CN115161415B - 一种引物和探针的组合及其在hpv分型检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种引物和探针的组合及其在HPV分型检测中的应用，属于生物技术领域，引物和探针的组合中，引物包括上游引物、下游引物和内标基因的引物，探针包括31条特异性探针和内标基因的探针；上游引物与GP5+同源，下游引物与GP6+同源；上游引物的序列，以及下游引物的序列，各自分别与至少一个HPV型别中的基因序列有≦3个碱基的差异；内标基因为人类管家基因β‑globin。该组合能够有效扩增31种HPV基因型，可在单一PCR反应管中同时扩增31种型别HPV‑DNA，并且引物和探针的组合对31种型别的HPV均有很好的检测灵敏度和特异性，使31种型别的HPV感染情况都能得到正确评估。

Description

一种引物和探针的组合及其在HPV分型检测中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种引物和探针的组合及其在HPV分型检测中的应用。
背景技术
HPV病毒（宫颈人乳头瘤病毒）是一种亲上皮细胞的双链DNA病毒，其基因组长7900bp，目前已发现有约200多型HPV病毒，该病毒主要感染皮肤和粘膜的上皮细胞，造成上皮增生甚至恶性转化。人们已经在生殖道检测到超过40型的HPV，其中，经WHO国际癌症研究机构（IARC）确认的有31种HPV的基因型，包括13种高危亚型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68，这部分型别的HPV病毒与宫颈内皮增生及宫颈癌密切相关；还有13种低危亚型，例如：6、11、40、42、43、44、55、61、67、69、70、72和81，这部分型别的HPV病毒主要存在于良性病变中，多造成生殖道疣等疾病，因此被称为低危型；以及5种中等风险的亚型，例如：26、53、66、73和82等。但是，在实际中人为区分的高危型或低危型并不是绝对的，因为在一些癌变中确实也存在上述的低危型HPV病毒。
多数HPV病毒对人体的感染都是一过性的，病毒很快会被人体免疫系统清楚，但少数情况下，病毒整合入宿主基因组DNA，转变为持续感染，从而引发宫颈恶性病变。研究表明，接近100%的宫颈癌样本中都可以检测到HPV病毒。据统计，每年约有29万人死于宫颈癌，同时，每年还有大约49万例新发宫颈癌病例。因此，对HPV病毒有效的检测方法，具有重要的临床和社会意义。
目前，HPV病毒尚不能人工体外培养，并且HPV的血清学检测技术也不成熟，对HPV病毒感染的检测方法仍然局限于使用分子生物学的方法在待测样本中直接检测，例如：原位杂交、液相杂交（杂交捕获技术）等，但是这些方法不但操作复杂，而且敏感性有限。
而HPV病毒的PCR检测具有操作简单、高敏感性等优点，对待测样本进行PCR检测仍是目前实验室最常用的一种检测方法。但是HPV病毒存在很多的型别，对每一型都使用其特异引物进行PCR检测的工作量十分巨大；同时，序列特异的PCR只能扩增序列已知的HPV病毒，对于未知HPV型或存在变异的HPV则不能进行有效的扩增检测。因此，在测试中，人们通常会选取HPV病毒基因组序列中较为保守的L1和E1基因区域设计通用引物，以实现在单一PCR反应中同时检测多种型别HPV的目的。目前常用的通用引物根据设计原则的不同分为三类：第一，单一引物，例如：GP5+/GP6+；第二，简并引物，例如：MY09/MY11；第三，混合引物，例如：SPF1/SPF2。上述三类针对HPV病毒的L1基因序列的通用引物可以有效地扩增现在已知的大部分HPV病毒，尤其是感染生殖道的HPV病毒类型，同时，这些通用引物还可以发现新的病毒型、亚型及病毒变异体，因此这三类通用引物被广泛应用于大样本流行病调查中。
虽然上述三类通用引物在实际应用中非常成功，但是作为通用引物，其缺点也是很明显的。具体的，对于第一类通用引物，GP5+/GP6+仅与某个或少数个HPV型别的序列匹配，而对与多数型别的HPV，引物结合区都存在或多或少的碱基错配。由于错配序列的存在，引物与模板的结合势必会受到影响，这将大大降低PCR扩增的效率，这也使得该类通用引物对不同型别的HPV扩增效率不同，对于某些与引物匹配较差的HPV型别，其感染情况往往可能被低估。实际应用中，该类通用引物对HPV52这种常见的宫颈高危HPV扩增效率较低。对于第二类通用引物，MY09/MY11在合成时，需要在引物序列的特定位点随机插入两到三种不同的碱基，这一不可控的过程导致人们无法保证在混合引物中每一种特定的引物序列都能够以相同的几率出现。因此，不同批次合成的MY09/MY11实际存在差异，而这种差异也往往导致不同批次合成的引物对相同样本中病毒的扩增也会出现效率不同的问题。这种缺点对于需要扩增条件稳定、实验结果均一的大样本病毒感染率检测是十分不利的。
除了上述缺点之外，当同一个样本中同时存在多种HPV类型感染时，通用引物扩增往往还存在竞争抑制，这使多重感染很难正确检测，特别是存在较多碱基错配的HPV及感染量很低的样本，就很难被检测到。
针对通用引物的这些缺点，研究人员尝试了多种解决方案，例如将SPF1和GP6+配合使用、改造MY09/MY11简并引物，使其成为类似SPF1/SPF2的混合引物，比如PGMY09/PGMY11通用引物等。但是至今为止，通用引物对不同型别的HPV扩增效率不同，对某些型别的HPV扩增效率低这些缺点仍然没有很好的解决办法。
发明内容
本发明的目的在于实现在单一PCR反应中同时检测多种型别HPV，并且保证不同型别的HPV扩增效率基本一致，以及各种型别的HPV感染都能得到正确评估。
为了实现上述目的，本发明设计了一组引物和探针的组合，其中引物包括一组上游引物和一组下游引物，以及内标基因的引物；探针包括31条特异性探针和内标基因的探针；
其中上游引物与GP5+同源，且与GP5+的序列相似；下游引物与GP6+同源，且与GP6+的序列相似。
其中，上游引物是一组长为23nt的与GP5+同源的碱基序列，Tm=50-60℃；
其中上游引物选自下述6条基于GP5+的引物中的任意5条的组合，所述6条基于GP5+的引物的序列分别为：
F1：TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC；
F2：TTTGTTACTGTTGTGGATACCAC；
F3：TTTGTTACTTGTGTTGATACTAC；
F4：TTTCTTACTGTAGTGGACACTAC；
F5：TTTTTAACAGTTGTAGATACTAC；
F6：TTTGTAACAGTTGTAGATACCAC；
优选的，上游引物由F1、F2、F3、F4和F5组合而成；优选的，各个序列的浓度相等，且等量混合，所述浓度的范围为0.1-0.5μM；优选的，浓度选择0.2μM。
其中，下游引物是一组长为25nt的与GP6+同源的碱基序列，Tm=45-55℃；
其中下游引物选自下述8条基于GP6+的引物中的任意6条的组合，所述8条基于GP6+的引物的序列分别为：
R1: GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC；
R2: GAAACATAAATTGTAATTCATACTC；
R3: GAAAAATAAACTGTAAATCAAATTC；
R4: GAAACACAAACTGTAATTCATATTC；
R5: GAAATATAAACTGCAAATCAAATTC；
R6: GAAAAACAAACTGTAAATCAAACTC；
R7:GAAATATAAACTGCAAGTCATATTC；
R8:GAAAAACAAACTGTAAGTCATATTC；
优选的，下游引物由R1、R2、R3、R4、R5和R6组合而成；优选的，各个序列的浓度相等，且等量混合，所述浓度的范围为0.1-0.5μM；优选的，浓度选择0.4μM。
目前常用的通用引物均存在与某个或少数几个型别的HPV序列匹配，而对于多数型别的HPV，引物结合区都存在或多或少的碱基错配，由于错配序列的存在，引物与模板的结合势必受到影响，这将大大降低PCR扩增的效率。这使得通用引物对不同型别的HPV扩增效率不同，对于某些与引物匹配较差的HPV型别，其感染情况往往可能被低估。
但有研究证实，引物与模板匹配较好时，可以检测到飞克（fg）水平的病毒序列，而当其中一个引物或引物对与模板存在4个或更多碱基错配时，可以检测到皮克（pg）水平。因此，当错配再3个碱基以下时，并不会显著影响PCR的扩增效率。
在此基础上，本发明设计了上述基于GP5+/GP6+的改进引物，上游引物由5条序列等比例混合而成，下游引物由6条序列等比例混合而成。上游引物的F1序列与HPV的6、11、16、18、31、33、35、42、43、44、55、56、58、67、70、72、73和81等型别的基因序列具有更好的匹配度，序列差异在3个碱基之内；F2序列与HPV的40、52、53、61、66和68等型别的基因序列具有更好的匹配度，序列差异在3个碱基之内；F3序列与HPV的26、51、69和82等型别的基因序列具有更好的匹配度，序列差异在3个碱基之内； F4序列与HPV的39和45等型别的基因序列具有更好的匹配度，序列差异在1个碱基之内； F5序列为与HPV的59和73等型别的序列差异在1个碱基之内。而下游引物同样如此，R1序列与HPV的6、16、18、33、35、45、69、70和81等型别的基因序列具有更好的匹配度，序列差异在3个碱基之内；R2序列与HPV的26、39、44、51、55和82等型别的基因序列具有更好的匹配度，序列差异在3个碱基之内；R3序列与HPV的11和52等型别的基因序列具有更好的匹配度，序列差异在3个碱基之内；R4序列与HPV的53、56、58和66等型别的基因序列具有更好的匹配度，序列差异在3个碱基之内；R5序列与HPV的40、61和73等型别的序列差异在3个碱基之内；R6序列与HPV的31、42、43、59、67、68和72等型别的序列差异在3个碱基之内。因此在PCR体系中，上下游引物互相配对，可以基本保证每个型别的HPV都有不超过3个错配碱基的引物，从而保证了每个型别HPV的扩增效率。
由于错配序列的存在，引物与模板的结合仍然会受到影响，这将大大降低PCR扩增的效率。为了提高PCR的扩增效率，用错配引物进行PCR扩增时，常常需要使用与平常不同的PCR反应条件。比如40℃的退火温度及3.5-10 mM的Mg2+浓度。在这种情况下，尤其是模板的拷贝数较低时，PCR扩增产物往往会产生许多非特异条带，这将影响研究人员对结果的分析。为了有效检测包含较多非特异条带的PCR产物，本发明选择了膜杂交的方法。
另一方面，本发明设计了包括31条特异性针对不同HPV型别的特异性探针。
其中特异性探针的碱基长度为20-32nt，Tm≧59℃。
本发明中，每个HPV型别的特异性探针与相应的HPV基因序列特异性互补，型别之间无交叉污染，每条特异性探针的序列与其对应的HPV型别如下表1所示。
表1 特异性探针的序列与其对应的HPV型别
其中，对于HPV11型、HPV45型和HPV67型，这三种型别的HPV病毒在探针区域存在个别碱基变异，为了提高杂交效果，保证检测灵敏度，此3个型别的HPV探针在变异区域选择了简并碱基。
同时，对于HPV52型、HPV68型和HPV82型，这三种型别的HPV病毒在探针区域的碱基序列存在较大变异，为了提高杂交效果，保证检测灵敏度，此3个型别的HPV探针是多条探针的混合物。
另一方面，本发明还设计了1套内标基因的引物和探针。
其中，内标基因为人类管家基因β-globin；引物包括：1条序列为GAAGAGCCAAGGACAGGTAC的上游引物和1条序列为CAACTTCATCCACGTTCACC的下游引物；内标基因的探针序列为CAGGAGCAGGGAGGGCAGG。
上述内标基因引物在PCR扩增时对其他HPV引物无干扰，内标基因的探针与其他HPV序列无交叉。
本发明的内标基因引物和探针能够有效监控HPV-DNA提取、PCR扩增效率、杂交捕获以及抗体显色等HPV分型检测的全过程，是良好的内在质量控制方法。
本发明同时要求保护一种上述的引物和探针的组合在HPV分型检测中的应用，HPV分型检测的方法，包括如下步骤：（1）HPV-DNA提取；（2）包括若干变性、退火和延伸步骤的PCR扩增；（3）包括若干膜条准备、DNA变性、杂交、抗体孵育、洗膜、显色以及结果判断等步骤的杂交检测过程。
与现有技术相比，本发明的引物和探针的组合及其在HPV分型检测中的应用具有如下优点：
（1）目前常用的通用引物仅与某个或少数几个HPV型别的序列匹配，而对于多数型别HPV，引物结合区都存在或多或少的碱基错配。由于错配的存在，引物与模板的结合受到影响，大大降低了PCR扩增的效率。这使得通用引物对不同型别的HPV扩增效率不同，对于某些与引物匹配较差的HPV型别，其感染情况往往可能被低估。本发明实现了在单一PCR反应管中同时有效扩增31种型别HPV-DNA的目的，并且本发明的引物和探针组合对31种型别的HPV均有很好的灵敏度和特异性，从而使31种型别的HPV感染情况都能得到正确评估。
（2）鉴于HPV类型众多，序列特异PCR只能扩增序列已知的HPV，对于未知HPV型或存在变异的HPV则不能有效扩增检测。本发明中的引物，除了可以有效扩增本发明提到的31种HPV亚型外，经实验证明，还可以扩增一些少见的HPV型别，比如HPV83型（探针：GCTGCTGCTACACAGGCTAATGAATA）和HPV89型（探针：TCCCAGTCTGGCACAGAATACAG）等；另外，由于上下游引物与模板存在错配，因此本发明的引物也可以用于发现新的HPV型别、亚型及HPV病毒的变异体。
（3）本发明的探针中，HPV11型、HPV45型和HPV67型的探针在变异区使用了简并碱基，而HPV52型、HPV68型和HPV82型使用了混合探针，这大大提高了杂交效果，保证了检测灵敏度，使变异型别的HPV感染也能得到正确检测。
（4）本发明中的内标基因引物在PCR扩增时对其他HPV引物无干扰，探针与其他HPV序列无交叉。在不影响HPV扩增效果的前提下，实现了HPV检测过程中的有效监控，从而保证了检测的准确性。
附图说明
图1：1000copies/mL的型别为6、11、16、18、26、31、33的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图2：500copies/mL的型别为6、11、16、18、26、31、33的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图3：200copies/mL的型别为6、11、16、18、26、31、33的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图4：1000copies/mL的型别为35、39、40、42、43、44的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图5：500copies/mL的型别为35、39、40、42、43、44的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图6：200copies/mL的型别为35、39、40、42、43、44的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图7：1000copies/mL的型别为45、51、52、53、55、56、58的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图8：500copies/mL的型别为45、51、52、53、55、56、58的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图9：200copies/mL的型别为45、51、52、53、55、56、58的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图10：1000copies/mL的型别为59、61、66、67、68、69、70的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图11：500copies/mL的型别为59、61、66、67、68、69、70的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图12：200copies/mL的型别为59、61、66、67、68、69、70的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图13：1000copies/mL的型别为72、73、81、82的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图14：500copies/mL的型别为72、73、81、82的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图15：200copies/mL的型别为72、73、81、82的pMD-18T-HPV载体分型检测中的显色状态图。
图16：使用本发明的引物和探针组合，检测HPV时的特异性实验检测结果。
其中，图16中，从上而下的膜条分别为：沙眼支原体核酸阳性标本、单纯疱疹病毒核酸阳性标本，解脲支原体核酸阳性标本，巨细胞病毒核酸阳性标本和正常宫颈细胞核酸的样本。
图17：使用本发明的引物和探针组合在临床检测中，对样本2、7、8、11、15中HPV分型检测的结果。
图18：使用本发明的引物和探针组合在临床检测中，对样本16、18、20、31、37中HPV分型检测的结果。
图19：使用本发明的引物和探针组合在临床检测中，对样本49、51、58、59中HPV分型检测的结果。
图20：使用本发明的引物和探针组合在临床检测中，对样本67、69、74中HPV分型检测的结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例中涉及的实验材料：
本发明中所使用的核酸（DNA）提取试剂盒（Yu-D01）、10×qPCR Buffer、20×SSC、10%SDS、1M柠檬酸钠、探针缓冲液、A液、B液、C液、TMB和7.5%的H2O2由本公司提供，辣根过氧化物标记的亲和素（POD）购自北京天恩泽生物科技有限公司。
含有HPV目的DNA片段的31种型别HPV（包括18种中高危型别：16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82，以及13种低危亚型：6、11、40、42、43、44、55、61、67、69、70、72、81型）的pMD-18T载体由本公司构建，各型别载体命名为pMD-18T-HPV型别（例如：pMD-18T-HPV16）。
TMB和H2O2以及引物和探针由上海生物工程有限公司合成。
商品化HPV分型试剂盒为市场上购得。
实施例1
制备探针和引物，以及载体的标化及实验的实施。
1、膜条的制备：
（1）将31种型别的HPV探针高速离心数秒，用超纯水稀释成100pmol/µL的探针母液，用探针缓冲液将探针母液稀释成5pmol/µL；如果某个型别HPV是混合探针，则混合探针中的每条探针的浓度均为5pmol/µL。
（2）把稀释好的探针液体点到已活化的尼龙膜的相应方格中，每格0.8µL，室温晾干。
（3）把膜条浸泡在0.1M的NaOH中摇动10分钟，用蒸馏水冲洗3次，每次1分钟，最后铺在吸水纸上晾干，制备成HPV分型检测膜条。制备好的膜条4℃低温保存备用。HPV分型检测膜条各型别分布位置如表2所示：
表2 HPV分型检测膜条各型别的分布位置示意图
2、混合引物的配制：
（1）将HPV引物和β-globin引物分别各自放入离心机，高速离心数秒使DNA聚集管底，按照要求加入相应体积的双蒸水，分别配成引物浓度为100µM的溶液，备用。
（2）上游引物配制（基于GP5+和β-globin）：从配好的100µM 的F1至F5和β-globin上游引物中各吸取5µL，加入20µL的无RNAase水，混匀后即配成体积为50µL浓度为10µM/条的上游混合引物，标记为“HPV上游引物”。
（3）下游引物配制（基于GP6+）：从配好的100µM R1至R6和β-globin下游引物中各吸取10µL，加入30µL的无RNAase水，混匀后即配成体积为100µL浓度为10µM/条的下游混合引物，标记为“HPV下游引物”。
（4）取“HPV上游引物”0.5µL和“HPV下游引物”1µL加入至13.5µL的PCR反应体系中，配制成15µL/管的PCR反应液。
3、载体的标化
将31种型别的pMD-18T载体经Nanodrop one微量分光光度计定量浓度后，用1ng/µL人基因组DNA分别稀释至1000copies/mL、500copies/mL和200copies/mL，备用。拷贝数计算公式：copies/µL =6.02×1023×载体初始浓度值(ng/µL)×10-9/（载体碱基数×660）。
4、本发明的实施步骤
本发明检验操作包括三个步骤：核酸提取、PCR扩增和杂交检测。
（1）DNA提取
取已稀释至标化浓度的pMD-18T载体或临床样本200µL，按核酸（DNA）提取试剂盒（Yu-D01）说明书操作。
（2）PCR扩增
在配制好的15µL/管的PCR反应液中加入10µL已提取的待测样本，反应总体系为25µL（体系中的上游每条引物的浓度为0.2µM，下游每条引物的浓度为0.4µM），低速离心数秒。PCR扩增条件为：50℃+10min、94℃+10min；然后进行10个循环的“94℃+30s、42℃+45s、72℃+20s、94℃+30s”，其中降温速率为0.8℃/s，升温速率为2.0℃/s；最后再进行30个循环的“46℃+45s、72℃+20s、72℃+2min”，其中降温速率为0.8℃/s，升温速率为2.0℃/s。
（3）杂交检测
在含膜条的杂交管中，加入8mL的A液和25µL 的PCR扩增产物。将杂交管置100℃水浴中变性10min后放入杂交仪，51℃杂交1.5小时；
将膜条取出，放入装有常温B液的小烧杯中涮洗一下，然后将膜条快速转移至已预热至51℃的40mL B液，杂交仪中，51℃摇洗5min；
将辣根过氧化物标记的亲和素（POD）用A液稀释20000倍，将膜条放入稀释后的POD中室温轻摇孵育30min；
将膜条转入含40mLA液中，室温轻摇洗涤两次，每次5min；
将膜条转入含40mLC液中，室温摇洗2min；
显色液配制：在19mLC液中加入1ml TMB和8µL 7.5%H2O2；
将膜条浸没于20mL显色液中避光显色15min，再将膜条转移至蒸馏水中涮洗1次，晾干后观察结果。
结果判断：依据显色信号（蓝色）的有无以及位置判断相应型别HPV的阴阳性。
实施例2
基于GP5+/GP6+引物改进的HPV引物组合及其探针在HPV分型鉴定中灵敏度分析。
以实施例1中的实施步骤，进行膜条制备、引物配制以及载体标化；
以本公司构建并标化的1000copies/mL、500copies/mL和200copies/mL 的31种型别的pMD-18T-HPV载体为模板，按实施例1中的方法进行核酸提取、PCR扩增以及杂交检测。
如图1-15所示，结果表明，本发明的引物和探针组合对31型HPV的检测灵敏度为200copies/mL。
实施例3
基于GP5+/GP6+引物改进的HPV引物组合及其探针在HPV分型鉴定中特异性分析。
以国家参考盘中沙眼支原体核酸阳性，单纯疱疹病毒核酸阳性，解脲支原体核酸阳性，巨细胞病毒核酸阳性和正常宫颈细胞核酸的样本为参考品，以实施例2中选择的序列组合为“HPV下游引物”，其他按照实施例1中的程序验证本发明的特异性。
如图16所示，结果表明，沙眼衣原体核酸阳性，单纯疱疹病毒核酸阳性，解脲支原体核酸阳性，巨细胞病毒核酸阳性，正常宫颈细胞核酸的结果均判为阴性，说明本发明方法与常见微生物核酸之间无交叉反应，检测特异性良好。
实施例4
本发明与商品化HPV分型检测试剂盒在临床样本中的比较。
用本发明的引物和探针组合，按实施例1中的程序对100例临床样本进行HPV分型，同时用商品化的HPV分型试剂盒和NGS方法进行验证。
结果，本发明的引物和探针组合共检测出18例阳性，阳性检出率为18%，与商品化检测试剂盒和NGS方法一致。但是，在型别检出率方面，本发明共检出各种型别45个，比商品化HPV分型试剂多检出10个型别，这10种为：26型1例，40型1例、52型2例，73型2例，81型2例和82型2例；与NGS方法相比，本发明多检出了52和82型2个型别（表3和图17-20）。
表3 本发明对临床样本中HPV分型结果与商品化试剂盒和NGS方法的比较
结果表明：第一，本发明的引物和探针组合对不同型别特别是一些不常见型别如73、81和82型的HPV均有较好的检出能力，保证了不同型别HPV感染都能得到正确的评估；第二，本发明方法在阳性和型别检出率方面与NGS方法高度一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制发明，凡在本发明的设计构思之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种引物和探针的组合，其特征在于：所述引物包括上游引物、下游引物和内标基因的引物，所述探针包括31条特异性探针和内标基因的探针；
所述上游引物与GP5+同源，所述下游引物与GP6+同源；
所述上游引物的序列与至少一个HPV型别中的基因序列有≦3个碱基的差异；所述下游引物的序列与至少一个HPV型别中的基因序列有≦3个碱基的差异；
所述内标基因为人类管家基因β-globin；
所述上游引物由F1、F2、F3、F4和F5组合而成，各自的序列分别为：
F1：TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC；
F2：TTTGTTACTGTTGTGGATACCAC；
F3：TTTGTTACTTGTGTTGATACTAC；
F4：TTTCTTACTGTAGTGGACACTAC；
F5：TTTTTAACAGTTGTAGATACTAC；
所述上游引物中的F1、F2、F3、F4和F5的浓度相等，且等量混合，所述浓度的范围为0.1-0.5μM；
所述下游引物由R1、R2、R3、R4、R5和R6组合而成，各自的序列分别为：
R1: GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC；
R2: GAAACATAAATTGTAATTCATACTC；
R3: GAAAAATAAACTGTAAATCAAATTC；
R4: GAAACACAAACTGTAATTCATATTC；
R5: GAAATATAAACTGCAAATCAAATTC；
R6: GAAAAACAAACTGTAAATCAAACTC；
所述下游引物中的R1、R2、R3、R4、R5和R6的浓度相等，且等量混合，所述浓度的范围为0.1-0.5μM；
所述特异性探针分别与对应型别的HPV基因序列特异性结合，每条特异性探针和其对应的HPV型别如下：
。
2.如权利要求1所述的引物和探针的组合，其特征在于：所述内标基因为人类管家基因β-globin，所述内标基因的引物包括：1条序列为GAAGAGCCAAGGACAGGTAC的上游引物、1条序列为CAACTTCATCCACGTTCACC的下游引物；所述内标基因的探针序列为CAGGAGCAGGGAGGGCAGG。
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