CN100390297C - 人乳头瘤病毒hpv基因芯片 - Google Patents
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- CN100390297C CN100390297C CNB2003101101868A CN200310110186A CN100390297C CN 100390297 C CN100390297 C CN 100390297C CN B2003101101868 A CNB2003101101868 A CN B2003101101868A CN 200310110186 A CN200310110186 A CN 200310110186A CN 100390297 C CN100390297 C CN 100390297C
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Abstract
本发明涉及一种基因芯片,特别是涉及人乳头瘤病毒HPV基因芯片。含有固相载体基片,监控显示,检测探针点样,监控显示含有阳性对照显示,阴性对照显示,空白对照显示,检测探针点样包括人乳头瘤病毒HPV通用性探针点样和HPV两种或两种以上型别的特异性探针点样。该基因芯片具有高通量、高速高效、高灵敏度等优点,通过一次检测即可判断出待检测样品中各种常见HPV类型的感染,可节省大量的人力、物力和时间,将广泛应用于HPV病原微生物的检测,为保证妇女的健康发挥巨大的作用。
Description
一、技术领域:
本发明涉及一种基因芯片,特别是涉及人乳头瘤病毒HPV基因芯片。
二、背景技术:
众所周知,妇女占全人类的一半,妇女健康不仅关系到妇女自身切身利益,同时也关系到人类后代的繁衍生殖。人乳头瘤病毒(human papillomavirus HPV)作为妇女致病微生物,可感染妇女的皮肤与黏膜上皮细胞,引起妇女生殖器官多种良性、恶性肿瘤病变,严重威胁妇女健康。各国的许多妇产科专家普遍认为,人乳头瘤病毒HPV感染,已被流行病学和生物学证明是引起妇女宫颈癌及其癌前病变的重要因素。在全世界范围内几乎所有宫颈癌组织中均可检测到HPV-DNA,同时HPV型别与它不同部位的组织的亲嗜性密切相关,所导致的疾病不尽相同。现已发现至少有58种不同型别的HPV与其特殊解剖部位有关。所以HPV-DNA的检测及分型在对其相关疾病的诊断、防治、判断预后,深入研究HPV致癌机理等方面具有重要意义。
1、HPV病毒形态。HPV病毒是一类双链环状小分子DNA病毒,属乳多空病毒科乳头瘤病毒属。毒粒直径约45~55nm,呈二十面对称体,有72个壳体,毒粒有含有DNA和蛋白质,无包膜。
2、HPV-DNA结构。HPV-DNA约7.9kbp,所有开放读码框架由一条DNA链编码,并有基因重叠。按功能分为三个区:E区为早期转录区,L区为晚期转录区,URR区为上游调节区。E区约占4kbp,编码8个开放读码框架,依次为E6,E7,E1,E8,E2,E4,E3,E5。E区的功能涉及DNA复制,转录调节和细胞转化;L区长约3kbp,有两个开放读码框架L1,L2,分别编码病毒的主要和次要衣壳蛋白;URR区位于L1和E6之间,长约1kbp,为非编码区,在基因的转录和翻译中起调节作用。
由于HPV体外增殖非常困难,到目前为止尚无可靠的血清学分型方法。对HPV感染的诊断,传统的方法是通过形态学和免疫学方法对其进行检测,如巴氏涂片法,液基薄层细胞学检查,阴道镜检查,组织病理学检查,电镜直接观察HPV病毒颗粒,放射免疫沉淀法检测患者血清中HPV16抗体水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中HPV-E6,E7特异性抗体等。这些传统的HPV检测方法灵敏度和特异性均不够理想,存在较高的假阳性率和假阴性率,并且不能对HPV进行分型。
最近十几年来,许多科学工作者为了克服传统检测方法的不足,采用现代分子生物学技术方法对HPV进行检测,这些方法主要包括核酸杂交法,聚合酶链反应PCR法。这些方法有的灵敏度不高,有的特异性差,有的比较费时间,有的易发生交叉感染,假阳性率高,有的操作繁琐且不能分型。
随着分子生物学技术的飞速发展,上世纪九十年代出现了基因芯片技术,美国Affymetrix公司于二十世纪八十年代末至九十年代初,率先开展基因芯片研究。1992年该公司运用半导体照相平板技术,在1cm2左右的玻璃片上原位合成寡核苷酸片段,诞生了世界上第一块基因芯片。基因芯片最早是由于高通量,大规模研究基因功能的需求而产生,但随着基因芯片技术上的日渐成熟,人们惊喜的发现基因芯片在传染病和遗传病的诊断上有独特的应用前景和巨大商业市场。
三、发明内容:
本发明所要解决的技术问题是:克服已知技术的缺陷,运用分子生物学的前沿技术,生产出人乳头瘤病毒检测及分型基因芯片。
本发明的技术方案是:
一种人乳头瘤病毒(HPV)基因芯片,含有固相载体基片,在芯片上固化有监控显示点样,HPV检测探针点样,监控显示点样含有阳性对照显示点样,阴性对照显示点样,空白对照显示点样,HPV检测探针点样包括HPV通用性探针点样和至少有两种不同类型的HPV特异性探针点样,阳性对照显示点样是一任选的与HPV不同源的寡核苷酸片段,其序列为:5’-NH2-T10-CGAGTCCAGTGCATGGACAG-3’,阴性对照显示点样为与HPV没有同源性的一任选寡核苷酸片段,其序列为:5’-NH2-TTAATTATTACAAGCGCAACAG-3’,空白对照显示点样为不含任何基因的点样,HPV通用探针点样是人工合成的一寡核苷酸片段,与HPV L1区内一段保守基因段完全互补,其序列为:5’-NH2-T8-GTRYTNCGDGTDGTATCHACHACNGT-3’,HPV特异性探针为人工合成的寡核苷酸片段,能够与该类型HPV L1区内特异性的一段基因片段互补;所述的HPV特异性探针为下列第(1)至第(7)组探针点样中的一组:
第(1)组:
型别 | 基因序列 |
HPV16 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gtagtttctgaagtagatatggc-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-gccatatctacttcagaaactac-3’ |
HPV18 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-cccaggtacaggagactgtg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ctacacagtctcctgtacctgggc-3’ |
第(2)组:
型别 | 基因序列 |
HPV6 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gtggaagatgtagttacggatg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-catccgtaactacatcttccac-3’ |
HPV11 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tgtagcagatttagacacagatg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-catctgtgtctaaatctgctac-3’ |
第(3)组
型别 | 基因序列 |
HPV6 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gtggaagatgtagttacggatg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-catccgtaactacatcttccac-3’ |
HPV11 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tgtagcagatttagacacagatg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-catctgtgtctaaatctgctac-3’ |
HPV16 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gtagtttctgaagtagatatggc-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-gccatatctacttcagaaactac-3’ |
HPV18 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-cccaggtacaggagactgtg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ctacacagtctcctgtacctgggc-3’ |
第(4)组:
型别 | 基因序列 |
HPV6 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gtggaagatgtagttacggatg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-catccgtaactacatcttccac-3’ |
HPV11 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tgtagcagatttagacacagatg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-catctgtgtctaaatctgctac-3’ |
HPV16 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gtagtttctgaagtagatatggc-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-gccatatctacttcagaaactac-3’ |
HPV18 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-cccaggtacaggagactgtg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ctacacagtctcctgtacctgggc-3’ |
HPV31 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tagtatcactgtttgcaattgca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgcaattgcaaacagtgatacta-3’ |
HPV33 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-atgtactgtcactagttacttgt-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-acaagtaactagtgacagtacat-3’ |
HPV35 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tactgtcactagaagacacagca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgctgtgtcttctagtgacagta-3’ |
HPV45 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-ttggcacaggattttgtgtagag-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ctctacacaaaatcctgtgccaa-3’ |
第(5)组:
型别 | 基因序列 |
HPV6 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gtggaagatgtagttacggatg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-catccgtaactacatcttccac-3’ |
HPV11 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tgtagcagatttagacacagatg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-catctgtgtctaaatctgctac-3’ |
HPV40 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-ttattatatggggttggtgtggg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-cccacaccaaccccatataataa-3’ |
HPV42 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-atgtatcaccagatgttgcagtg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-cactgcaacatctggtgatacat-3’ |
HPV44 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-acggaggggactgtgtagtggca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgccactacacagtcccctccgt-3’ |
HPV16 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gtagtttctgaagtagatatggc-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-gccatatctacttcagaaactac-3’ |
HPV18 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-cccaggtacaggagactgtg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ctacacagtctcctgtacctgggc-3’ |
HPV31 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tagtatcactgtttgcaattgca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgcaattgcaaacagtgatacta-3’ |
HPV33 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-atgtactgtcactagttacttgt-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-acaagtaac tagtgacagtacat-3’ |
HPV45 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-ttggcacaggattttgtgtagag-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ctctacacaaaatcctgtgccaa-3’ |
第(6)组:
型别 | 基因序列 |
HPV16 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gtagtttctgaagtagatatggc-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-gccatatctacttcagaaactac-3’ |
HPV18 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-cccaggtacaggagactgtg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ctacacagtctcctgtacctgggc-3’ |
HPV31 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tagtatcactgtttgcaattgca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgcaattgcaaacagtgatacta-3’ |
HPV33 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-atgtactgtcactagttacttgt-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-acaagtaactagtgacagtacat-3’ |
HPV35 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tactgtcactagaagacacagca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgctgtgtcttctagtgacagta-3’ |
HPV39 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-aaggtatggaagactctatagag-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ctctatagagtcttccatacctt-3’ |
HPV45 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-ttggcacaggattttgtgtagag-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ctctacacaaaatcctgtgccaa-3’ |
HPV51 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-ttggggaaaccgcagcagtggca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgccactgctgcggtttccccaa-3’ |
HPV52 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tcctcgccatgacgaaggtattc-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-gaataccttcgtcatggcgagga-3’ |
HPV56 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tacctcagccttagattcctgca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgcaggaatctaaggctgaggta-3’ |
HPV58 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-atgtaccttccttagttacttca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgaagtaactaaggaaggtacat-3’ |
第(7)组:
型别 | 基因序列 |
HPV6 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gtggaagatgtagttacggatg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-catccgtaactacatcttccac-3’ |
HPV11 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tgtagcagatttagacacagatg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-catctgtgtctaaatctgctac-3’ |
HPV13 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-ctgaaagagatgatgtagtggct-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-agccactacatcatctctttcag-3’ |
HPV32 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-atgtgtcttcagttgttacagta-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tactgtaacaactgaagacacat-3’ |
HPV34 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gtacttgtggattgtgtacctac-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-gtaggtacacaatccacaagtac-3’ |
HPV40 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-ttattatatggggttggtgtggg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-cccacaccaaccccatataataa-3’ |
HPV41 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-attgttatatgaagaagcatccc-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-gggatgcttcttcatataacaat-3’ |
HPV42 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-atgtatcaccagatgttgcagtg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-cactgcaacatctggtgatacat-3’ |
HPV44 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-acggaggggactgtgtagtggca-3’ |
5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgccactacacagtcccctccgt-3’ | |
HPV53 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-atgtagacatagactgtgtggtt-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-aaccacacagtctatgtctacat-3’ |
HPV54 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-agctatcctgcgtggatgctgta-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tacagcatccacgcaggatagct-3’ |
HPV55 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tagatggagactgagttgtagca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgctacaactcagtctccatcta-3’ |
HPV74 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-ggaggggattgtgtagtaggcgc-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-gcgcctactacacaatcccctcc-3’ |
HPV16 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gtagtttctgaagtagatatggc-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-gccatatctacttcagaaactac-3’ |
HPV18 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-cccaggtacaggagac tgtg-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ctacacagtctcctgtacctgggc-3’ |
HPV31 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tagtatcactgtttgcaattgca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgcaattgcaaacagtgatacta-3’ |
HPV33 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-atgtactgtcactagttacttgt-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-acaagtaactagtgacagtacat-3’ |
HPV35 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tactgtcactagaagacacagca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgctgtgtcttctagtgacagta-3’ |
HPV38 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gcagaatcatattcttgagcacc-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ggtgctcaagaatatgattctgc-3’ |
HPV39 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-aaggtatggaagac t c tatagag-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ctctatagagtcttccatacctt-3’ |
HPV45 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-ttggcacaggattttgtgtagag-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ctctacacaaaatcctgtgccaa-3’ |
HPV51 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-ttggggaaaccgcagcagtggca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgccactgctgcggtttccccaa-3’ |
HPV52 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tcctcgccatgacgaaggtattc-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-gaataccttcgtcatggcgagga-3’ |
HPV56 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-tacctcagccttagattcctgca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgcaggaatctaaggctgaggta-3’ |
HPV58 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-atgtaccttccttagttacttca-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-tgaagtaactaaggaaggtacat-3’ |
HPV59 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-taggaatagaagaagtagtagaa-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-ttctactacttcttctattccta-3’ |
HPV66 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-atttagttaatgtgcttttagct-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-agctaaaagcacattaactaaat-3’ |
HPV69 | 5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>8</sub>-gatgcagattgtgcagatacagt-3’5’-NH<sub>2</sub>-T<sub>10</sub>-actgtatctgcacaatctgcatc-3’ |
固相载体基片为玻璃片,或硅片,或尼龙膜,或硝酸纤维膜,或凝胶,或杂交膜,阳性显示点样为每一排的第一列点样,阴性显示和空白显示为最后两排点样,另外各排点样依次为HPV通用探针点样,HPV特异性探针点样。
HPV特异性探针。
本发明的有益积极效果:
基因芯片技术是二十世纪九十年代初期发展起来的一门由分子生物学、微电子学、物理学、化学、计算机科学等多门学科交叉融合而成的高新技术,它是将大量探针固化于固相支持物上,然后与标记的样品杂交,通过对杂交信号的检测分析,得出样品的遗传信息。该技术具有高通量,大规模,高度并行性,快速高效,高灵敏度等优点,不仅可以节约试剂和样品,而且将节省大量的人力、物力和时间,使基因检测更为快速、敏感和精确。基因芯片技术已被广泛应用于病原微生物的检测中,并发挥着巨大的作用。
入乳头瘤病毒作为人类致病微生物严重威胁着人类的健康,目前已有100多种不同型别的HPV被鉴定,不同型别的HPV可导致不同的疾病。HPV感染已被流行病学和生物学证明是引起宫颈癌及其癌前病变的首要原因,对HPV进行检测及分型是一种有效的、可靠的宫颈癌筛查手段。然而,传统的HPV检测方法主要是通过形态学和免疫组化法对其进行检测,这些检测方法的灵敏度和特异性均不够理想,存在较高的假阳性率和假阴性率,且不能对HPV进行分型。常用的分型方法有PCR、原位杂交、线样探针分析、等,它们存在易污染、假阳性率高、灵敏度不高、操作繁琐、对混合感染难以判断、价格昂贵等缺点,难以推广应用。
目前尚无有关HPV检测分型芯片的研究,我们将基因芯片技术应用于HPV的检测及分型。本研究制备的HPV检测及分型基因芯片是采用点样法制作的低密度芯片,可以根据实际需要设计芯片探针数量。
1、人乳头瘤病毒基因芯片,能一次检测多种常见类型HPV,大大提高了HPV的检测效率,缩短检测时间。
2、HPV基因芯片检测分型操作简单,通过一次杂交检测不仅可以判断样品中是否存在HPV感染,而且可以鉴别出属于哪种型别的感染,便于临床推广应用。
3、HPV基因芯片针对性强,对样品中的HPV-DNA直接进行检测,可以检测出HPV的潜伏期感染,克服了血清学和免疫组化检测法对潜伏感染会产生漏检的缺陷,从而实现对HPV疾病的早期快速诊断。
4、HPV基因芯片,敏感性高,特异性强。通过基因序列比对设计了HPV特异性寡核苷酸探针,同时在芯片上设计阳性对照、阴性对照和空白对照,对芯片的质量进行监控,排除假阳性、假阴性,使检测结果更加可靠。
5、HPV基因芯片能同时检测多种HPV型别,对多重HPV感染的判断一目了然,克服了其它HPV检测方法难以判断混合感染或操作繁琐的缺点。
6、检测结果客观性强,运用计算机软件对杂交结果进行扫描分析和数据处理,大大降低了分析结果判断过程中人为的主观因素。
四、说明书附图:
图1:HPV基因芯片结构示意图之一
图2:HPV基因芯片结构示意图之二
图3:HPV基因芯片结构示意图之三
图4:HPV基因芯片结构示意图之四
图5:HPV基因芯片结构示意图之五
图6:HPV基因芯片结构示意图之六
图7:HPV基因芯片结构示意图之七
图8:HPV 6感染阳性显示扫描图
图9:HPV 11感染阳性显示扫描图
图10:HPV 16感染阳性显示扫描图
图11:HPV 18感染阳性显示扫描图
图12:HPV 6,16混合感染阳性显示扫描图
图13:HPV 6,11混合感染阳性显示扫描图
图14:HPV 6,18混合感染阳性显示扫描图
图15:HPV阴性显示扫描图
五、具体实施方式:
实施例一:参见图3,图中1为阳性显示点样,2为阴性显示点样,3为空白对照点样,4为HPV通用性探针点样,5为HPV特异性探针点样,6为固相载体基片采用玻璃片,在本实施例中,有4条HPV特异性探针点样,分别是HPV6,HPV11,HPV16,HPV18
一.HPV的基因芯片的制作方法如下:
1.将有关阳性、阴性对照显示和入工合成的HPV通用探针点样和HPV特异性探针点样(TAKARA公司合成)溶于点样液(上海博星基因芯片有限公司配制),浓度为50μMMOL/L,取适量转移至96孔板。
2.开机:打开Prosys 5510A点样仪(Cartesian Technologie公司),真空泵与计算机电源连接。
3.准备:将微孔板以及预处理玻片放入点样仪的工作平台,装上点样针,将真空装置上不用的孔密封上。
4.打开软件,点样仪与电脑联机。选择编制好的程序,按“GO”开始打印。
1).清洗打印针,并干燥3次。
2).点样针移到微孔板,浸入待打印的探针液中上样。
3).点样针移到预点样玻片上,打印数个样品点,直到打印的样品点的大小均匀。
4).点样针移到待点样玻片上,根据所编制的微阵列设计,打印样品点。
5).点样针移到同一批待点玻片,继续打印
6).点样针回到洗涤槽中清洗,抽真空吸去洗涤液
7).载下一个样品重复上述过程,直到打印完所有探针
5.退出软件,关机,超声波清洗点样针
6.将打印好的芯片水合30分钟
7.室温干燥
8.0.2%SDS洗10分钟
9.ddH2O洗10分钟
10.室温干燥
11.4 ℃度保存或立即使用。
二.芯片的使用操作
(一)提取待检组织标本DNA
1.取新鲜组织标本约30mg,液氮研碎
2.加DNA抽提液0.3ml(配制方法参照《分子克隆实验指南》98版),混匀;加蛋白酶K7.6ul,混匀
3.60℃过夜
4.95℃10min
5.离心:13000rpm 5min
6.取上清,加0.3ml酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀
7.离心:13000rpm 5min
8.重复6.7步两次
9.取上清,加0.3ml氯仿∶异戊醇(24∶1),混匀
10.离心:13000rpm 1min
11.取上清,加1/10体积的PH5.2,3mmol/l的醋酸钠溶液和2.5倍体积的预冷无水乙醇,混匀
12.20℃30min
13.离心:13000rpm 15min
14.弃上清,用70%乙醇1ml洗1次
15.干燥,用50ul MilliQ水溶解
16.4℃保存
(二)待检样品的扩增与标记(避光操作)
1.取0.2mlEP管一只,在冰浴条件下向管中依次加入ddH2O17.1ul,10×Buffer2.5ul,dNTP2ul(2.5ummol/l),带荧光标记(CY5)的上游引物5’-CY5-GCHCARGGHCAHAAYAATGG-3’和下游引物5’-CY5-RCGWCCMARRGGRWAYTGATG-3’各1ul(10ummol/l),(引物由上海生工生物工程公司合成,要求纯度为PAGE级),模板DNAlul,Taq酶0.4ul(5U/ul)
2.混匀后,放入PCREXPRESS 2400PCR仪(德HYBAID)进行扩增,反应条件为:
a)94℃3min
i.94℃30sec
ii.53℃30sec 35循环
iii.72℃60sec
b)72℃5min
c)4℃避光保存
(三)杂交(避光操作)
1.取0.2mlEP管,依次加入杂交液6ul,阳性对照
5’-CY5-CTGTCCATGCACTGGACTCG-3’(10uM)1ul,标记产物5ul,混匀
2.放入PCREXPRESS 2400PCR仪中于94℃下变性2.5min后,立即放入冰盒内防止复性,至少1分钟
3.将变性后的产物12ul点于芯片点样区,盖上盖玻片,赶走气泡,置于湿杂交盒内,在47℃下杂交60min
4.用ddH2O冲掉盖玻片,将芯片放入02.%SDS液中洗脱5分钟后,用ddH2O冲洗干净
5.室温干燥
(四)扫描检测
将杂交后干燥的芯片插入GMS418 Array Scanner扫描仪(美AFFYMETRIX)中进行扫描,扫描图片以Tiff格式保存
利用实施例一生产的HPV基因芯片,对有关病人进行临床检测,获得图8至图14的各种类型HPV感染与混合型感染的阳性显示扫描图。
图8-图14为HPV芯片检测几种HPV感染阳性显示扫描图,其中,图8-图11分别为HPV6,HPV11,HPV16,HPV18单纯感染的检测结果,而图12-图14分别为HPV6+HPV16,HPV6+HPV11,HPV6+HPV18混合感染的检测结果。对于上述通过HPV基因芯片检测结果病例,我又用DNA序列测定法对上述检测结果进行验证,两者是吻合的。
图8为HPV基因芯片检测结果:HPV6感染阳性显示扫描图。为验证HPV基因芯片检测结果的准确性,我们又采用HPV通用引物对图8所对应样品的PCR产物在3700测序仪(PE公司)上进行DNA序列测定,结果为:ACTGGGGGACCTCACGCAGTACAAATATGACATAATGTGCTGCCATATTTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATCCCATGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTTCAGCACCTAAAGGAAGATCCTTTAAAAAAATACACCTTTTTGGGGAAGTAAATTAAGGGAAAGGGTTTTTGCCACCTAGATCAAATTNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNTNNNNNNNCNTNNNNNNNNNNNNAGTGGNNNNNNNNNNNNNNANJNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNATTTANGNNNNNNNNNNNNTTTNNTTTTGTTTTTNNNNNNNNNNNNNNNAN,经过检索GeneBank,也证实该样品为HPV6感染,说明我们研制的HPV基因芯片是成功的.
图9为HPV基因芯片检测结果:HPV11感染阳性显示扫描图。为验证HPV基因芯片检测结果的准确性,我们又采用HPV通用引物对图9所对应样品的PCR产物在3700测序仪(PE公司)上进行DNA序列测定,结果为:CCACACGCAGTACCCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTTTGGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGGAAAAGCCAGATCCCTATAAAAACCCTTAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGGTTTCTAGTGATTGGGGTCANTTNCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTTTNNNNNNNNNNNNNN,经过检索GeneBank,也证实该样品为HPV11感染,说明我们研制的HPV基因芯片是成功的.
图10为HPV基因芯片检测结果:HPV16感染阳性显示扫描图。为验证HPV基因芯片检测结果的准确性,我们又采用HPV通用引物对图10所对应样品的PCR产物在3700测序仪(PE公司)上进行DNA序列测定,结果为:ATTTACTTCCCAAAAAGTGTATTTTTTAAGGGGATCTTCTTTAGGTGCTGGAGGTGTATGTTTTTGACAAGCAATTGCCTGGGATGTTACAAACCTATAAGTATCTTCTAGTGTGCCTCCTGGGGGAGGTTGTAGACCAAAATTCCAGTCCTCCAAAATAGTGGAATTCATAGAATGTATGTATGTCATAACGTCTGCAGTTAAGGTTATTTTGCACAGTTGAAAAATAAACTGTAAATCATATTCCTCCCCATGTCGTAGGTACTCCTTAAAGTTAGTATTTTTATATGTAGTTTCTGAAGTAGGATATGGCAGCACATAATGACATATTTTGTACTGCGTGTAGTATCAACAACAGTAACAAATAGTTGGTTACCCCAACAAATGCCATTNTTTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNNTNNATNNNNGGATTGNNNNNNNNNNNTTNNCCTNNNTNTTTNTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNTNNN,经过检索GeneBank,也证实该样品为HPV16感染,说明我们研制的HPV基因芯片是成功的.
图11为HPV基因芯片检测结果:HPV18感染阳性显示扫描图。为验证HPV基因芯片检测结果的准确性,我们又采用HPV通用引物对图11所对应样品的PCR产物在3700测序仪(PE公司)上进行DNA序列测定,结果为:ACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTTTGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTACCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATTCCCTCTTGGTCGTAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN,经过检索GeneBank,也证实该样品为HPV18感染,说明我们研制的HPV基因芯片是成功的.
图14为HPV基因芯片检测结果:HPV6和HPV18混合感染阳性显示扫描图。为验证HPV基因芯片检测结果的准确性,我们又采用HPV通用引物对图14所对应样品的PCR产物在3700测序仪(PE公司)上进行DNA序列测定,结果为:ACTGGGGGACCTCACGCAGTACAAATATGACATAATGTGCTGCCATATTTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATCCCATGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTTCAGCACCTAAAGGAAGATCCTTTAAAAAAATACACCTTTTTGGGGAAGTAAATTAAGGGAAAGGGTTTTTGCCACCTAGATCAAATTNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNTNNNNNNNCNTNNNNNNNNNNNNAGTGGNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNTNNNATTTANGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTNNTTTTGTTTTTNNNNNNNNNNNNNNNAN,经过检索GeneBank,证实该样品为HPV6感染.DNA测序结果与HPV基因芯片检测结果有所不司,这是因为对于HPV混合感染,DNA序列测定法只能检测出样品中占优势的HPV型别,不能显示混合感染型别,这更说明了我们研制的HPV基因芯片检测灵敏度更高,结果更可靠,能显示出混合感染型别.说明我们研制的HPV基因芯片是成功的.
对照检测结果表明,本实施例的HPV基因芯片的检测结果准确,灵敏度高,检测快速敏捷。
实施例二:参见图1,图中编号与实施例一相同的代表意义相同,芯片的制作方法同实施例一相同,不重述。不同之处在于:本实施例亚型特异性探针只有两条,HPV16,HPV18。
实施例三:参见图2,图中编号与实施例一相同的代表意义相同,芯片的制作方法同实施例一相同,不重述。不同之处在于:本实施例亚型特异性探针只有两条,HPV6,HPV11。
实施例四:参见图4,图中编号与实施例一相同的代表意义相同,芯片的制作方法同实施例一相同,不重述。不同之处在于:本实施例亚型特异性探针有8条,HPV6,HPV11,HPV31,HPV33,HPV35,HPV45,HPV16,HPV18。
实施例五:参见图5,图中编号与实施例一相同的代表意义相同,芯片的制作方法同实施例一相同,不重述。不同之处在于:本实施例亚型特异性探针有10条,HPV6,HPV11,HPV40,HPV42,HPV44,HPV31,HPV33,HPV45,HPV16,HPV18。
实施例六:参见图6,图中编号与实施例一相同的代表意义相同,芯片的制作方法同实施例一相同,不重述。不同之处在于:本实施例亚型特异性探针有11条,HPV39,HPV51,HPV52,HPV56,HPV58,HPV31,HPV33,HPV35,HPV45,HPV16,HPV18。
实施例七:参见图7,图中编号与实施例一相同的代表意义相同,芯片的制作方法同实施例一相同,不重述。不同之处在于:本实施例亚型特异性探针有28条,HPV6,HPV11,HPV13,HPV32,HPV34,HPV40,HPV41,HPV42,HPV44,HPV53,HPV54,HPV55,HPV74,HPV16,HPV18,HPV31,HPV33,HPV35,HPV38,HPV39,HPV45,HPV51,HPV52,HPV56,HPV58,HPV59,HPV66,HPV69。
Claims (2)
1.一种人乳头瘤病毒基因芯片,含有固相载体基片,在芯片上固化有监控显示点样,HPV检测探针点样,其特征是:监控显示点样含有阳性对照显示点样,阴性对照显示点样,空白对照显示点样,HPV检测探针点样包括HPV通用性探针点样和至少有两种不同类型的HPV特异性探针点样,阳性对照显示点样是一任选的与HPV不同源的寡核苷酸片段,其序列为:5’-NH2-T10-CGAGTCCAGTGCATGGACAG-3’,阴性对照显示点样为与HPV没有同源性的一任选寡核苷酸片段,其序列为:5’-NH2-TTAATTATTACAAGCGCAACAG-3’,空白对照显示点样为不含任何基因的点样,HPV通用探针点样是人工合成的一寡核苷酸片段,与HPVL1区内一段保守基因段完全互补,其序列为:5’-NH2-T8-GTRYTNCGDGTDGTATCHACHACNGT-3’,HPV特异性探针为人工合成的寡核苷酸片段,能够与该类型HPVL1区内特异性的一段基因片段互补;所述的HPV特异性探针为下列第(1)至第(7)组探针点样中的一组:
第(1)组:
第(2)组:
第(3)组
第(4)组:
第(5)组:
第(6)组:
第(7)组:
2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒基因芯片,其特征是:固相载体基片为玻璃片,或硅片,或尼龙膜,或硝酸纤维膜,或凝胶,或杂交膜,阳性显示点样为每一排的第一列点样,阴性显示和空白显示为最后两排点样,另外各排点样依次为HPV通用探针点样,HPV特异性探针点样。
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