KR100452163B1

KR100452163B1 - 인유두종 바이러스의 감염을 진단하기 위한 유전형 분석키트

Info

Publication number: KR100452163B1
Application number: KR10-2001-0056827A
Authority: KR
Inventors: 윤성욱; 박태신; 김정미; 박미선
Original assignee: 주식회사 바이오메드랩
Priority date: 2001-09-14
Filing date: 2001-09-14
Publication date: 2004-10-12
Also published as: JP2005503177A; EP1434873A1; US20040265794A1; HK1074221A1; CN100363501C; CN1558954A; EP1434873A4; US7301015B2; WO2003027323A1; KR20030027178A

Abstract

본 발명은 인유두종 바이러스의 DNA 또는 RNA에 결합하는 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩을 사용하여 인유두종바이러스의 감염 및 유전형을 진단하는 인유두종바이러스의 유전형 분석키트, 및 전기 분석키트를 사용하여 인유두종바이러스의 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

인유두종 바이러스의 감염을 진단하기 위한 유전형 분석키트{Genotyping kit for diagnosis of human papilloma virus infection}

본 발명은 인유두종 바이러스의 감염을 진단하기 위한 유전형 분석키트 및 분석방법, 그리고 이에 이용되는 프로브 및 DNA 칩에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 DNA 칩을 사용하여 인유두종 바이러스에 감염된 환자의 유전형을 분석하는 인유두종 바이러스의 유전형 분석키트 및 전기 분석키트를 사용하여 환자의 유전형을 분석함으로써, 인유두종 바이러스의 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.

자궁암에는 자궁경부암, 자궁체부암, 자궁육종암 등이 있으나, 이중 자궁경부암의 경우는 매년 전세계적으로 약 45 만명, 우리 나라의 경우 약 6,000명의 새로운 환자가 발생하고 있다. 자궁경부암은 한국 여성암의 22.1 %에 달하며(상피내암 포함), 발생률 1위, 사망률 2위를 차지하여, 자궁경부암의 예방, 진단 및 치료는 여성 보건에 있어서 중요한 문제로 여겨지고 있다.

자궁경부암은 자궁경부 상피내종양이라는 암 전단계를 걸쳐 진행되는데, 인유두종 바이러스(Human papillomavirus, HPV)의 감염이 자궁경부 종양의 발생에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 특히, 특정 유전형(genotype)의 HPV에 감염된 경우에 종양으로 진행할 가능성은 더욱 높아지게 된다. 인유두종 바이러스가 자궁경부암의 주요원인으로 밝혀진 이후로 현재까지 HPV는 70여 가지의 유전형이 발견되었으며, 병소의 위치와 병변의 진행정도에 따라 각각 특이한 HPV 유전형이 선택적으로 발견되어, HPV 감염의 생물학적 특징의 다양성을 인식하게 되었다. 생식기 감염 HPV 유전형 중 10개 이상이 고위험군으로 분류되어 자궁경부암과 연관되는 것으로 알려져 있으므로, HPV 감염의 생물학적 특징의 다양성이 자궁경부암의 진단과 예방에 중요한 의미를 지닌다는 것을 암시하고 있다.

자궁경부암의 가장 간단한 조기진단법은 병리세포학적 검사인 자궁경부 세포진검사로서 자궁표면의 노화된 세포를 채집, 염색하여 상피세포 핵주위에 공동화(perinuclear halo)를 보이는 코일로사이토시스(koilocytosis) 등의 특징적인 병리소견으로 진단하는 방법인데, 그 진단율이 1 내지 15%로 낮고, 진단상 많은 제한이 있어, 이를 보완하기 위하여 질확대경진을 시행하여 HPV 감염을 70%까지 진단할 수 있으나, 장비가 고가이며, 고도로 숙련된 판독자가 필요하고, 악성화위험도가 다른 HPV 유전형을 분류할 수 없다는 단점이 있었다. 이에 따라 자궁경부암전구 병변의 진단을 위한 선별검사 또는 자궁경부 세포진 검사의 보조적 수단으로서 HPV의 존재와 유전형을 확인하는 기법들에 관한 연구가 지속적으로 진행되고 있는 실정이다.

상기 HPV의 존재 및 유전형 확인 방법은 크게 HPV DNA의 직접확인법과 HPV DNA의 증폭을 이용하는 방법으로 나눌 수 있다. 상기 HPV DNA의 직접확인법으로는 리퀴드 하이브리디제이션(liquid hybridization, Hybrid Capture by Digene Diagnostics, Silver Spring, MD), HPV 타입-특이적 프로브(type-specific probe)를 이용한 서던블롯(Southern blot) 및 도트블롯(Dot blot), 필터 인 시튜 하이브리디제이션(Filter in situ hybridization, FISH) 등이 있고, HPV DNA의 증폭을 이용하는 방법으로는 타입-특이적 PCR(type-specific polymerase chain reaction), 제너럴-프라이머 PCR(general-primer PCR) 등이 있으며, 특히 제너럴 프라이머 세트(General primer set)를 이용하여 증폭된 HPV DNA는 도트 블롯 하이브리디제이션(dot blot hybridization), 마이크로티터 플레이트 하이브리디제이션(microtiter plate hybridization), 또는 라인 프로브 어세이(line probe assay)등의 방법을 통해 유전형을 검색하는 방법이 일반적으로 수행되고 있다.

그러나, 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)에 올리고뉴클레오티드 프로브를 고정하여 20 여 가지 타입을 검색하는 라인 프로브 어세이는 탐지감도가 낮고 데이터의 해석이 불분명하여 신뢰성이 낮다는 단점이 있다. 또한, 상품화되어 있는 하이브리드 캡처 키트(Hybrid Capture kit, Digene Diagnostics, MD, USA, www. digene. com)는 HPV DNA를 시료로부터 쉽게 분리하여 PCR 증폭과정 없이 검색할 수 있으나, 해당 HPV DNA가 고위험군(high risk group)에 속하는지 저위험군(low risk group)에 속하는지 만을 알 수 있을 뿐 정확한 유전형 판별이 불가능하므로, 고위험군중에서도 암발생률과 상관관계가 매우 높은 유형을 다른 고위험군(중위험군(intermediate group)이라고 할 수 있음)과 구별할 수 없고, RNA 프로브를 이용하므로 안정성이 낮고 오염가능성을 배제할 수 없는 문제점이 있다.

따라서, HPV의 감염여부와 감염된 HPV의 유전형을 간단하고, 정확하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라 높은 특이도와 민감도를 갖는 HPV 의 진단 방법 및 키트, 이에 사용되는 프로브 및 DNA 칩을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다. 또한, 상기 진단키트, 이에 사용되는 프로브 및 DNA 칩은 가능한한 여러 가지 유형의 HPV를 높은 특이도 및 민감도로 분석하여 HPV 감염여부와 유전형을 더욱 정확하게 진단할 수 있어야 한다.

여러 가지 유형의 HPV를 높은 특이도 및 민감도로 HPV 감염여부와 유전형을 더욱 정확하게 진단하기 위해서, 본 발명은 HPV의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 신규한 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 HPV의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 신규한 프로브를 포함하는 HPV의 감염 및 유전형 분석을 위한 DNA 칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 HPV의 감염 및 유전형 분석을 위한 신규한 DNA 칩을 포함하는 HPV 유전형 분석키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 HPV의 감염 및 유전형 분석을 위한 신규한 DNA 칩을 이용한 HPV의 감염여부 및 유전형을 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또다른 목적은, HPV의 감염 및 유전형 분석을 위한 신규한 DNA 칩을 이용한 HPV의 감염여부 및 유전형을 진단하는 방법에 있어서, 신규한 PCR 반응으로 시료 DNA을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일례에 따른 DNA 칩에 위치한 프로브의 종류와 위치를 나타내는 모식도이다.

도 2a는 도 1a에 나타낸 DNA 칩으로 HPV16 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2b는 도 1a에 나타낸 DNA 칩으로 HPV18 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2c는 도 1a에 나타낸 DNA 칩으로 HPV39 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2d는 도 1a에 나타낸 DNA 칩으로 HPV58 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2e는 도 1a에 나타낸 DNA 칩으로 HPV68 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2f는 도 1a에 나타낸 DNA 칩으로 HPV69 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2g는 도 1a에 나타낸 DNA 칩으로 HPV6 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2h는 도 1a에 나타낸 DNA 칩으로 HPV11 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2i는 도 1a에 나타낸 DNA 칩으로 HPV43 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2j는 도 1a에 나타낸 DNA 칩으로 HPV44 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2k는 도 1b에 나타낸 DNA 칩으로 HPV61 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2l은 도 1b에 나타낸 DNA 칩으로 HPV67 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 3a는 본 발명의 DNA 칩을 사용한 HPV 16 유형에 감염된 시료의 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 3b는 본 발명의 DNA 칩을 사용한 HPV 31 유형에 감염된 시료의 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 3c는 본 발명의 DNA 칩을 사용한 HPV 51 유형에 감염된 시료의 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 3d는 본 발명의 DNA 칩을 사용한 HPV 52 유형에 감염된 시료의 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 3e는 본 발명의 DNA 칩을 사용한 HPV 56 유형에 감염된 시료의 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 3f는 본 발명의 DNA 칩을 사용한 HPV 16과 HPV 68 유형에 이중 감염된 시료의 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 3g는 본 발명의 DNA 칩을 사용한 HPV 16과 HPV 58 유형에 이중 감염된 시료의 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 3h는 본 발명의 DNA 칩을 사용한 HPV 33과 HPV 56 유형에 이중 감염된 시료의 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 3i는 본 발명의 DNA 칩을 사용한 HPV 16, HPV 52 및 HPV59 유형에 삼중 감염된 시료의 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 3j는 본 발명의 DNA 칩을 사용한 HPV 16, HPV 35 및 HPV 59 유형에 삼중 감염된 시료의 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 4는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 두단계 PCR 증폭반응을 이용한 DNA 증폭결과를 나타내는 사진이다.

도 5는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 다중 PCR 반응을 이용한 DNA 증폭결과를 나타내는 사진이다.

도 6은 DNA 칩에 위치한 본 발명의 프로브와 종래의 프로브 종류와 위치를 나타내는 모식도이다.

도 7a은 도 6에 나타난 DNA 칩으로 HPV 16 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 7b은 도 6에 나타난 DNA 칩으로 HPV 18 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 7c은 도 6에 나타난 DNA 칩으로 HPV 56 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 7d은 도 6에 나타난 DNA 칩으로 HPV 43 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 7e은 도 6에 나타난 DNA 칩으로 HPV 68 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 8은 종래의 HPV 66 프로브와 본 발명의 HPV 66 프로브를 이용하여 HPV 66 DNA를 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

본 발명의 인유두종 바이러스(humanpapillomavirus, HPV)의 감염을 진단하기 위한 유전형 분석키트는 HPV의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 가지는 프로브를 포함하는 DNA 칩, 시료로부터 채취한 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머 및 전기 DNA 칩과 하이브리디제이션되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함한다.

본 발명자들은 간단한 방법으로 환자의 유전형을 분석하여 인유두종 바이러스(HPV)의 감염여부를 진단하고, 감염된 HPV의 종류를 정확하게 판별할 수 있는 방법을 확립하고자 연구노력한 결과, HPV의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브, 및 이를 포함하는 DNA 칩을 개발하였다. 또한, HPV의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는 DNA 칩, 시료로부터 채취한 DNA를 PCR방법으로 증폭시키기 위한 프라이머 및 전기 DNA 칩과 하이브리디제이션되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 HPV의 유전형 분석키트를 제작하였고, 전기 분석키트를 사용하여 환자의 시료에서 채취한 DNA의 유전형을 분석함으로써, HPV의 감염여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 감염된 HPV의 종류를 판별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 HPV DNA의 염기서열, 바람직하게는 HPV의 L1 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합하는 염기서열을 프로브로 제공한다. 본 발명의 프로브는 서열목록 서열번호 1 내지 30에 기재된 염기서열을 포함한다(표 1a 및 표 1b). 표 1a중 서열번호 25에서 서열중 밑줄 그어 진하게 표시한 부분은 프로브 기능을 위해 적합한 형태를 제공하기 위해서 부가된 서열이다.

SEQ ID NO.	HPV 유형	서열	염기수
1	13	5’-acatcatctctttcagacacatataaggcc-3’	30
2	26	5’-agtacattatctgcagcatctgcatccact-3’	30
3	30	5’-ttatccacatataattcaagccaaattaaa-3’	30
4	43	5'-cctctactgaccctactgtgcccagtacat-3'	30
5	53	5’-tctacatataattcaaagcaaattaaacagta-3'	32
6	54	5'-tacagcatccacgcaggatagctttaataat-3'	31
7	54	5'-catccacgcaggatagctttaataattctg-3'	30
8	55	5'-tgtgctgctacaactcagtctccatctacaaca 3'	33
9	57	5'-gaaactaattataaagcctccaattataaggaa-3'	33
10	61	5'-ctgtatctgaatataaagccacaagctttag-3'	31
11	61	5'-cctgtatctgaatataaagccacaagcttt-3'	30
12	62	5'-cctccactgctgcagcagaatacacggcta-3'	30
13	64	5'-tacaaatccaccatatgcaaacactaattttaa-3'	33
14	67	5'-tatgttctgaggaaaaatcagaggctacat-3'	30
15	68	5'-tttgtctactactactgaatcagctgtaccaaa-3'	33
16	69	5'-aatctgcatctgccacttttaaaccatcagatt-3'	33
17	70	5'-aacggccatacctgctgtatatagccctac-3'	30
18	70	5'-accgaaacggccatacctgctgtatatagc-3'	30
19	74	5'-cgccttctgctacatataatagttcagact-3'	30
20	JC9710	5'-aaacaccctctgacacatacaaggcttcca-3'	30
21	16	5'-gtgctgccatatctacttcagaaactacat-3'	30
22	16	5'-tatgtgctgccatatctacttcagaaactacata-3'	34
23	34	5'-ggtacacaatccacaagtacaactgcacca-3'	30
24	35	5'-ttctgctgtgtcttctagtgacagtacata-3'	30
25	35	5'- gcacg gtctgtgtgttctgctgtgtcttcta cgtgc -3'	36
26	40	5'-cttatgtgctgccacacagtcccccacacc-3'	30
27	56	5'-tattagtactgctacagaacagttaagtaa-3'	30
28	58	5'-cactgaagtaactaaggaaggtacatataa-3'	30
29	59	5'-tctactacttcttctattcctaatgtatac-3'	30
30	66	5'-ctaaaagcacattaactaaatatgatgccc-3'	30

31	6	5'-atccgtaactacatcttccacatacaccaa-3'	30
32	11	5'-atctgtgtctaaatctgctacatacactaa-3'	30
33	18	5'-tgcttctacacagtctcctgtacctgggca-3'	30
34	31	5'-tgtttgtgctgcaattgcaaacagtgatac-3'	30
35	33	5'-tttatgcacacaagtaactagtgacagtac-3'	30
36	39	5'-tctacctctatagagtcttccataccttct-3'	30
37	42	5'-ctgcaacatctggtgatacatatacagctg-3’	30
38	44	5’-gccactacacagtcccctccgtctacatat-3’	30
39	45	5’-acacaaaatcctgtgccaagtacatatgac-3’	30
40	51	5’-agcactgccactgctgcggtttccccaaca-3’	30
41	52	5’-tgctgaggttaaaaaggaaagcacatataa-3’	30
42	β-글로빈	5 -tgcacctgactcctgaggagaagtctgccg-3’	30

47	16	5'-gtcattatgtgctgccatatctacttcaga-3'	30
48	34	5'-tacacaatccacaagtacaaatgcaccata-3'	30
49	35	5'-gtctgtgtgttctgctgtgtcttctagtga-3'	30
50	40	5'-gctgccacacagtcccccacaccaacccca-3'	30
51	56	5'-gtactgctacagaacagttaagtaaatatg-3'	30
52	58	5'-attatgcactgaagtaactaaggaaggtac-3'	30
53	59	5'-ctgtgtgtgcttctactactgcttctattc-3'	30
54	66	5'-ctattaatgcagctaaaagcacattaacta-3'	30

본 발명의 프로브를 이용하여 높은 특이도와 민감도로 HPV의 감염여부 및 유전형을 분석할 수 있으며, 특히 서열번호 1 내지 30에 나타난 염기서열을 갖는 프로브는 본 출원인의 PCT/KR/01213호(2000년 10월 26일자 출원)에 기재된 HPV 유전형 분석용 프로브(서열번호 31 내지 42, 그리고 서열번호 47 내지 54)에 비해서 그 특이도와 민감도가 높다. 본 발명의 프로브중 서열번호 1 내지 서열번호 20에 나타난 염기서열을 갖는 프로브는 HPV 13, 26, 30, 43, 53, 54, 55, 57, 61, 62, 64, 67, 68, 69, 70, 74 및 JC9710에 대한 브로브는 상기 출원에 기재된 분석키트에는 포함되지 않은 HPV 유형에 대한 프로브이며, 따라서 본 발명의 프로브를 이용하여 HPV를 진단할 경우에 더 많은 종류의 HPV타입에 대해 탐지가 가능하여 더욱 정확성이 높다. PCT/KR/01213호(2000년 10월 26일자 출원)에 기재된 HPV 유전형 분석용 프로브는 서열번호 31 내지 35, 서열번호 39 내지 41, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 51, 및 서열번호 52로 표시된 염기서열을 갖는 HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56 및 58의 유전형 분석용 프로브를 포함하며, 추가로 서열번호 36 내지 38, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 54에 표시된 염기서열을 갖는 HPV 34, 39, 40, 42, 44, 59 및 66에 대한 프로브를 포함한다.본 발명의 프로브는 서열번호 1 내지 41, 및 서열번호 47 내지 54에 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종의 프로브, 또는 1종 이상의 프로브를 포함하는 HPV 유전형 분석용 프로브 세트일 수 있다.바람직하게는, 본 발명의 프로브는 인유두종 바이러스(HPV)의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합하며, 서열번호 1 내지 30, 서열번호 36 내지 38, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 54에 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 프로브, 또는 1종 이상의 프로브를 포함하는 프로브세트일 수 있다.또한, 본 발명의 프로브 세트는 a) 인유두종 바이러스(HPV)의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합하며, 서열번호 1 내지 30, 서열번호 36 내지 38, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 54에 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브와, b) 서열번호 31 내지 35, 서열번호 39 내지 41, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 51, 및 서열번호 52로 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 DNA 칩은 서열번호 1 내지 41, 및 서열번호 47 내지 54에 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 프로브 세트, 바람직하게는 서열번호 1 내지 30, 서열번호 36 내지 38, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 54에 표시된 염기서열를 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 HPV 프로브를 포함하는 프로브 세트을 함유할 수 있다. 또한 추가로 마커로서 β-글로빈 서열을 포함할 수 있으며, 바람직한 서열은 서열번호 42에 나타나 있다. 본 발명의 일례에서, 상기 DNA칩은 본 발명의 기술분야 전문가가 용이하게 조합가능한 모든 프로브 서열 세트를 포함하는 DNA 칩도 포함되며, 다음과 같은 예를 포함한다.

예 1)

서열번호 1 내지 30, 서열번호 36 내지 38, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 54에 표시된 염기서열를 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 HPV 프로브를 포함하는 DNA 칩.

예 2)

i) 서열번호 1 내지 30, 서열번호 36 내지 38, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 54에 표시된 염기서열를 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 HPV 프로브와

ii) 서열번호 31 내지 35, 서열번호 39 내지 41, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 51, 및 서열번호 52로 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 HPV 프로브를 포함하는 DNA 칩.

예 3)

i) 서열번호 1 내지 20에 나타난 염기서열 및 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 프로브들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 HPV 프로브,

ii) 서열번호 21 내지 30, 서열번호 36 내지 38, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 및 서열번호 54에 나타난 염기서열 및 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 프로브들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 HPV 프로브, 및

iii) 서열번호 31 내지 35, 서열번호 39 내지 41, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 51, 및 서열번호 52로 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 HPV 프로브를 포함하는 DNA 칩.예 4)i) 서열번호 1 내지 20에 나타난 염기서열 및 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 프로브들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 HPV 프로브,ii) 서열번호 21 내지 30에 나타난 염기서열 및 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 프로브들로 이루어진 군에서 선택된 8종의 HPV 프로브, 및iii) 서열번호 31 내지 41에 표시된 염기서열 또는 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 11종의 HPV 프로브를 포함하는 DNA 칩.

예 5)

i) 서열번호 4 내지 서열번호 10, 서열번호 15 및 서열번호 16에 나타난 염기서열을 갖는 프로브들중에서 선택된 9종의 HPV 프로브,

ii) 서열번호 21 내지 30에 나타난 염기서열 및 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 프로브들로 이루어진 군에서 선택된 8종의 HPV 프로브, 및

iii) 서열번호 31 내지 41에 표시된 염기서열 또는 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 11종의 HPV 프로브를 포함하는 DNA 칩.

예 6)

i) 서열번호 4, 서열번호 15, 및 서열번호 16에 나타난 염기서열을 갖는 3종의 HPV 프로브,

본 발명의 일례에서, DNA 칩은 프로브의 위치를 알려주는 기준 마커(marker)를 추가로 포함할 수도 있다. 마커로는 β-글로빈, 액틴, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 마커는 β-글로빈으로서, 그 서열을 서열번호 42에 나타낸다.

또한 본 발명에 따라 HPV의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합가능한 염기서열을 가지는 프로브를 제공한다. 본 발명의 프로브는 HPV에 특이적으로 하이브리디제이션되는 것이 특징이다.

한편, 전기 HPV의 유전형 분석키트에 포함된 DNA 칩의 제조방법은 HPV의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 5말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 작제하는 공정; 전기 작제된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시키는 공정; 및, 전기 DNA 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시키는 공정을 포함한다. 이하, 본 발명의 DNA 칩 및 그의 제조방법을 공정별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

제 1공정: 프로브의 작제

HPV의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 5말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 작제한다. 이때, 프로브는 HPV의 DNA의 염기서열, 바람직하게는 HPV의 L1 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합하는 염기서열을 갖도록 설계 및 합성되고, 합성된 염기서열이 고체의 표면에 결합될 수 있도록 염기서열의 5'말단에 아민기를 결합시켜서 프로브를 작제한다.

제 2공정: 프로브의 고정화

전기 작제된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시킨다: 이때, 고체는 특별히 제한되는 것은 아니나, 유리인 것이 바람직하고, 고체 표면의알데히드는 이 분야에서 알려진 방법, 즉 프로브의 5’말단에 결합된 아민과 30 내지 40℃, 70 내지 100%의 습도조건에서 시프염기반응(Schiffs base reaction)을 수행하여 고체표면에 프로브를 결합시킨다. 이때, 프로브의 농도는 100 내지 300 pmol/l가 바람직하고, 가장 바람직하게는 200 pmol/l이다. 또한 상기 고체의 표면에 전체적인 위치 마커 및 하이브리디제이션 반응에 대한 대조군 역할을 하는 β-글로빈을 부착한다.

제 3공정: DNA 칩의 제조

전기 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시켜서, DNA 칩을 제조한다. 이때, 알데히드의 환원조건이 특별히 제한되는 것은 아니나, NaBH₄등의 환원제를 사용함이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 칩을 포함하는 인유두종바이러스의 유전형 진단키트 및 이를 이용한 인유두종바이러스 감염의 진단방법에 관한 것이다. 본발명은 본 발명에 따른 DNA 칩을, 시료로부터 채취한 DNA를 PCR방법으로 증폭시키기 위한 프라이머, 및 전기 DNA칩과 하이브리디제이션되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 인유두종 바이러스의 유전형 분석키트에 관한 것이다.

본 발명은 또한,

i) 상기 인유두종 바이러스의 유전형 분석키트의 프라이머, 예컨대 서열번호 43 및 44의 프라이머를 사용하여, 검사할 시료로 부터 채취한 DNA를 증폭시키는 단계,

ii) 전기 증폭된 DNA를 상기 유전형 분석키트의 DNA칩에 적용하여 증폭된 DNA와 프로브를 하이브리디제이션시키는 단계, 및

iii) 상기 프로브와 하이브리디제이션된 DNA를 상기 HPV의 유전형 분석키트의 표지수단으로 표지하고, 이를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일례에서, 시료 DNA의 증폭은 통상의 PCR 반응으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 두단계 PCR 증폭법 또는 2종 이상의 프라이머를 사용하여 동시에 증폭하는 다중 PCR 증폭법을 수행하거나, 더욱 바람직하게는 2종 이상의 프라이머를 사용하여 두단계로 증폭하는 2단계 다중 PCR 증폭을 수행할 수 있다.

또한 HPV 유전자 증폭을 위한 가장 적합한 조건을 개발한 결과, 증폭방법으로는 두단계 PCR (Two steps PCR) 또는 다중 PCR(mulitiplex PCR)이다.

전변성, 변성, 프라이머 결합, 및 사슬연장단계로 이루어진 PCR반응에서, 종래에는 동일한 반응조건에서 반복수행하는 한단계 PCR반응을 수행하였으나, 두단계 PCR 반응이란 다른 증폭반응, 예컨대 변성단계, 프라이머 결합단계, 또는 사슬연장단계중 하나이상의 단계를 다른 반응조건하에서 일부 반복증폭을 수행하는 것을 말한다. 본 발명에서는 제 1 증폭단계에서는 통상의 사슬연장단계 시간에 비해서 짧게 수행하고, 제 2증폭단계에서는 제 1 단계보다 더 짧은 시간동안 수행하여, 긴시간동안(예, 1분 내지 2분) 연장반응을 수행할 경우에 지나치게 긴 산물이 얻어지는 것을 방지하여 프로브의 특이도(specificity)를 높일 수 있어 바람직하다. 더욱 바람직하게는 PCR 증폭반응의 사슬연장반응을 제 1단계에서는 20 ~ 30초간 실시하고, 제 2 증폭단계에서는 10 ~ 15초간 실시할 수 있다.

본 발명에서, HPV 프라이머를 사용한 시료와, 마커인 β-글로빈 시료를 별개로 증폭하여 분석할 수도 있으나, 서열번호 43과 서열번호 44의 HPV 프라이머와 서열번호 45과 서열번호 46의 β-글로빈 프라이머를 함께 사용하여 한단계 PCR 증폭을 하거나, 상기와 같이 두단계 PCR 반응을 수행할 수도 있다.

본 발명의 바람직한 일예에서, 상기 HPV 프라이머 및 β-글로빈 프라이머, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 표지물질, 그리고 Taq 폴리머라제를 포함하고, 경우에 따라 첨가물로 BSA 및 DMSO등을 사용하여 PCR 서머싸이클러에 넣고, 94℃에서 5분간 변성(denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 45 ~ 50℃에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 20 ~ 30초간 연장(extension)과정을 5회 반복 후 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 45 ~ 50℃에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 10 ~ 15초간 연장(extension)과정을 35회 반복한 뒤 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, 표지분자가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득한다.

이하, 본 발명의 인유두종바이러스의 유전형 진단키트를 이용한 인유두종바이러스 감염의 진단방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

제 1공정: 시료의 수득 및 증폭

검사할 시료를 증폭시켜서 CY5(Cyanine 5)을 포함하는 증폭시료를 수득한다: 이때, 증폭된 시료가 CY5을 함유하기 위하여 CY5-dUTP를 사용한 PCR을 통하여 증폭시료를 수득한다. 증폭을 위한 프라이머: 4개를 다음의 표 2에 나타낸다.

SEQ ID NO.	HPV 유형	서열	염기수
43	Gp5d+	5’-tttkttachgtkgtdgatacyac-3’	23
44	Gp6d+	5’-gaaahataaaytgyaadtcataytc-3’	25
45	BG 1	5'-atacaagtcagggcagag-3'	18
46	BG 2	5'-cttaaacctgtcttgtaacc-3'	20

상기 표에서 R(A,g): Y(C,T): M(A,C): K(g,T): S(g,C): W(A,T), V(A,C,g): H(A,T,C): B(g,T,C): D(g,A,T): N(A,g,C,T)을 의미하며, 이는 본 기술분야의 전문가에게 널리 알려져 있다.

서열번호 43 및 44 염기서열로 구성된 HPV 증폭용 프라이머가 제공되며, 또한, 서열번호 45 및 46 염기서열로 구성된 신규한 β-글로빈 프라이머가 제공된다.

제 2공정: 하이브리디제이션 반응

전기 증폭시료를 DNA 칩에 적용하여, 프로브와 하이브리디제이션 반응을 수행한다.

제 3공정: 검출

프로브와 하이브리디제이션된 DNA를 표지수단으로 표지하고, 이를 검출하여, HPV의 감염여부를 판단한다:

표지수단은 Cy5, 비오틴 결합 화합물, CY3, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 또는 텍사스 레드(Texas red) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 Cy5 및 비오틴-결합 물질이다. 표지물질의 검출수단으로 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner)로 스캔닝하여 읽는다.

따라서, 본 발명의 DNA 칩을 이용한 HPV의 유전형 진단키트를 사용하여, 인유두종바이러스의 감염여부를 진단할 경우, 신속하고 간단하며 정확하게 HPV 감염여부 및 유전형을 검출할 수 있으므로, 자궁경부암의 조기진단, 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 특히, 하기의 실시예에서는 22 또는 28개의 프로브가 고정된 DNA 칩을 제조하였으나, 프로브의 종류 및 개수가 특별히 제한되는 것은 아니므로, HPV로부터 유도된 염기서열을 갖는 프로브를 이용한 DNA 칩 및 전기 DNA 칩을 이용한 각종 분석키트 또한 본 발명의 범주에 속한다.

실시예 1: 프로브의 제조

HPV를 15가지의 고위험군(HPV 타입 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 69)과 7가지의 저위험군(HPV 타입 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44)으로 분류하고, HPV 유전형 검출을 위하여 사용된 각 HPV 유전형에 특이적인 프로브와 β-글로빈에 특이적인 프로브는 5'말단에 아민(amine)기가 포함되도록 작제하였다. 각 프로브의 염기서열은 표 1과 서열목록에 나타냈다.

실시예 2: DNA 칩의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 각각의 프로브를 3X SSC(0.05 M 소디움 시트레이트, 0.45 M NaCl, pH 7.0)에 200pmol/l가 되도록 용해시키고, 알데히드기가 결합된슬라이드(silylated slide, CSS-100, CEL, Houston, TX, USA) 표면에 어레이어(GMS 417 Arrayer, TaKaRa, Japan)를 이용하여 크기 150m, 간격 300m으로 스파팅(spotting)한 다음 37℃, 습도 70%이상의 조건에서 4시간 동안 시프염기반응(Schiff base reaction)을 수행하였다. 이어, 0.2%(w/v) 소디움 도디실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액으로 슬라이드를 세척하고, 3차 증류수로 세척한 다음, NaBH₄용액(0.1g NaBH₄, 30ml phosphate buffered saline(PBS), 10ml 에탄올)에 5분 동안 침지하여 아민이 결합되지 않은 알데히드를 환원시킨 후, 3차 증류수로 세척하고, 건조시켜서 DNA 칩을 제조하였다.

또한 상기 고체의 표면에 전체적인 위치 마커 및 하이브리디제이션 반응에 대한 대조군 역할을 하는 β-글로빈을 부착하였다.

실시예 3: 최적 PCR 증폭반응

시료로부터 HPV 유전자의 증폭과 다중 PCR의 확립하기 위해서,

HPV PCR의 최적화를 위하여 다음과 같은 조건으로 수행하였다.

3-1: 두단계 PCR 증폭반응

방법 1)

94℃에서 5분간 변성(denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 50℃에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 30초간 연장(extension)과정을 5회 반복 후 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 50℃에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 15초간 연장(extension)과정을35회 반복한 뒤 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.

방법 2)

50℃에서 30초간 프라이머 결합(primer annealing)을 수행하는 것을 제외하고는 상기 방법1과 동일하게 실험하여 Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.

방법 3) 종래의 한단계 PCR 반응

94℃에서 5분간 변성(denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 50℃에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 1분 30초간 연장(extension)과정을 40회 반복 뒤 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하여 비교하였다. 도 4의 레인 4~6, 레인 8~10과 레인 11~13을 각각 비교하였을 때 방법론 2(레인 4, 8, 11)에 의한 조건에서 가장 특이적이며 효율적인 방법론임을 확인하였다.

3-2: 다중 PCR 반응

HPV과 β-글로빈의 다중 PCR 확립을 위한 구성과 조건은 다음과 같다. 상기 실시예 3-1앞에서 언급한 두단계 PCR을 사용한 Mutiplex PCR은 2XPCR 완충용액(50mM KCl, 4mM MgCl2, 10mM Tris-HCl, pH 8.3), 0.1 ㎍의 DNA, 2 ~ 4 mM MgCl₂, 서열번호 43과 서열번호 44의 25 pmol의 HPV 프라이머와 서열번호 44과 서열번호 45의 5pmol의 β-글로빈 프라이머, 40μM의 각 dATP, dCTP, dGTP(Pharmacia), 30μM의 dTTP(Pharmacia), 0.05nM의 Cy5-dUTP(NEN, USA) 및 2 유니트 Taq 폴리머라제(2 unitTaqpolymerase, TaKaRa, Japan)를 포함하고 경우에 따라 첨가물로 BSA 및 DMSO등을 사용하여 50 ㎕의 반응혼합물을 PCR 서머싸이클러(thermocycler, Perkin-Elmer Cetus, CA, USA)에 넣고, 94℃에서 5분간 변성(denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 45 ~ 50℃에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 20 ~ 30초간 연장(extension)과정을 5회 반복 후 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 45 ~ 50℃에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 10 ~ 15초간 연장(extension)과정을 35회 반복한 뒤 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다. 도 5의 레인 2~5, 레인 6~9을 각각 비교하였을 때 1X PCR 완충액 모노플렉스 PCR과 2XPCR 완충액 다중 PCR조건에서의 HPV의 증폭 효율이 유사하였으며 따라서 2X PCR 완충액 다중 PCR 조건에서 가장 특이적이며 효율적인 방법론임을 확인하였다.

실시예 4: 시료의 수득

사람의 자궁경부조직(Human cervical swabs)이 HPV에 감염되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 먼저 전기 조직에서 DNA를 추출하고, 정제하였다. 전기 정제된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 45 및 46를 갖는 β-글로빈 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하며, β-글로빈 유전자가 결합된 증폭 DNA를 선별하여 검색시료로서 사용하였다.

또한, 플라스미드 DNA를 검색시료의 대조군으로 사용하였다. HPV 타입 6, 11, 26, 40, 45, 51 및 57(Dr. Ethel-Michele de Villiers, Angewandte Tumorvirologie, Deutsches Krebsforschungszentrum, Im Neuenheimer Feld 242,69009 Heidelberg, Germany); HPV 타입 35, 44 및 56(Dr. Attila L rincz, Vice President, R&D and Scientific Director, Digene Diagnostics, Inc., 2301-B Broadbirch Drive, Silver Spring, MD 20904, USA); 타입 42, 58, 59, 61, 64 및 67(Dr. Toshihiko Matsukura, Department of Pathology and Laboratory of Pathology, AIDS Research Center, National Institute of Infectious Diseases, Tokyo 162, Japan); 및, 타입 33, 34, 39, 52, 54, 66 및 70(Dr. Grard Orth, Unit Mixte Institut Pasteur/INSERM (U.190), Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)의 플라스미드 DNA를 검색시료로 사용하였다.

아울러, 대한민국 서울시 종로구 연건동 28번지에 소재하는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 구입한 SiHa 세포주(HPV16, KCLB 30035, Human squamous carcinoma, cervix) 에서 추출 및 정제된 DNA를 양성 대조군으로 사용하였다.

전기 선별된 DNA를 주형으로 사용하고, 서열번호 43 및 서열번호 44의 염기서열을 프라이머로 사용하여 PCR를 수행하여 증폭된 시료를 수득하였다.

4-1: 양성대조군 시료의 수득

전기 정제된 HPV16과 HPV18의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 43 및 서열번호 44를 프라이머로 사용하여 다음과 같이 PCR 를 수행하였다: 1 x PCR 완충용액(50mM KCl, 4mM MgCl2, 10mM Tris-HCl, pH 8.3), 0.1 ㎍의 DNA, 4 mM MgCl₂, 각 25 pmol의 프라이머, 40μM의 각 dATP, dCTP, dGTP(Pharmacia), 30μM의dTTP(Pharmacia), 0.05 nM의 Cy5-dUTP(NEN, USA) 및 2 유니트 Taq 폴리머라제(TaKaRa, Japan)를 포함하는 50 ㎕의 반응혼합물을 PCR 서머싸이클러(thermocycler, Perkin-Elmer Cetus, CA, USA)에 넣고, 94℃에서 5분간 변성(denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 50℃에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 30초간 연장(extension)과정을 5회 반복 후 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 50℃에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 15초간 연장(extension)과정을 35회 반복한 뒤 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.

4-2: HPV 시료의 수득

전기 수득한 각종 HPV의 플라스미드 DNA를 주형으로 하는 것을 제외하고는, 실시예 4-1과 동일한 방법으로 Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.

4-3: 검사 시료의 수득

전기 수득한 자궁경부조직의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 43 및 44를 갖는 염기서열을 프라이머로 사용하며, 실시예 4-1과 동일한 방법으로 Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.

실시예 5: DNA 칩을 사용한 감염여부의 확인

전기 실시예 2에서 제조한 DNA 칩에 실시예 4에서 수득한 증폭된 시료를 적용하여, 하이브리디제이션 반응을 다음과 같이 수행하였다. 이때, 하이브리디제이션 반응실(Hybridization reaction chamber)로 100 l 용량의 커버슬립(cover slip, GRACE Bio-Labs, USA, PC4L-1.0)을 사용하였다.

양성 대조군과 플라스미드 DNA의 경우는 10 ㎕의 증폭산물, 자궁경부조직의 DNA의 경우는 HPV 증폭산물 10 ㎕와 β-글로빈 증폭산물 5 ㎕의 혼합물을 반응시료로서 사용하였다. 전기 반응시료에 3N 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 10%(v/v) 첨가하여 실온에서 5분간 변성시키고, 1M Tris-HCl(pH 7.2)을 5%(v/v) 첨가하여 중화시켰다. 그런 후에, 상기 결과물에 3N 염산을 10%(v/v) 첨가한 후, 얼음에서 5분간 방치하였다. 이어서, 하이브리디제이션 용액(6X 식염수-소디움 포스페이트-EDTA 완충액(SSPE, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)와 0.2% 소디움 도데실 설페이트(SDS))을 사용하여 40 ℃에서 실릴화된 슬라이드(silylated slide)에 고정된 프로브와 2시간 동안 반응시키고, 3X SSPE로 2분, 1X SSPE로 2분간 DNA 칩을 세척하여 실온에서 공기 건조하거나 스핀 건조기(spin dryer)를 사용하여 건조하였다.

이를 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner, GSI Lumonics, Germany)를 이용하여 형광신호를 분석하였다(excitation 650 nm, emission 668 nm)(도 1, 도 2a 내지 도 2l, 도 3a 내지 도 3j)

도 1은 DNA 칩에 위치한 프로브의 종류와 위치를 나타내는 모식도로서, 표시된 번호는 각각의 프로브를 나타내고, (○)는 시료와 결합할 수 있는 프로브가 결합된 부위를 나타내며, (●)는 반응이 일어난 것인지를 확인하기 위한 배경마커이며 동시에 프로브의 위치를 나타내기 위한 기준마커를 나타낸다. 도 2a 내지 도 2e는 고위험군으로 분류된 HPV 유형을 분석한 결과를 나타내는 사진이며(HPV 16, 18, 39, 58, 및 69), 도 2g 내지 도 2i는 저위험군으로 분류된 HPV를 분석한 결과를 나타내는 사진이다(HPV 6, 11, 및 40). 도 2a 내지 도 2e, 및 도 2g 내지 도 2i에서 보듯이, 각 DNA의 증폭산물로부터 기인한 하이브리디제이션 신호가 다른 심각한 교차-하이브리디제이션(cross-hybridization) 없이 제 위치의 프로브에서만 각각 깨끗하게 나타남을 확인할 수 있었다.

실시예 6: DNA 칩을 사용한 진단결과의 확인

본 발명의 DNA 칩을 이용한 HPV의 감염진단 결과의 정확성을 확인하기 위하여, 동일시료로부터 수득한 DNA를 대상으로 하여, 전기 DNA 칩을 이용한 진단방법을 수행하고, 또한 전기 DNA를 주형으로 사용하고, 서열번호 43 내지 46의 염기서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 감염여부를 직접적으로 확인하였다.

먼저, 실시예 4-3과 동일한 방법을 사용하여, 자궁경부조직으로부터 213개의 증폭된 DNA를 수득하였다. 이어서, 본 발명의 DNA 칩을 사용하여 증폭된 DNA의 HPV 감염여부를 분석하고, 감염된 것으로 분석된 HPV의 종류를 판별하였다. 또한, Digene사 제품인 하이브리드 캡쳐 II(hybrid capture II) 방법으로 전기 200개의 DNA를 고위험군에 속하는 HPV의 유무를 판별하였다. 상기 두 가지 방법의 결과를 비교하였다(참조: 도 2a 내지 도 2l, 도 3a 내지 도 3j, 표 3). 본 발명의 도 2a 내지 도 2l, 및 도 3a 내지 도 3j는 자궁경부조직에서 수득한 DNA 시료를 대상으로 HPV의 감염여부를 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 상기 도면에서 보듯이, 본 발명의 DNA 칩을 사용하여 각 시료에 감염된 HPV의 유형을 구체적으로 진단할 수 있었다. DNA 칩의 진단결과와 하이브리드 캡쳐 II를 통한 진단결과를 표 3에서 비교하여 나타낸다.

하이브리드 캡쳐 II	본 발명의 DNA 칩
하이브리드 캡쳐 II	구분	HPV 유형	단일감염 시료수(전체 감염시료수)	퍼센트(%)
양성149개	고위험군	HPV 16	31 *1(66)	20.8 (44.3)
		HPV 18	1 (18)	0.7 (12.1)
		HPV 31	2 (3)	1.4 (2)
		HPV 33	2 (6)	1.4 (4)
		HPV 35	2 (6)	1.4 (4)
		HPV 39	1 (3)	0.7 (2)
		HPV 45	- (1)	- (0.7)
		HPV 51	6 (9)	4 (6)
		HPV 52	10 (14)	6.7 (9.4)
		HPV 56	15 (27)	10.1 (18.1)
		HPV 58	7 (13)	4.7 (8.7)
		HPV 59	2 (7)	1.4 (4.7)
		HPV 66	1	0.7
		HPV 68	2 (6)	1.4 (4)
		HPV 69	-	-
	저위험군	HPV 6	- (1)	- (0.7)
		HPV 11	1 (2)	0.7 (1.4)
		HPV 34	1 (2)	0.7 (1.4)
		HPV 40	1 (2)	0.7 (1.4)
		HPV 42	-
		HPV 43	1	0.7
		HPV 44	- (1)	- (0.7)
	다른 유형	4	2.7
음성51개	음성50개	HPV 181개

*1 () 다중 감염 샘플을 포함한 개수

상기 표에서 “-”는 해당 항목에 HPV 감염 시료가 없는 것을 의미하고,

퍼센트는 (단일감염시료수 또는 전체 감염시료수) / 149 x 100 으로 계산된다.

본 발명에 따른 DNA 칩의 특이도와 민감도

본 발명의 DNA 칩	하이브리드 캡쳐 II
본 발명의 DNA 칩	양성	음성	합계
양성	162	1*	163
음성	0	50	50
합계	162	51	213
상대 민감도상대 특이도일치도카파값(κ)	100%98%(95%CI=94-100)98.6% (95%CI=99-100)0.99 (95%CI=0.96-1.00)

상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 하이브리드 캡쳐 방법과 비교시 100%의 상대 민감도를, 98%의 상대 특이도를 보여주었다. 감염된 HPV의 종류까지 동시에 파악할 수 있는 본 발명의 DNA의 유전형 분석키트를 사용한 HPV감염의 진단방법이 종래의 진단방법보다 월등히 우수함을 알 수 있었다.

상기 표 3 및 4에서, 하이브리드 캡쳐(Hybrid Capture)방법에서 양성인 것으로 판명된 시료는 모두 DNA 칩 방법으로 진단되었으며, 음성으로 판명된 시료중 하나에서 HPV 18 유형으로 검출이 되었다. 이것이 가양성(false positive)인지 여부를 확인하기 위하여 서열분석을 한 결과 정확하게 HPV 18유형임을 확인할 수 있었다. 하이브리드 캡쳐 방법이 HPV 유무만을 검출할 수 있는데 비하여 DNA 칩 방법을 사용하게 되면 한 번에 신속하고 정확하게 어떤 타입인지까지 판별을 해 줄 수 있었다. 또한 하이브리드 캡쳐에서 가음성으로 판명된 시료까지도 검출할 수 있을 정도로 본 발명의 DNA 칩은 민감도(sensitivity)가 높게 나타났다. 본 기술분야의 전문가에게 잘 알려진 바와 같이, HPV 감염 빈도를 보면 HPV 16 유형이 가장 높은 빈도를 나타내고 있고, 그 다음으로는 HPV 18 유형이 많이 나타나는 서양에서의 결과와 달리 HPV 56, 58, 52 유형 등이 많이 나타났다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 DNA 칩을 사용하여 인유두종 바이러스(HPV)에 감염된 환자의 바이러스의 유전형을 분석하는 상기 프로브 (SEQ ID NO 1~30)가 포함된 HPV의 유전형 분석키트 및 전기 분석키트를 사용하여 환자의 유전형을 분석함으로써, HPV의 감염여부를 진단하는 방법을 제공한다.

비교예 1: 프로브 테스트

도 6에 나타난 바와 같이, HPV 16, 34, 56, 및 59에 대한 기존 프로브(서열번호 47, 48, 51, 및 53)와 본 발명의 프로브(서열번호 21 또는 22, 서열번호 23, 27, 및 29)의 효과를 비교하고, 새로이 추가된 HPV 유형인 HPV 43, 68, 및 69의 프로브의 효과를 확인하기 위한 DNA칩을 나타낸다. 상기 DNA 칩을 사용한 것을 제외하고는 실시예 6과 동일하게 수행하였다.

도 7 내지 도 8에서 각 타입에 대한 대조군 DNA로 분석한 결과, 전기 출원된 프로브의 비특이적 반응(가양성) 및 저민감도(가음성)을 확인하였다.

비교예 2: DNA 칩 테스트

서열번호 31 내지 42 및 서열번호 47 내지 54의 프로브를 포함하는 종래 프로브와 도 1a에 표시한 본 발명의 DNA 칩을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 6과 동일하게 실험하였다. 서열분석을 통상의 서열분석방법을 이용하여 수행하였다.

기존 DNA칩과 본 발명의 DNA칩을 수행한 결과와, 이를 확인하기 위해서 PCR 반응을 수행하여 확인한 서열분석결과를 기존 프로브와 PCR법을 통해 얻어진 결과를 표 5a 및 5b에 나타냈다. 기존 DNA칩은 본 발명의 DNA 칩을 이용한 유전형 분석키트보다 가음성과 가양성의 빈도가 높은 것으로 나타났다. 본 발명은 DNA 칩을 사용하여 인유두종 바이러스(HPV)에 감염된 환자의 바이러스의 유전형을 분석하는 상기 프로브 (SEQ ID NO 1~30)가 포함된 HPV의 유전형 분석키트 및 전기 분석키트를 사용하여 환자의 HPV 유전형을 보다 정확하고 신속한 결론을 제공한다.

시료	기존 HPV DNA 칩	본 발명의 DNA 칩	서열분석	기존 HPV DNA 칩
시료	기존 HPV DNA 칩	본 발명의 DNA 칩	서열분석	가양성	가음성
1	OT	16,68	16,68		16, 68
2	35	51	51	35	51
3	16	OT	OT	16
4	59	59,68	59,68		68
5	40, 58	51	51	40, 58	51
6	16, 18, 33, 35	16,18,33	16,18,33	35
7	33	16,33	16,33	-	16
8	16	16,68	16,68	-	68
9	58	16,18	16,18	58	16, 18
10	16	56	56	16	56
11	16	56,58	56,58	16	56, 58
12	16	56	56	16	56
13	35	68	68	35	-
14	16	16, 69	16, 69	-	69
15	35, 52	52	52	35	52
16	16	18,56	18,56	16	18, 52
17	35	52	52	35	52
18	35	51	51	35	51
19	58	40	40	58	40
20	59	52	52	59	52
21	59	16	16	59	16
22	35	16,18	16,18	35	16, 18
23	35	16,18	16,18	35	16,18
24	35	43	43	35	43
25	16	52	52	16	52
26	35, 16	35	35	16	-
27	58	31,39,58	31,39,58	-	31, 39
28	31, 59	31	31	59	31
29	31, 16	31	31	16, 35	31
30	35, 16	31	31	16, 35	31
31	35, 58	35, 58	35, 58	-	-
32	35, 33	33	33	35	33

33	16, 35	16	16	35	-
34	52, 40	52, 66	52, 66	40	66
35	58	66, 58	66, 58	-	66
36	16, 56	16	16	56	-
37	58, 34	58	58	34	-
38	16	16, 43	16, 43	-	43
39	31, 35	31	31	35	-
40	33, 16	33	33	16	-
41	16	18	18	16	-
42	16, 40	neg	neg	16, 40	-
43	16, 56	neg	neg	16, 56	-
44	16, 59	16	16	59	-
45	35	35, 66	35, 66	-	66
46	16, 40	16	16	40	-
47	34, 58	58	58	34	-
48	6, 18	6, 18, 69	6, 18, 69	-	69
49	58	51	51	58	51
50	59	11	11	59	11

발명의 유전형 분석키트는 손쉽게 HPV감염여부를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 감염된 HPV의 유전형을 판별할 수 있으므로, 자궁경부암의 조기진단, 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 인유두종 바이러스(HPV)의 유전형 분석키트 및 HPV 분석방법, 이를 위한 프로브 및 DNA칩을 제공하여, 본 발명의 분석키트를 사용하여 인유두종바이러스의 감염여부를 진단할 경우, 신속하고 간단하며 높은 특이도와 민감도로 HPV 감염여부 및 유전형을 검출할 수 있으므로, 자궁경부암의 조기진단, 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것이다.

<110> biomedlab(representative: Kim. Jong-Won) <120> Genotyping kit for diagnasis of human papilltmavirus infection <130> DPP012599 <160> 54 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> porbe HPV 13 <400> 1 acatcatctc tttcagacac atataaggcc 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 26 <400> 2 agtacattat ctgcagcatc tgcatccact 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 30 <400> 3 ttatccacat ataattcaag ccaaattaaa 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 43 <400> 4 cctctactga ccctactgtg cccagtacat 30 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> porbe HPV 53 <400> 5 tctacatata attcaaagca aattaaacag ta 32 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 54 <400> 6 tacagcatcc acgcaggata gctttaataa t 31 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 54 <400> 7 catccacgca ggatagcttt aataattctg 30 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 55 <400> 8 tgtgctgcta caactcagtc tccatctaca aca 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 57 <400> 9 gaaactaatt ataaagcctc caattataag gaa 33 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 61 <400> 10 ctgtatctga atataaagcc acaagcttta g 31 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 61 <400> 11 cctgtatctg aatataaagc cacaagcttt 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 62 <400> 12 cctccactgc tgcagcagaa tacacggcta 30 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 64 <400> 13 tacaaatcca ccatatgcaa acactaattt taa 33 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 67 <400> 14 tatgttctga ggaaaaatca gaggctacat 30 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 68 <400> 15 tttgtctact actactgaat cagctgtacc aaa 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 69 <400> 16 aatctgcatc tgccactttt aaaccatcag att 33 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 70 <400> 17 aacggccata cctgctgtat atagccctac 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 70 <400> 18 accgaaacgg ccatacctgc tgtatatagc 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 74 <400> 19 cgccttctgc tacatataat agttcagact 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV JC9710 <400> 20 aaacaccctc tgacacatac aaggcttcca 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 16 <400> 21 gtgctgccat atctacttca gaaactacat 30 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 16 <400> 22 tatgtgctgc catatctact tcagaaacta cata 34 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 34 <400> 23 ggtacacaat ccacaagtac aactgcacca 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 35 <400> 24 ttctgctgtg tcttctagtg acagtacata 30 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 35 <400> 25 gcacggtctg tgtgttctgc tgtgtcttct acgtgc 36 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 40 <400> 26 cttatgtgct gccacacagt cccccacacc 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 56 <400> 27 tattagtact gctacagaac agttaagtaa 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 58 <400> 28 cactgaagta actaaggaag gtacatataa 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 59 <400> 29 tctactactt cttctattcc taatgtatac 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 66 <400> 30 ctaaaagcac attaactaaa tatgatgccc 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 6 <400> 31 atccgtaact acatcttcca catacaccaa 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 11 <400> 32 atctgtgtct aaatctgcta catacactaa 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 18 <400> 33 tgcttctaca cagtctcctg tacctgggca 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 31 <400> 34 tgtttgtgct gcaattgcaa acagtgatac 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 33 <400> 35 tttatgcaca caagtaacta gtgacagtac 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 39 <400> 36 tctacctcta tagagtcttc cataccttct 30 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 42 <400> 37 ctgcaacatc tggtgataca tatacagctg 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 44 <400> 38 gccactacac agtcccctcc gtctacatat 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 45 <400> 39 acacaaaatc ctgtgccaag tacatatgac 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 51 <400> 40 agcactgcca ctgctgcggt ttccccaaca 30 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 52 <400> 41 tgctgaggtt aaaaaggaaa gcacatataa 30 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-globin <400> 42 tgcacctgac tcctgaggag aagtctgccg 30 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Gp5+ <400> 43 tttkttachg tkgtdgatac yac 23 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Gp6+ <400> 44 gaaahataaa ytgyaadtca taytc 25 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer BG 1 <400> 45 atacaagtca gggcagag 18 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer BG 2 <400> 46 cttaaacctg tcttgtaacc 20 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 16 <400> 47 gtcattatgt gctgccatat ctacttcaga 30 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 34 <400> 48 tacacaatcc acaagtacaa atgcaccata 30 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 35 <400> 49 gtctgtgtgt tctgctgtgt cttctagtga 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 40 <400> 50 gctgccacac agtcccccac accaacccca 30 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 56 <400> 51 gtactgctac agaacagtta agtaaatatg 30 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 58 <400> 52 attatgcact gaagtaacta aggaaggtac 30 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 59 <400> 53 ctgtgtgtgc ttctactact gcttctattc 30 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HPV 66 <400> 54 ctattaatgc agctaaaagc acattaacta 30

Claims

인유두종 바이러스(HPV)의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합가능하며, 서열번호 1, 서열번호 3 내지 28, 서열번호 30, 서열번호 53, 및 서열번호 54에 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 프로브 세트.
(정정)

제 1항에 따른 프로브 세트를 포함하는, HPV의 유전형 분석용 DNA 칩.
(정정)

제 2 항에 있어서,

상기 프로브 세트는 인유두종 바이러스(HPV)의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합가능하며, 서열번호 31 내지 35, 서열번호 39 내지 41, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 51, 및 서열번호 52로 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 추가로 포함하는 DNA 칩.
제 3 항에 있어서,

상기 DNA 칩은 서열번호 1 내지 20에 나타난 염기서열 및 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 프로브들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 HPV 프로브,

서열번호 21 내지 30에 나타난 염기서열 및 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 프로브들로 이루어진 군에서 선택된 8종의 HPV 프로브, 및

서열번호 31 내지 41에 표시된 염기서열 또는 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 11종의 HPV 프로브를 포함하는 DNA 칩.
(정정)

제 4 항에 있어서,

상기 DNA 칩은 서열번호 4 내지 서열번호 10, 서열번호 15 및 서열번호 16에 나타난 염기서열을 갖는 프로브들중에서 선택된 9종의 HPV 프로브,

서열번호 21 내지 30에 나타난 염기서열 및 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 프로브들로 이루어진 군에서 선택된 8종의 HPV 프로브, 및

서열번호 31 내지 41에 표시된 염기서열 또는 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 11종의 HPV 프로브를 포함하는 DNA 칩.
제 5 항에 있어서,

상기 DNA 칩은 서열번호 4, 서열번호 15, 및 서열번호 16에 나타난 염기서열을 갖는 3종의 HPV 프로브,

서열번호 21 내지 30에 나타난 염기서열 및 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 프로브들로 이루어진 군에서 선택된 8종의 HPV 프로브, 및

서열번호 31 내지 41에 표시된 염기서열 또는 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 11종의 HPV 프로브를 포함하는 DNA 칩.
제 2항 내지 6항중 어느 한항에 따른 HPV의 유전형 분석용 DNA 칩,

시료 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머, 및

상기 DNA 칩과 하이브리디제이션되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 HPV의 유전형 분석키트.
제 7 항에 있어서,

상기 DNA 칩은 프로브의 위치를 알려주는 기준마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전형 분석키트.
제 8 항에 있어서,

상기 기준 마커가 β-글로빈, 액틴, 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 유전형 분석키트.
제 7 항에 있어서,

상기 표지수단은 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 유전형 분석키트.
제 7 항에 있어서,

상기 시료 DNA의 PCR 증폭이, 사슬연장단계가 제 1증폭단계에서는 20-30초간, 제 2 증폭단계에서는 10-15초간 수행되는 두단계 PCR 증폭인, 유전형 분석키트.
제 9항 또는 11항에 있어서,

HPV 증폭용 프라이머와 β-글로빈 증폭용 프라이머를 동시에 첨가하여 상기 시료 DNA를 PCR증폭하는 것이 특징인, 유전형 분석키트.
제 7 항에 있어서,

상기 프라이머가 서열번호 45 또는 46에 나타난 염기서열을 갖는 β-글로빈의 증폭용 프라이머를 포함하는 유전형 분석키트.
서열번호 45 또는 서열번호 46에 나타난 염기서열을 갖는 β-글로빈의 증폭을 위한 프라이머.
(신설)

서열번호 43 또는 서열번호 44에 나타난 염기서열을 갖는 HPV 유전자 증폭용 프라이머.
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