgg 36
<210> 50
<211> 20
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<210> 51
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catattgtgt atatatgaca taac 24
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agatactaga agcacta 17
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<212> DNA
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<400> 53
acaaactgta aatcaaactc 20
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ccggcagaca tgctgaagaa tatgatgtgc cgg 33
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
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cgctatggac tttaaggtgt 20
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ctctgcaggt attgtttc 18
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gacggtgaca tggtggacac 20
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<213> 人工序列(synthetic sequence)
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ttgccaccct tccaataca 19
<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 59
ccggccttta gacattgtac aatccacctg gccgg 35
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
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aataatggca tttgttggtt 20
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 61
gsagaaattc cttaaagtta gag 23
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 62
ccggcactac cagaagcacc aatttgccgg 30
Claims (10)
1.一种用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的引物探针组合物，该组合物包括引物组和探针组，其特征在于：
所述引物组包括：
引物1：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，
引物2：如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，
引物3：如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，
引物4：如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，
引物5：如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，
引物6：如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，
引物7：如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，
引物8：如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，
引物9：如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，
引物10：如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列，
引物11：如SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列，
引物12：如SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列，
引物13：如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列，
引物14：如SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列，
引物15：如SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，
引物16：如SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列，
引物17：如SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列，
引物18：如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列，
引物19：如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列，
引物20：如SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列，
引物21：如SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列，
引物22：如SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列，
引物23：如SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列，
引物24：如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列，
引物25：如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列，
引物26：如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列，
引物27：如SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列，
引物28：如SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列，
引物29：如SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列，
引物30：如SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列，
引物31：如SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列，
引物32：如SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列，
引物33：如SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列，
引物34：如SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列，
引物35：如SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列，
引物36：如SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列，
引物37：如SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列，
引物38：如SEQ ID NO.51所示的核苷酸序列，
引物39：如SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列，
引物40：如SEQ ID NO.53所示的核苷酸序列，
引物41：如SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列，
引物42：如SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列，
引物43：如SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列，
引物44：如SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列，
引物45：如SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列，
引物46：如SEQ ID NO.61所示的核苷酸序列，
所述探针组包括：
探针A：如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，
探针B：如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，
探针c：如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，
探针D：如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，
探针E：如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列，
探针F：如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，
探针G：如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列，
探针H：如SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列，
探针I：如SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列，
探针G：如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列，
探针K：如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列，
探针L：如SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列，
探针M：如SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列，
探针N：如SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列，
探针O：如SEQ ID NO.59所示的核苷酸序列，
探针P：如SEQ ID NO.62所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于：所述23种人乳头瘤病毒是HPV52、HPV39、HPV18、HPV16、HPV31、HPV26、HPV35、HPV45、HPV68、HPV59、HPV33、HPV58、HPV43、HPV53、HPV81、HPV6、HPV11、HPV51、HPV82、HPV73、HPV42、HPV56、HPV66。
3.如权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于：
HPV52、HPV39、HPV18、HPV16、HPV31、HPV26、HPV35、HPV45在E6/E7区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列，用于对称PCR扩增并分型检测的线性荧光探针分别为如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列，
HPV68和HPV59在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列，
HPV33和HPV58在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列，
HPV53和HPV43在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列，
HPV6和HP11在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列，
HPV51和HPV82在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列，
HPV73和HPV42在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列，
HPV56和HPV66在L1区对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列，并共用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.59所示的核苷酸序列，
HPV81在L1区对应的上、下游引物分别为如SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61所示的核苷酸序列，用一条熔解曲线探针进行不对称PCR扩增并分型检测，所述探针为如SEQ ID NO.62所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于：所述探针组中的探针分别标记不同的荧光发光基团。
5.一种用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物探针组合物。
6.一种用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的方法，该方法用于非疾病诊断目的，其特征在于该方法包括如下步骤：
S1、取宫颈脱落细胞样本进行DNA提取，
S2、配制荧光PCR试剂，该荧光PCR试剂包含权利要求1所述的引物探针组合物，以及DNA聚合酶和PCR缓冲液，
S3、将提取的样本核酸加入荧光PCR试剂中，
S4、荧光PCR检测，根据检测结果判断样品中是否含有23种人乳头瘤病毒型别。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：S4中荧光PCR检测的具体参数设定：95℃预变性15分钟；95℃变性30秒，变性时采集荧光，55℃变性20秒，58℃变性20秒，重复50个循环；PCR结束后进行熔解曲线分析，95℃10分钟，37℃5分钟，37℃-75℃进行熔解曲线分析，采集荧光，升温速率0.04℃/秒。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：对称荧光PCR扩增引物终浓度为0.1μM-0.5μM，线性荧光探针终浓度在0.01μM-0.5μM。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：不对称PCR扩增的上游引物(与探针同向)的终浓度为下游引物(与探针反向)的1/50-1/10，上游引物终浓度为0.01μM-0.05μM，下游引物终浓度为0.1μM-1μM，熔解曲线探针终浓度为0.05μM-0.5μM。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于：S4中荧光PCR检测，在扩增阶段和熔解曲线阶段同时进行多色荧光采集检测；扩增阶段中的收集荧光是在循环扩增内高温变性这一步进行。
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