CN102703606B - Hr-hpv e6/e7基因snp检测的固相芯片和探针以及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属生命科学和生物技术领域,具体是涉及HR-HPVE6/E7基因SNP检测固相芯片和探针以及检测试剂盒。本发明的第一个目的是提供一种HR-HPVE6/E7基因SNP检测的固相芯片,该固相芯片的探针具有SEQIDNo.1-225的核苷酸序列,该固相芯片包含65个HR-HPV16、58、18、52E6/E7SNP位点,可以弥补单纯HPV-DNA检测低特异性和低阳性预测值,检测具有快速、高通量的特点,从而更好的用于宫颈癌的筛查,做到宫颈癌的早期诊断和治疗。本发明的第二个目的是提供HR-HPVE6/E7基因SNP检测的探针引物。本发明的第三个目的是提供一种用于HR-HPVE6/E7基因SNP检测的试剂盒。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域,具体是涉及HR-HPVE6/E7基因SNP检测固相芯片和探针以及检测试剂盒。
背景技术
宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤,高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是宫颈癌发病的必要因素,已经在99.7%的宫颈癌组织中证实HPV DNA的存在。大量研究已证实,高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)持续感染和特定的HR-HPV型内变异体(对某一特定的HPV型别,与原型相比其基因组的编码区有小于2%差异,非编码区小于5%的差异)能增加宫颈癌(CC)及宫颈上皮内瘤变(CIN)的发病危险。
目前,宫颈癌发生的三步模式是:HPV感染,高级别癌前病变的进展,宫颈癌。因此,HPV检测能做到更早期的发现具有潜在病变危险的病人,从而做到早期的诊断和治疗。宫颈癌是世界卫生组织建议在全世界范围内开展筛查的唯一恶性肿瘤,是目前唯一通过常规筛查几乎完全可预防因此得到早期治疗的疾病。
从1941年巴氏细胞涂片技术开始用于临床常规筛查,但是这项技术的准确性却受到标本收集、制备、染色和阅片等很多方面的影响,使其检测潜在癌前病变的敏感性仅有50%左右,为了克服其敏感性低的缺点,液基细胞学(LBC)取代传统涂片成为标准初筛方法,但有文献经过Meta分析表明无论是在检出率还是在降低样本的不满意度上LBC并未优于传统涂片,并且细胞学为基础的筛查方法具有高度的主观性并且具有资源和劳动力密集型的特点,因此,在资源缺乏的地区不适合采用。肉眼检测包括醋酸白实验(VIA)和碘染色法(VILI)是一种经济有效的筛查方法,但敏感性低,主观性强。因此,改进目前已存在的筛查技术就尤为重要。
在那些宫颈细胞学无异常的妇女中,HR-HPV阳性妇女患CIN2-3和原位癌的风险是未检测到HPV妇女的58-71倍。HPV-DNA检测克服了细胞学筛查的主观性,最近的研究表明HPV检测作为一种初筛方法在检测癌前病变上比细胞学具有更高的敏感性(高于25-35%)和阴性预测值,但特异性(5-10%)和阳性预测值较细胞学低,因此,寻找一种能增加HPV-DNA检测特异性的方法很有必要。
最近越来越多的流行病学的数据表明HR-HPV基因组型内变体通过改变转化能力或是免疫反应能力影响HR-HPV的致癌力。HR-HPV特定的型内变异体与病毒持续感染和宫颈病变进展关系密切,并且存在地区差异。目前对HPV16、HPV18、HPV58和HPV52变体研究的最多,如有研究表明,在瑞典、意大利和法国人群中,HPV16E6L83V与HPV持续感染、宫颈癌及宫颈高级别瘤变的发展相关,而在日本和中国人群中,HPV16E6D25E与宫颈癌及宫颈高级别瘤变的发展相关。
以上的研究提示,将HPV型内基因组变异体作为生物学标记,即通过检测HR-HPV阳性病人的病毒基因组变异来预测其发展为持续感染和引起宫颈病变的危险性是合理的、可行的,并且可以弥补单纯HPV-DNA检测特异性和阳性预测值低的缺点。我们之前的研究也表明某些特定的E6/E7变异可能有更高的致癌性,具体详见文章(Gynecol Oncol 2010;119:436-43 IntJ Gynecol Cancer 2010;20:1391-8)。
中国发明专利申请(申请号:201010151982.6申请日:2010-04-20)公开了检测人乳头瘤病毒的基因芯片及试剂盒,基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的人乳头瘤病毒检测探针,所述检测探针包括SEQ ID No.9-37的核苷酸序列;包括27种HPV亚型特异性探针,对应包括了22种高危及中危型HPV,5种低危型HPV和2种高危型HPV整合(HPV16/HPV18)。该专利包含的基因芯片是针对亚洲地区常见的HR-HPV16、58、18、52四种型别的E6/E7基因变异位点构建含有特定SNP位点的芯片,通过此芯片不仅可以检测样品中存在的HR-HPV16、58、18、52四种亚型,而且最主要的是检测四种亚型E6/E7基因特定位点的变异情况(野生型或突变型)。本发明所建立的基因芯片是针对HPV类型设计的,探针设计在L1区域,主要检测样品中的HPV亚型(如HPV6、11、16、18、31、33等)。
发明内容
针对现有筛查技术敏感性低及主观性强以及HPV-DNA检测的低特异性和低阳性预测值,本发明的第一个目的是提供一种HR-HPV E6/E7基因SNP检测的固相芯片,该固相芯片包含65个HR-HPV16、58、18、52E6/E7SNP位点,可以弥补单纯HPV-DNA检测低特异性和低阳性预测值,检测具有快速、高通量的特点,从而更好的用于宫颈癌的筛查,做到宫颈癌的早期诊断和治疗。本发明的第二个目的是提供HR-HPV E6/E7基因SNP检测的探针引物。本发明的第三个目的是提供一种用于HR-HPV E6/E7基因SNP检测的试剂盒。
为了实现上述的第一个目的,本发明采用了以下的技术方案:
HR-HPV E6/E7基因SNP检测的固相芯片,该基因芯片包括固相载体和固定于其上的检测探针,其特征在于:所述的HR-HPV E6/E7基因的一个基因具有多个突变SNP位点,每个突变SNP位点设计若干条的检测探针序列,所述的HR-HPV E6/E7基因的一个基因具有所述检测探针序列的一条或多条检测探针;所述的基因、突变SNP位点、检测探针序列如下所示:
为了实现上述的第二个目的,本发明采用了以下的技术方案:
HR-HPV E6/E7基因SNP检测的探针,该探针具有SEQID No.1-225的核苷酸序列之一的序列。
本发明的除SEQID No.115-118外特异性探针长度为21碱基,探针的TM值均一性与杂交特异性通过探针合成过程中的特殊碱基修饰获得,使得探针和对应的PCR产物杂交时最佳温度条件基本一致,有利于在同一杂交温度下以相近的效率同步结合,使检测准确性大大增加。
为了实现上述的第二个目的,本发明采用了以下的技术方案:
一种用于HR-HPV E6/E7基因SNP检测的试剂盒,该试剂盒包括:
1)包含HR-HPV样品的裂解液;
2)掺入荧光的多重PCR反应液;
3)权利要求1所述的固相芯片。
作为优选,所述的多重PCR的引物如下所示:
HPV16E6F | CGAAACCGGTTAGTATAA |
HPV16E6R | GTATCTCCATGCATGATT |
HPV16E7F | CTGAAGAAAAGCAAAGACATC |
HPV16E7R | CATTACATCCCGTACCCTC |
HPV58E6F | AATGCCAAATCTTGTAAAAACTAGG |
HPV58E6R | CATAATTGCTCATAGCAGAA |
HPV58E7F | ACAAGTGTAACCTGTAACAACGC |
HPV58E7R | TTGTACCTTCAGGGTCATCCA |
HPV52E6F | TAACCGAAAACGGTCAGA |
HPV52E6R | GTTTCAGGTTGCAGATCTAAT |
HPV52E7F | ATATTATGGGTCGTTGGACA |
HPV52E7R | CCTGTACATCCCTCCCTTTC |
HPV18E6F | GAAAACGGTGTATATAAAAGATGTG |
HPV18E6R | GTCAACCGGAATTTCATTTTG |
作为优选,所述的裂解液的成分为0.01M Tris-HCL pH 8.0,0.005M EDTA pH 8.0,SDS0.5%。
作为优选,所述的多重PCR反应液包括:
Onetaq 5u/μl |
DATP 100mM |
DTTP 100mM |
DGTP 100mM |
DCTP 100mM |
CY3-DCTP 1nm/ul |
20×SSPE |
SDS |
100×BSA |
EDTA |
Nuclease-free water |
HCONH2 |
PCR产物纯化试剂盒 |
无水乙醇 |
作为优选,所述的掺入荧光物质为cy3-dCTP。
作为优选,所述的该试剂盒的阳性对照为人β-globin基因,其扩增引物如下,与HR-HPVE6/E7同时扩增,同时检测:
β-globin GH20 5’-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3’
β-globin PC04 5’-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3’。
利用本发明试剂盒的检测方法的具体步骤如下:
(1)扩增样品:将临床样本中提取的DNA进行多重PCR,所用引物如上,分为两组扩增,扩增得到带有cy3-dCTP荧光标记的HR-HPV16、58、18、52E6/E7基因序列;
(2)杂交:将上述扩增得到的DNA序列与基因芯片上分布的DNA探针进行反应;
(3)扫描:将杂交信号进行扫描;
(4)结果判读:将芯片扫描后的原始图像信息转变成数字信息,按照芯片探针检出情况判断样品HPV类型及E6/E7SNP情况。
本发明的用于检测方法能够快速、准确度检测出HPV感染及鉴定常见的四种高危亚型,同时能准确的检测出HR-HPV16、58、18、52E6/E7基因SNP位点情况,操作简单,快速,对于宫颈癌的早期诊断、预防、治疗具有重大意义。
附图说明
图1为四种类型HPV 7个基因的所有探针布局图。
具体实施方式
实施例1:探针设计及构建芯片
本发明的HR-HPVE6/E7SNP信息如表1;
表1.用于构建检测芯片的SNP位点
在本发明中,为了探讨我们的芯片能够更好的区分四种HR-HPV类型以及各个类型里面的各HPVE6/E7基因的SNP位点,在一张芯片当中重复设计相同的两组探针,其中当中放置本研究拟放置的4个HPV类型的7个基因的探针序列,并且重复一次,如图1中的芯片布局情况;
本实施例所述探针包括SEQ ID No.1-225的核苷酸序列,对应每一个SNP位点都有一对及以上探针,采用多组探针的信号强度来对每一个SNP位点信号值进行研判,以降低其临近SNP位点的干扰。
探针设计,由于位点在基因中的位置是固定的,决定了探针设计的难度,为了更好的检测出每个特定的SNP位点,采用“Tilling”原则,即用一组探针来决定一个SNP位点,由于位点较靠近,所以一条探针可能包含多个相邻的SNP位点,最后,针对65个SNP位点,设计了225条探针,采用定制芯片的原理,构建成基因芯片。225条探针的序列如下表:
实施例2:样品制备
采用酚氯仿法制备和纯化临床样本中的DNA。
多重PCR反应体系为50ul分为A、B两组为:
体系A | 体积ul |
模板 | 2 |
5×buffer | 10 |
2mM dGTP,dATP,dTTP | 1.25 |
1mM dCTP(Cy3-dCTP∶dCTP,1∶10) | 2.5 |
引物体系A(引物对:1、2、3、6,浓度10mM,上下游引物各1ul) | 2×4 |
Onetaq(5u/ul) | 0.2 |
Nuclease-Free水 | 28.05 |
体系B | 体积ul |
模板 | 2 |
5×buffer | 10 |
2mM dGTP,dATP,dTTP | 1.25 |
1mM dCTP(Cy3-dCTP∶dCTP,1∶10) | 2.5 |
引物体系A(引物对:4、5、7,浓度10mM,上下游引物各1ul) | 2×3 |
Onetaq(5u/ul) | 0.2 |
Nuclease-Free水 | 26.05 |
将样品核酸稀释为35ng/ul,每个稀释后的样品核酸按照体系A和体系B分别配制两个PCR体系,每次实验设立一个阴性对照,即以2ul Nuclease-Free水为模板。
按以下条件进行扩增:
94℃2min
68℃7min
4℃∞
实施例3:HR-HPV16、58、18、52E6/E7SNP检测
将实施例2中扩增得到的E6/E7DNA用实施例1中包含有SNP检测探针的芯片进行杂交反应,最后通过扫描仪扫描,数据转换器获得不同样品E6/E7特定位点的SNP情况。
具体操作步骤:
1、杂交
试剂配方:
Hybridization buffer(杂交液HB):6XSSPE,25%Formamide,PH 6.6 to 6.8
Wash buffer(洗液WB):500μL HB,500μL H2O,20μL 10%SDS,注意,Wash buffer要现配现用。
Blocking buffer(封闭液BSA):50μL HB,2μL of 25×heat-treated BSA*
Stripping buffer(解吸缓冲液SP)0.3mM EDTA,50%Formamide pH=6.63
(1)、样品浓缩
将两体系的PCR产物等分为两管(每管约30ul)以离心浓缩仪真空避光常温浓缩至每管12-15ul(两管总体积约25-30ul)。再将两管合并,加入等体积的杂交液(Hybridizationbuffer:HB)备用。
(2)、(1)中混合液95℃变性5min后迅速置于冰上3min
(3)、将在冰上预冷好的样品,加入Blocking buffer管中,30℃,“Binding”speed双向循环16h(过夜),速度500μL/min
2、芯片清洗和扫描
(1)用Hybridization buffer将样品从系统中挤出。1mL Hybridization buffer,在系统中以“Wash”speed(100μL/min)32℃循环20min
(2)1mL Wash buffer在系统中以“Wash”speed(100μL/min)32℃循环20min
(3)1mL Wash buffer在系统中以“Wash”speed(100μL/min)40℃循环20min
(4)扫描,将芯片从系统中取出,以Microarry Scanner Genepix 4000B扫描,扫描分辨率为10微米,波长为635nm,PMT和Focal distance根据需要调整。保存图片。
数据提取和分析
(1)数据提取
通过Array-Pro Analyzer软件,将芯片扫描后的原始图像信息转变成数字信息。
(2)数据分析
按照芯片探针检出情况判断样品HPV类型。
根据SNP探针信号情况对各个SNP位点类型进行判断。判断原则为:每个SNP位点的对应的每对探针间信号值相差2倍为界限,判断该位点的SNP情况。
结果:见表3
表3.芯片检测结果情况
序号 | 突变 | 所属基因 | 本次实验中突变检出情况 |
1 | 12(G/A) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
2 | 29(A/C) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
3 | 42(G/A) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
4 | 49(A/C) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
5 | 50(G/C) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
6 | 55(T/G) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
7 | 63(G/T) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
8 | 80(A/C) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
9 | 86(C/G) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
10 | 91(C/A) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
11 | 96(T/G) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
12 | 101(T/C) | HPV16E6 | 探针信号值过于接近背景值,检测不出 |
13 | 103(T/G) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
14 | 106(G/C) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
15 | 121(A/G) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
16 | 158(C/G) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
17 | 163(C/T) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
18 | 187(G/A) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
19 | 194(A/G) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
20 | 203(C/G) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
21 | 235(A/G) | HPV16E6 | 探针信号值过于接近背景值,检测不出 |
22 | 253(C/T) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
23 | 268(T/G) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
24 | 278(C/T) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
25 | 337(T/G) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
26 | 367(C/G) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
27 | 375(T/G) | HPV16E6 | 探针信号值过于接近背景值,检测不出 |
28 | 425(G/A) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
29 | 434(C/G) | HPV16E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
30 | 45(G/T) | HPV16E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
31 | 85(A/C) | HPV16E7 | 探针信号值过于接近背景值,检测不出 |
32 | 86(A/G) | HPV16E7 | 探针信号值过于接近背景值,检测不出 |
33 | 136(G/A) | HPV16E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
34 | 151(C/A) | HPV16E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
35 | 169(T/C) | HPV16E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
36 | 171(T/G) | HPV16E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
37 | 188(C/T) | HPV16E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
38 | 196(C/T) | HPV16E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
39 | 223(G/A) | HPV16E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
40 | 258(A/G) | HPV16E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
41 | 262(G/A) | HPV16E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
42 | 94(G/C) | HPV58E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
43 | 258(C/A) | HPV58E6 | 探针信号值过于接近背景值,检测不出 |
44 | 279(A/C) | HPV58E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
45 | 26(G/A) | HPV58E7 | 探针信号值过于接近背景值,检测不出 |
46 | 40(G/A) | HPV58E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
47 | 121(G/A) | HPV58E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
48 | 187(G/A) | HPV58E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
49 | 220(A/G) | HPV58E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
50 | 225(C/T) | HPV58E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
51 | 228(C/A) | HPV58E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
52 | 230(T/C) | HPV58E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
53 | 233(G/C) | HPV58E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
54 | 251(T/A) | HPV58E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
55 | 272(T/G) | HPV58E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
56 | 49(C/T) | HPV18E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
57 | 183(C/G) | HPV18E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
58 | 445(C/A) | HPV18E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
59 | 90(T/C) | HPV52E6 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
60 | 110(C/T) | HPV52E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
61 | 175(T/G) | HPV52E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
62 | 181(C/T) | HPV52E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
63 | 190(G/A) | HPV52E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
64 | 249(A/G) | HPV52E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
65 | 296(T/G) | HPV52E7 | 检出信号与样品SNP情况相符 |
结果分析:65个SNP位点中的58个位点检出信号与样品SNP情况相符。7个SNP位点探针信号值过于接近背景值,检测不出,具体情况见表2-3。通过对已检出SNP位点分析表明,未检测出的SNP位点并不影响其他位点的检出率和整张芯片的质量。
以基因测序的结果为“金标准”,检验芯片杂交的准确性,表明芯片杂交结果与测序结果完全一致,一致率为100%。在实验中,我们也验证了HPV型别间交叉杂交情况,表明我们的芯片不存在交叉杂交现象,具有型特异性特点。通过比较HPV16E6重复性杂交结果表明了我们的芯片杂交的重复性好。
本实验所研究的用于检测HR-HPV型内变异情况的基于芯片技术的方法,基本能成功的检测HPVE6/E7基因型内变异,能准确检测相距较远的单个位点的变异和同时存在的多个位点的变异。与基因测序相比较,此方法具有速度快、通量高、重复性佳、操作方便等优点,且此HPVE6/E7型内变异芯片具有型别特异性。
本芯片的应用:
利用本芯片分别测定10例已知病检结果和10例不同感染状态的宫颈标本,进一步验证本芯片的准确性。
一、样品信息
二、实验操作过程同上;
三、结果:
Claims (8)
1.HR-HPV E6/E7基因SNP检测的固相芯片,该基因芯片包括固相载体和固定于其上的检测探针,其特征在于:所述的HR-HPV E6/E7基因的一个基因具有多个突变SNP位点,每个突变SNP位点设计若干条的检测探针序列,所述的HR-HPV E6/E7基因的一个基因具有所述检测探针序列的多条检测探针;所述的基因、突变SNP位点、检测探针序列如下所示:
。
2.HR-HPV E6/E7基因SNP检测的探针,其特征在于:该探针为SEQID No.1-225的核苷酸序列之一的序列。
3.一种用于HR-HPV E6/E7基因SNP检测的试剂盒,其特征在于该试剂盒包括:
1)包含HR-HPV样品的裂解液;
2)掺入荧光的多重PCR反应液;
3)权利要求1所述的固相芯片。
4.根据权利要求3所述的用于HR-HPV E6/E7基因SNP检测的试剂盒,其特征在于多重PCR的引物如下所示:
。
5.根据权利要求3所述的用于HR-HPV E6/E7基因SNP检测的试剂盒,其特征在于裂解液的成分为0.01M Tris-HCL pH8.0,0.005M EDTA pH8.0,SDS0.5%。
6.根据权利要求3所述的用于HR-HPV E6/E7基因SNP检测的试剂盒,其特征在于多重PCR反应液包括:
。
7.根据权利要求3所述的用于HR-HPV E6/E7基因SNP检测的试剂盒,其特征在于掺入荧光物质为cy3-dCTP。
8.根据权利要求3所述的用于HR-HPV E6/E7基因SNP检测的试剂盒,其特征在于该试剂盒的阳性对照为人β-globin基因,其扩增引物如下,与HR-HPVE6/E7同时扩增,同时检测:
β-globin GH20 5'-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3'
β-globin PC04 5'-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3'。
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