PT1694870E

PT1694870E - Iniciadores e sondas para a detecção de genótipos de vph genital

Info

Publication number: PT1694870E
Application number: PT04803571T
Authority: PT
Inventors: Kurt Battenfeld; Thomas Glockseisen
Original assignee: Greiner Bio One Gmbh
Priority date: 2003-12-10
Filing date: 2004-12-07
Publication date: 2011-01-05
Also published as: US8399652B2; EP2062983A2; PL1694870T3; EP1694870B1; DE502004011834D1; EP2062984A2; EP2062983A3; EP2062984A3; DK1694870T3; US20080287318A1; ES2353503T3; DE10357677A1; ATE486140T1; EP2062984B1; WO2005056839A3; EP1694870A2; WO2005056839A2

Description

DESCRIÇÃO "INICIADORES E SONDAS PARA A DETECÇÃO DE GENÓTIPOS DE VPH GENITAL" A presente invenção refere-se a métodos para a detecção e/ou para a determinação de genótipos de VPH genital, matrizes de nucleótidos e kits compreendendo oligonucleótidos e moléculas de ácido nucleico, bem como a utilização dos oligonucleótidos e moléculas de ácido nucleico para a amplificação ou para a detecção e/ou para a determinação de genótipos de VPH genital, para o diagnóstico e/ou diagnóstico precoce de doenças, bem como para a preparação de meios para o diagnóstico de doenças.

As infecções com o virus do papiloma patogénico para humanos, muito disseminado na população, fazem parte das doenças virais sexualmente transmissíveis mais frequentes. No entanto, a infecção também pode ocorrer em recém nascidos através do canal do parto. Como consequências de uma doença de VPH surgem maioritariamente erupções cutâneas inofensivas. Até hoje foram comprovados cerca de cem tipos diferentes deste vírus. Os vírus do papiloma são subdivididos em tipos cutâneos, que provocam principalmente lesões no epitélio queratinoso, e tipos da mucosa, que infectam as mucosas em particular. Uma subdivisão adicional sucede com os tipos associados a lesões de tipo benigno (tipos de baixo risco) e os implicados com alterações epiteliais malignas e pré-neoplásicas (tipos de alto risco) . Os tipos de alto risco conhecidos são, por exemplo, os tipos 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 e 1 82. Tipos conhecidos de VPH de baixo risco são, por exemplo, os tipos 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57 e MM8.

Cerca de 25 tipos do vírus do papiloma estão associados como causa com doenças na região genital da mulher. As infecções de vph manifestam-se na região anogenital da mulher, em particular na forma de lesões condilomatosas, displásicas e neoplásicas. Uma vez que 99,7% de todos os carcinomas do cérvix contêm ADN de vírus do papiloma, é entretanto, em geral, aceite que vírus do papiloma humano representam factores de risco inevitáveis para o desenvolvimento desta doença cancerosa. Estudos epidemiológicos, bem como estudos moleculares, mostraram que uma infecção prolongada com tipos de VPH de alto risco, em particular dos tipos de VPH 16 e 18, intervém decisivamente no desenvolvimento do carcinoma do cérvix.

Tanto no caso do cancro do colo do útero, como também no caso de outras doenças cancerosas que estejam associadas epidemiologicamente com vírus do papiloma, por exemplo, formas específicas do cancro da pele, trata-se de doenças evitáveis, caso seja assegurado o diagnóstico precoce e tratamento. Um método fidedigno para o diagnóstico de uma infecção de VPH existente é por conseguinte o pressuposto para uma terapia dirigida.

Em termos de diagnóstico devem-se distinguir três formas da infecção de VPH, nomeadamente as infecções de VPH clínicas, subclínicas e latentes. As alterações epiteliais associadas a VPH do estádio de manifestação subclínico ou clínico da infecção conseguem determinar-se relativamente bem citologicamente. Estádios precoces do carcinoma do cérvix são, por conseguinte, actualmente principalmente determinados pela colheita de células 2 do pórtio ou cérvix uterino, em combinação com a colposcopia. Apesar dos métodos citológicos terem contribuído para que a incidência de carcinomas do cérvix tenha podido ser significativamente diminuída nos últimos anos, não fornecem no entanto quaisquer resultados inteiramente satisfatórios. Não é possível um prognóstico acerca do desenvolvimento subsequente de lesões individuais. Além disso, os métodos citológicos sofrem de um erro de subjectividade relativamente elevado e não são estandardizados.

Uma vez que não é possível uma inoculação e multiplicação em cultura de VPH, a detecção de VPH por técnicas laboratoriais baseia-se, em particular, na determinação de ADN virai ou de proteínas do invólucro. Por meio de coloração imuno-histoquímica podem identificar-se, por exemplo, antigénios específicos de grupo (antigénios da cápside) dos vírus do papiloma. No entanto, devido à sua diminuta sensibilidade, este teste tem apenas uma capacidade conclusiva diminuta. Também as pesquisas serológicas para a detecção de anticorpos específicos de VPH em soro de doentes não têm significado para o diagnóstico, uma vez que mesmo em doentes com carcinoma do cérvix apenas se conseguem detectar anticorpos em 50% de todos os casos.

Os métodos para a detecção de ácidos nucleicos virais em amostras clínicas de tecidos têm uma grande importância no diagnóstico. Neste caso têm particular importância aqueles métodos que possibilitam uma diferenciação entre tipos individuais de uma infecção de VPH de baixo risco e alto risco, uma vez que apenas os tipos de VPH VPH16, VPH18, VPH31, vph33, VPH35, VPH39, VPH45, VPH51, VPH52, VPH56, VPH58, VPH59, VPH6 6, VPH 6 8 e VPH82 estão associados com o desenvolvimento de 3 carcinomas do cérvix in situ, em que possivelmente também o VPH53 é carcinogénico.

Um método conhecido para a detecção de ácidos nucleicos de VPH é o método HCM (Microplaca de Captura de Híbrido) da firma Digene (HC2 hpv DNA-Test), que se baseia num método de hibridação de amplificação de sinal. Como sondas de hibridação são empregues sequências de ARN especificas para VPH. Após incubação das sondas com ADN desnaturado de VPH de tecido infectado, os hibridos de ARN/ADN formados são ligados através de anticorpos específicos à superfície de uma microplaca. A detecção dos hibridos de ARN/ADN efectua-se através de um segundo anticorpo, que está marcado com fosfatase alcalina. Esta enzima pode produzir luz mensurável após adição de substâncias especificas. 0 métodos HCM permite uma diferenciação especifica para subgrupos entre os tipos de baixo risco 6, 11, 42, 43 e 44 e os tipos de alto risco 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59 e 68 e pode por conseguinte ser útil no caso do diagnóstico diferencial de resultados citológicos pouco claros. Uma desvantagem deste método é, no entanto, o facto de não estarem compreendidos alguns tipos de alto risco e de, além disso, ocorrer uma reacção cruzada entre ambos os subgrupos.

Muitos métodos conhecidos do estado da técnica para a detecção de ácidos nucleicos virais, em amostras clinicas de tecido, baseiam-se na amplificação prévia de genes de VPH. Neste caso, o método da PCR demonstrou-se como o método mais sensível. Por meio de métodos deste tipo pode ser detectado um espectro relativamente largo de vírus VPH e subsequentemente também pode sujeitar-se a uma tipagem, em que a tipagem se efectua essencialmente por meio de análise da sequência do produto de amplificação por PCR. A tipagem permite uma caracterização 4 exacta do tipo de VPH, não apenas no caso de infecções individuais mas também no caso de infecções múltiplas ou mistas, e possibilita assim uma análise do potencial oncogénico dos genótipos de VPH detectados que ultrapassa o resultado citológico.

Snijders et al. J. Gen. Virol., 71 (1990), 173 - 181, e

Surentheran et al., J. Clin. Path., 51 (1998), 606 - 610, descrevem métodos de PCR para a detecção de ADN de VPH, em que são empregues pares de iniciadores que se encontram no interior do gene estrutural Ll de VPH. O fragmento do gene amplificado é depois, subsequentemente, sequenciado, para se proceder a uma tipagem dos tipos de VPH detectados. No entanto, é desvantagem em ambos os métodos o facto de o gene Ll ser menos bem conservado do que outras regiões do ADN de VPH. Por conseguinte, por meio dos métodos descritos apenas pode ser abrangido um número limitado de tipos de VPH. Por exemplo, por meio dos iniciadores descritos por Snijder et al. alguns tipos de VPH, como VPH30, VPH39 e VPH51, apenas se detectam com sensibilidade fortemente reduzida. Além disso, no caso da utilização dos iniciadores descritos por Snijder et al., alguns tipos de VPH, como VPH18, produzem bandas adicionais. O documento DE 10009143 Al descreve um método de PCR para a detecção de uma infecção geral de VPH, em particular no entanto, de ADN de VPH na região anogenital, em que são empregues 2 pares de iniciadores que se encontram no interior do gene conservado El de VPH. No entanto, apenas os produtos de amplificação obtidos por utilização de um par de iniciadores podem ser empregues para a tipagem certa, mas não os produtos de amplificação obtidos por utilização do segundo par de iniciadores. Além disso, é desvantajoso que a tipagem se realize 5 na medida em que os produtos de amplificação tenham que ser ou sequenciados ou analisados por meio de electroforese em gel com gradiente de temperatura. Tanto a sequenciação como também a realização de uma electroforese em gel com gradiente de temperatura são métodos laboriosos e dispendiosos. 0 documento WO 03/087829 refere-se a um microarray para a detecção do gene EI de VPH, em particular da sua extremidade 3'. Por outro lado, as sondas da presente invenção compreendem adicionalmente regiões do gene EI de VPH localizadas no lado 5'.

Um desvantagem considerável do teste comercial conhecido para a detecção e para a tipagem de genótipos de VPH consiste, por conseguinte, sobretudo no facto deste detectar apenas um espectro limitado de tipos de VPH, em que estão abrangidos apenas de forma insuficiente, em particular tipos raros de VPH genital, apesar de ser conhecido um potencial oncogénico elevado para alguns destes tipos de vírus. Além disso é desvantajoso que em cada caso, após a amplificação, tenha que ser realizada uma sequenciação demorada e dispendiosa para poder proceder-se a uma tipagem. O problema técnico que está na base da presente invenção consiste na disponibilização de meios e métodos que permitam uma detecção fácil e indubitável ou uma tipagem simples e rápida em particular de genótipos de VPH genital de alto risco e que não apresentem as desvantagens conhecidas do estado da técnica, isto é, que abranjam em particular todos os tipos de VPH dos quais se conhece estarem associados com doenças cancerosas da mulher. A presente invenção soluciona o problema técnico que está na sua base através das reivindicações independentes, em 6 particular pela disponibilização de uma matriz de nucleótidos para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de um vírus do papiloma humano contido numa amostra biológica, em particular por utilização do método de acordo com a invenção para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de vírus VPH, compreendendo um suporte sólido com uma superfície e no mínimo um primeiro oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico ligado à superfície do suporte, que é adequado para a detecção e/ou para a determinação de um genótipo de VPH genital, seleccionado do grupo composto por: a) oligonucleótidos específicos para o genótipo de VPH com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, b) oligonucleótidos que apresentem uma sequência de nucleótidos mutada face a um dos oligonucleótidos de acordo com a), nomeadamente uma delecção ou adição de 1 até 10 nucleótidos ou uma substituição numa das sequência de nucleótidos representadas em a), c) oligonucleótidos que apresentem uma sequência de nucleótidos que ao longo do comprimento total seja complementar à sequência de nucleótidos de um oligonucleótido de acordo com a) ou b), d) moléculas de ácidos nucleicos compreendendo no mínimo uma região que apresente uma das sequências de nucleótidos representadas em a) até c) e uma ou várias regiões adicionais com um comprimento total de no minimo um nucleótido, e 7 e) misturas dos oligonucleótidos de acordo com a) até c) e/ou das moléculas de ácido nucleico de acordo com d).

No contexto da presente invenção entende-se por uma "matriz de nucleótidos" ou um "chip de nucleótidos" um dispositivo que contém uma multiplicidade de diferentes moléculas de ácidos nucleicos ou sequências de nucleótidos, por exemplo moléculas de ADN, moléculas de ARN, moléculas de APN, moléculas de LNA e/ou formas de mistura destas na forma imobilizada, e com a ajuda das quais, por meio de hibridação de ácidos nucleicos, pode ser detectada uma pequena quantidade de um ácido nucleico complementar num liquido de amostra pequeno. Por utilização da matriz de nucleótidos de acordo com a invenção é possível, por um lado, a detecção fácil de vírus do papiloma humano numa amostra biológica, no entanto por outro lado também pode proceder-se a uma diferenciação entre genótipos de VPH genital, em particular a uma diferenciação entre genótipos de alto risco e de baixo risco, bem como a uma tipagem de genótipos individuais de VPH genital.

Por "suporte" da matriz de nucleótidos entende-se, no contexto da presente invenção, um dispositivo que compreende uma placa de suporte com uma superfície na qual pode ser imobilizada ou fixada uma molécula biologicamente activa, por exemplo um ácido nucleico. O suporte da matriz de nucleótidos é utilizado, portanto, para a preparação de uma matriz de nucleótidos, na medida em que moléculas biologicamente activas, em particular ácidos nucleicos ou partes destes, são imobilizados ou fixados à superfície do suporte. As moléculas biologicamente activas estão dispostas neste caso na forma de pontos sobre a superfície do suporte. 8

Por "placa de suporte" do suporte da matriz de nucleótidos entende-se um elemento delgado e plano com, por exemplo, a forma rectangular que é composto em particular por um metal, um óxido metálico, um plástico, uma membrana, vidro, cerâmica, gel, etc. ou um híbrido ou uma combinação destes materiais. No contexto da presente invenção, isto significa que a placa de suporte do suporte é, por exemplo, totalmente composta por um dos materiais anteriormente indicados como exemplo, ou que esta é essencialmente ou totalmente composta por uma combinação destes materiais, ou que substancialmente os contém. A placa de suporte ou a sua superfície consiste neste caso, pelo menos, em cerca de 50%, 60%, de um modo preferido, em cerca de 70%, de um modo preferido, em cerca de 80% e, de um modo mais preferido, em cerca de 100% num dos materiais anteriormente indicados como exemplo ou numa combinação de materiais deste tipo. Na forma de realização preferida, a placa de suporte da matriz de nucleótidos de acordo com a invenção consiste em cerca de 100% em plástico. A superfície do suporte do suporte de acordo com a invenção compreende, de um modo preferido, um material que não é liso, mas áspero, e/ou que não é impermeável, mas permeável, ou consiste neste material ou contém este material. Numa forma de realização preferida da invenção, a superfície do suporte consiste num outro material diferente do da placa de suporte. A superfície pode consistir, por exemplo, num material como a nitrocelulose ou conter este material, enquanto o próprio suporte consiste em plástico, vidro, cerâmica ou num metal. Numa forma de realização preferida adicional da invenção, a superfície do suporte também pode consistir no material utilizado para a preparação da placa de suporte. De um modo 9 preferido, este material apresenta uma superfície áspera e/ou permeável.

Numa forma de realização preferida da invenção, o suporte da matriz de nucleótidos de acordo com a invenção é preparado na forma de placa, por exemplo na forma de um suporte de objectos, ou na forma de placa com concavidades, por exemplo como Chamberslide ou como placa de microtitulação com dimensionamentos de acordo com recomendações da SBS (Society of Biomolecular Screening).

De acordo com a invenção, os primeiros oligonucleótidos ou moléculas de ácido nucleico são em particular os oligonucleótidos com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, dispostos sobre a superfície do suporte, dentro de uma zona de análise definida, na forma de pontos. Além disso, está previsto de acordo com a invenção, que a superfície do suporte apresente no mínimo uma zona de controlo a par da zona de análise. A zona de análise e a zona de controlo podem estar dispostas neste caso em qualquer posição definida sobre a superfície do suporte. A zona de controlo disposta sobre a superfície do suporte compreende, de acordo com a invenção, um controlo para a orientação do suporte, um controlo de amplificação, um controlo de hibridação, um controlo de amostras e/ou um controlo de impressão.

Numa forma de realização da invenção está previsto que o controlo para a orientação do suporte compreenda no mínimo um segundo oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico. 0 segundo oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico está de um modo 10 preferido marcado, de um modo preferido marcado com fluorescência. 0 segundo oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico está disposto de um modo preferido, em no minimo três pontos sobre a superfície do suporte, de modo a que seja possível uma orientação da matriz de nucleótidos.

Numa forma de realização adicional da invenção está previsto que o controlo de amplificação compreenda no mínimo um terceiro oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico. De um modo preferido, o terceiro oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico é adequado como sonda para a detecção de um produto de amplificação, em que o produto de amplificação é obtenível por meio de um método de amplificação por utilização de um ácido nucleico controlo como matriz e um par de iniciadores de acordo com a invenção, isto é, um oligonucleótido com uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 6 como iniciador directo e um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7 como iniciador reverso. Numa forma de realização particularmente preferida está previsto que o ácido nucleico controlo apresente de um modo preferido um comprimento e um teor em GC que corresponda ao comprimento e ao teor de GC do produto de amplificação que seja obtenível por meio do método de amplificação de acordo com a invenção por utilização da região de ácido nucleico, em particular do gene El, de um vírus do papiloma humano genital como matriz, um oligonucleótido com uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 6 como iniciador directo e um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7 como iniciador reverso.

Numa forma de realização preferida adicional da invenção está previsto que o controlo de hibridação compreenda no minimo 11 um quarto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico. De um modo preferido estão dispostos no mínimo dois até dez pontos do quarto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico sobre a superfície do suporte. Está previsto de acordo com a invenção que os pontos individuais do controlo de hibridação apresentem quantidades definidas diferentes do quarto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico. De um modo preferido, o controlo de hibridação compreende pontos com uma série de diluições do quarto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico.

Numa forma de realização preferida adicional da invenção está previsto que o controlo das amostras compreenda no mínimo um quinto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico. 0 quinto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico é, de um modo preferido, adequado como sonda para a detecção de um gene presente em todas as células de um organismo humano. Numa forma de realização preferida, no caso do gene a comprovar por utilização do quinto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico trata-se do gene humano ADATl (adenosina desaminase específica de ARN-t. 1; Gene Bank Accession: NM_012091).

Numa forma de realização preferida adicional da invenção está previsto que o controlo de impressão compreenda no mínimo um sexto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico. 0 sexto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico pode estar disposto na forma de pontos separados sobre a superfície do suporte. No entanto, de um modo preferido em particular, o sexto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico empregue como controlo de impressão está contido em todos os pontos dispostos sobre o suporte da matriz de nucleótidos com excepção dos pontos do quarto oligonucleótido/molécula de ácido nucleico que serve como controlo de hibridação. Isto é, neste aperfeiçoamento, cada 12 ponto do primeiro oligonucleótido/molécula de ácido nucleico que serve para a detecção do genótipo de VPH, cada ponto do segundo oligonucleótido/molécula de ácido nucleico que serve como controlo para a orientação do suporte, cada ponto do terceiro serve como do quinto serve como o sexto serve como o sexto oligonucleótido/molécula de ácido nucleico que controlo de amplificação e cada ponto oligonucleótido/molécula de ácido nucleico que controlo das amostras compreende também oligonucleótido/molécula de ácido nucleico que controlo de impressão. De um modo preferido, oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico é colocado em conjunto com o primeiro, segundo, terceiro ou quinto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico como ponto sobre o suporte da matriz de nucleótidos, num passo de impressão.

Os oligonucleótidos ou moléculas de ácido nucleico fixados sobre a matriz de nucleótidos podem ser formados, de acordo com a invenção, tanto por moléculas de ADN, moléculas de ARN, moléculas de APN, moléculas de LNA ou formas de mistura destas.

Numa forma de realização adicional da invenção está previsto que os primeiros, terceiros, quartos, quintos e sextos oligonucleótidos ou moléculas de ácido nucleico colocados sobre o suporte da matriz de nucleótidos não apresentem qualquer marcação, enquanto o segundo oligonucleótido ou molécula de ácidos nucleico que serve como controlo de orientação apresente uma marcação, de um modo preferido uma marcação de fluorescência.

Numa forma de realização preferida adicional da invenção está previsto que a matriz de nucleótidos apresente um código de barras com base no qual é possível identificar inequivocamente a 13 matriz de nucleótidos de acordo com a invenção e diferenciá-la de outros chips de nucleótidos que apresentem por exemplo a mesma forma e/ou a mesma disposição de pontos ou uma disposição semelhante de pontos como a matriz de nucleótidos de acordo com a invenção, que sejam no entanto empregues para outros fins e que por conseguinte apresentem outras sondas fixadas. 0 código de barras de acordo com a invenção também assegura além disso que, no caso da avaliação baseada em software, seja empregue o software correcto para a análise dos resultados obtidos por utilização da matriz de nucleótidos de acordo com a invenção. Uma vez que as informações relevantes relativamente à matriz de nucleótidos são colocadas directamente sobre o chip de nucleótidos, já não é necessária uma marcação adicional do chip. 0 chip pode ainda assim apresentar uma marcação adicional. Caso esta marcação se perca durante a utilização da matriz de nucleótidos, o código de barras de acordo com a invenção assegura a capacidade de identificação inequívoca do chip. Está previsto de acordo com a invenção que o código de barras seja colocado no chip durante a preparação deste. Evidentemente, o código de barras de acordo com a invenção pode ser empregue não apenas para a matriz de nucleótidos de acordo com a invenção, que serve para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de um vírus do papiloma humano, mas também para outros chips de nucleótidos que sirvam por exemplo para a determinação ou para a detecção de um gene ou produto de gene específico, para a detecção de bactérias específicas, etc.

Está previsto de acordo com a invenção que o código de barras de acordo com a invenção contenha no mínimo informações relativamente ao tipo de aplicação previsto de uma matriz de nucleótidos, por exemplo detecção e/ou determinação do genótipo de vírus do papiloma humano, o número de lote e o número de 14 chip. Evidentemente, o código de barras de acordo com a invenção pode conter ainda informações adicionais.

Está previsto de acordo com a invenção que o tipo de aplicação seja caracterizado por meio de um número único. Por exemplo, a matriz de nucleótidos de acordo com a invenção que é empregue para a detecção e/ou determinação do genótipo de vírus do papiloma humano, pode ser caracterizada através do símbolo "#1". Um chip de nucleótidos que deva ser empregue para a detecção e/ou para a determinação de um tipo específico de bactérias pode ser caracterizado por exemplo através do símbolo "#2". Este símbolo pode ser codificado por meio de um código numérico qualquer, por exemplo por meio de um sistema binário, um sistema decimal, etc. No caso do método de codificação 1 de n, existem n posições em que n é um número inteiro e uma das posições n é positiva. No caso do método de codificação n-ary, existem m posições que podem apresentar n níveis de intensidade. No caso da codificação binária, isto significa que existem dois níveis diferentes de intensidade, de modo que existem m posições, que podem ser ou "1" (sinal positivo) ou "0" (sinal negativo). No caso da codificação decimal, 2 posições podem codificar 100 números diferentes, em que cada posição pode apresentar 10 níveis de intensidade diferentes. A codificação também pode compreender de acordo com a invenção uma matriz de pontos bidimensional, em que é alcançada uma codificação binária em duas dimensões correspondendo a 2A(n*m), em que nem representam as dimensões da matriz. A leitura (read out) do código de barras pode efectuar-se de acordo com a invenção de forma binária ou análoga. No caso de um read out binário é atribuída ao ponto específico uma "presença" ou uma "ausência". Em oposição a um read out binário, no caso do 15 read out análogo, é atribuído um valor numérico a cada ponto. Este valor numérico contém ele próprio informações e pode por exemplo referir-se ao tamanho do ponto ou à intensidade de sinal do ponto.

Além disso, podem obter-se informações adicionais sobre a matriz de nucleótidos pela utilização e/ou combinação de quantidades diferentes de duas ou mais cores sobre a matriz de nucleótidos, em que as duas ou mais cores podem estar contidas em um ou mais pontos.

De acordo com a invenção, está previsto, no caso da utilização da matriz de nucleótidos de acordo com a invenção para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de um vírus do papiloma humano, em que é empregue em particular o produto de amplificação que é obtido por utilização do método de acordo com a invenção para a amplificação de uma região de um vírus do papiloma humano genital, que o produto de amplificação a analisar seja empregue na forma marcada. 0 produto de amplificação empregue pode já ser provido com uma marcação durante a reacção de amplificação, mas também pode ser marcado só após o terminar da reacção de amplificação, portanto antes da análise por meio do microarray de nucleótidos de acordo com a invenção. Uma marcação do produto de amplificação durante a reacção de amplificação pode efectuar-se por exemplo por utilização de iniciadores marcados e/ou nucleótidos marcados. De acordo com a invenção, o produto de amplificação pode ser marcado por exemplo por utilização de corantes de fluorescência como Cy3 ou Cy5, biotina, haptenos, antigénios, grupos químicos, por exemplo por utilização de nucleótidos marcados com aminoalilo ou pela inclusão de um marcador por meio de uma reacção de succinimida com o nucleótido marcado com aminoalilo, 16

etc. A substâncias radioactivas, marcadores enzimáticos, detecção do produto de amplificação marcado após hibridação do produto de amplificação com um oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico complementar à superfície do suporte da matriz de nucleótidos de acordo com a invenção pode efectuar-se por exemplo por utilização de métodos de fluorescência, métodos de quimioluminescência, métodos radiométricos, métodos de densitometria, métodos de fotometria, reacções de precipitação, reacções enzimáticas incluindo reacções de amplificação enzimática, SPR, métodos de elipsometria, medição do índice de refracção, medição da reflectância e métodos análogos.

Numa forma de realização preferida, o controlo de orientação, o controlo de hibridação e o controlo de impressão podem ser detectados por meio de Cy3 no canal de Cy3, enquanto o controlo de amplificação, o controlo de amostras e os genótipos de VPH a detectar podem ser detectados por meio de Cy5 no canal de Cy5. A presente invenção utiliza um oligonucleótido, que pode ser empregue como iniciador directo para a amplificação de uma região de ácido nucleico de um vírus do papiloma humano genital (VPH), e que apresenta a sequência 5'-CAR GCI AAA WWW KTD AAR GAY TGT G-3' ou 5'-CAR GCN AAA WWW KTD AAR GAY TGT G-3' (SEQ ID n° 1), em que Ré=AouG, Wé = TouA, Ké = TouG, Ié = inosina, N é = A, T, G ou C, D é = A, T ou G e Y é = C ou T. 0 oligonucleótido utilizado de acordo com a invenção empregue como iniciador directo é seleccionado de um modo preferido do grupo composto por: 17

a) um oligonucleótido com a sequência 5'-CAR GCI AAA TAT

5' -CAR GCN AAA TAT KTR

KTR AAA GAT TGT G-3' OU AAA GAT TGT G-3' (SEQ ID n° 2), sequência 5'-CAR GCA AAA TAT 0 3), sequência 5' -CAR GCW AAA ATT 0 4), sequência 5'-CAA GCA AAA ATA 0 5) e b) um oligonucleótido com a GTW AAG GAT TGT G-3' (SEQ ID n c) um oligonucleótido com a GTA AAR GAT TGT G-3' (SEQ ID n d) um oligonucleótido com a GTA AAR GAC TGT G-3' (SEQ ID n e) um oligonucleótido com a sequência 5'-CAR GCA AAA TAT GTA AAA GAC TGT G-3' (SEQ ID n° 6), em que R é = A ou G, W é = T ou A, K é = T ou G, lé= inosina e N é = A, T, G ou C. A presente invenção, na forma de realização mais preferida, utiliza como iniciador directo para a amplificação do ácido nucleico de virus do papiloma humano genital uma mistura equimolar dos oligonucleótidos com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 2 até 6.

Além disso é utilizado um oligonucleótido que pode ser empregue como iniciador, em particular como iniciador reverso para a amplificação de uma região de ácido nucleico de um vírus do papiloma humano genital, em que o oligonucleótido apresenta a sequência 5'-ARY GGY TSY ARC CAA AAR TGR CT-3' (SEQ ID n° 7), em que Ré=AouG, Yé=CouTeSé=CouG. 18 A presente invenção também soluciona o problema técnico que está na sua base pela disponibilização de um oligonucleótido que pode ser empregue como sonda para a detecção e/ou para a determinação de genótipos de VPH genital, seleccionado do grupo composto por: 1) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 117 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH6, em particular do genótipo de VPH6b, 2) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 118 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPHll, 3) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 19 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH16, 4) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 119 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH18, 5) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 120 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH31, 6) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 32 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH33, 19 7) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 41 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH35, em particular do genótipo de VPH35h, 8) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 44 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH39, 9) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 48 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH40, 10) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 121 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH42, 11) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 122 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH43, 12) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 123 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH44, 13) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 124 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH45, 14) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 125 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH51, 20 15) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 126 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH52, 16) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 127 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH53, 17) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 128 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH56, 18) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 82 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH58, 19) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 129 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH59, 20) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 130 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH66, 21) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 131 ou 132 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH68, 22) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 133 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH70, 21 23) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 134 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH73, e 24) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 135 para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de VPH82.

Uma forma de realização particularmente preferida tira proveito da utilização de um oligonucleótido que pode ser empregue como sonda para a detecção e/ou para a determinação de genótipos de VPH genital, seleccionado dos oligonucleótidos com uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 19, SEQ ID n° 32, SEQ ID n° 41, SEQ ID n° 44, SEQ ID n° 48, SEQ ID n° 82 ou SEQ ID n° 117 até SEQ ID n° 135.

Os oligonucleótidos empregues de acordo com a invenção, em particular os com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7 permitem, de um modo vantajoso, uma amplificação extremamente especifica de regiões de ácido nucleico no caso de uma multiplicidade de diferentes tipos de VPH humano, em que está previsto em particular de acordo com a invenção que seja amplificada uma região especifica do gene EI de VPH. Em oposição a outras regiões do genoma de VPH, o gene El oferece uma série de vantagens consideráveis como região alvo para a amplificação, e com isso para a detecção de tipos de VPH. 0 genoma de VPH em forma de anel com um tamanho de cerca de 7,9 kB consiste nos genes E6, E7, El, E2, E4, E5, L2, Ll e na "long chain region" (LCR), em que os genes estão ordenados no genoma nesta sequência. No caso de infecções de VPH ocorre com 22 muita frequência uma integração do virus no genoma humano, em que em muitos casos são deletadas partes do genoma do virus. Assim é conhecido que por exemplo em carcinomas, os genes E2, E4, E5 e L2 podem ser pelo menos parcialmente deletados. Os genes E2, E4, E5 e L2 não se consideram por conseguinte como região alvo para a amplificação, uma vez que não é possível uma detecção segura de ADN de VPH numa amostra. Em oposição a isto, é conhecido que no caso da integração do vírus no genoma humano, o El permanece muito frequentemente conservado, em que El é pelo menos muito menos frequentemente deletado do que o gene Ll. Se El permanece no entanto sempre conservado, não está actualmente ainda completamente clarificado. No entanto, o El é amplificado com grande probabilidade também no caso da integração do vírus no genoma humano e pode por conseguinte ser detectado em muitas infecções de VPH. Por conseguinte, por utilização dos iniciadores de oligonucleótidos de acordo com a invenção também podem ser abrangidas em particular infecções persistentes de VPH, em que o risco do desenvolvimento de cancro é muito elevado.

Apesar de também a região LCR e os genes E6 e E7 permanecerem conservados no caso da integração do vírus no genoma humano e não serem deletados, estas regiões do genoma também não são adequadas como região alvo para a amplificação de ADN de VPH, uma vez que as sequências destas regiões podem divergir em parte fortemente nos diferentes tipos de VPH. A utilização destas regiões do genoma como região alvo para a amplificação iria requerer uma multiplicidade de diferentes pares de iniciadores, para abranger todos os tipos de VPH. Também é conhecido do gene Ll que a sua sequência é menos conservada nos tipos individuais de VPH do que outras regiões do genoma de VPH, de modo que não podem ser abrangidos todos os 23 tipos de VPH. Em oposição a isto, o gene El apresenta a vantagem de ser relativamente bem conservado nos diferentes tipos de VPH, de modo que a amplificação do gene El abrange um espectro extremamente amplo de diferentes tipos de VPH. Diferenças mínimas da sequência entre tipos individuais de VPH são compensadas por ser empregue uma mistura equimolar de oligonucleótidos diferentes como iniciador directo, em particular dos oligonucleótidos com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 2 até 6, de modo que por meio de uma única reacção de amplificação seja obtido um produto de amplificação em todos os tipos de VPH e com isso seja possível uma detecção de todos os tipos de VPH. 0 produto de amplificação obtido por utilização dos iniciadores directo e reverso pode depois ser detectado por utilização das sondas de oligonucleótidos de acordo com a invenção. Os oligonucleótidos empregues como sondas de acordo com a invenção permitem, de um modo extremamente vantajoso, a detecção específica de tipos individuais de VPH e por conseguinte uma tipagem dos tipos de VPH numa amostra biológica. Por utilização das sondas de oligonucleótidos de acordo com a invenção podem detectar-se e diferenciar-se mais de vinte tipos patogénicos de VPH genital que ocorrem com muita frequência. Numa forma de realização particularmente preferida da invenção, as sondas de oligonucleótidos estão contidas numa matriz de nucleótidos de acordo com a invenção, de modo que pode ser testada uma multiplicidade de produtos de amplificação em pouco tempo e de maneira fácil e pode proceder-se a uma tipagem dos genótipos de VPH. As matrizes de nucleótidos de acordo com a invenção permitem por conseguinte uma tipagem extremamente eficiente e rápida de vírus do papiloma, enquanto os métodos de 24 tipagem conhecidos do estado da técnica necessitam de análises de sequências ou electroforeses em gel demoradas e dispendiosas.

Também pode estar prevista a utilização dos oligonucleótidos e o emprego dos métodos para a amplificação ou para a detecção e para a tipagem de vírus do papiloma humano em particular naqueles casos em que já antes foi comprovada e detectada uma infecção de VPH. Está previsto, por conseguinte, não empregar os oligonucleótidos e métodos primeiramente para a pesquisa de infecções de vph, mas para a tipagem, isto é, para a detecção e para a determinação de genótipos individuais de VPH. Para a comprovação ou para a detecção da infecção de VPH pode ser empregue um teste usual, por exemplo o teste de captura híbrida da Digene. Com o auxílio do teste de captura híbrida podem diferenciar-se os tipos de baixo risco dos tipos de alto risco. Uma vez que este teste é muito frequentemente empregue para a pesquisa de tipos de alto risco, é de esperar que com este teste estejam abrangidos essencialmente os tipos de alto risco clinicamente relevantes, que depois podem ser tipados por utilização dos oligonucleótidos de acordo com a invenção ou dos métodos de acordo com a invenção.

No contexto da presente invenção, entende-se por um "oligonucleótido" uma molécula isolada e purificada que seja composta por dois até menos de cem nucleótidos. No caso dos oligonucleótidos de acordo com a invenção pode tratar-se de moléculas de ADN, ARN, APN ou LNA, de um modo preferido purificadas e isoladas, ou formas de mistura destas.

No caso de "APN" ("Ácido Nucleico Peptídico" ou "Ácido Nucleico de Poliamida") trata-se de moléculas que não são carregadas negativamente e que actuam de maneira idêntica ao ADN 25 (Nielsen et al., Science, 254 (1991), 1497 - 1500; Nielsen et al., Biochemistry, 26 (1997), 5072 - 5077; Weiler et al., Nuc.

Acids Res., 25 (1997), 2792 - 2799). As sequências APN compreendem uma estrutura de base de poliamida de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina e não possuem quaisquer unidades de glucose e quaisquer grupos fosfato. As diversas bases estão ligadas à estrutura de base através de ligações metileno - carbonilo. As moléculas "LNA" (Ácido Nucleico bloqueado) são caracterizadas por a conformação em anel de furanose estar demarcada por um ligando de metileno, que liga a posição 2'-O com a posição 4'-C. Os LNAs são incorporados como nucleótidos individuais em ácidos nucleicos, como por exemplo o ADN ou ARN. Os oligonucleótidos LNA, como as moléculas de APN, estão igualmente sujeitos às regras de emparelhamento de bases de Watson e Crick e hibridam com oligonucleótidos complementares. Face a moléculas duplex semelhantes que sejam exclusivamente formadas por ADN ou ARN, as moléculas duplex de LNA/ADN ou LNA/ARN mostram estabilidade térmica elevada.

Os oligonucleótidos apresentam sequências de nucleótidos que são parcial ou totalmente complementares a sequências da região do gene EI de genótipos de VPH genital. Está previsto em particular que os oligonucleótidos com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7 sejam complementares a sequências de consenso que estão presentes na região do gene EI de no minimo 29 genótipos de VPH genital, de modo que por utilização destes oligonucleótidos como iniciador directo e/ou reverso é possível uma amplificação da região do gene El de todos estes 29 genótipos de VPH genital. Está igualmente previsto que os oligonucleótidos com as sequências representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135 sejam pelo contrário apenas complementares a sequências 26 respectivamente de um determinado genótipo de VPH genital, mas não apresentem no entanto qualquer complementaridade com as sequências de outros genótipos de VPH genital, de modo a que a utilização de um dos oligonucleótidos empregues de acordo com a invenção com as sequências representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135 possibilite a detecção específica de um genótipo determinado de VPH genital. No contexto da presente invenção, um ácido nucleico é "complementar" a outro ácido nucleico quando pode formar com este uma cadeia dupla ao longo do seu comprimento total ou pelo menos ao longo da maior parte do seu comprimento, em que todos os nucleótidos estejam presentes emparelhados através de ligações por pontes de hidrogénio, de acordo com as regras de Watson e Crick.

Além disso, os oligonucleótidos empregues de acordo com a invenção podem apresentar uma sequência de nucleótidos que esteja mutada face a uma das sequências de nucleótidos de acordo com a invenção representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135, em que os oligonucleótidos são obteníveis por: a) delecção de 1 até 10 nucleótidos numa das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135, b) adição de 1 até 10 nucleótidos numa das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135, e/ou c) substituição de 1 até 3 nucleótidos numa das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135. 27

De um modo preferido de acordo com a invenção, a delecção ou adição dos nucleótidos encontra-se na extremidade 5' e/ou extremidade 3' de uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135. No caso de uma adição é além disso preferido de acordo com a invenção que os nucleótidos adicionais formem uma sequência, em conjunto com uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135, que seja complementar ao longo do seu comprimento total ou pelo menos ao longo da maior parte do seu comprimento às sequências alvo correspondentes na região do gene El. A presente invenção compreende naturalmente também oligonucleótidos que apresentem uma sequência de nucleótidos que seja complementar ao longo do seu comprimento total a uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135 ou a uma das sequências de nucleótidos mutadas de acordo com a invenção, que sejam caracterizados por, face a uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135, apresentarem uma adição e/ou delecção de 1 até 10 nucleótidos e/ou uma substituição de 1 - 3 nucleótidos.

Além disso é empregue um par de iniciadores para a amplificação de uma região de ácido nucleico de um virus do papiloma humano genital, compreendendo um iniciador directo e um iniciador reverso, em que o iniciador directo é seleccionado do grupo composto por: a) um oligonucleótido com uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 6, 28 b) um oligonucleótido que apresente uma sequência de nucleótidos mutada face ao oligonucleótido de acordo com a), isto é com uma adição e/ou substituição de 1 até 10 nucleótidos e/ou uma substituição de 1 até 3 nucleótidos, e c) uma mistura dos oligonucleótidos de acordo com a) e/ou b) e o iniciador reverso é seleccionado do grupo composto por: d) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7, e) um oligonucleótido que apresente uma sequência de nucleótidos mutada face ao oligonucleótido de acordo com d), isto é com uma adição e/ou delecção de 1 até 10 nucleótidos e/ou uma substituição de 1 até 3 nucleótidos, e f) uma mistura dos oligonucleótidos de acordo com d) e e). O par de iniciadores compreende uma mistura equimolar dos oligonucleótidos com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 2 até 6 como iniciador directo e o oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7 como iniciador reverso.

Além disso está previsto que os oligonucleótidos com uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135 empregues de acordo com invenção, uma sequência de nucleótidos mutada destas ou uma sequência de nucleótidos complementar a estas possam ser parte de um 29 oligonucleótido mais longo ou de um polinucleótido. 0 oligonucleótido mais longo ou polinucleótido, que em seguida é também designado como molécula de ácido nucleico, compreende por conseguinte outros nucleótidos e/ou sequências de nucleótidos adicionais, a par de uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ id n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135 empregues de acordo com invenção, uma sequência mutada destas ou uma sequência de nucleótidos complementar a estas. No contexto da presente invenção, entende-se por um "polinucleótido" uma molécula purificada e isolada que seja constituída no mínimo por uma centena de nucleótidos.

Por conseguinte, também é empregue uma molécula de ácido nucleico, de um modo preferido uma molécula de ácido nucleico purificada e isolada, compreendendo no mínimo uma região que apresente uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135 empregues de acordo com a invenção, uma sequência de nucleótidos mutada destas, obtenível por delecção e/ou adição de 1 até 10 nucleótidos e/ou uma substituição de 1 até 3 nucleótidos de uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135 empregues de acordo com a invenção, ou uma sequência de nucleótidos complementar a estas sequências, e uma ou mais regiões adicionais com um comprimento total de no mínimo 1 nucleótido. No caso da molécula de ácido nucleico empregue de acordo com a invenção pode tratar-se de um oligonucleótido mais longo ou de um polinucleótido. Quando a molécula de ácido nucleico empregue de acordo com a invenção está presente como oligonucleótido mais longo, o comprimento total do oligonucleótido mais longo empregue de acordo com a invenção perfaz no máximo 99 nucleótidos. Quando o oligonucleótido mais longo empregue de acordo com a invenção 30 compreende por exemplo uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135 empregues de acordo com a invenção, as regiões adicionais podem por conseguinte apresentar um comprimento total de no minimo 1 nucleótido até no máximo 69 até 72 nucleótidos. Quando o oligonucleótido mais longo empregue de acordo com a invenção compreende uma sequência de nucleótidos que esteja mutada por adição de 1 até 10 nucleótidos face a uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135 empregues de acordo com a invenção, as regiões adicionais podem apresentar um comprimento total de no minimo 1 nucleótido até no máximo 68-71 nucleótidos (no caso da adição de um nucleótido) ou 59-62 nucleótidos (no caso da adição de 10 nucleótidos). 0 comprimento total das regiões adicionais da molécula de ácido nucleico que está presente como oligonucleótido mais longo perfaz em particular 1 até cerca de 60, de um modo preferido 1 até cerca de 50, de um modo preferido em particular 1 até cerca de 40 e de um modo o mais preferido 1 até cerca de 30 nucleótidos. Quando a molécula de ácido nucleico empregue de acordo com a invenção está presente como polinucleótido, o seu comprimento total perfaz no minimo 100 nucleótidos. O comprimento total das regiões adicionais do polinucleótido empregue de acordo com a invenção perfaz, dependendo de se o polinucleótido empregue de acordo com a invenção compreende uma das sequências de nucleótidos representada em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135 empregues de acordo com a invenção ou uma sequência mutada destas, no mínimo cerca de 70 até 80 nucleótidos até cerca de 1000 nucleótidos, de um modo preferido cerca de 70-80 nucleótidos até cerca de 500 nucleótidos, de um modo preferido em particular cerca de 70 - 80 nucleótidos até cerca 31 de 250 nucleótidos, e de um modo o mais preferido cerca de 70-80 nucleótidos até cerca de 100 nucleótidos. A, no minimo, uma região contida na molécula de ácido nucleico empregue de acordo com a invenção e que apresenta uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ id n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135, uma sequência de nucleótidos mutada destas ou uma sequência de nucleótidos complementar a estas pode estar disposta na extremidade 5' e/ou na extremidade 3' da sequência da molécula de ácido nucleico e/ou entre as regiões adicionais.

Numa forma de realização da invenção está previsto que estas regiões adicionais da molécula de ácido nucleico empregue de acordo com a invenção apresentem sequências de nucleótidos que sejam complementares a sequências de um produto de amplificação que seja obtenível por meio de um método de amplificação por utilização de uma região de ácido nucleico de um vírus do papiloma humano genital como matriz e um dos pares de iniciadores empregues de acordo com a invenção. Por exemplo, as regiões adicionais podem compreender várias repetições da região que apresente uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 ou 117 até 135 empregues de acordo com a invenção, uma sequência de nucleótidos mutada destas ou uma sequência de nucleótidos complementar a estas. Também é possível que as repetições desta região sejam separadas respectivamente por espaçadores com um comprimento de no mínimo um nucleótido ou no mínimo um fosfato ou no mínimo um átomo de carbono ou no mínimo um grupo amino.

Numa forma de realização adicional da invenção está previsto que as regiões adicionais das moléculas de ácido 32 nucleico empregues de acordo com a invenção apresentem sequências de nucleótidos que não apresentem qualquer complementaridade com sequências de um produto de amplificação que seja obtenível por meio de um método de amplificação por utilização de uma região de ácido nucleico de um vírus do papiloma humano genital como matriz e um dos pares de iniciadores empregues de acordo com a invenção, e com isso não hibridem com o produto de amplificação. Por exemplo, as regiões adicionais das moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção podem apresentar sequências de nucleótidos poli-A ou poli-T. A presente invenção utiliza igualmente moléculas de ácido nucleico que apresentam uma sequência de nucleótidos que é complementar ao longo do seu comprimento total à sequência de nucleótidos de uma molécula de ácido nucleico empregue de acordo com a invenção. Além disso está previsto de acordo com a invenção que as moléculas de ácido nucleico empregues de acordo com a invenção estejam presentes como moléculas de ADN, moléculas de ARN, moléculas de APN, moléculas de LNA, de um modo preferido purificadas e isoladas, ou como formas de mistura destas. A presente invenção também pode partir de um método para a amplificação de uma região de um ácido nucleico de um vírus do papiloma humano genital presente numa amostra biológica, compreendendo a realização de um método de amplificação de ácido nucleico por utilização de um par de iniciadores compreendendo um iniciador directo e um iniciador reverso, em que o iniciador directo é seleccionado do grupo composto por: 33 a) um oligonucleótido com uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 6, b) um oligonucleótido que apresente uma sequência de nucleótidos mutada face ao oligonucleótido de acordo com a) e c) uma mistura dos oligonucleótidos de acordo com a) e/ou b), e o iniciador reverso é seleccionado do grupo composto por: d) um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7, e) um oligonucleótido que apresente uma sequência de nucleótidos mutada face ao oligonucleótido de acordo com d) e f) uma mistura dos oligonucleótidos de acordo com d) e e).

Por utilização deste método podem ser amplificadas de forma vantajosa regiões específicas de ácido nucleico, em particular uma região do gene conservado EI de uma multiplicidade de vírus do papiloma humano genital. Os produtos de amplificação obtidos neste caso permitem a detecção da presença de um vírus do papiloma ou de vários vírus do papiloma numa amostra biológica, enquanto a falta de um produto de amplificação aponta para que não esteja presente qualquer vírus de vph na amostra analisada. 0 produto de amplificação obtido por utilização deste método de amplificação pode depois ser empregue, por meio das sondas de oligonucleótidos e/ou de polinucleótidos empregues de acordo com 34 a invenção, para a tipagem do vírus do papiloma detectado ou dos vírus do papiloma detectados.

No contexto da presente invenção, entende-se por uma "amostra biológica" uma colheita de tecido ou de mucosa, uma biopsia de um órgão, uma biopsia de tecido, um líquido corporal ou uma secreção corporal. A amostra pode ser recolhida em organismos, órgãos ou tecidos vivos ou mortos. De acordo com a invenção, uma "amostra biológica" também pode ser uma cultura ou um meio de cultura, por exemplo um meio em que foram cultivadas células humanas ou animais. No caso de uma amostra no âmbito da invenção também se pode tratar de uma solução aquosa, emulsão, dispersão ou suspensão, que contenha vírus do papiloma humano isolados e purificados ou componentes destes. Uma amostra biológica pode já ter sido sujeita a passos de purificação, no entanto também pode estar presente impura.

Numa forma de realização preferida da invenção, a amostra biológica é uma colheita do cérvix uterino, uma amostra de tecido fresca do cérvix uterino, uma amostra de tecido fixada do cérvix uterino ou um preparado de corte de uma amostra de tecido do cérvix uterino. Está previsto de acordo com a invenção que no caso da amostra se trate de uma amostra que seja recolhida no contexto de uma análise citológica e/ou de uma colposcopia para a identificação de alterações epiteliais associadas a VPH, do estádio de manifestação subclínica ou clínica de uma infecção de VPH.

Pode estar previsto que, antes da amplificação por utilização dos iniciadores, o ácido nucleico a amplificar possa ser purificado e/ou isolado a partir da amostra biológica. A purificação e isolamento do ácido nucleico a amplificar, isto é, 35 o ADN de VPH a amplificar, pode efectuar-se por utilização dos métodos conhecidos do estado da técnica.

Para a amplificação de ácido nucleico pode ser empregue um método de PCR (reacção de polimerase em cadeia) . No caso do método de PCR trata-se de um método para a multiplicação orientada de um ácido nucleico especifico ou de uma região deste numa mistura de sequências diferentes ou semelhantes. 0 método baseia-se em serem repetidos várias vezes determinados passos de reacção, nomeadamente a desnaturação de uma molécula de ácido nucleico de cadeia dupla a amplificar, aposição de iniciadores na molécula de ácido nucleico de cadeia simples obtida (emparelhamento) e uma síntese de cadeias complementares a partir dos iniciadores apostos (extensão), em que as moléculas de ácido nucleico de cadeia simples servem como matrizes. Num primeiro passo, o ácido nucleico de cadeia dupla a amplificar é por conseguinte desnaturado a uma temperatura adequada, em que são obtidos os ácidos nucleicos de cadeia simples que servem de matrizes. Depois disso efectua-se um abaixamento da temperatura, em que os oligonucleótidos (iniciadores) contidos em excesso na mistura reaccional, cujas sequências são complementares ao início ou ao final dos ácidos nucleicos a amplificar, hibridam com as regiões de ácido nucleico complementares. A uma temperatura que pode corresponder à temperatura de hibridação de cerca de 50 °C até 72 °C, mas que no entanto também pode ser ajustada para o óptimo de 72 °C até 75 °C da ADN polimerase, de um modo preferido termicamente estável, a polimerase sintetiza depois, a partir dos iniciadores, cópias do ácido nucleico de partida na forma de produtos de elongação dos iniciadores, em que o comprimento das cópias é determinado pela distância entre os iniciadores. Obtém-se uma reacção em cadeia, por ser realizado um ciclo que compreende a desnaturação do produto de 36 elongação dos iniciadores da matriz, o tratamento das moléculas de cadeia simples assim produzidas com os mesmos iniciadores, e a formação de produtos de elongação adicionais dos iniciadores. 0 ciclo é repetido até o ácido nucleico alvo a amplificar estar presente numa quantidade desejada. A amplificação de PCR do ADN de VPH a detectar pode ser realizada sob as seguintes condições de temperatura: a) aquecimento para 95 °C, em que a temperatura aumenta em 1 °C por segundo, b) manutenção da temperatura a 95 °C durante 10 minutos, c) realização de 40 ciclos, cada um compreendendo 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C e 1 minuto a 72 °C, d) manutenção da temperatura a 72 °C durante 5 minutos e e) arrefecimento para 4 °C.

Os oligonucleótidos empregues como iniciador directo e iniciador reverso na reacção de amplificação de ácido nucleico podem ser empregues respectivamente numa concentração de 0,5-1 pmole/pL. De um modo preferido em particular é empregue como iniciador directo uma mistura equimolar dos oligonucleótidos com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 2 até 6, em que cada oligonucleótido está presente numa concentração de 0,1 - 0,2 pmole/pL, e como iniciador reverso o oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7 numa concentração de 0,5-1 pmole/pL. Os oligonucleótidos empregues como iniciador 37 directo e reverso podem ser empregues como moléculas de ADN, ARN, APN ou LNA ou formas de mistura destas.

Também pode estar igualmente previsto que o método de amplificação de ácido nucleico seja um método de LCR (reacção em cadeia de ligase), um método nasba ou um método isotérmico. 0 método de LCR baseia-se na realização repetida de dois passos de reacção, em que no primeiro passo é desnaturado um ácido nucleico de cadeia dupla a temperatura elevada. No segundo passo, dois conjuntos de oligonucleótidos complementares adjacentes são hibridados com o ácido nucleico de cadeia simples obtido no primeiro passo e são ligados um ao outro. Os produtos da ligação desta reacção servem como matrizes na repetição do método. Como a PCR, também o método de LCR resulta numa amplificação exponencial dos produtos de ligação.

Através do método de amplificação é amplificada uma região específica do gene EI de VPH. A região de ácido nucleico amplificada pode depois a seguir ser purificada e/ou isolada, para se proceder por exemplo a uma tipagem de VPH. 0 produto de amplificação produzido por um método deste tipo pode ser provido com uma marcação, durante ou após a amplificação, facto pelo qual é possibilitada a detecção posterior do produto de amplificação dos oligonucleótidos empregues como sondas de acordo com a invenção com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135 empregues de acordo com a invenção, sequências de nucleótidos mutadas destas ou sequências de nucleótidos complementares a estas e/ou as moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a invenção. Pode realizar-se uma marcação do produto de amplificação durante a reacção de 38 amplificação por exemplo por utilização de iniciadores marcados e/ou nucleótidos marcados. 0 produto de amplificação pode naturalmente também ser marcado depois da conclusão da reacção de amplificação por utilização de métodos conhecidos do estado da técnica. De acordo com a invenção, o produto de amplificação pode ser marcado por exemplo por utilização de corantes de fluorescência, biotina, haptenos, antigénios, grupos químicos, por exemplo por utilização de nucleótidos marcados com aminoalilo ou pela inclusão de um marcador por meio de uma reacção de succinimida com o nucleótido marcado com aminoalilo, substâncias radioactivas, marcadores enzimáticos, etc. A detecção do produto de amplificação marcado pode efectuar-se por exemplo por utilização de métodos de fluorescência, métodos de quimioluminescência, métodos de densitometria, métodos de fotometria, reacções de precipitação, reacções enzimáticas incluindo reacções de amplificação enzimática, SPR ("ressonância de plasmão de superfície"), métodos de elipsometria, medição do índice de refracção, medição da reflectância e métodos análogos. A presente invenção soluciona o problema técnico que está na sua base também pela disponibilização de um método para a detecção e/ou para a determinação de um genótipo individual de VPH genital, compreendendo a análise de um ácido nucleico de um vírus do papiloma humano genital presente numa amostra biológica, em particular a análise do gene El de VPH ou de uma parte deste, por hibridação com uma matriz de nucleótidos da invenção compreendendo: a) oligonucleótidos específicos para o genótipo de VPH com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, 39 b) oligonucleótidos que apresentem uma sequência de nucleótidos mutada face a um dos oligonucleótidos de acordo com a), nomeadamente uma delecção ou adição de 1 até 10 nucleótidos ou uma substituição de 1 até 3 nucleótidos numa das sequências de nucleótidos representadas em a), c) oligonucleótidos que apresentem uma sequência de nucleótidos que seja complementar ao longo do comprimento total à sequência de nucleótidos de um oligonucleótido de acordo com a) ou b), d) moléculas de ácido nucleico compreendendo no mínimo uma região que apresente uma das sequências de nucleótidos representadas em a) até c) e uma ou várias regiões adicionais com um comprimento total de no mínimo um nucleótido, e e) misturas dos oligonucleótidos de acordo com a) até c) e/ou das moléculas de ácido nucleico de acordo com d) e a detecção da hibridação. 0 método de acordo com a invenção para a detecção e/ou para a determinação de um genótipo individual de VPH genital serve em particular, para a tipagem de genótipos de VPH cuja presença numa amostra biológica já foi seguramente detectada por meio de um outro método. A detecção da presença de uma infecção de VPH pode, por exemplo, ser efectuada por utilização do método de HCM, com o auxílio do qual podem ser distinguidos tipos de alto risco de tipos de baixo risco. 40

Numa forma de realização preferida do método de acordo com a invenção está previsto que o ácido nucleico de VPH presente na amostra biológica seja amplificado antes da hibridação com a/as sonda(s) de oligonucleótido ou ácido nucleico, e que seja obtido um produto de amplificação que, no método de acordo com a invenção para a tipagem, possa ser analisado por meio das sondas de oligonucleótido e/ou ácido nucleico de acordo com a invenção. De um modo preferido em particular, a amplificação do ácido nucleico de VPH efectua-se por utilização do método de amplificação de ácidos nucleicos de VPH, isto é por utilização dos oligonucleótidos com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1, 2, 3, 4, 5 e 6 como iniciador directo e do oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7 como iniciador reverso. De acordo com a invenção está por conseguinte previsto que a amostra biológica, que deverá ser sujeita a uma tipagem de acordo com a invenção, compreenda uma região de ácido nucleico amplificada que tenha sido obtida por meio do método para a amplificação de ácido nucleico de acordo com a invenção.

Naturalmente o método de acordo com a invenção para a detecção e/ou para a determinação, isto é para a tipagem de um genótipo de VPH genital, também pode ser efectuado numa amostra biológica que não foi sujeita a qualquer amplificação de uma região de ácido nucleico de VPH. Numa outra forma de realização da invenção está por conseguinte previsto que a amostra biológica seja uma colheita do cérvix uterino, uma amostra de tecido fresca do cérvix uterino, uma amostra de tecido fixada do cérvix uterino ou um preparado de corte de uma amostra de tecido deste tipo. 41 A hibridação com as sondas de oligonucleótido ou moléculas de ácido nucleico empregues de acordo com a invenção é realizada em condições que são descritas no estado da técnica. De acordo com a invenção está previsto que uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 117, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 117, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indique o genótipo de VPH6, em particular o genótipo de VPH6b.

Uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 118, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 118, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indica, de acordo com a invenção, o genótipo de VPHll.

De acordo com a invenção está previsto que uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 19, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 19, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indique o genótipo de VPH16. 42

De acordo com a invenção está previsto que uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 119, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 119, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indique o genótipo de VPH18. Uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 120, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 120, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indica, de acordo com a invenção, o genótipo de VPH31.

Além disso, está previsto de acordo com a invenção que uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 32, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 32, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indique o genótipo de VPH33.

De acordo com a invenção está previsto que uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 41, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 41, uma sequência de 43 nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indique o genótipo de VPH35, em particular o genótipo de VPH35h.

Além disso, está previsto de acordo com a invenção que uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 44, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 44, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indique o genótipo de VPH39.

Uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 48, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 48, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indica, de acordo com a invenção, o genótipo de VPH40.

Além disso, está previsto de acordo com a invenção que uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 121, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 121, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indique o genótipo de VPH42. 44

Além disso, está previsto de acordo com a invenção que uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 122, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 122, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indique o genótipo de VPH43.

Uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 123, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 123, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indica, de acordo com a invenção, o genótipo de VPH44.

Além disso, está previsto de acordo com a invenção que uma hibridação com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 124, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 124, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indique o genótipo de VPH45.

Uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 125, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 45 125, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indica, de acordo com a invenção, o genótipo de VPH51.

Além disso, está previsto de acordo com a invenção que uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 126, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 126, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indique o genótipo de VPH52.

Uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 127, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 127, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indica, de acordo com a invenção, o genótipo de VPH53.

Uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 128, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 128, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indica, de acordo com a invenção, o genótipo de VPH56. 46

Além disso, está previsto de acordo com a invenção que uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 82, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 82, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indique o genótipo de VPH58.

Uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 129, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 129, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indica, de acordo com a invenção, o genótipo de VPH59.

Uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 130, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 130, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indica, de acordo com a invenção, o genótipo de VPH66.

Uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 131 ou 132, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em 47 SEQ ID n° 131 ou 132, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indica, de acordo com a invenção, o genótipo de VPH68.

Numa forma de realização adicional da invenção está previsto que uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 133, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 133, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indique o genótipo de VPH70.

Uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 134, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 134, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indica, de acordo com a invenção, o genótipo de VPH73.

Uma hibridação com um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 135, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta ou com uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 135, uma sequência de nucleótidos mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, indica, de acordo com a invenção, o genótipo de VPH82. 48 0 oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico empregue como sonda pode estar presente como molécula de ADN, ARN, APN ou LNA ou suas formas de mistura.

Os métodos para a amplificação de regiões de ácido nucleico de virus do papiloma humano e para a detecção e/ou para a determinação de genótipos de VPH genital podem ser empregues em particular para o diagnóstico e/ou para o diagnóstico precoce de doenças que sejam provocadas por virus do papiloma humano genital. Os métodos podem por exemplo ser empregues como parte de um método para o diagnóstico e/ou para o diagnóstico precoce de doenças, em particular de doenças cancerosas, por exemplo cancro do colo do útero. Os métodos podem igualmente ser empregues no âmbito de uma análise para o diagnóstico precoce de doenças cancerosas. Os métodos conduzem a resultados positivos seguros no que respeita a uma infecção de VPH e podem assim servir como ponto de partida para uma terapia dirigida. A presente invenção refere-se igualmente a um kit para a detecção e/ou para a determinação de genótipos de VPH genital, compreendendo no minimo um primeiro recipiente com no mínimo um iniciador para a amplificação de regiões de ácido nucleico de um vírus do papiloma humano genital, nomeadamente regiões do gene El de VPH, e uma matriz de nucleótidos de acordo com a invenção para a detecção e/ou determinação de genótipos de VPH genital, em particular para a detecção de uma região amplificada do gene El de VPH. 0 iniciador a utilizar para a amplificação é seleccionado, de acordo com a invenção, de oligonucleótidos com uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ id n° 1 até 7, oligonucleótidos com uma sequência de nucleótidos que está mutada face a uma das sequências de nucleótidos representada em SEQ ID n° 1 até 7, e dos pares de iniciadores de 49 acordo com a invenção. A matriz de nucleótidos do kit de acordo com a invenção compreende oligonucleótidos com uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, oligonucleótidos com uma sequência de nucleótidos que esteja mutada face a uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, oligonucleótidos com uma sequência de nucleótidos que seja complementar a uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, ou a uma sequência de nucleótidos mutada destas, e/ou moléculas de ácido nucleico que compreendam uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, uma sequência de nucleótidos mutada destas ou uma sequência de nucleótidos complementar a estas.

Numa forma de realização preferida da invenção, o kit de acordo com a invenção compreende no mínimo dois primeiros recipientes, em que um destes recipientes contém quantidades equimolares dos oligonucleótidos com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 2 até 6 e o outro recipiente contém o oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7. Numa forma de realização alternativa, o kit de acordo com a invenção compreende seis primeiros recipientes, em que cinco destes recipientes contêm respectivamente um dos oligonucleótidos com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 2 até 6 e o sexto recipiente contém o oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7. 0 kit de acordo com a invenção pode compreender adicionalmente um recipiente com um ácido nucleico controlo que pode ser amplificado por utilização de um oligonucleótido com 50 uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 6 como iniciador directo e um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7 como iniciador reverso. A presente invenção refere-se igualmente à utilização de um oligonucleótido com uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, um oligonucleótido cuja sequência de nucleótidos esteja mutada face a uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, um oligonucleótido que apresente uma sequência de nucleótidos que seja complementar a uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135 ou a uma sequência mutada destas, uma molécula de ácido nucleico que compreenda uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, uma sequência mutada destas ou uma sequência complementar a estas, ou um par de iniciadores empregue de acordo com a invenção para a preparação de um meio para o diagnóstico de doenças que são provocadas por vírus do papiloma humano genital.

No caso do meio a preparar, pode tratar-se, por exemplo, de um kit de acordo com a invenção ou de uma matriz de nucleótidos de acordo com a invenção. A presente invenção é elucidada com mais detalhe através do protocolo subsequente de sequências, das figuras seguintes e dos exemplos seguintes. 0 protocolo de sequências é parte desta descrição e contém as sequências SEQ ID n° 1 até 135. 51

As SEQ ID n° 1 até SEQ ID n° 6 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas como iniciador directo para a amplificação de regiões do gene El de VPH. Os oligonucleótidos utilizados como iniciador directo com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 2 até 6 são designados em seguida também como Loma 1, Loma 2, Loma 3, Loma 4 ou Loma 5. A SEQ ID n° 7 mostra a sequência de um oligonucleótido que é adequado como iniciador reverso para a amplificação de regiões do gene El de VPH. 0 oligonucleótido utilizado como iniciador reverso com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7 é designado em seguida também como Loma-rev.

As SEQ ID n° 8, 9 (não de acordo com a invenção) e 117 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH6, em particular do genótipo VPH6b.

As SEQ ID n° 10 até SEQ ID n° 17 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 118 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH11.

As SEQ ID n° 18 e SEQ ID n° 20 (não de acordo com a invenção) bem como a SEQ ID n° 19 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH16.

As SEQ ID n° 21 até SEQ ID n° 24 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 119 mostram as sequências de 52 oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH18.

As SEQ ID n° 25 até SEQ ID n° 28 (não de acordo com a invenção) mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH26 .

As SEQ ID n° 29 até SEQ ID n° 31 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 120 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH31.

As SEQ ID n° 33 e SEQ ID n° 34 (não de acordo com invenção) bem como a SEQ ID n° 32 mostram as sequências oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH33. As SEQ ID n° 35 até SEQ ID n° 39 (não de acordo com a invenção) mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH34.

As SEQ ID n° 40 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 41 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH35, em particular o genótipo de VPH35h.

As SEQ ID n° 42, 43, 45 e SEQ ID n° 46 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 44 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH39. 53

As SEQ ID n° 47, 49 e SEQ ID n° 50 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 48 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH40.

As SEQ ID n° 51, SEQ ID n° 52 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 121 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH42. A SEQ ID n° 122 mostra a sequência de um oligonucleótido que é adequada para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH43.

As SEQ ID n° 53 até SEQ ID n° 55 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 123 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH44.

As SEQ ID n° 56 até SEQ ID n° 61 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 124 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH45.

As SEQ ID n° 62 até SEQ ID n° 64 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 125 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH51.

As SEQ ID n° 65 até SEQ ID n° 67 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 126 mostram as sequências de 54 oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH52.

As SEQ ID n° 68 até SEQ ID n° 73 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 127 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH53.

As SEQ ID n° 74 até SEQ ID n° 77 (não de acordo com a invenção) mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH54.

As SEQ ID n° 78 até SEQ ID n° 81 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 128 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH56.

As SEQ ID n° 83 até SEQ ID n° 86 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 82 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH58.

As SEQ ID n° 87 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 129 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH59.

As SEQ ID n° 88 até SEQ ID n° 94 (não de acordo com a invenção) mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH61. 55

As SEQ ID n° 95 até SEQ ID n° 97 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 130 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH66. As SEQ ID n° 98 até SEQ ID n° 102 (não de acordo com a invenção) mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH67.

As SEQ ID n° 103 até SEQ ID n° 105 (não de acordo com a invenção), SEQ ID n° 131 e SEQ ID n° 132 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH68.

As SEQ ID n° 106 até SEQ ID n° 108 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 133 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH70.

As SEQ ID n° 109 até SEQ ID n° 112 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 134 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH73.

As SEQ ID n° 113 até SEQ ID n° 116 (não de acordo com a invenção) e SEQ ID n° 135 mostram as sequências de oligonucleótidos que são adequadas para a detecção e para a determinação do genótipo de VPH82. A figura 1 mostra os resultados de uma electroforese em gel de acrilamida (não desnaturante) de produtos de amplificação que foram obtidos por utilização dos iniciadores e do ADN de diferentes virus do papiloma como matrizes. Como iniciador 56 directo foi empregue uma mistura equimolar dos iniciadores Loma 1, Loma 2, Loma 3, Loma 4 e Loma 5 (que correspondem aos oligonucleótidos com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 2 até 6). Como iniciador reverso foi empregue o iniciador Loma-rev (corresponde ao oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7) . Como matrizes foram empregues plasmideos que continham a totalidade do genoma de VPH6, VPH16, VPH58, VPH59 ou VPH82. Como controlo negativo foi empregue ADN humano.

Figura IA: padrão de tamanhos de ácido nucleico (pista de corrida 1), produto de amplificação por utilização de ADN de VPH6 (pista de corrida 2), produto de amplificação por utilização de ADN de VPH16 (pista de corrida 3),

Figura 1B: produto de amplificação por utilização de ADN de VPH58 (pista de corrida 4), produto de amplificação por utilização de ADN de VPH59 (pista de corrida 5), produto de amplificação por utilização de ADN de VPH82 (pista de corrida 6), produto de amplificação por utilização de ADN humano (pista de corrida 7; controlo negativo), padrão de tamanhos de ácido nucleico (pista de corrida 8). A figura 2 mostra os resultados de uma electroforese em gel de acrilamida (não desnaturante) de produtos de amplificação que foram obtidos por utilização de ADN de VPH16 ou de VPH18 como matrizes. Foram empregues como iniciadores de acordo com a invenção a combinação de iniciadores Loma 1 - 5/Loma-rev (combinação 1), a combinação de iniciadores Loma 1 - 5/P2 (SEQ ID n° 2 do documento DE 10009143 Al) (combinação 2), a combinação de iniciadores Loma 1 - 5/P3 (SEQ ID n° 3 do documento DE 10009143 Al) (combinação 3), a combinação de 57 iniciadores Pl (SEQ ID n° 1 do documento DE 10009143 Al)/Loma-rev (combinação 4), a combinação de iniciadores P1/P2 (combinação 5) e a combinação de iniciadores P1/P3 (combinação 6). M = padrão de tamanhos de ADN (marcador de 123 pb), 1 = combinação de iniciadores 1, 2 = combinação de iniciadores 2, 3 combinação de iniciadores 3, 4 combinação de iniciadores 4, 5 = combinação de iniciadores 5, 6 = combinação de iniciadores 6. A figura 3 mostra os resultados de uma electroforese em gel de acrilamida (não desnaturante) de produtos de amplificação que foram obtidos por utilização de amostras de doentes. Foram empregues como iniciadores as combinações de iniciadores 1 (Loma 1 - 5/Loma-rev) e 6 (P1/P3). A = amostra de doente que foi classificada como positiva para VPH16 por meio de hibridação in situ, B = amostra de doente que foi classificada como positiva para VPH73 por meio de hibridação in situ, C = amostra de doente que foi classificada como negativa por meio de hibridação in situ, D = amostra de doente que foi classificada como positiva para VPH33 por meio de hibridação in situ. Nas pistas de corrida exterior à esquerda e exterior à direita está aplicado respectivamente um padrão de tamanhos de ADN (marcador de 123 pb) . A figura 4A mostra o design de uma matriz de nucleótidos ou de um chip de nucleótidos de acordo com a invenção, em que sobre a superfície do suporte de microarray estão dispostos um controlo para a orientação do suporte do microarray (OC), um controlo de hibridação (HC), um controlo de PCR (AC), um controlo de amostras (controlo de amostras, SC), bem como sondas para a tipagem de genótipos de VPH. O microarray apresenta além disso pontos para a codificação do chip. O controlo de 58 hibridação e o controlo de PCR podem ser preparados respectivamente como séries de diluição dos oligonucleótidos correspondentes. Os números indicam as designações dos tipos de VPH para os quais a respectiva sonda é especifica. Adicionalmente está colocado um controlo de impressão em todos os pontos excepto no controlo de orientação e no controlo de hibridação. A figura 4b mostra uma hibridação efectuada concretamente efectuada para VPH42. Os OC, HC e controlos de impressão são detectados por luz fluorescente após excitação com luz do comprimento de onda de 532 nm. Os AC, SC e os sinais específicos de HPC são detectados por luz fluorescente após excitação com luz do comprimento de onda de 635 nm.

Exemplo de referência 1

Amplificação de ADN de VPH por utilização dos iniciadores Loma/Loma-rev empregues de acordo com a invenção

Para a amplificação foram utilizados plasmideos com os genomas de VPH6, VPH16, VPH58, VPH59 e VPH82 como matrizes (molde;. Estes plasmideos contêm a totalidade do genoma do tipo de VPH correspondente. Como controlo negativo foi utilizado ADN humano. A tabela 1 mostra a relação da mistura reaccional e a concentração dos iniciadores empregues. 59

Tabela 1

Solução pL Concentração final h20 12,6 10 x tampão de PCR (para AmpliTaq Gold; sem MgCl2 2 lx MgCl2 a 25 mM 2 2, 5 mM dNTP a 25 mM (f.c.: 0,25 mM) 0,2 0,25 mM Mistura Loma com 4 pmole/pL de cada um dos iniciadores Lomal - Loma5 1 0,2 pmole/pL de cada um dos 5 iniciadores Loma 20 pmole/pL de Loma-rev marcado com Cy5 1 1 pmole/pL 5 U/pL Ampli Taq Gold 0,2 0,05 U/pL ADN molde (plasmideo de VPH) 1 Soma 20 A PCR foi realizada sob as seguintes condições de temperatura. Em primeiro lugar a mistura reaccional foi levada para uma temperatura de 95 °C, em que a temperatura foi aumentada com uma velocidade de 1 °C/seg. A temperatura da mistura reaccional foi mantida 10 minutos a 95 °C. Depois disso a mistura reaccional foi sujeita às seguintes condições de temperatura: por ciclo, 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C e 1 minuto a 72 °C. Na totalidade foram realizados 40 ciclos. Após realização dos 40 ciclos, a temperatura da mistura reaccional foi mantida 5 minutos a 72 °C e depois foi arrefecida para 4 °C.

Respectivamente 2 pL dos produtos de PCR obtidos foram separados num gel de acrilamida não desnaturante e foram tornados visiveis por meio de coloração com prata. Os resultados estão representados nas figuras IA e 1B. As diferenças nas sequências entre os diferentes tipos de VPH conduzem a um comportamento de corrida distinto no gel não desnaturante. Como 60 é visível a partir da figura 1, no controlo de ADN como controlo negativo não foi obtido qualquer produto de PCR.

Exemplo de referência 2

Amplificação por PCR sob utilização dos iniciadores empregues de acordo com a invenção em comparação com a amplificação por PCR por utilização de iniciadores conhecidos do estado da técnica

Nesta experiência deverá ser determinada a adequação dos iniciadores directo e reverso no caso da amplificação de regiões de ácido nucleico de vírus de VPH genital em comparação com a amplificação por PCR por utilização de pares de iniciadores conhecidos do estado da técnica.

No documento DE 10009143 Al são descritos dois sistemas de iniciadores de PCR. Estes sistemas de iniciadores compreendem ou o iniciador com a SEQ ID n° 1 (em seguida também designado como Pl) e com a SEQ ID n° 2 (em seguida também designado como P2), ou os iniciadores com SEQ ID n° 1 e SEQ ID n° 3 (em seguida também designado como P3) . Uma vez que apenas é adequado para a tipagem de vírus do papiloma o sistema de PCR com os iniciadores Pl e P3, este representa a base de comparação determinante para o sistema de iniciadores Loma/Loma-rev. Devido à posição dos iniciadores no genoma de VPH, tanto o iniciador Pl como também a mistura equimolar de iniciadores de acordo com a invenção, compreendendo os iniciadores Lomal, Loma2, Loma3, Loma4 e Loma5, podem ser combinados com cada um dos iniciadores P2, P3 e Loma-rev para a obtenção de um produto de PCR. Na experiência foram testadas todas as seis combinações de iniciadores 61 possíveis. As combinações de iniciadores utilizadas estão representadas na tabela 2.

Como moldes de ADN foram empregues o plasmídeo de VPH16 com o genoma do tipo VPH16, bem como ADN de VPH18 que tinha sido extraído de células HeLa. As concentrações dos moldes respectivos foram ajustadas em experiências prévias de modo a que chegassem à proximidade do limite da capacidade de amplificação com o sistema de iniciadores Loma/Loma-rev mas que ainda produzissem um claro produto de amplificação por PCR. A PCR foi realizada sob as seguintes condições de temperatura: rampa: 1 °C/seg, manutenção da temperatura a 95 °C durante 10 minutos, 40 ciclos com, respectivamente, 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C, 1 minuto a 72 °C, depois disso 5 minutos de manutenção da temperatura a 72 °C e arrefecimento para 4 °C.

Tabela 2

Combinação de iniciadores Iniciador directo Iniciador reverso 1 Loma 1-5 Loma-rev 2 Loma 1-5 SEQ ID n° 2 do documento DE 10009143 (P2) 3 Loma 1-5 SEQ ID n° 3 do documento DE 10009143 (P3) 4 SEQ ID n° 1 do documento DE 10009143 (Pl) Loma-rev 5 SEQ ID n° 1 do documento DE 10009143 (Pl) SEQ ID n° 2 do documento DE 10009143 (P2) 6 SEQ ID n° 1 do documento DE 10009143 (Pl) SEQ ID n° 3 do documento DE 10009143 (P3)

Os resultados obtidos com as combinações de iniciadores anteriores estão representados na figura 2. A combinação de 62 iniciadores 1 produziu um produto de PCR tanto na amplificação do ADN de VPH16, como também na amplificação do ADN de VPHl8. A combinação de iniciadores 2 não produziu qualquer produto de PCR detectável no caso do ADN de VPHl6. A combinação de iniciadores 3 produziu um produto de PCR em ambos os moldes de ácido nucleico testados. As combinações de iniciadores 4 até 6 não produziram qualquer produto de PCR na diluição seleccionada do ADN de VPH16 e no caso do ADN de VPH18 produziram uma quantidade de produto de amplificação claramente menor do que as combinações de iniciadores 1 até 3.

Exemplo de referência 3

Amplificação de moldes de VPH a partir de amostras de doentes

Por utilização de extractos de ADN de quatro amostras de doentes (cortes de parafina de amostras cervicais) foram realizadas reacções de PCR com as combinações de iniciadores 1 e 6 (conferir tabela 2). Estas amostras tinham sido anteriormente examinadas quanto a infecções de VPH por meio de hibridação in situ. Os resultados estão representados na tabela 3 e figura 3.

Tabela 3

Amostra do doente Resultado da hibridação in situ Resultado de PCR Loma 1-5/Loma-rev Resultado de PCR SEQ ID n° 1 (Pl)/ SEQ ID n° 3 (P3) A VPH 16 + + B VPH 7 3 + - c Negativo + + D VPH 3 3 + - 63 A partir dos resultados é perceptível que, no caso da amostra C, ambas as reacções de PCR são mais sensíveis do que a hibridação, uma vez que esta amostra foi positiva no caso de ambos os pares de iniciadores. As amostras B e D apenas são positivas com os iniciadores de acordo com a invenção Loma/Loma-rev, não o são no entanto com a combinação de iniciadores P1/P3 conhecida do estado da técnica.

Exemplo 4

Hibridação de um produto de amplificação dos iniciadores Loma numa matriz de nucleótidos de acordo com a invenção

Para a amplificação foi empregue como molde um plasmídeo com uma parte do genoma de VPH42, misturado com ADN humano e com um plasmídeo que contém uma construção sintética de ADN com uma secção curta do genoma do fago lambda flanqueada por locais de ligação para o iniciador de acordo com SEQ ID n° 4 e SEQ ID n° 7. A sonda do controlo de amplificação na matriz de nucleótidos é específica para esta secção do genoma do fago lambda.

Na mistura de PCR foram também utilizados, além dos iniciadores Loma, iniciadores para a amplificação de uma secção do gene humano ADATl.

Um dos iniciadores para a amplificação do gene humano ADATl e o iniciador de acordo com SEQ ID n° 6 estão marcados com o corante de fluorescência Cy5.

Após amplificação de ADN bem sucedida, 5 pL do produto de PCR foram misturados com 30 pL de tampão de hibridação (0,5% de lauril sarcosina, NaCl a 0,225 M, citrato de sódio a 0,0225 M, 20 nm de um oligonucleótido marcado com Cy3, que é complementar ao controlo de hibridação e controlo de impressão na matriz de nucleótidos) . A mistura foi desnaturada 3 min a 95 °C, arrefecida em água gelada e hibridada sobre a matriz de nucleótidos durante 10 min a 50 °C. A matriz de nucleótidos foi lavada 3 x durante, respectivamente, 20 segundos a 50 °C em tampão de lavagem (0,2% de dodecilsulfato de sódio, NaCl a 0,3 M, citrato de sódio a 0,03 M, pH 7). Num dispositivo de digitalização de imagem de microarrays comercialmente corrente a matriz de nucleótidos foi digitalizada por excitação com luz de um comprimento de onda de 532 nm e 635 nm. O resultado é mostrado na figura 4b. A figura 4a mostra a posição das sondas sobre a matriz de nucleótidos utilizada. PROTOCOLO DE SEQUÊNCIAS <110> Greiner Bio-One <120> Sondas para a detecção de genótipos de VPH genital <130> 25974 <140> <141> <16 0> 135 <170> Patentln Ver. 2.1 65 < 210 > 1 <211 > 25 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano < 4 0 0 > 1 cargcnaaaw wwktdaarga ytgtg 25 < 210 > 2 <211 > 25 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano < 4 0 0 > 2 cargcnaaat atktraaaga ttgtg 25 < 210 > 3 <211 > 25 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano < 4 0 0 > 3 cargcaaaat atgtwaagga ttgtg 25 <210> 4 <211> 25 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 4 cargcwaaaa ttgtaaarga ttgtg 25 66 5 < 210 > <211> 25

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 5 caagcaaaaa tagtaaarga ctgtg 25 <210> 6 <211> 25

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 6 cargcaaaat atgtaaaaga ctgtg 25 <210> 7 <211> 23

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 7 aryggytsya rccaaaartg rct 23 <210> 8 <211> 30

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 8 aagctttcta ggaggtacag ttattagtca 30 67 9 < 210 > <211> 30

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 9 ataaaacata ggggttctaa aatagaaggc 30 <210> 10 <211> 30

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 10 actaaagttg acagtgtagg taactggaag 30 <210> 11 <211> 30

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 11 ttaaacaatg gattaagtat aggggtacta 30 <210> 12 <211> 30

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 68 < 4 0 0 > 12 aaaagatgtc tattaaacaa tggattaagt 30 <210> 13 <211> 29 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 13 gggtact aaa gttgacagtg taggtaact 29 <210> 14 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 14 gggaac agtt attagttatg ttaattcctg 30 <210> 15 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 15 aattgt atag ccattgtagg gccacctgac 30 <210> 16 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 69 < 4 0 0 > 16 gggccacctg acactgggaa gtcgtgcttt 30 <210> 17 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 17 gggccacctg acactgggaa gtcgtgcttt 30 <210> 18 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 18 tgatggaggt gattggaagc aaattgttat 30 <210> 19 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 19 tgaaatttct gcaagggtct gtaatatgtt 30 <210> 20 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 70 < 4 Ο Ο > 20

atggaggtga ttggaagcaa attgttatgt 30 <210> 21 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 21 gaccaatagt gcaattcctg cgataccaac 30 <210> 22 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 22 caaacattat aggcgagccc aaaaacgaca 30 <210> 23 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 23 tcctgcgata ccaacaaata gagtttataa 30 <210> 24 <211> 28 <212> ADN 71 <213> Vírus do papiloma humano <400> 24 ctgcgatacc aacaaataga gtttataa 28 <210> 25 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 25 agaaacgatc tatgtgtatg tcacaatggc 30 <210> 26 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 26 agaagagggc gggtcgtgga aggaaattgc : <210> 27 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 30 <400> 27 ggcgggtcgt ggaaggaaat tgccaaattt 30 72 < 210 > 28 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 28 gcacagaaac : gatctatgtg tatgtcacaa 30 <210> 29 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 29 gtagatgtga caaagttagt gacgaaggtg 30 <210> 30 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 30 tgagccttat tagcttttta caaggatgta 30 <210> 31 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 31 caaagttagt gacgaaggtg actggaggga 30 73 < 210 > 32 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <40 0> 32 acagttttta aaagggtgtg ttatatcatg 30 <210> 33 <211> 30 <212> ADN < 213 > Vírus do papiloma humano <40 0> 33 gggtgtgtta tatcatgtgt aaattctaaa 30 <210> 34 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <40 0> 34 aaagggtgtg ttatatcatg tgtaaattct 30 <210> 35 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 74 < 4 0 0 > 35 attacacata gatgtgattt aatagatgat 30 <210> 36 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 36 tttaatgcag tttatgcaag gtgtggttat 30 <210> 37 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 37 tgatttaata gatgatggag gaaactggaa 30 <210> 38 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 38 tgcagtttat gcaaggtgtg gttatttcat 30 <210> 39 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 75

< 4 0 0 > 39 ttaatagatg atggaggaaa ctggaaacat 30 <210> 40 <211> 28 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 40 aggtggacga tgacggtgac tggaggga 28 <210> 41 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 41 gcatttctta caaggagcta ttatatccta 30 <210> 42 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 42 aaggcaaatg tccatgtctc aatggataaa 30 <210> 43 <211> 30 <212> ADN 76 < 213 > Vírus do papiloma humano <400> 43 tgtaaacatt acaagcgagc acaaaaaagg 30 <210> 44 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 44 agccttatgc attttttaca gggcacagtt 30 <210> 45 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 45 tatttcatat gtaaactcca ccagccactt 30 <210> 46 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 4 6 aatttaggtg tagtaaatgt gatgaaggcg 30 77 < 210 > 47 <211> 27 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 47 gaagtgtgat gaaggcgact ggaaacc 27 <210> 48 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 48 gaatgagcct gatgcacttt atgcaaggta 30 <210> 49 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 49 cctgatgcac tttatgcaag gtacaataat 30 <210> 50 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 50 tccatgtgca aacactatag gttagcagaa 30 78 < 210 > 51 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 51 acaaatgaga cgtatgtcta tgggtgcatg 30 <210> 52 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 52 gacgtatgtc tatgggtgca tggataaaac 30 <210> 53 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 53 cagtaaattt gaagacacag gaaattggaa 30 <210> 54 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 79 30 <4Ο Ο> 54 ggcactgtaa ttagttatgt aaactccagc <210> 55 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 55 atatgaaaca gtggataaaa tttaggagca 30 <210> 56 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 56 acgccaaatg aatatgtctc aatggattaa 30 <210> 57 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 57 cgccaaatga atatgtctca atggattaaa 30 <210> 58 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 80

< 4 0 0 > 58 tttaagggca ctaaaclgaat ttcttaaagg 30 <210> 59 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 59 ggtgcaataa tatcatttgt aaattcaaac 30 <210> 60 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 60 ggcactaaag gaatttctta aaggaacacc 30 <210> 61 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 61 agggcactaa aggaatttct taaaggaaca 30 <210> 62 <211> 30 <212> ADN 81 <213> Vírus do papiloma humano <400> 62 cattatctat gtcagcctgg ataaggtata 30 <210> 63 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 63 gcacaaagaa aatcattatc tatgtcagcc 30 <210> 6 4 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 6 4 aaatcattat ctatgtcagc ctggataagg 30 <210> 65 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <4Ο Ο> 65 aaacatatga atattggaca atggatacag 30 82 66 < 210 > <211> 30

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 66 gaaagaaaac atatgaatat tggacaatgg 30 <210> 67 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 67 ttaattaggt tcttaagtgg atgtgtaata 30 <210> 68 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 68 taaagcatgt atgtagcaag gtggatgatg 30 <210> 69 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 69 gatgaatatg aaacaatgga taaagcatgt 30 83 < 210 > 70 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <40 0> 70 aagcatgtat gtagcaaggt ggatgatggt 30 <210> 71 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <40 0> 71 gttatttatg gtcctccaaa cacgggtaaa 30 <210> 72 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <40 0> 72 aaacaatgga taaagcatgt atgtagcaag 30 <210> 73 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 84 < 4 0 0 > 73 ttagttattt atggtcctcc aaacacgggt 30 <210> 74 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 74 ttagcttttt aggaggtgta gtgctatcat 30 <210> 75 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 75 ttgtgattta gtagaggagg aaggtgagtg 30 <210> 76 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 76 cgttgtgatt tagtagagga ggaaggtgag 30 <210> 77 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 85 <4Ο Ο> 77 catcgttgtg atttagtaga ggaggaaggt 30 <210> 78 <211> 30

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 78 30 gggcacaaca gcaacaaatg aatatgtgcc <210> 79 <211> 30

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 79 30 cacaacagca acaaatgaat atgtgccagt <210> 80 <211> 30

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 80 ctgtttggta ctttgtggac cgccaaatac <210> 81 <211> 30

<212> ADN 86 30 <213> Vírus do papiloma humano <400> 81 tttcaagggt ctgtcatttc atttgtgaat 30 <210> 82 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 82 acatttttta aaaggatgca ttatttcata 30 <210> 83 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 83 cgtggtatga caatgggaca atggatacaa 30 <210> 84 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 84 gagcagaaaa gcgtggtatg acaatgggac 30 87 < 210 > 85 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 85 aggatgcatt atttcatatg taaattccaa 30 <210> 86 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 86 aaagcgtggt atgacaatgg gacaatggat 30 <210> 87 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 87 agcctgctac attttttaca aggaactgta 30 <210> 88 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 88 gattacacat agaggccgca aggtggcaga 30 88 < 210 > 89 <211 > 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <40 0> 89 attacacata gaggccgcaa ggtggcagac 30 <210> 90 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano < 4 0 0 > 90 agtggattac acatagaggc cgcaaggtgg 30 <210> 91 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano < 4 0 0 > 91 acagtggatt acacatagag gccgcaaggt 30 <210> 92 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 89 <40 0> 92 gtaccattta ttagtgccct taaattgttt 30 <210> 93 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 93 ttacggacca agcgacacag ggaagtcgct 3 <210> 94 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 94 tacggaccaa gcgacacagg gaagtcgcta <210> 95 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 95 gagccttata aattttttcc aagggtcagt 30 <210> 96 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 30 90 96 < 4 Ο Ο > ccttataaat tttttccaag ggtcagtcat 30

<210> 97 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 97 attacaaaag ggcacagcaa cagcaaatga 30 <210> 98 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 98 atggaggaga ctggagaaca atagtaaagc 30 <210> 99 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 99 aagttgtatg gtaatatgcg gaccaccaaa 30 <210> 100 <211> 30 <212> ADN 91 <213> Vírus do papiloma humano <400> 100 caaggatgtg taatatcata tgtaaacgcc 30 <210> 101 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 101 aggagactgg agaacaatag taaagctatt 30 <210> 102 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 102 gttgtatggt aatatgcgga ccaccaaaca 30 <210> 103 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 103 aacgacaaat gtcaatgccg caatggatta 30 <210> 104 <211> 30 92 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 104 cgggcacaaa aacgacaaat gtcaatgccg : <210> 105 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 105 tcaatgccgc aatggattaa atttagatgc 30 <210> 106 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 106 atggcgcaat ggattaggtt tagatgtgat 30 <210> 107 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 107 aaatgactat ggcgcaatgg attaggttta 30 93 < 210 > 108 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 108 attaggttta gatgtgataa atgtgacgat 30 <210> 109 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 109 taaatttata caaggtgtag ttatttcgta 30 <210> 110 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 110 atgtgattta actaatgatg gtggtaattg 30 <210> 111 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 111 taatgatggt ggtaattgga aagatattgt 30 94 < 210 > 112 <211 > 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano < 4 0 0 > 112 taaacaaatg tcaatggcac aatggataca 30 < 210 > 113 <211 > 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano < 4 0 0 > 113 ttaattagat ttttgcaagg gtgcgttatt 30 <210> 114 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 114 agaaaatcac taacaatgtc agcatggatt 30 <210> 115 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 95 < 4 Ο Ο > 115 taggtataga tgtgacaaag tgcaagacgg 30 <210> 116 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 116 ttgcgatacc agggtattaa ctttatgtat 30 <210> 117 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 117 gaggtacagt tattagtcat gtaaattcca 30 <210> 118 <211> 32 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 118 taagtttttg gggggaacag ttattagtta tg 32 <210> 119 <211> 34 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 96 < 4 Ο Ο > 119 ttatacactt tatacaagga gcagtaatat catt 34

<210> 120 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 120 caaggatgta taatatcata tgcaaattca 30 <210> 121 <211> 35 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 121 tgagtttaat aaacttctta gcaggaactg taata <210> 122 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 122 aggcggtacc atattatcat atgtaaatgc 30 <210> 123 <211> 30 <212> ADN 35 97 <213> Vírus do papiloma humano <400> 123 ggaggcactg taattagtta tgtaaactcc 30 <210> 124 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 124 gagttttata catttcctac aaggtgcaat 30 <210> 125 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 125 tatttgcaat gagcctaatg aagtttatgc 30 o <210> 126 <211> 32 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 126 gagtttaatt aggttcttaa gtggatgtgt aa 32 98 < 210 > 127 <211> 29 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 127 gtttagttat ttatggtcct ccaaacacg 29 <210> 128 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 128 agtcttataa agttttttca agggtctgtc 30 <210> 129 <211> 32 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 129 tgagcctgct acatttttta caaggaactg ta 32 <210> 130 <211> 27 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 130 tgagccttat aaattttttc caagggt 27 99 < 210 > 131 <211> 32 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <40 0> 131 atacatttct tgcaaggcac aataatttca ta 32 <210> 132 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 132 tgagtcttat acatttcttg caaggcacaa 30 <210> 133 <211> 30 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 133 aatgcacttt ttacaaggta cagtaatttc 30 <210> 134 <211> 32 <212> ADN <213> Vírus do papiloma humano 100 134 < 4 Ο Ο > ttaaatttat acaaggtgta gttatttcgt at 32 <210> 135 <211> 26

<212> ADN <213> Vírus do papiloma humano <400> 135 taattagatt tttgcaaggg tgcgtt 26

Lisboa, 30 de Dezembro de 2010 101

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Matriz de nucleótidos para a detecção e/ou para a determinação do genótipo de um virus do papiloma humano contido numa amostra biológica, compreendendo um suporte sólido com uma superfície e no mínimo um primeiro oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico ligado à superfície do suporte, que é adequado como sonda para a análise do gene El de VPH ou de uma parte deste, para a detecção e para a determinação de um genótipo de VPH humano genital, seleccionado do grupo composto por: a) oligonucleótidos específicos para o genótipo de VPH com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, b) oligonucleótidos que apresentem uma sequência de nucleótidos mutada face a um dos oligonucleótidos de acordo com a), nomeadamente uma delecção ou adição de 1 até 10 nucleótidos ou uma substituição de 1 até 3 nucleótidos numa das sequência de nucleótidos representadas em a), c) oligonucleótidos que apresentem uma sequência de nucleótidos que ao longo do comprimento total seja complementar à sequência de nucleótidos de um oligonucleótido de acordo com a) ou b), d) moléculas de ácidos nucleicos compreendendo no mínimo uma região que apresente uma das sequências de nucleótidos representadas em a) até c) e uma ou várias 1 regiões adicionais com um comprimento total de no mínimo um nucleótido, e e) misturas dos oligonucleótidos de acordo com a) até c) e/ou das moléculas de ácido nucleico de acordo com d).
2. Matriz de nucleótidos de acordo com a reivindicação 1, em que o suporte é preparado na forma de placa, por exemplo, na forma de um suporte de objectos ou na forma de placa com concavidades, por exemplo como Chamberslide ou como placa de microtitulação com dimensionamentos de acordo com recomendações da SBS (Society of Biomolecular Screening) .
3. Matriz de nucleótidos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que os primeiros oligonucleótidos ou moléculas de ácido nucleico estão dispostos sobre a superfície do suporte numa zona de análise definida.
4. Matriz de nucleótidos de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, em que a superfície do suporte apresenta uma zona de controlo.
5. Matriz de nucleótidos de acordo com a reivindicação 4, em que a zona de controlo compreende um controlo para a orientação do suporte, um controlo de amplificação, um controlo de hibridação, um controlo de amostras e/ou um controlo de impressão.
6. Matriz de nucleótidos de acordo com a reivindicação 5, em que o controlo para a orientação do suporte compreende no mínimo um segundo oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico. 2
7. Matriz de nucleótidos de acordo com a reivindicação 6, em que o segundo oligonucleótido é um oligonucleótido fluorescente e o controlo para a orientação do suporte compreende no mínimo três pontos do oligonucleótido fluorescente.
8. Matriz de nucleótidos de acordo com a reivindicação 7, em que o controlo de amplificação compreende no mínimo um terceiro oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico.
9. Matriz de nucleótidos de acordo com a reivindicação 5, em que o controlo de hibridação compreende no mínimo um quarto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico.
10. Matriz de nucleótidos de acordo com a reivindicação 5, em que o controlo de amostras compreende no mínimo um quinto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico.
11. Matriz de nucleótidos de acordo com a reivindicação 10, em que o quinto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico é adequado como sonda para a detecção do gene humano ADATl.
12. Matriz de nucleótidos de acordo com a reivindicação 5, em que o controlo de impressão compreende no mínimo um sexto oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico.
13. Kit para a detecção e/ou para a determinação de genótipos de VPH genital, compreendendo no mínimo um primeiro recipiente com no mínimo um iniciador para a amplificação de regiões do gene El de VPH, seleccionado dos oligonucleótidos do grupo composto por 3 um oligonucleótido que pode ser empregue como iniciador, em particular como iniciador directo para a amplificação de uma região de ácido nucleico de um vírus do papiloma humano genital (VPH) e que apresenta a sequência 5'-CAR GCI AAA WWW KTD AAR GAY TGT G-3' ou 5'-CAR GCN AAA WWW KTD AAR GAY TGT G-3' (SEQ ID n° 1), em que R é = A ou G, W é = T ou A, Ké=TouG, I é = inosina, N é = A, T, G ou C, D é = A, T ou G e Y é = C ou T, um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos 5'-CAR GCI AAA TAT KTR AAA GAT TGT G-3' OU 5'-CAR GCN AAA TAT KTR AAA GAT TGT G-3’ (SEQ ID n° 2), um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos 5'-CAR GCA AAA TAT GTW AAG GAT TGT G-3' (SEQ ID n° 3), um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos 5'-CAR GCW AAA ATT GTA AAR GAT TGT G-3' (SEQ ID n° 4), um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos 5'-CAA GCA AAA ATA GTA AAR GAC TGT G-3' (SEQ ID n° 5), e um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos 5'-CAR GCA AAA TAT GTA AAA GAC TGT G-3' (SEQ ID n° 6), em que em SEQ ID n° 2 até 6Ré=AouG, Wé=TouA, Ké = T ou G, I é = inosina e N é = A, T, G ou C, um oligonucleótido, que pode ser empregue como iniciador, em particular como iniciador reverso para a amplificação de uma região de ácido nucleico de um vírus do papiloma humano genital, com a sequência de nucleótidos 5'-ARY GGY TSY ARC CAA AAR TGR CT-3' (SEQ ID n° 7), em que R é = A ou G, Y é=CouTeSé=CouG, um oligonucleótido que apresenta uma sequência de nucleótidos mutada face a uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, e é obtenível por: 4 a) delecção de 1 até 10 nucleótidos numa das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, b) adição de 1 até 10 nucleótidos numa das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, e/ou c) substituição de 1 até 3 nucleótidos numa das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7 e uma matriz de nucleótidos de acordo com uma das reivindicações 1 a 12.
14. Kit de acordo com a reivindicação 13, compreendendo dois primeiros recipientes, em que um recipiente contém quantidades equimolares dos oligonucleótidos com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 2 até 6 ou sequências mutadas destas, e um recipiente contém um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7 ou uma sequência de nucleótidos mutada desta.
15. Kit de acordo com a reivindicação 13, compreendendo seis primeiros recipientes, em que cinco recipientes contêm respectivamente um dos oligonucleótidos com as sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 2 até 6 ou sequências mutadas destas, e um recipiente contém um oligonucleótido com a sequência de nucleótidos representada em SEQ ID n° 7 ou uma sequência de nucleótidos mutada desta.
16. Utilização de um oligonucleótido com uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 5 44, 48, 82 e 117 até 135, um oligonucleótido cuja sequência de nucleótidos seja mutada face a uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, nomeadamente apresente uma delecção ou adição de 1 até 10 nucleótidos ou uma substituição de 1 até 3 nucleótidos, um oligonucleótido que apresente uma sequência de nucleótidos que ao longo do comprimento total seja complementar a uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 1 até 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135 ou à sequência mutada desta, uma molécula de ácido nucleico que compreenda uma das sequências de nucleótidos representadas em SEQ ID n° 19, 32, 41, 44, 48, 82 e 117 até 135, a sequência mutada desta ou uma sequência de nucleótidos complementar a esta, para a preparação de uma matriz de nucleótidos de acordo com as reivindicações 1 a 12 ou um kit de acordo com as reivindicações 13 a 15 para o diagnóstico de doenças que são provocadas por vírus do papiloma humano genital.
17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, em que o oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico é uma molécula de ADN, molécula de ARN, molécula de APN, molécula de LNA ou uma forma de mistura destas.
18. Método para a detecção e/ou determinação do genótipo de um vírus do papiloma humano contido numa amostra biológica, em que é empregue uma matriz de nucleótidos de acordo com uma das reivindicações 1 a 12 para a detecção e/ou a determinação. Lisboa, 30 de Dezembro de 2010 6 1/5

Figura 1 2/5

Μ 1 2 3 4 5 6 Μ 1 2 3 4 5 6. Μ· HPV16 HPV18 Figura 2 3/5

Combinação cie 3j' g 161 6 16 iniciadores _________ _ _ _____ Amostra A B C D Figura 3 4/5 OC OC OC OC OC AC AC AC AC 6 6 6 6 6 45 45 45 45 11 11 11 11 11 51 51 51 51 16 16 16 16 16 52 52 52 52 18 18 18 18 18 53 53 53 53 31 31 31 31 31 56 56 56 56 33 33 33 33 33 58 58 58 58 35 35 35 35 35 59 59 59 59 39 39 39 39 39 66 66 66 66 40 40 40 40 40 68 68 68 68 42 42 42 42 42 70 70 70 70 43 43 43 43 43 73 73 73 73 44 44 44 44 44 82 82 82 82 HC HC HC HC HC SC SC SC SC OC Controlo de orientação HC Controlo de hibridação AC Controlo de amplificação (= controlo de PCR) SC Controlo de amostras Figura 4a 5/5

Figura 4b