KR20160033054A - 인유두종 바이러스의 탐지용 고감도 프로브 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

인유두종 바이러스의 탐지용 고감도 프로브 및 이를 포함하는 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인유두종 바이러스의 DNA 또는 RNA에 결합하는 고감도 프로브, 이를 포함하는 마이크로어레이를 사용하여 인유두종 바이러스의 탐지키트 및 유전형을 결정하는 인유두종 바이러스의 유전형 분석키트에 관한 것으로서, 기존 사용하던 프로브 및 이를 이용한 DNA 칩에 비해 특이도 및 민감도가 현저히 우수한 유전형 분석방법 및 분석키트를 제공한다.

Description

인유두종 바이러스의 탐지용 고감도 프로브 및 이를 포함하는 키트{High Definition Probe for detecting human papilloma virus and kit using the same}
본 발명은 인유두종 바이러스의 감염을 진단하기 위한 유전형 분석용 고감도제작 프로브 및 이를 포함하는 바이오칩에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 DNA 칩을 사용하여 인유두종 바이러스에 감염된 환자의 유전형을 분석하는 인유두종 바이러스의 유전형 분석키트 및 상기 분석키트를 사용하여 환자의 유전형을 분석함으로써, 인유두종 바이러스의 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.
자궁경부암은 자궁경부 상피내종양이라는 암 전단계를 걸쳐 진행되는데, 인유두종 바이러스(Human papillomavirus, HPV)의 감염이 자궁경부 종양의 발생에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 자궁경부암의 예방, 진단 및 치료는 여성 보건에 있어서 중요한 문제로 여겨지고 있다. 특히, 특정 유전형(genotype)의 HPV에 감염된 경우에 종양으로 진행할 가능성은 더욱 높아지게 된다.
인유두종 바이러스가 자궁경부암의 주요원인으로 밝혀진 이후로 현재까지 HPV는 70여 가지의 유전형이 발견되었으며, 병소의 위치와 병변의 진행정도에 따라 각각 특이한 HPV 유전형이 선택적으로 발견되어, HPV 감염의 생물학적 특징의 다양성을 인식하게 되었다. 생식기 감염 HPV 유전형 중 10개 이상이 고위험군으로 분류되어 자궁경부암과 연관되는 것으로 알려져 있으므로, HPV 감염의 생물학적 특징의 다양성이 자궁경부암의 진단과 예방에 중요한 의미를 지닌다는 것을 암시하고 있다.
크게 고위험군, 저위험군으로 분류되고, 고위험군은 (HPV-16, 18, 31, 33, 35 등) 90% 이상의 자궁경부암과 상피내암 조직에서 검출된다. 여성의 자궁경부암은 초기에 진단이 되면 거의 완치가 가능하므로 조기진단을 위해 Pap smear, 분자생물학적 HPV 검사법이 사용되고 있다.
따라서, HPV의 감염여부와 감염된 HPV의 유전형을 간단하고, 정확하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라 높은 특이도와 민감도를 갖는 HPV 의 진단 방법 및 키트, 이에 사용되는 프로브 및 DNA 칩을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
또한, 상기 탐지키트, 이에 사용되는 프로브 및 DNA 칩은 가능한 여러 가지 유형의 HPV를 높은 특이도 및 민감도로 분석하여 HPV 감염여부와 유전형을 더욱 정확하게 진단할 수 있어야 함과 동시에, 하나의 칩 상에서 검출가능한 HPV 유형의 프로브간에 혼성화가 발생하지 않아야 한다.
이와 관련하여, 한국등록공보 10-051727에는 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 유전형 분석 DNA 프로브 및 상기 프로브를 포함하는 HPV 감염을 진단하기 위한 DNA 칩 및 유전형 분석키트를 제공하고 있다. 그러나, 이들 종래에 알려진 HPV 유전형 분석칩은 다양한 유전형의 HPV를 하나의 칩으로 모두 검출할 수 있는 장점이 있는 반면에, 프로브 서열의 길이가 30bp이상인 경우, 반복서열의 존재 및 비표적 서열과의 염기서열 동일성이 높은 문제 등으로 인해, 몇몇 HPV 유형의 포로브들은 서로간에 또는 비표적 서열과의 혼성화 반응(cross-hybridization)으로 인한 특이도 및 민감도가 낮다는 문제점이 있다. 구체적으로 시판되는 안국바이오진단의 HPV 칩의 경우 HPV 유전형 16, 40 및 58 등은 교차 혼성화 문제가 발생되며, 30bp이상의 길이를 갖는 프로브를 포함하며, 최대 5회 반복의 서열을 포함하는 프로브, 및 비표적 영역과 염기서열 동일성이 최대 85%을 갖는 프로브를 포함하고 있다.
여러 가지 유형의 HPV를 높은 특이도 및 민감도로 분석하여 HPV 감염여부와 유전형을 더욱 정확하게 탐지하기 위해서는, 프로브의 길이, 혼성화가 풀어지는 온도, GC함량, 비표적 서열과 서열 유사도 등을 개선한 HPV 탐지 및 유전형 분석용 프로브의 개발이 절실하다.
본 발명의 목적은 여러 가지 유형의 HPV를 높은 특이도 및 민감도로HPV 감염여부와 유전형을 더욱 정확하게 진단하기 위해서, 본 발명은 HPV의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 HPV의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는 HPV의 감염 및 유전형 분석을 위한 DNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 HPV의 감염 및 유전형 분석을 위한 신규한 DNA 칩을 포함하는 HPV 유전형 분석키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인유두종 바이러스(humanpapillomavirus, HPV)의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 유전형 분석 DNA 프로브 및 상기 프로브를 포함하는 HPV 감염을 진단하기 위한 DNA 칩 및 유전형 분석키트를 제공한다.
본 발명자들은 간단한 방법으로 환자의 유전형을 분석하여 인유두종 바이러스(HPV)의 감염여부를 진단하고, 감염된 HPV의 종류를 정확하게 판별할 수 있는 방법을 확립하고자 연구노력한 결과, HPV의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브, 및 이를 포함하는 DNA 칩을 개발하였다. 본 발명은 HPV DNA의 염기서열, 바람직하게는 HPV의 L1 DNA와 상보적으로 결합하는 염기서열을 프로브를 제공한다. 본 발명의 프로브는 서열목록 서열번호 1 내지 27에 기재된 염기서열을 포함한다. 본 발명의 프로브를 이용하여 높은 특이도와 민감도로 HPV의 감염여부 및 유전형을 분석할 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명은 인유두종 바이러스(HPV)의 감염여부를 진단하고, 감염된 HPV의 종류를 정확하게 판별할 수 있으며, 비표적 영역과 서열유사도가 낮고 교차 혼성화가 일어나지 않으며 2차 구조형성이 방지되어 특이도와 민감도가 높은 HPV 탐지 및 유전형 분석용 프로브 서열을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 HPV 탐지 및 유전형 분석용 프로브 서열을 하기 표 1 내지 3에 나타낸다. 하기 표에는 한 종류의 HPV 유형에 대해서 각각 3 종의 상이한 서열을 갖는 프로브를 제시한다. 또한 본 발명에 따라 HPV의 DNA와 상보적으로 결합가능한 염기서열을 가지는 프로브를 제공한다. 본 발명의 프로브는 HPV에 특이적으로 하이브리디제이션되는 것이 특징이다.
명명 서열(5'->3') 서열길이(base) 서열번호
6-1 CATTATGTGCATCCGTAACTACA 23 1
6-2 AACTACATCTTCCACATACACCA 23 2
6-3 TCTGATTATAAAGAGTACATGCGT 24 3
11-1 TATGACACTATGTGCATCTGTG 22 4
11-2 AAATCTGCTACATACACTAATTCAG 25 5
11-3 AGATTATAAGGAATACATGCGCC 23 6
16-1 ATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAA 25 7
16-2 CCATATCTACTTCAGAAACTACATA 25 8
16-3 TAAGGAGTACCTACGACATGG 21 9
18-1 TTAACAATATGTGCTTCTACACAGT 25 10
18-2 TCTCCTGTACCTGGGCAATAT 21 11
18-3 ACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGA 24 12
26-1 AACCTTACCATTAGTACATTATCTG 25 13
26-2 GCATCTGCATCCACTCCATT 20 14
26-3 ATTTATAAGACATGGCGAAGAATAT 25 15
31-1 TAGTACCAATATGTCTGTTTGTG 23 16
31-2 CTGCAATTGCAAACAGTGATAC 22 17
31-3 AAAGAGTATTTAAGACATGGTGAG 24 18
32-1 CTACTGTAACAACTGAAGACAC 22 19
32-2 GACACATACAAGTCTACTAACTTTA 25 20
32-3 GAATATCTACGCCATGCAGA 20 21
33-1 TAATATGACTTTATGCACACAAGTA 25 22
33-2 CAAGTAACTAGTGACAGTACATATA 25 23
33-3* TATAAGACATGTTGAAGAATATG 23 24
34-1 GTAGGTACACAATCCACAAGTA 22 25
34-2 AGTACAACTGCACCATATGCAA 22 26
34-3 CAGTAATTTTAAGGAATACCTCAGA 25 27
35-1 CAAATATGTCTGTGTGTTCTGCT 23 28
35-2 GTCTTCTAGTGACAGTACATATAAA 25 29
35-3 TAAGGAATATTTAAGGCATGGTGAA 25 30
39-1 CTTTACATTATCTACCTCTATAGAG 25 31
39-2 GAGTCTTCCATACCTTCTACAT 22 32
39-3 TTCTAAGTTTAAGGAATATACCAGG 25 33
40-1 TCGTAGCACTAATTTAACCTTATGT 25 34
40-2 CCCACACCAACCCCATATAAT 21 35
40-3 GTAATTTCAAGGAATATTTGCGTCA 25 36
42-1 ATGACTTTGTGTGCCACTGC 20 37
42-2 ACTGCAACATCTGGTGATACAT 22 38
42-3 TACAGCTGCTAATTTTAAGGAATAT 25 39
43-1 CGTTATGTGCCTCTACTGAC 20 40
43-2 CCCAGTACATATGACAATGCAA 22 41
43-3 AGTTTAAGGAATACTTGCGGCA 22 42
명명 서열(5'->3' 서열길이(base) 서열번호
44-1 AATATGTGCTGCCACTACACA 21 43
44-2 CCTCCGTCTACATATACTAGT 21 44
44-3 GAACAATATAAGCAATACATGCGA 24 45
45-1 TGCCTCTACACAAAATCCTGT 21 46
45-2 TCCTGTGCCAAGTACATATGA 21 47
45-3 ATATGACCCTACTAAGTTTAAGC 23 48
51-1 ACTATTAGCACTGCCACTGC 20 49
51-2 TTCCCCAACATTTACTCCAAGT 22 50
51-3 AGCAATATATTAGGCATGGGGA 22 51
52-1 CATGACTTTATGTGCTGAGGTT 22 52
52-2 TGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATA 24 53
52-3 AGGAATACCTTCGTCATGGC 20 54
53-1 ATACAAACATGACTCTTTCCGC 22 55
53-2 CCACACAGTCTATGTCTACATA 22 56
53-3 ACAGTATGTTAGACATGCAGAG 22 57
54-1 CTAACCTAACATTGTGTGCTAC 22 58
54-2 TCCACGCAGGATAGCTTTAATA 22 59
54-3 TTCTGACTTTAGGGAGTATATTAGA 25 60
55-1 ACAATATGTGCTGCTACAACTCA 23 61
55-2 TACAACTCAGTCTCCATCTACA 22 62
55-3 CATCTACAACATATAATAGTACAGA 25 63
56-1 TAGAAGTACTAACATGACTATTAGT 25 64
56-2 AACAGTTAAGTAAATATGATGCACG 25 65
56-3 CGAAAAATTAATCAGTACCTTAGAC 25 66
57-1 AAATGTCTCTTTGTGTGCCACT 22 67
57-2 GTAAACACAGAAACTAATTATAAGG 25 68
57-3 GCCTCCAATTATAAGGAATACC 22 69
58-1 TGACATTATGCACTGAAGTAACTAA 25 70
58-2 CTAAGGAAGGTACATATAAAAATGA 25 71
58-3 TTTTAAGGAATATGTACGTCATGTT 25 72
59-1 TCGCAGCACCAATCTTTCTG 20 73
59-2 TCTACTACTTCTTCTATTCCTAATG 25 74
59-3 TATACACACCTACCAGTTTTAAAGA 25 75
61-1 TAATTTAACCATTTGTACTGCTACA 25 76
61-2 CCTGTATCTGAATATAAAGCCAC 23 77
61-3 CCACAAGCTTTAGGGAATATTTG 23 78
62-1 TTTTACTATTTGTACCGCCTCC 22 79
62-2 AGCAGAATACACGGCTACCA 20 80
62-3 GGGAATTTTTGCGACACACG 20 81
66-1 CAACATGACTATTAATGCAGCTAA 24 82
66-2 AAGCACATTAACTAAATATGATGCC 25 83
66-3 TGAAATCAATCAATACCTTCGCC 23 84
명명 서열(5'->3') 서열길이(base) 서열번호
67-1 CATGACTTTATGTTCTGAGGAAAAA 25 85
67-2 CAGAGGCTACATACAAAAATGAAAA 25 86
67-3 GGAATACCTTAGACATGTGGAA 22 87
68-1 CCAATTTTACTTTGTCTACTACTAC 25 88
68-2 TGAATCAGCTGTACCAAATATTTA 24 89
68-3 TTTAAGGAATATATTAGGCATGTTG 25 90
69-1 CCAACCTCACTATTAGTACTGT 22 91
69-2 CACAATCTGCATCTGCCACT 20 92
69-3 CAGTTTATAAGGCATGGTGAG 21 93
70-1 ATTTTACATTGTCTGCCTGCAC 22 94
70-2 AAACGGCCATACCTGCTGTA 20 95
70-3 AGCCCTACAAAGTTTAAGGAATATA 25 96
72-1 GTAACTATTTGTACTGCCACAG 22 97
72-2 CGTCCTCTGTATCAGAATATAC 22 98
72-3 ATTTTCGTGAGTATCTTCGCCA 22 99
73-1 CACTAATTTTTCTGTATGTGTAGGT 25 100
73-2 TAGCTCTACTACAACGTATGC 21 101
73-3 GTATGCCAACTCTAATTTTAAGGAA 25 102
81-1 CAATTTTACTATTTGCACAGCTACA 25 103
81-2 CTGCAGAATACAAGGCCTCT 20 104
81-3 AGGAATTTCTGCGCCATACA 20 105
82-1 AATTTAACCATTAGCACTGCTGTT 24 106
82-2 CTCCATCTGTTGCACAAACATT 22 107
82-3 GCAAACTTTAAGCAGTACATTAG 23 108
83-1 ATATTACTATTTCAGCTGCTGCT 23 109
83-2 ACACAGGCTAATGAATACACAG 22 110
83-3 TAAGGAATACCTCCGCCACA 20 111
90-1 ATATGACTATTTGTGCCACACAA 23 112
90-2 CTCTGACACATACAAGGCTT 20 113
90-3 AATTTTAAAGAGTACATGCGCCA 23 114
HPV 탐지 및 유전형 분석의 특이도와 민감도를 높이기 위해 고려되어야 할 사항으로서는 프로브와 관련하여 특이도와 민감도를 고려하여 적절한 길이를 선정하고, i) 비교적 좁은 범위의 혼성화된 가닥이 풀어지는 온도(melting temperature range)을 가지며, ii)가급적 2차 구조를 형성하지 않도록 제작하며, iii)적절한 신호강도를 갖는 40 내지 60%의 GC 함량을 설정하고, iv) 교차 혼성화(cross hybridization)를 방지하기 위해 서열의 반복을 최소화하고, v)탐지대상서열 (target 서열)의 선택성을 높이고자 상기 표적 서열을 제외한 영역(non-target서열)과 서열상동성(nucleotide sequence identity)가 높지 않아야 하며 예를 들면 염기서열의 서열동일성이 약 75%이하인 것이 바람직하다. 표적서열과 비표적 서열에 대한 프로브의 염기서열 동일성을 낮추기 위하여, 예를 들면 Cluster W program 사용으로 non-target과의 유사도를 측정하여 75% 미만의 염기서열 동일성을 가지도록 프로브를 설계할 수 있다.
본 발명에 따른 프로브는 높은 특이도와 민감도로 HPV 탐지 및 유전형 분석이 가능하다. 본 발명에 따른 프로브는 바람직하게는 5'-말단에 아민-TTTTTTTTTT를 추가로 포함하여 마이크로 어레이 고정화에 용이하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 프로브는 한 종류의 HPV 유형에 대해 상이한 염기서열을 갖는 3 가지 종류의 프로브를 제공하며, 구체적으로 서열번호 1 내지 114의 염기서열을 갖는 프로브들중에서 1종 이상 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 프로브로 탐지가능한 HPV 유형은 상기 표 1 내지 표 3에 기재하였다.
본 발명에 따른 프로브들중에서, 한 종류의 HPV 유형에 대해 상이한 3가지 종류의 프로브가 제공되며, 한종류의 HPV 유형에 대해 하나의 프로브를 사용하여 탐지할 수도 있으나, 2종 이상을 혼합하여 하나의 점적에 포함시킨 경우 특이도와 민감도를 더욱 높일 수 있으며, 바람직하게는 한 종류의 HPV 유형에 대해 3가지 종류의 프로브를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 프로브로 팀지가능한 HPV 유형으로는 HPV type 6, 11, 16, 18, 26, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 66, 67,68, 69, 70, 72, 73, 81, 82, 83 및 90을 포함한다. 표 1 내지 표 3에는 서열번호 1 내지 114의 114개 프로브가 제시되며, HPV type 6, 11, 16, 18, 26, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 66, 67,68, 69, 70, 72, 73, 81, 82, 83 및 90와 관련하여 하나의 HPV유형에 대해 상이한 3개씩의 프로브가 제시된다. 예를 들면 서열번호 1 내지 3은 동일한 HPV type6의 탐지용 프로브이며, 이들 프로브는 각각 단독으로 사용하거나, 2종 이상 혼합한 세트로 사용될 수도 있다.
본 발명에 따른 추가 구현예에서, 본 발명에 따른 프로브들로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 DNA 칩 및 HPV 탐지 및 유전형 분석 키트를 제공한다. 본 발명의 DNA 칩 또는 진단용 유전형 분석 키트는 서열번호 1 내지 114에 기재된 염기서열을 갖는 프로브중에서 선택된 HPV 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적 일예에서, 상기 DNA 칩은 서로 다른 유형의 HPV를 검출할 수 있는 2이상의 점적을 포함하며, 상기 점적은 한 종류의 HPV 유형에 대해 프로브를 1종 이상, 예를 들면 2종 또는 3종의 프로브 세트를 포함하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 DNA 칩은 하나의 HPV 유형당 상이한 서열을 갖는 탐지 프로브를 2이상, 바람직하게는 3개를 혼합하여 사용함으로써 특이도와 정확도를 높이고 교차혼성화의 오류를 더욱 줄일 수 있는 장점이 있다.
더욱 자세하게는, 상기 DNA칩은, 프로브를 함유하는 하나 이상의 점적(spot)을 포함할 수 있으며, 상기 점적은 동일한 프로브 또는 프로브 세트를 포함하는 점적을 반복하여 다수 개로 설치되어 동일한 반복실험을 하나의 DNA 칩으로 용이하고 간편하게 수행가능 하도록 하거나, 상기 점적은 상이한 프로브 또는 프로브 세트를 포함하는 점적을 다수 개 설치되어 다양한 종류의 HPV 유형을 하나의 DNA 칩으로 간편하게 탐지 및 분석가능 하도록 한다.
상기 DNA 칩에 포함된 점적은 1종 이상의 프로브, 예컨대 2종 이상의 프로브 세트를 포함할 수 있다. 2종 이상의 프로브를 하나의 점적에 포함하는 경우, 이들 프로브간에 상호 혼성화가 일어나거나 한종의 HPV유형의 프로브가 다른 종의 HPV 유형의 시료와 상호 혼성화가 일어나지 않아야 한다. 본 발명에 따른 프로브 서열은 모두 상이한 염기서열을 갖는 것으로서, 상기 바람직하지 않은 혼성화를 최소화하고자 하였다.
또한, 하나의 점적에 포함되는 프로브는 한 종류의 HPV 유형에 대해 프로브를 1종 이상 포함하여 한 종류의 HPV 유형을 탐지할 수도 있고, 상이한 종류의 HPV 유형에 대한 프로브들을 혼합하여 2종 이상의 HPV 유형을 탐지할 수도 있으며, 바람직하게는 하나의 점적은 한 종류의 HPV 유형에 대한 1종 이상의 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 하나의 점적은 한 종류의 HPV 유형에 대한 2종 이상의 프로브 세트를 포함하여 민감도와 특이도를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일례에서, 상기 DNA 칩 또는 진단용 유전형 분석 키트는 본 기술분야 전문가가 용이하게 조합가능한 모든 프로브 서열 세트를 포함하는 DNA 칩도 포함된다. 본 발명에 따른 DNA에 사용되는 HPV 탐지 및 유전형 분석용 프로브는 서로간에 서열이 모두 상이하며, 적정GC함량, Secondary structures가 없음, 반복서열의 최소화, non-target과 75%이하의 염기서열 동일성을 갖는 특성이 있어 이를 이용한 DNA 칩은 특이도와 정확도를 높이고 교차혼성화의 오류를 더욱 줄일 수 있는 장점이 있다.
현재 시판중인 HPV Genotypeing Chip(상표명, 안국바이오진단㈜)의 프로브는 최소23mer, 최대 32mer, 평균 27mer이고, 상기 프로브중 HPV type 11, 16, 31, 45, 52, 54, 55, 62, 66, 및 81등은 헤어핀과 같은 이차 구조를 가지며, HPV type 26, 31, 32, 33, 54, 56, 66, 68 등은 self-annealing 특성을 가지며, 일부 프로브는 75% 이상의 염기서열 유사도를 나타내며, 다수의 반복서열을 포함하는 경우가 있다. 상기 프로브중 HPV type 16 및 31에 대한 이차구조 형성을 설명하는 내용을 도 4에 나타냈으며, 프로브의 반복서열의 정도를 도 5에 나타냈다. 이러한 점들로 인하여 HPV 유형간에 종종 교차 혼성화가 발생하여 HPV 검사결과에 정확성, 특이성이 떨어지고, 민감도가 떨어지는 결과를 가져오게 됐다.
상기 DNA 칩은 프로브의 위치를 알려주는 기준 위치마커(marker)를 추가로 포함할 수도 있다. 상기 위치마커로는 베타-글로빈, 액틴, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 상기 위치마커는 베타-글로빈일 수 있다.
한편, 상기 HPV의 유전형 분석키트에 포함된 DNA 칩의 제조방법은 HPV의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 5'말단 또는 3'말단에 아민 또는 결합된 DNA 프로브를 제작하는 공정; 전기 작제된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시키는 공정; 및, 전기 DNA 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시키는 공정을 포함한다.
이하, 본 발명의 DNA 칩 및 그의 제조방법을 공정별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
제 1공정: 프로브의 제작
HPV의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 5'또는 3'말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 제작한다. 이때, 프로브는 HPV의 DNA의 염기서열, 바람직하게는 HPV의 L1 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합하는 염기서열을 갖도록 설계 및 합성되고, 합성된 염기서열이 고체의 표면에 결합될 수 있도록 염기서열의 5' 또는 3'말단에 아민기를 결합시켜서 프로브를 제작한다.
제 2공정: 프로브의 고정화
전기 제작된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시킨다. 이때, 고체는 특별히 제한되는 것은 아니나, 유리인 것이 바람직하고, 고체 표면의 알데히드는 이 분야에서 알려진 방법, 즉 프로브의 5'또는 3'말단에 결합된 아민 또는 아민과 티미딘이 2-10개 염기가 결합 화합물과 30 내지 40 ?의 온도 조건 그리고 70 내지 100%의 습도조건에서 시프염기반응(Schiffs base reaction)을 수행하여 고체표면에 프로브를 결합시킨다. 이때, 프로브의 농도는 50 내지 300 pmol/l가 가능하고, 가장 바람직하게는 200 pmol/l이다. 또한 상기 고체의 표면에 전체적인 위치 마커 및 하이브리디제이션 반응에 대한 대조군 역할을 하는 베타-글로빈을 부착한다.
제 3공정: DNA 칩의 제조
전기 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시켜서, DNA 칩을 제조한다. 이때, 알데히드의 환원조건이 특별히 제한되는 것은 아니나, NaBH4 등의 환원제를 사용함이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 칩을 포함하는 인유두종바이러스의 유전형 진단키트 및 이를 이용한 인유두종바이러스 감염의 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 칩을, 시료로부터 채취한 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머, 및 전기 DNA칩과 하이브리디제이션되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 인유두종 바이러스의 유전형 분석키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한,
i) 상기 인유두종 바이러스의 유전형 분석키트의 프라이머, 예컨대 서열번호 115 및 120의 프라이머를 사용하여, 검사할 시료로부터 채취한 DNA를 증폭시키는 단계,
ii) 전기 증폭된 DNA를 상기 유전형 분석키트의 DNA칩에 적용하여 증폭된 DNA와 프로브를 하이브리디제이션시키는 단계, 및
iii) 상기 프로브와 하이브리디제이션된 DNA를 상기 HPV의 유전형 분석키트의 표지수단으로 표지하고, 이를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일례에서, 시료 DNA의 증폭은 통상의 PCR 반응으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 두단계 PCR 증폭법 또는 2종 이상의 프라이머를 사용하여 동시에 증폭하는 다중 PCR 증폭법을 수행하거나, 더욱 바람직하게는 2종 이상의 프라이머를 사용하여 두단계로 증폭하는 2단계 다중 PCR 증폭을 수행할 수 있다.
또한 HPV 유전자 증폭을 위한 가장 적합한 조건을 개발한 결과, 증폭방법으로는 두단계 PCR (Two steps PCR) 또는 다중 PCR(mulitiplex PCR)이다.
전변성, 변성, 프라이머 결합, 및 사슬연장단계로 이루어진 PCR반응에서, 종래에는 동일한 반응조건에서 반복수행하는 한단계 PCR반응을 수행하였으나, 두단계 PCR 반응이란 다른 증폭반응, 예컨대 변성단계, 프라이머 결합단계, 또는 사슬연장단계중 하나이상의 단계를 다른 반응조건하에서 일부 반복증폭을 수행하는 것을 말한다.
본 발명에서, HPV 프라이머를 사용한 시료와, 마커인 베타-글로빈 시료를 별개로 증폭하여 분석할 수도 있으나, HPV 프라이머와 베타-글로빈 프라이머를 함께 사용하여 한단계 PCR 증폭을 하거나, 상기와 같이 두단계 PCR 반응을 수행할 수도 있다.
상기 HPV 프라이머 하기 표 4에 기재된 프라이머을 사용하고, 베타-글로빈 프라이머은 표 5에 기재된 프라이머를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일예에서, 상기 HPV 프라이머 및 베타-글로빈 프라이머, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 표지물질, 그리고 Taq 폴리머라제를 포함하고, 경우에 따라 첨가물로 BSA 및 DMSO등을 사용하여 PCR 서머싸이클러에 넣고, 94?에서 5분간 변성(denaturation)후, 94?에서 1분간 변성(denaturation), 45 ~ 50?에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72?에서 20 ~ 30초간 연장(extension) 과정을 5회 반복 후 94?에서 1분간 변성(denaturation), 45 ~ 50?에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72?에서 10 ~ 15초간 연장 과정을 35회 반복한 뒤 72?에서 2분간 더 연장 반응을 하여, 표지분자가 결합된 증폭된 DNA 시료를 수득한다.
이하, 본 발명의 인유두종바이러스의 유전형 진단키트를 이용한 인유두종바이러스 감염의 진단방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
제 1공정: 시료의 수득 및 증폭
검사할 시료를 증폭시켜서 Cy5(Cyanine 5)을 포함하는 증폭시료를 수득한다: 이때, 증폭된 시료가 Cy5을 함유하기 위하여 Cy5-dUTP를 사용한 PCR을 통하여 증폭시료를 수득한다. 증폭을 위한 프라이머 4개를 다음의 표 4에 나타내며, 이들 프라이머는 모든 종류의 HPV 유형의 DNA 를 증폭하는 데 사용될 수 있다.
SEQ ID NO. 서열 (5'->3') 명명
115 TTTGTTACTGTTGT R GATAC Y AC 정방향 HPV
프라이머(HPVF1)
116 TTTGTTACTGTTGTAGATACCAC HPVF2
117 TTTGTTACTGTTGTAGATACTAC HPVF3
118 TTTGTTACTGTTGTGGATACCAC HPVF4
119 TTTGTTACTGTTGTGGATACTAC HPVF5
120 GAAAAATAAACTG Y AAATCA W A Y TC 역방향 HPV
프라이머(HPVR1)
121 GAAAAATAAACTGCAAATCAAACTC HPVR2
122 GAAAAATAAACTGCAAATCAAATTC HPVR3
123 GAAAAATAAACTGCAAATCATACTC HPVR4
124 GAAAAATAAACTGCAAATCATATTC HPVR5
125 GAAAAATAAACTGTAAATCAAACTC HPVR6
126 GAAAAATAAACTGTAAATCAAATTC HPVR7
127 GAAAAATAAACTGTAAATCATACTC HPVR8
128 GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC HPVR9
상기 표 4에서 R(A,G): Y(C,T): W(A,T) 을 의미하며, 이는 본 기술분야의 전문가에게 널리 알려져 있다.
SEQ ID NO. 서열 (5'->3') 명명
129 ATACAAGTCAGGGCAGAG 정방향 베타-글로빈 프라이머(BGF)
130 CTTAAACCTGTCTTGTAACC 방향 베타-글로빈 프라이머(BGR))
제 2공정: 하이브리디제이션 반응
상기 증폭시료를 DNA 칩에 적용하여, 프로브와 하이브리디제이션 반응을 수행한다.
제 3공정: 검출
프로브와 하이브리디제이션된 DNA를 표지수단으로 표지하고, 이를 검출하여, HPV의 감염여부를 판단한다.
표지수단은 Cy5, 비오틴 결합 화합물, Cy3, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 또는 텍사스 레드(Texas red) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 Cy5 및 비오틴-결합 물질이다. 표지물질의 검출수단으로 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner)로 스캔닝하여 읽는다.
따라서, 본 발명의 DNA 칩을 이용한 HPV의 유전형 진단키트를 사용하여, 인유두종바이러스의 감염여부를 진단할 경우, 신속하고 간단하며 정확하게 HPV 감염여부 및 유전형을 검출할 수 있으므로, 자궁경부암의 조기진단, 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것이다.
본 발명은 인유두종 바이러스(HPV)에 감염된 환자의 바이러스의 유전형을 분석하는 상기 고민감도 프로브 및 이를 포함하는 마이크로어레이를 제공하여 민감하게 HPV감염여부를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 감염된 HPV의 유전형을 판별할 수 있으므로, 자궁경부암의 조기진단, 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV16 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV18 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV58 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 시판 HPV 탐지용 DNA칩에 사용되는 프로브중 HPV type 16 및 31에 대한 이차구조 형성을 보여주는 도면이다.
도 5는 시판 HPV 탐지용 DNA칩에 사용되는 프로브의 반복서열을 보여주는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV6 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV11 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV26 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV31 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV32 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV33 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 12는 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV34 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 13은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV35 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 14는 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV40 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 15은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV42 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 16은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV43 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 17은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV44 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 18는 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV45 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 19은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV51 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 20은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV52 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 21는 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV54 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 22는 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV55 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 23는 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV58 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 24은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV59 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 25은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩으로 HPV61 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 26은 본 발명의 일예에 따른 DNA 칩과 종래 시판 DNA 칩을 이용하여 임상 시료를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 프로브의 제조 및 특성확인
1-1: 프로브의 제조
HPV 유전형 검출을 위하여 사용된 각 HPV 유전형에 특이적인 프로브와 베타-글로빈에 특이적인 프로브는 5' 말단에 Amine-TTTTTTTTTT가 포함되도록 제작하였다. 각 프로브의 염기서열은 표 6 내지 표 8과, 서열목록에 나타냈다.
1-2: 프로브 특성분석
하기 표 6 내지 8에 나타낸 프로브에 대해서, melting temperature 및 GC함량을 분석하여 표시하였다. 본 실시예에서 제공하는 프로브는 i) 비교적 좁은 범위의 혼성화된 가닥이 풀어지는 온도(melting temperature range)을 가지며, ii) 2차 구조를 형성하지 않으며, iii)적절한 신호강도를 갖는 40 내지 60%의 GC 함량을 가지고, iv) 교차 혼성화(cross hybridization)를 방지하기 위해 서열의 반복을 최소화하였고, v) 염기서열의 서열동일성이 약 75%이하임을 확인하였습니다.
명명 서열(5'->3') 길이(base) Tm (?) GC 함량 서열번호
6-1 CATTATGTGCATCCGTAACTACA 23 51.7 39 1
6-2 AACTACATCTTCCACATACACCA 23 51.7 39 2
6-3 TCTGATTATAAAGAGTACATGCGT 24 50.6 33 3
11-1 TATGACACTATGTGCATCTGTG 22 51.1 41 4
11-2 AAATCTGCTACATACACTAATTCAG 25 51.1 32 5
11-3 AGATTATAAGGAATACATGCGCC 23 51.7 39 6
16-1 ATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAA 25 54.4 40 7
16-2 CCATATCTACTTCAGAAACTACATA 25 47.8 24 8
16-3 TAAGGAGTACCTACGACATGG 21 52.4 48 9
18-1 TTAACAATATGTGCTTCTACACAGT 25 51.1 32 10
18-2 TCTCCTGTACCTGGGCAATAT 21 52.4 48 11
18-3 ACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGA 24 50.6 33 12
26-1 AACCTTACCATTAGTACATTATCTG 25 51.1 32 13
26-2 GCATCTGCATCCACTCCATT 20 51.8 50 14
26-3* ATTTATAAGACATGGCGAAGAATAT 25 49.5 28 15
31-1 TAGTACCAATATGTCTGTTTGTG 23 49.9 35 16
31-2 CTGCAATTGCAAACAGTGATAC 22 51.1 41 17
31-3 AAAGAGTATTTAAGACATGGTGAG 24 50.6 33 18
32-1 CTACTGTAACAACTGAAGACAC 22 51.1 41 19
32-2 GACACATACAAGTCTACTAACTTTA 25 51.1 32 20
32-3 GAATATCTACGCCATGCAGA 20 49.7 45 21
33-1 TAATATGACTTTATGCACACAAGTA 25 49.5 28 22
33-2 CAAGTAACTAGTGACAGTACATATA 25 51.1 32 23
33-3* TATAAGACATGTTGAAGAATATG 23 46.4 26 24
34-1 GTAGGTACACAATCCACAAGTA 22 51.1 41 25
34-2 AGTACAACTGCACCATATGCAA 22 51.1 41 26
34-3 CAGTAATTTTAAGGAATACCTCAGA 25 51.1 32 27
35-1 CAAATATGTCTGTGTGTTCTGCT 23 51.7 39 28
35-2 GTCTTCTAGTGACAGTACATATAAA 25 51.1 32 29
35-3 TAAGGAATATTTAAGGCATGGTGAA 25 51.1 32 30
39-1 CTTTACATTATCTACCTCTATAGAG 25 51.1 32 31
39-2 GAGTCTTCCATACCTTCTACAT 22 51.1 41 32
39-3 TTCTAAGTTTAAGGAATATACCAGG 25 51.1 32 33
40-1 TCGTAGCACTAATTTAACCTTATGT 25 51.1 32 34
40-2 CCCACACCAACCCCATATAAT 21 52.4 48 35
40-3 GTAATTTCAAGGAATATTTGCGTCA 25 51.1 32 36
42-1 ATGACTTTGTGTGCCACTGC 20 51.8 50 37
42-2 ACTGCAACATCTGGTGATACAT 22 51.1 41 38
42-3 TACAGCTGCTAATTTTAAGGAATAT 25 49.5 28 39
43-1 CGTTATGTGCCTCTACTGAC 20 51.8 50 40
43-2 CCCAGTACATATGACAATGCAA 22 51.1 41 41
43-3 AGTTTAAGGAATACTTGCGGCA 22 51.1 41 42
명명 서열(5'->3') 길이(base) Tm(?) GC 함량 서열번호
44-1 AATATGTGCTGCCACTACACA 21 50.5 43 43
44-2 CCTCCGTCTACATATACTAGT 21 50.5 43 44
44-3 GAACAATATAAGCAATACATGCGA 24 50.6 33 45
45-1 TGCCTCTACACAAAATCCTGT 21 50.5 43 46
45-2 TCCTGTGCCAAGTACATATGA 21 50.5 43 47
45-3 ATATGACCCTACTAAGTTTAAGC 23 49.9 35 48
51-1 ACTATTAGCACTGCCACTGC 20 51.8 50 49
51-2 TTCCCCAACATTTACTCCAAGT 22 51.1 41 50
51-3 AGCAATATATTAGGCATGGGGA 22 51.1 41 51
52-1 CATGACTTTATGTGCTGAGGTT 22 51.1 41 52
52-2 TGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATA 24 50.6 33 53
52-3 AGGAATACCTTCGTCATGGC 20 51.8 50 54
53-1 ATACAAACATGACTCTTTCCGC 22 51.1 41 55
53-2 CCACACAGTCTATGTCTACATA 22 51.1 41 56
53-3 ACAGTATGTTAGACATGCAGAG 22 51.1 41 57
54-1 CTAACCTAACATTGTGTGCTAC 22 51.1 41 58
54-2 TCCACGCAGGATAGCTTTAATA 22 51.1 41 59
54-3 TTCTGACTTTAGGGAGTATATTAGA 25 51.1 32 60
55-1 ACAATATGTGCTGCTACAACTCA 23 51.7 39 61
55-2 TACAACTCAGTCTCCATCTACA 22 51.1 41 62
55-3 CATCTACAACATATAATAGTACAGA 25 49.5 28 63
56-1 TAGAAGTACTAACATGACTATTAGT 25 49.5 28 64
56-2 AACAGTTAAGTAAATATGATGCACG 25 51.1 32 65
56-3 CGAAAAATTAATCAGTACCTTAGAC 25 51.1 32 66
57-1 AAATGTCTCTTTGTGTGCCACT 22 51.1 41 67
57-2 GTAAACACAGAAACTAATTATAAGG 25 49.5 28 68
57-3 GCCTCCAATTATAAGGAATACC 22 51.1 41 69
58-1 TGACATTATGCACTGAAGTAACTAA 25 54.4 40 70
58-2 CTAAGGAAGGTACATATAAAAATGA 25 49.5 28 71
58-3 TTTTAAGGAATATGTACGTCATGTT 25 49.5 28 72
59-1 TCGCAGCACCAATCTTTCTG 20 51.8 50 73
59-2 TCTACTACTTCTTCTATTCCTAATG 25 51.1 32 74
59-3 TATACACACCTACCAGTTTTAAAGA 25 51.1 32 75
61-1 TAATTTAACCATTTGTACTGCTACA 25 49.5 28 76
61-2 CCTGTATCTGAATATAAAGCCAC 23 51.7 39 77
61-3 CCACAAGCTTTAGGGAATATTTG 23 51.7 39 78
62-1 TTTTACTATTTGTACCGCCTCC 22 51.1 41 79
62-2 AGCAGAATACACGGCTACCA 20 51.8 50 80
62-3 GGGAATTTTTGCGACACACG 20 51.8 50 81
66-1 CAACATGACTATTAATGCAGCTAA 24 50.6 33 82
66-2 AAGCACATTAACTAAATATGATGCC 25 51.1 32 83
66-3 TGAAATCAATCAATACCTTCGCC 23 51.7 39 84
명명 서열(5'->3') 길이(base) Tm(?) GC 함량 서열번호
67-1 CATGACTTTATGTTCTGAGGAAAAA 25 51.1 32 85
67-2 CAGAGGCTACATACAAAAATGAAAA 25 51.1 32 86
67-3 GGAATACCTTAGACATGTGGAA 22 51.1 41 87
68-1 CCAATTTTACTTTGTCTACTACTAC 25 51.1 32 88
68-2 TGAATCAGCTGTACCAAATATTTA 24 49.5 28 89
68-3 TTTAAGGAATATATTAGGCATGTTG 25 49.5 28 90
69-1 CCAACCTCACTATTAGTACTGT 22 51.1 41 91
69-2 CACAATCTGCATCTGCCACT 20 51.8 50 92
69-3 CAGTTTATAAGGCATGGTGAG 21 50.5 43 93
70-1 ATTTTACATTGTCTGCCTGCAC 22 51.1 41 94
70-2 AAACGGCCATACCTGCTGTA 20 51.8 50 95
70-3 AGCCCTACAAAGTTTAAGGAATATA 25 51.1 32 96
72-1 GTAACTATTTGTACTGCCACAG 22 51.1 41 97
72-2 CGTCCTCTGTATCAGAATATAC 22 51.1 41 98
72-3 ATTTTCGTGAGTATCTTCGCCA 22 51.1 41 99
73-1 CACTAATTTTTCTGTATGTGTAGGT 25 51.1 32 100
73-2 TAGCTCTACTACAACGTATGC 21 50.5 43 101
73-3 GTATGCCAACTCTAATTTTAAGGAA 25 51.1 32 102
81-1 CAATTTTACTATTTGCACAGCTACA 25 51.1 32 103
81-2 CTGCAGAATACAAGGCCTCT 20 51.8 50 104
81-3 AGGAATTTCTGCGCCATACA 20 49.7 45 105
82-1 AATTTAACCATTAGCACTGCTGTT 24 50.6 33 106
82-2 CTCCATCTGTTGCACAAACATT 22 51.1 41 107
82-3 GCAAACTTTAAGCAGTACATTAG 23 49.9 35 108
83-1 ATATTACTATTTCAGCTGCTGCT 23 49.9 35 109
83-2 ACACAGGCTAATGAATACACAG 22 51.1 41 110
83-3 TAAGGAATACCTCCGCCACA 20 51.8 50 111
90-1 ATATGACTATTTGTGCCACACAA 23 49.9 35 112
90-2 CTCTGACACATACAAGGCTT 20 49.7 45 113
90-3 AATTTTAAAGAGTACATGCGCCA 23 49.9 35 114
실시예 2: DNA 칩의 제조
표 6 내지 표 8에 나타낸 HPV 탐지용 프로브를 각각의 HPV 유전형에 대해서 상이한 서열을 갖는 3개의 프로브를 혼합하여 하나의 점적으로 DNA 칩을 제조하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 각각의 프로브를 3X SSC(0.05 M 소디움 시트레이트, 0.45 M NaCl, pH 7.0)에 200pmol/l가 되도록 용해시키고, 알데히드기가 결합된 슬라이드(silylated slide, CSS-100, CEL, Houston, TX, USA) 표면에 어레이어(OmniGrid 100, Digilab, 미국)를 이용하여 크기 150m, 간격 300m으로 스파팅(spotting)한 다음 37?, 습도 70%이상의 조건에서 4시간 동안 시프염기반응(Schiff base reaction)을 수행하였다. 이어, 0.2%(w/v) 소디움 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액으로 슬라이드를 세척하고, 3차 증류수로 세척한 다음, NaBH4 용액(0.1g NaBH4, 30ml phosphate buffered saline(PBS), 10ml ethanol)에 5분 동안 침지하여 아민이 결합되지 않은 알데히드를 환원시킨 후, 3차 증류수로 세척하고, 건조시켜서 DNA 칩을 제조하였다. 또한 상기 고체의 표면에 전체적인 위치 마커 및 하이브리디제이션 반응에 대한 대조군 역할을 하는 베타-글로빈을 부착하였다.
실시예 3: HPV 시료를 이용한 검증
3-1: HPV 시료의 수득
플라스미드 DNA를 검색시료의 대조군으로 사용하였다. HPV 타입 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 70, 73, 6, 11, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 55, 57, 61, 62, 67, 72, 81, 83, 90의 플라스미드 DNA를 검색시료로서 사용하였다.
아울러, 대한미국 서울시 종로구 연건동 28번지에 소재하는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 구입한 SiHa 세포주(HPV16, KCLB 30035, Human squamous carcinoma, cervix) 및 HeLa 세포주(HPV 18, KCLB 10002, Human adenocarcinoma, cervix) 에서 추출 및 정제된 DNA를 양성 대조군 또는 실험군으로 사용하였다.
전기 선별된 DNA를 주형으로 사용하고, 서열번호 115 및 서열번호 120의 염기서열을 프라이머로 사용하여 PCR를 수행하여 증폭된 시료를 수득하였다. 각종 HPV의 플라스미드 DNA를 주형으로 Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.
실시예 2에서 제조한 DNA 칩에 실시예 3-1에서 수득한 증폭된 시료를 적용하여, 하이브리디제이션 반응을 다음과 같이 수행하였다. 이때, 하이브리디제이션 반응실(Hybridization reaction chamber)로 100 ㎕ 용량의 커버슬립(cover slip, GRACE Bio-Labs, USA, PC4L-1.0)을 사용하였다.
3-2: DNA칩을 이용한 시료검정
HPV DNA의 경우는 10 ㎕의 증폭산물을 반응시료로서 사용하였다. 전기 반응시료에 3N 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 10%(v/v) 첨가하여 실온에서 5분간 변성시키고, 1M Tris-HCl(pH 7.2)을 5%(v/v) 첨가하여 중화시켰다. 그런 후에, 상기 결과물에 3N 염산을 10%(v/v) 첨가한 후, 얼음에서 5분간 방치하였다. 이어서, 하이브리디제이션 용액(6X 식염수-소디움 포스페이트-EDTA 완충액(SSPE, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)와 0.2% 소디움 도데실 설페이트(SDS))을 사용하여 40 ?에서 실릴화된 슬라이드(silylated slide)에 고정된 프로브와 2시간 동안 반응시키고, 3X SSPE로 2분, 1X SSPE로 2분간 DNA 칩을 세척하여 실온에서 공기 건조하거나 스핀 건조기(spin dryer)를 사용하여 건조하였다.
이를 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner, GenePix 4000B, MDS, 미국)를 이용하여 형광신호를 분석하였다(excitation 650 nm, emission 668 nm), 본 실시예에서 얻어진 결과중에서, HPV type 24종에 대해 표 6 내지 표 8에 나타낸 각 유형에 대한 3가지 프로브의 혼합물을 하나의 점적에 포함되도록 하고, 동일한 점적을 각 유형별로 3개씩 제조한 DNA 칩을 활용한 HPV 유형 검정결과를 도 1 내지 도 3 및 도 6 내지 도 25에 나타냈다.
대조군으로서, 안국바이오진단 HPV Genotypeing Chip Kit을 사용하였다. 표준물질로서는 식약처에서 판매하는 HPV 표준물질 세트(ng/㎕)를 사용하였으며, 민감도 부분 확인하고자 표준물질의 농도를 점증적으로 증가시키면서, 각각에 대해 실험하였다. 도 1 내지 도 3 및 도 6 내지 도 25에 나타낸 바와 같이, 표준물질의 농도가 낮을 때 시그널이 강하게 나오면 민감도가 더욱 우수하다고 할 수 있으며, 대조군인 HPV Genotypeing Chip Kit에 비해서, 본원 발명에 따른 프로브를 사용한 DNA칩이 더욱 우수한 민감도를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4: 임상 시료를 이용한 검증
4-1: 검사 시료의 수득
사람의 자궁경부조직(Human cervical swabs)이 HPV에 감염되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 먼저 6명의 여성으로부터 질 Swab을 이용하여 전기 조직에서 DNA를 추출하고, 정제하였다. 전기 정제된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 129 및 130를 갖는 베타-글로빈 프라이머(globin primer)를 이용하여 PCR을 수행하며, 베타-글로빈 유전자가 증폭된 DNA를 선별하여 6개의 검색시료를 제조하였다.
서열번호 129 (BGF): 정방향 프라이머
5'-ATACAAGTCAGGGCAGAG-3'
서열번호 130 (BGR): 역방향 프라이머
5'-CTTAAACCTGTCTTGTAACC-3'
전기 선별된 DNA를 주형으로 사용하고, 서열번호 115 및 서열번호 120의 염기서열을 프라이머로 사용하여 PCR를 수행하여 증폭된 시료를 수득하였다. 1 x PCR 완충용액(50mM KCl, 4mM MgCl2, 10mM Tris-HCl, pH 8.3), 0.1 ㎍의 DNA, 4 mM MgCl2, 각 25 pmol의 프라이머, 40?의 각 dATP, dCTP, dGTP(Pharmacia), 30?의 dTTP(Pharmacia), 0.05 nM의 Cy5-dUTP(NEN, USA) 및 2 유니트 Taq 폴리머라제(TaKaRa, Japan)를 포함하는 50 ㎕의 반응혼합물을 PCR 서머싸이클러(thermocycler, Perkin-Elmer Cetus, CA, USA)에 넣고, 94?에서 5분간 변성(denaturation)후, 94?에서 1분간 변성(denaturation), 50?에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72?에서 30초간 연장(extension)과정을 5회 반복 후 94?에서 1분간 변성(denaturation), 50?에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72?에서 15초간 연장(extension)과정을 35회 반복한 뒤 72 ?에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.
4- 2:DNA칩을 이용한 시료검정
상기 실시예 3-2에서 사용한 플라스미드 DNA의 경우는 10 ㎕의 증폭산물 대신에, 자궁경부조직의 DNA의 경우는 HPV 증폭산물 10 ㎕와 베타-글로빈 증폭산물 5 ㎕의 혼합물을 반응시료로서 사용한 것을 제외하고는 실질적으로 동일한 방법으로 상기 4-1의 6개 임상 검사시료에 대해서 실험을 수행하였다. 그 결과를, 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner, GenePix 4000B, MDS, 미국)를 이용하여 형광신호를 분석하였다(excitation 650 nm, emission 668 nm).
비교예로서 안국바이오진단 HPV Genotypeing Chip Kit를 이용하여 상기 6개 임상 검사시료에 대해서 동일한 시험을 수행하여 결과를 비교하였다.
실험결과를 도 26에 나타냈다. 검사시료 1, 2 및 4번의 경우 본 발명의 DNA칩을 사용시 시그널이 높게 나와 민감도가 좋은 것으로 확인되었다. 또한 1, 2, 4, 및 6번 검체는 58 type의 같은 HPV type이지만 각 사람의 HPV 감염 정도에 따른 시그널의 차이가 있으며, 2번 시료의 경우 감염 정도가 약하나 6번 시료 의 경우 감염 정도가 강함을 알 수 있었다.
<110> LabGenomics Co., Ltd. <120> Probe for detecting human papilloma virus and kit using the same <130> DPP20154352KR <160> 130 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 6-1 for HPV type 6 <400> 1 cattatgtgc atccgtaact aca 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prboe 6-2 for HPV type 6 <400> 2 aactacatct tccacataca cca 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 6-3 for HPV type 6 <400> 3 tctgattata aagagtacat gcgt 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 11-1 for HPV type 11 <400> 4 tatgacacta tgtgcatctg tg 22 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prboe 11-2 for HPV type 11 <400> 5 aaatctgcta catacactaa ttcag 25 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 11-3 for HPV type 11 <400> 6 agattataag gaatacatgc gcc 23 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 16-1 for HPV type 16 <400> 7 atgtgctgcc atatctactt cagaa 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 16-2 for HPV type 16 <400> 8 ccatatctac ttcagaaact acata 25 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 16-3 for HPV type 16 <400> 9 taaggagtac ctacgacatg g 21 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 18-1 <400> 10 ttaacaatat gtgcttctac acagt 25 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 18-2 <400> 11 tctcctgtac ctgggcaata t 21 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 18-3 <400> 12 accaaattta agcagtatag caga 24 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 26-1 <400> 13 aaccttacca ttagtacatt atctg 25 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 26-2 <400> 14 gcatctgcat ccactccatt 20 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 26-3 <400> 15 atttataaga catggcgaag aatat 25 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 31-1 <400> 16 tagtaccaat atgtctgttt gtg 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 31-2 <400> 17 ctgcaattgc aaacagtgat ac 22 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 31-3 <400> 18 aaagagtatt taagacatgg tgag 24 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 32-1 <400> 19 ctactgtaac aactgaagac ac 22 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 32-2 <400> 20 gacacataca agtctactaa cttta 25 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 32-3 <400> 21 gaatatctac gccatgcaga 20 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 33-1 <400> 22 taatatgact ttatgcacac aagta 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 33-2 <400> 23 caagtaacta gtgacagtac atata 25 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 33-3 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Artificial Sequence <220> <223> Probe 39-3 <400> 33 ttctaagttt aaggaatata ccagg 25 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 40-1 <400> 34 tcgtagcact aatttaacct tatgt 25 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 40-2 <400> 35 cccacaccaa ccccatataa t 21 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 40-3 <400> 36 gtaatttcaa ggaatatttg cgtca 25 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 42-1 <400> 37 atgactttgt gtgccactgc 20 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 42-2 <400> 38 actgcaacat ctggtgatac at 22 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 42-3 <400> 39 tacagctgct aattttaagg aatat 25 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 43-1 <400> 40 cgttatgtgc ctctactgac 20 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 43-2 <400> 41 cccagtacat atgacaatgc aa 22 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ttccccaaca tttactccaa gt 22 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 51-3 <400> 51 agcaatatat taggcatggg ga 22 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 52-1 <400> 52 catgacttta tgtgctgagg tt 22 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 52-2 <400> 53 tgaggttaaa aaggaaagca cata 24 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 52-3 <400> 54 aggaatacct tcgtcatggc 20 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 53-1 <400> 55 atacaaacat gactctttcc gc 22 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 53-2 <400> 56 ccacacagtc tatgtctaca ta 22 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 53-3 <400> 57 acagtatgtt agacatgcag ag 22 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 54-1 <400> 58 ctaacctaac attgtgtgct ac 22 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 54-2 <400> 59 tccacgcagg atagctttaa ta 22 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 54-3 <400> 60 ttctgacttt agggagtata ttaga 25 <210> 61 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 55-1 <400> 61 acaatatgtg ctgctacaac tca 23 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 55-2 <400> 62 tacaactcag tctccatcta ca 22 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 55-3 <400> 63 catctacaac atataatagt acaga 25 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 56-1 <400> 64 tagaagtact aacatgacta ttagt 25 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 56-2 <400> 65 aacagttaag taaatatgat gcacg 25 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 56-3 <400> 66 cgaaaaatta atcagtacct tagac 25 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 57-1 <400> 67 aaatgtctct ttgtgtgcca ct 22 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 57-2 <400> 68 gtaaacacag aaactaatta taagg 25 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 57-3 <400> 69 gcctccaatt ataaggaata cc 22 <210> 70 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 58-1 <400> 70 tgacattatg cactgaagta actaa 25 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 58-2 <400> 71 ctaaggaagg tacatataaa aatga 25 <210> 72 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 58-3 <400> 72 ttttaaggaa tatgtacgtc atgtt 25 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 59-1 <400> 73 tcgcagcacc aatctttctg 20 <210> 74 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 59-2 <400> 74 tctactactt cttctattcc taatg 25 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 59-3 <400> 75 tatacacacc taccagtttt aaaga 25 <210> 76 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 61-1 <400> 76 taatttaacc atttgtactg ctaca 25 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 61-2 <400> 77 cctgtatctg aatataaagc cac 23 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 61-3 <400> 78 ccacaagctt tagggaatat ttg 23 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 62-1 <400> 79 ttttactatt tgtaccgcct cc 22 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 62-2 <400> 80 agcagaatac acggctacca 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 62-3 <400> 81 gggaattttt gcgacacacg 20 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 66-1 <400> 82 caacatgact attaatgcag ctaa 24 <210> 83 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 66-2 <400> 83 aagcacatta actaaatatg atgcc 25 <210> 84 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 66-3 <400> 84 tgaaatcaat caataccttc gcc 23 <210> 85 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 67-1 <400> 85 catgacttta tgttctgagg aaaaa 25 <210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 67-2 <400> 86 cagaggctac atacaaaaat gaaaa 25 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 67-3 <400> 87 ggaatacctt agacatgtgg aa 22 <210> 88 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 68-1 <400> 88 ccaattttac tttgtctact actac 25 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 68-2 <400> 89 tgaatcagct gtaccaaata ttta 24 <210> 90 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 68-3 <400> 90 tttaaggaat atattaggca tgttg 25 <210> 91 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 69-1 <400> 91 ccaacctcac tattagtact gt 22 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 69-2 <400> 92 cacaatctgc atctgccact 20 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 69-3 <400> 93 cagtttataa ggcatggtga g 21 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 70-1 <400> 94 attttacatt gtctgcctgc ac 22 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 70-2 <400> 95 aaacggccat acctgctgta 20 <210> 96 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 70-3 <400> 96 agccctacaa agtttaagga atata 25 <210> 97 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 72-1 <400> 97 gtaactattt gtactgccac ag 22 <210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 72-2 <400> 98 cgtcctctgt atcagaatat ac 22 <210> 99 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 72-3 <400> 99 attttcgtga gtatcttcgc ca 22 <210> 100 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 73-1 <400> 100 cactaatttt tctgtatgtg taggt 25 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 73-2 <400> 101 tagctctact acaacgtatg c 21 <210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 73-3 <400> 102 gtatgccaac tctaatttta aggaa 25 <210> 103 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 81-1 <400> 103 caattttact atttgcacag ctaca 25 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 81-2 <400> 104 ctgcagaata caaggcctct 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 81-3 <400> 105 aggaatttct gcgccataca 20 <210> 106 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 82-1 <400> 106 aatttaacca ttagcactgc tgtt 24 <210> 107 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 82-2 <400> 107 ctccatctgt tgcacaaaca tt 22 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 82-3 <400> 108 gcaaacttta agcagtacat tag 23 <210> 109 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 83-1 <400> 109 atattactat ttcagctgct gct 23 <210> 110 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 83-2 <400> 110 acacaggcta atgaatacac ag 22 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 83-3 <400> 111 taaggaatac ctccgccaca 20 <210> 112 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 90-1 <400> 112 atatgactat ttgtgccaca caa 23 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 90-2 <400> 113 ctctgacaca tacaaggctt 20 <210> 114 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 90-3 <400> 114 aattttaaag agtacatgcg cca 23 <210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer HPVF1 for HPV <220> <221> N_region <222> (15) <223> R is A or G <220> <221> N_region <222> (21) <223> Y is C or T <400> 115 tttgttactg ttgtrgatac yac 23 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer HPVF2 for HPV <400> 116 tttgttactg ttgtagatac cac 23 <210> 117 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer HPVF3 for HPV <400> 117 tttgttactg ttgtagatac tac 23 <210> 118 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer HPVF4 for HPV <400> 118 tttgttactg ttgtggatac cac 23 <210> 119 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer HPVF5 for HPV <400> 119 tttgttactg ttgtggatac tac 23 <210> 120 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer HPVR1 for HPV <220> <221> N_region <222> (14) <223> Y is C or T <220> <221> N_region <222> (21) <223> W is A or T <220> <221> N_region <222> (23) <223> Y is C or T <400> 120 gaaaaataaa ctgyaaatca waytc 25 <210> 121 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer HPVR2 for HPV <400> 121 gaaaaataaa ctgcaaatca aactc 25 <210> 122 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer HPVR3 for HPV <400> 122 gaaaaataaa ctgcaaatca aattc 25 <210> 123 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer HPVR4 for HPV <400> 123 gaaaaataaa ctgcaaatca tactc 25 <210> 124 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer HPVR5 for HPV <400> 124 gaaaaataaa ctgcaaatca tattc 25 <210> 125 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer HPVR6 for HPV <400> 125 gaaaaataaa ctgtaaatca aactc 25 <210> 126 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer HPVR7 for HPV <400> 126 gaaaaataaa ctgtaaatca aattc 25 <210> 127 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer HPVR8 for HPV <400> 127 gaaaaataaa ctgtaaatca tactc 25 <210> 128 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer HPVR9 for HPV <400> 128 gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25 <210> 129 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primmer BGF for beta-globin <400> 129 atacaagtca gggcagag 18 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primmer BGR for beta-globin <400> 130 cttaaacctg tcttgtaacc 20

Claims (13)

  1. 서열번호 1 내지 114로 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되며, 인유두종 바이러스(HPV)의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합하는 HPV 탐지용 프로브.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단이, 아민기, 또는 아민기가 말단에 연결되며 2개 내지 10개의 티미딘(T)을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 변형된 것인, 프로브.
  3. 제 1항에 따른 프로브를 포함하는, 인유두종 바이러스(HPV)의 유전형 분석용 DNA 칩.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단이, 아민기, 또는 아민기가 말단에 연결되며 2개 내지 10개의 티미딘(T)을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 변형된 것인, HPV의 유전형 분석용 DNA 칩.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 하나 이상의 점적(spot)을 포함하며, 상기 점적은 서열번호 1 내지 114로 표시된 염기서열 및 이들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 HPV 탐지용 프로브를 함유하는 것인 HPV의 유전형 분석용 DNA 칩.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 DNA 칩은, 동일 유형의 HPV에 대한 2종 이상의 프로브의 세트를 하나의 점적에 포함하는 것인, HPV의 유전형 분석용 DNA 칩.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 DNA 칩은, 각각 상이한 HPV 유형을 탐지하는 2종 이상의 점적을 포함하며, 각각의 점적은 동일 유형의 HPV에 대한 2종 이상의 프로브 세트를 하나의 점적에 포함하는 것인 HPV의 유전형 분석용 DNA 칩,
  8. 제 3 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 프로브의 위치를 알려주는 베타-글로빈, 액틴, 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 기준 마커를 추가로 포함하는 HPV의 유전형 분석용 DNA 칩.
  9. 제3항 내지 제8항중 어느 한항에 따른 인유두종 바이러스(HPV)의 유전형 분석용 DNA 칩,
    시료 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 서열번호 115 및 120으로 표시되는 프라이머쌍, 및
    상기 DNA 칩과 하이브리디제이션되는 증폭된 시료 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 인유두종 바이러스(HPV)의 유전형 분석키트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 표지수단은 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS(5'-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 HPV의 유전형 분석키트.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 프로브의 위치를 알려주는 베타-글로빈, 액틴, 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 기준 마커를 추가로 포함하는 HPV의 유전형 분석키트.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 시료 DNA의 PCR 증폭이, 사슬연장단계가 제 1증폭단계에서는 20-30초간, 제 2 증폭단계에서는 10-15초간 수행되는 두단계 PCR 증폭인, 유전형 분석키트.
  13. 제 5 항에 있어서, 상기 서열번호 115 또는 120에 나타낸 염기서열을 갖는 HPV 증폭용 프라이머와 서열번호 129 또는 130에 나타난 염기서열을 갖는 베타-글로빈 증폭용 프라이머를 동시에 첨가하여 상기 시료 DNA를 PCR 증폭하는 것인 유전형 분석키트.
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CN115161415A (zh) * 2022-08-16 2022-10-11 苏州康唯纳思生物科技有限公司 一种引物和探针的组合及其在hpv分型检测中的应用
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