CN102994647B - 一种人乳头瘤病毒(hpv)的分型定量检测试剂盒 - Google Patents

一种人乳头瘤病毒(hpv)的分型定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测方法，包括如下步骤(1)收集宫颈样品；(2)样品DNA提取；(3)以提取的DNA样品为模板进行PCR反应；(4)以毛细电泳的方法分离样品。本发明具有灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的优点。

Description

一种人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测方法，尤其是一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测方法及试剂盒。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，简称HPV)是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性。根据致病力强弱，HPV被分为高危型和低危型两种，“是否能致癌”是危险度大小的主要标志。全世界每年宫颈癌的新发病例大约有500,000，是除乳腺癌之外威胁女性生命健康的第二大恶性肿瘤。HPV和宫颈癌的病因学关系已经明确，从HPV感染到宫颈癌发生需要较长时间，在此期间通过检测可以了解是否感染HPV，早发现早治疗，从而有效预防宫颈癌的发生。
目前主要的技术方法如下：1.原位杂交：优点是特异性好；缺点是操作繁琐费时耗力、需要大量较纯的DNA。2.DNA直接捕捉法：优点是有大量的数据支持该技术的应用，能检测高危型别；缺点是灵敏度低于PCR；不能确定具体的HPV亚型。3.亚型特异性PCR：优点是特异性较好；缺点是劳动强度大。4.通用引物PCR：优点是灵敏度高，一次可以扩增多种亚型；缺点是不能区分确定具体HPV的亚型。5.PCR产物直接测序：优点是在确定目前尚未知道的HPV亚型感染以及突变研究时尤其有用；缺点是不是十分灵敏，特别是对HPV混合感染的临床样本更是如此，不宜作为体外诊断方法。6.PCR-酶联免疫分析法：优点是灵敏度高；缺点是样本消耗大。7.PCR-固相反向杂交法：优点是效率高、一次实验可分出多个HPV亚型；缺点是重复性较差。8.荧光定量PCR：优点是灵敏度高、操作方便、耗时短；缺点是通量少、一次只能检测1-2个亚型、且不能确切分型。9.优点是成本相对较低，操作简单；缺点是可以观察到细胞形态的变化，但不能确定发生细胞形态变化的病因；取样的部位决定检测的结果。
综上，目前的人乳头瘤病毒(HPV)的主要检测方法存在操作繁琐费时耗力、灵敏度低、劳动强度大、样本消耗大、重复性较差、通量少的缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测方法。
本发明采用如下技术方案：
本发明的一个方面涉及一种人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测方法，包括如下步骤：(1)收集宫颈样品；(2)样品DNA提取；(3)以提取的DNA样品为模板进行PCR反应；(4)以毛细电泳的方法分离样品。
优选地，所述步骤(2)包括如下子步骤：
1)取500μL细胞保存液于1.5mL EP管中，13000g离心5分钟，去掉上清液，底部为宫颈脱落细胞；
2)向含有宫颈脱落细胞的EP管中加入500μL裂解液，裂解10分钟；
3)向裂解液中加入100μL磁珠吸附游离的DNA；
4)用清洗液将磁珠清洗两次；
5)100μL洗脱液洗脱DNA。
优选地，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。
优选地，所述步骤(3)的子步骤中的热循环温度分别为94℃、60℃、70℃、4℃。
优选地，所述步骤(4)包括制备GeXP遗传分析仪样品、准备分离液、毛细电泳分离样品、结果分析的步骤。
本发明的另一方面涉及一种用于上述方法的试剂盒，包括以下试剂：引物管、溶液X、PCR缓冲剂、25mM氯化镁、聚合酶以及阳性对照。
本发明的有益效果为：
1.灵敏度高、重复性好：采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度。
2.准确性强：GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性。
3.高通量：本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测30-40个位点，可同时做192个反应(如192个患者样品，每个样品检测19种呼吸道病毒，22个位点)，一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。
4.精确定量：可精确定量病原体基因拷贝数。
5.灵活性强：可随时根据需求增加或删减HPV亚型。
6.成本低：利于大规模推广。
具体实施方式
下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明创立了一种一次性检测25种HPV亚型，包括6种低危型6、11、42、43、44、81和19种高危型HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83的分型定量检测方案，具体亚型见表1。
本发明的25种HPV亚型的特异性引物是针对各亚型基因组上的致癌基因E6/E7设计的，再通过多重PCR和毛细电泳的方法，根据扩增片段长度的不同将各亚型分辨出来。
建立了可靠的样品质量及反应过程的对照(表1)
a)人DNA完整性的对照内参β-globin：确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性。
b)正常反应对照内参pcDNA3.1(+)：监控PCR反应效率，避免假阴性。
2.通过人为加入反应内参pcDNA3.1(+)对HPV亚型的拷贝数进行定量。
3.25种HPV分型检测的引物序列(见表2)。
表1.检测的HPV亚型和反应参照
表2.引物序列表
具体实施步骤：
1.宫颈样品收集
宫颈刷、细胞保存液
2.样品DNA提取
利用磁珠法可以同时提取HPV和人的DNA。基本原理如下：
6)取500μL细胞保存液于1.5mL EP管中，13000g离心5分钟，去掉上清液，底部为宫颈脱落细胞；
7)向含有宫颈脱落细胞的EP管中加入500μL裂解液，裂解10分钟；
8)向裂解液中加入100μL磁珠吸附游离的DNA；
9)用清洗液将磁珠清洗两次；
10)100μL洗脱液洗脱DNA。
3.以步骤2.提取的DNA样品为模板进行PCR反应
3.1按以下比例在96孔样品板或八连管中加入试剂和样品：
3.2混匀后按以下温度进行热循环反应：
3.2GenomeLab GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
3.3.1制备GeXP样品：
注：PCR产物量可为0.1-1μL，或用水按需要预稀释后上样
3.3.2准备分离液：将约220μL分离液加入96孔分离液板上适当数目的孔中
3.3.3毛细电泳分离样品。
3.3.4结果分析。
4.HPV分型定量检测试剂盒包括以下试剂：
引物管(Primer mix)
溶液X(Solution X)
PCR缓冲液(PCR Buffer)
25mM氯化镁(25mM MgCl2)
聚合酶(Taq polymerase)
阳性对照(Positive control)
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (1)

1.一种人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测试剂盒，其特征在于包括引物管、PCR缓冲剂、25mM氯化镁、聚合酶以及阳性对照，引物管中的HPV正向引物和HPV反向引物及反应内参如下表所示：
HPV亚型/内参 正向引物 反向引物 6 GAGAAACATGGCGTACCGGAA CTACCACCCAATCTGCACAT 11 CAGATCATCTGTAGCTAGTAGT AAACTCCTCCACATGGCGCA 16 GGAGGAGGATGAAATAGATG GCTTTGTACGCACAACCGAA 18 GACGCAGAGAAACACAAGTA CGGGCTGGTAAATGTTGAT 26 CGGTAACAGTGGTATTTGATTG CATTGCACACCTGTCCCATA 31 TCAAAGACCGTTGTGTCCAGA GGGTTTCAGTACGAGGTCTT 33 CTATGAGCAATTAAGTGACAGCT TGTACTGTTGACACATAAACGA 35 AATTACAGCGGAGTGAGG TGTCCACCGTCCACCGATGTTA 39 TGGCCAATCGTGAAGGTACA TGTCGCCACTGCTGTCT 42 ACGAACTAAGTCCTAGGCTT CTACCACCCTTGTTGTAGGCGTA 43 TAAGTGCCACAAGCCATTATCA TTTCCAGCAATGTAAGCAG 44 TGCTATTTGTGCCACAAACCAT GACCCTTCCAGGTATCTTGT 45 GTATATGGAGAGACACTGGA GCTATGCTGTGGAATCTTCGT 51 GGCTCCACCGTGCGCAGGGTC AAACCGCAGCAGTGGC 52 GAGCAATTAGGTGACAGCTC AATGTGCCCAACAGCATCTGCT 53 ATGGATCGCCAGTTATTT ACACAGCCAAGTTGCAGCTCCA 56 GGTGCTACAGATGTCAAAGTC GACCCGGTCCAACCATGTGCTAT 58 CCTGAACCAATTGACCTATTCT GGTTGTTGTACTGTTGATACA 59 GGACCCGAGCAAGACACCTAA CTCGTAGCACACAAGGTCAAC 66 CCATCTGAGCGAGGTAT TACCCTACATACTGCATATGGC 68 CAGTACGTTTTAGCAGAGTAG CCATAGGGTCAGACTGCT 73 CTGCAACTGTGGTGTAAGAT AATGGCAAGGCATACTGT 81 GGGCCAGCAAACCCTAC GTCCGAAGCACGAATATTGC 82 GGCACCGGGTCTGGCACTG CAAAGCCATCAGTACCAGTA 83 GCTACGGCACTGGAGCCACTCA TACCCTACACTGGCAGCA beta-globin CTCTTATCTTCCTCCCACAGCT GACTTAGGGAACAAAGGAACCT pcDNA3.1(+) CAGACAATCGGCTGCTCTGA GCTTCAGTGACAACGTCGA
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