CN1948503A - 一种人乳头瘤病毒检测分型方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种人乳头瘤病毒(HPV)检测分型方法及试剂盒，涉及引物与核酸探针，尤其涉及HPV检测分型的引物与核酸探针。本发明将低危HPV的不同亚型或高危HPV的不同亚型或是低/高危中的一些人群感染率极低的亚型的特异性探针固定在同一介质位置或在同一介质上；利用Luminex xMAP技术平台，将HPV特异性的寡核苷探针，固定在微球上，形成检测HPV亚型的微球探针，形成HPV分型流式芯片。本发明提供了操作简单的HPV检测分型方法及其试剂盒，不仅高灵敏度、高通量，而且结果稳定、重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及核酸探针，尤其涉及人乳头瘤病毒(HPV)检测分型的核酸探针及其试剂盒。
背景技术
人类乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，长期以来，已知HPV可引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。目前已经确定的HPV型别大约有80余种，依其感染的上皮所在部位分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，大约35种型别可感染妇女生殖道，约20种与肿瘤相关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别HPV，低危险型别HPV包括HPV6、11、40、42、43、44、53和54等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CIN I)，高危险型HPV包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73、82和83等型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CIN II/III)的发生相关，尤其是HPV16和18型。
传统的宫颈癌筛查方法有以下几种：肉眼观察法、巴氏细胞学涂片和薄层液基细胞学技术。由于上述方法可以得出一些细胞学诊断结果，但是下一步该如何处理，正确的判断往往很困难，HPV检测将有利于指导进一步处理。同时，细胞学和HPV联合检测具有更高的阴性预测值(＞99％)，提供评价妇女风险状态的客观指标，减少检测结果阴性人群的顾虑。HPV分型检测，方法简单、效率高，敏感度高，特异性强、重复性好，适合于大样本筛查，是最有效最准确的宫颈癌早期检测手段。以下将目前常见的检测分型方法及其优缺点概括于表1，它们在一些相关的专利文献中都有提及。
表1 常见的HPV检测分型方法及其优缺点
| 方法 | 优点 | 缺点 |
| 原位杂交 | 特异性好 | 操作繁琐费时耗力，需要大量较纯的DNA、需要大量的型特异的探针，不适合于大通量临床样本的筛查。 |
| DNA直接捕捉法(HC II，DigeneCorp.，USA) | 有大量的数据支持该技术的应用，能够分出低危型和高危型HPV检测 | 灵敏度低于PCR扩增方法，不能确定具体的HPV亚型，且存在交叉反应，影响其检测的准确性。 |
| 亚型特异性PCR | 特异性较好 | 劳动强度大 |
| 通用引物PCR | 灵敏度高，一次可以扩增多种亚型 | 不能区分确定具体HPV的亚型 |
| PCR产物直接测序 | 在确定目前尚未知道的HPV亚型感染以及突变研究时尤其有用 | 不是十分灵敏，特别是对HPV混合感染的临床样本更是如此，不宜作为体外诊断方法。 |
| PCR-酶联免疫分析法 | 灵敏度高 | 样本消耗大 |
| PCR-固相反向杂交法 | 效率高，一次实验可分出多个HPV亚型。 | 重复性较差 |
在某些基因分型的临床检测中，确定人群中稀有基因型并无实际意义，同时对资源也是一种浪费。如目前报道发现的HPV亚型有将近100种之多，人群中感染HPV各亚型的比例也不相同，不同的文献报道有一定的差异，但几乎所有的报道数据均显示HPV6、HPV11、HPV16和HPV18是主要的类型，占HPV感染的绝大多数，所占比例达98％以上。根据临床需要，应分清这些主要的类型，所以相应的探针必须严格区分开；而对于其它罕见类型，特别是低危型，分清每种型别的临床价值不大。
为此，本领域迫切需要一种高灵敏度、高通量、结果稳定、重复性好；在满足临床需要的同时又不使检测工作复杂化而无谓增加检测成本的HPV检测分型方法。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种高灵敏度、高通量、结果稳定、重复性好，而且操作简单的用于HPV检测分型的核酸探针及其试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种检测人乳头瘤病毒HPV的核酸探针微球集，其特征在于，它包括2-60种不同荧光编码的微球，以及每种所述荧光编码微球上固定有的1～20种人乳头瘤病毒特异性核酸探针，并且至少有一种荧光编码微球上有2-20种人乳头瘤病毒特异性核酸探针；
其中，所述的1～20种人乳头瘤病毒特异性核酸探针选自下组：
(a)针对低危型别HPV的不同亚型的人乳头瘤病毒特异性核酸探针；
(b)针对高危型别HPV的不同亚型的人乳头瘤病毒特异性核酸探针。
在另一优选例中，所述的低危险型别HPV选自下组：HPV6、11、40、42、43、44、53或54型别；
所述的高危险型别HPV选自下组：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73、82或83。
在另一优选例中，固定于所述微球上的人乳头瘤病毒特异性核酸探针选自下组：
(i)HPV6、HPV11、HPV53、HPV54；
(ii)HPV40、HPV42、HPV43和HPV44；
(iii)HPV16、HPV18、HPV31、HPV51
(iv)HPV33、HPV35、HPV39、HPV56；
(v)HPV45、HPV52、HPV58HPV59、HPV66；并且
探针包被在荧光编码的微球上。
在另一优选例中，所述的荧光编码微球的表面共价连接核酸探针。
在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒特异性核酸探针的序列如下：
HPV06 5′AGACGTTCGATTTCCACTAC3′ SEQ ID NO：1
HPV11 5′GGGGGTAATAACAGATCATC3′ SEQ ID NO：2
HPV53 5′TTTCCTCACCAATAACGC3′ SEQ ID NO：3
HPV54 5′GGAGTTGCAGCATAAATAGA3′ SEQ ID NO：4
HPV40 5′CAATAGGAGTCCGACCAG3′ SEQ ID NO：5
HPV42 5′GGCAGACATAATTTAGGTAGTA3′ SEQ ID NO：6
HPV43 5′TCTAATACCAGGTCCAAAAT3′ SEQ ID NO：7
HPV44 5′GCACTTTTAATAACCAGATCCT3′ SEQ ID NO：8
HPV16 5′GAAAATAATTTGAACTGGCT3′ SEQ ID NO：9
HPV18 5′CAGGTATGCCTGCTTCAC3′ SEQ ID NO：10
HPV31 5′CAGTAGGGACCGATTCAC3′ SEQ ID NO：11
HPV33 5′ACTACTGCCTCTATTCAAAGC3′ SEQ ID NO：12
HPV35 5′GCTGGAACTGTAGGTGAAA3′ SEQ ID NO：13
HPV39 5′CCACCATACCACCACGAT3′ SEQ ID NO：14
HPV45 5′ACGCATATTAGCGCTAGTG3′ SEQ ID NO：15
HPV52 5′ATACAAGGGTCTAACTCTGGC3′ SEQ ID NO：16
HPV58 5′GGGTCCGGTAATACTGC3′ SEQ ID NO：17
HPV26 5′CCCCTACATCTTCTATTTATTC3′ SEQ ID NO：18
HPV51 5′TTCCCCAACACCTACAAG3′ SEQ ID NO：19
HPV55 5′GGCATTAGGAACTGTACTTTT3′ SEQ ID NO：20
HPV56 5′CCCCTCCGAGTTCTGTAT3′ SEQ ID NO：21
HPV59 5′AACCCAGGCAGTTATTTAT3′ SEQ ID NO：22
HPV61 5′TTAAGGGTGCGAATGACA3′ SEQ ID NO：23
HPV66 5′GCCACCCTTCCAATACAA3′ SEQ ID NO：24
HPV68 5′TAAGGGCACTGACATTCG3′ SEQ ID NO：25
HPV73 5′CTGGGATTTTATCACCGG3′ SEQ ID NO：26
HPV83 5′GGTGCTGCCTACCTCTTA3′ SEQ ID NO：27
HPV82 5′TAAGGGTACTGGTGCTGG3′ SEQ ID NO：28。
在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，它包括：容器以及位于容器内本发明上述的检测人乳头瘤病毒的核酸探针微球集。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括通用引物，杂交试剂和信号标记试剂。
更佳地，所述的引物是针对于HPV基因组中L1区域内的一个区域设计的一组引物系统(BT/12F-BT/12R)。
更佳地，所述的引物中还有扩增Human Golbin基因片段的一对引物用来作为内对照片段。
在另一优选例中，所述的核酸探针是HPV分型流式芯片。
在另一优选例中，固定于所述的微球上的人乳头瘤病毒特异性核酸探针选自下组：
(i)HPV6、HPV11、HPV53、HPV54
(ii)HPV40、HPV42、HPV43和HPV44
(iii)HPV16、HPV18、HPV31、HPV51；
(iv)HPV33、HPV35、HPV39、HPV56；
(v)HPV45、HPV52、HPV58、HPV59、HPV66；
并且所述的探针包被在荧光编码的微球上。
在本发明的第三方面，提供了本发明上述检测人乳头瘤病毒(HPV)的核酸探针微球的用途，所述的用途选自下组：(a)体外检测HPV的存在及其亚型中的应用；(b)制备检测人乳头瘤病毒的试剂盒。
在本发明的第四方面，提供了一种体外检测样本中是否存在HPV的方法，所述的方法包括：
(a)抽提所述的样本的DNA，并用HPV特异性引物进行扩增，获得扩增产物；
(b)将步骤(a)中的扩增产物与本发明上述的检测人乳头瘤病毒(HPV)的核酸探针微球集混合；
(c)检测微球上的核酸探针是否与扩增产物结合，其中微球上的核酸探针与扩增产物结合就表明样本中存在人乳头瘤病毒。
在另一优选例中，步骤(c)中的检测方法是Luminex xMAP。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现可以将低危HPV的不同亚型或高危HPV的不同亚型或是低/高危中的一些人群感染率极低的亚型固定在同一介质位置或在同一介质上，可以实现一个介质位置或介质种类同时可以检测几种不同的基因型别的存在；另外发明人利用Luminex xMAP技术平台，将HPV特异性的寡核苷探针，固定在微球上，形成检测HPV亚型的微球探针，并按照一定的数量比例混合在一起形成HPV分型流式芯片，同通用引物、杂交试剂和信号标记试剂一起制成相应的试剂盒。
本发明所称的HPV流式芯片是指不同荧光编码微球的一个混合体，其中不同荧光编码微球的表面共价连接着针对不同HPV亚型核苷酸序列的特异性寡核苷酸探针。
HPV流式芯片具体的制作方法为先将特定序列的寡核苷酸探针的5’端进行化学修饰，使其带有一个NH2基团，同荧光编码聚苯乙烯微球表面的羧基形成酰氨键，从而将两者连接在一起；不同特异性的寡核苷探针，分别固定在不同微球上，形成检测不同HPV亚型的微球探针；将带有不同特异性寡核苷酸探针的微球按照一定的数量比例混合在一起形成HPV分型流式芯片；上述的将寡核苷酸探针固定到微球上的方法是每种寡核苷酸探针分别包被在不同荧光编号的微球上，形成一对一的关系。
针对不同HPV亚型的特异性寡核苷酸探针的序列如下：
| 名称 | 序列 | SEQ ID NO |
| HPV06 | 5′AGACGTTCGATTTCCACTAC 3′ | 01 |
| HPV11 | 5′GGGGGTAATAACAGATCATC3′ | 02 |
| HPV53 | 5′TTTCCTCACCAATAACGC3′ | 03 |
| HPV54 | 5′GGAGTTGCAGCATAAATAGA3′ | 04 |
| HPV40 | 5′CAATAGGAGTCCGACCAG3′ | 05 |
| HPV42 | 5′GGCAGACATAATTTAGGTAGTA3′ | 06 |
| HPV43 | 5′TCTAATACCAGGTCCAAAAT3′ | 07 |
| HPV44 | 5′GCACTTTTAATAACCAGATCCT3′ | 08 |
| HPV16 | 5′GAAAATAATTTGAACTGGCT3′ | 09 |
| HPV18 | 5′CAGGTATGCCTGCTTCAC3′ | 10 |
| HPV31 | 5′CAGTAGGGACCGATTCAC3′ | 11 |
| HPV33 | 5′ACTACTGCCTCTATTCAAAGC3′ | 12 |
| HPV35 | 5′GCTGGAACTGTAGGTGAAA3′ | 13 |
| HPV39 | 5′CCACCATACCACCACGAT3′ | 14 |
| HPV45 | 5′ACGCATATTAGCGCTAGTG3′ | 15 |
| HPV52 | 5′ATACAAGGGTCTAACTCTGGC3′ | 16 |
| HPV58 | 5′GGGTCCGGTAATACTGC3′ | 17 |
| HPV26 | 5′CCCCTACATCTTCTATTTATTC3′ | 18 |
| HPV51 | 5′TTCCCCAACACCTACAAG3′ | 19 |
| HPV55 | 5′GGCATTAGGAACTGTACTTTT3′ | 20 |
| HPV56 | 5′CCCCTCCGAGTTCTGTAT3′ | 21 |
| HPV59 | 5′AACCCAGGCAGTTATTTAT3′ | 22 |
| HPV61 | 5′TTAAGGGTGCGAATGACA3′ | 23 |
| HPV66 | 5′GCCACCCTTCCAATACAA3′ | 24 |
| HPV68 | 5′TAAGGGCACTGACATTCG3′ | 25 |
| HPV73 | 5′CTGGGATTTTATCACCGG3′ | 26 |
| HPV83 | 5′GGTGCTGCCTACCTCTTA3′ | 27 |
| HPV82 | 5′TAAGGGTACTGGTGCTGG3′ | 28 |
在满足临床需要的前提下，为了节约成本并简化检测工作，本发明还提供了一种寡核苷酸探针混合包被的方法，即将针对于低危HPV的不同亚型或高危HPV的不同亚型或是低/高危中的一些人群感染率极低的亚型的探针包被在同一个微球上，不加以具体区分而同时检测几种亚型的方法。以下举例说明这种探针固定思路。若要检测的基因型别有A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8和A9(数量可以任意变化)，设计检测上述型别的特异性探针为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8和B9，将探针B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8和B9分别固定在介质的不同位置或介质的不同种类C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8和C9上，形成一个介质位置或介质种类对应一种探针，检测一种基因型别。
当检测的基因型别存在以下的情形时：
1.一些基因型别如A1、A2、A5和A9具有相同的临床检测意义，A1、A2、A5和A9的单独存在或者同时存在没有累计、叠加的剂量效应，可以为临床的治疗提供相同的信息，同时区别A1、A2、A5和A9之间的型别没有实际的意义。
2.一些基因型别如A1、A2、A5和A9在被检测对象中所占总的基因型别的比例很少，
没有必要按照传统的作法，将对应于基因型别A1、A2、A5和A9对应的探针B1、B2、B5和B9分别固定在C1、C2、C5和C9，而可以将探针B1、B2、B5和B9固定在C1一个位置。这样可以实现一个介质位置或介质种类同时可以检测四种不同的基因型别的存在，虽然不能区分具体四种中的哪一种或哪几种。
本发明所称的通用引物是专门针对于HPV基因组中L1区域内的一个区域设计的一组引物系统(BT/12F-BT/12R)，包括12条正向和12条反向引物，另外还有扩增Human Golbin基因片段的一对引物用来作为内对照片段的扩增。
本发明提供了用于HPV06、11、53、54、40、42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、52、58、26、51、55、56、59、61、66、68、73、83、82亚型DNA扩增的引物系统BT/12F-BT/12R，所有引物5′端均标记Biotin。
BT/12F-BT/12R引物系统序列如下：
| 引物序列 | SEQ ID NO： |
| BT/12F： | |
| 5′AAATATCCAGATTATTTAAAAATG 3′ | 29 |
| 5′AAATATCCTGACTATTTAAAAATG 3′ | 30 |
| 5′AAATACCCTGATTACTTAAAAATG 3′ | 31 |
| 5′AAATATCCTGATTATCTAAAAATG 3′ | 32 |
| 5′AAATATCCTGATTACCTTAAAATG 3′ | 33 |
| 5′AAATATCCAGATTATATTAAAATG 3′ | 34 |
| 5′AAATATCCTGATTATTTGCAAATG 3′ | 35 |
| 5′AAATATCCTGACTATTTGCAAATG 3′ | 36 |
| 5′AAATATCCTGATTATTTACAAATG 3′ | 37 |
| 5′AAATATCCTGACTATTTACAAATG 3′ | 38 |
| 5′AAATATCCAGATTATTTGGGAATG 3′ | 39 |
| 5′AAATACCCAGATTATTTAGGCATG 3′ | 40 |
| BT/12R | |
| 5′CCAATATGGTTTATTAAATAATTG 3′ | 41 |
| 5′CCAATATGGCTTATTAAACAATTG 3′ | 42 |
| 5′CCATAAGGGTTTGTTAAACAATTG 3′ | 43 |
| 5′CCAATATGGTTTATTAAATATTTG 3′ | 44 |
| 5′CCAATAAGGTTTATTGAATATTTG 3′ | 45 |
| 5′CCAATATGGTTTATTAAAAATTTG 3′ | 46 |
| 5′CCAGTAGGGCTTATTAAATAGTTG 3′ | 47 |
| 5′CCAATAAGGCTTATTAAATAACTG 3′ | 48 |
| 5′CCAATAGGGCTTGTTAAATAACTG 3′ | 49 |
| 5′CCAATATGGTTTATTAAACAACTG 3′ | 50 |
| 5′CCAATAAGGCTTATTAAAAATCTG 3′ | 51 |
| 5′CCACAATGGCTTGTTAAATATCTG 3′ | 52 |
本发明所称的杂交是PCR产物变性后和HPV芯片充分混合，在一定的条件下进行核酸的杂交。
本发明所称的信号标记是在杂交完成后加入标记了藻红蛋白(PE)的Strepavidin，最终形成微球-探针-PCR产物-Biotin-StrepAvidin-PE复合物。
本发明使用Luminex xMAP对杂交的结果进行检测，并根据本发明提供的标准进行判定。
本发明的主要优点在于：
1、高灵敏度、高通量、结果稳定、重复性好；
2、在满足临床需要的同时又不使检测工作复杂化，节约成本。
下面结合具体实施例详细说明本发明，但并不能理解为对本发明的限制。所述的实施例只提供阐明核酸探针、试剂盒及其制作和应用方法而不为其所限制。其间各种变化形式在本发明和所附的权项的范围内是可预期的。
实施例1：
探针一对一包被方式
一、检测HPV6、HPV11、HPV16和HPV18的芯片的制备：
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针
| 名称 | 序列 | SEQ IDNO |
| HPV06 | 5′NH2TTTTTTTTTTAGACGTTCGATTTCCACTAC3′ | 01 |
| HPV11 | 5′NH2TTTTTTTTTTGGGGGTAATAACAGATCATC3′ | 02 |
| HPV16 | 5′NH2TTTTTTTTTTACCTCTGATGCCCAAATA3′ | 09 |
| HPV18 | 5′NH2TTTTTTTTTTCAGGTATGCCTGCTTCAC3′ | 11 |
| Globin | 5′NH2TTTTTTTTTTCCCTGACTTTTATGCCCAG-3′ | 53 |
| (阳性对照) | ||
| NC(阴性对照) | 5′NH2TTTTTTTTTTCGTTAGGTCGGAGCTTGATC-3′ | 54 |
2.选取编号31、32、33、34、35、和36号6种微球【Luminex公司】按照如下的方法进行探针的包被：
(1)将31、32、33、34、35、和36号6种微球和-20℃保存的一份EDC粉末置于
室温下平衡30分钟；
(2)将HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、Globin和NC探针用双蒸水溶解，浓度
为0.01mM(10pmole/μL)；
(3)用振荡器将微球混合均匀；
(4)各取50ul(6.0×105)微球，放入预先标记号码的洁净的Ep管中；
(5)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，小心弃取上清液；
(6)加入100ul双蒸水，充分振荡悬浮微球，8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(7)弃去上清液，用50ul 0.1M MES(pH 4.5)重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(8)每一种探针各自取2ul(10pmole/μL)加到上步骤中的对应的微球悬液中，用振荡器混匀；
(9)按10mg/mL新鲜配制EDC溶液；
(10)取2.5ul上步骤的EDC溶液加入各微球悬液中(25μg or≈[0.5μg/μL]final)，用振荡器混匀；
(11)避光，37℃静置30分钟；
(12)重复(10)-(11)步骤；
(13)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(14)弃去上清液，用1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(15)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(16)弃去上清液，用100ul TE(pH 8.0)重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(17)微球计数：
a.将连接好的微球悬液用水稀释50倍；
b.振荡器混匀；
c.取10ul到计数板上；
d.对四个角上的计数室内的微球计数；
e.计算微球悬液的浓度；
五种微球的计数结果都约为：6×103个/ul
(18)将连接好的微球避光保存在2-10℃条件下。
3.芯片制备：
取等体积的上述包被有探针的微球进行混合，各种微球的终浓度为1.2×103个/ul，2-10℃条件下避光保存，即为检测HPV6、HPV11、HPV16和HPV18的流式芯片。
二、样本的制备
1～5号宫颈表皮脱落细胞的临床样本样本按照下面的步骤抽提DNA：
1.将装有样本的市售细胞保存液漩涡振荡5秒，以使脱落细胞悬浮起来；
2.取1ml保存液于1.5ml离心管中，8000转/分钟离心5分钟；
3.小心倾倒丢弃上清；
4.加入500μlpH7.4磷酸缓冲液，漩涡振荡10秒；
5.8000转/分钟离心5分钟，小心倾倒丢弃上清；
6.加入90μlpH7.4磷酸缓冲液，漩涡振荡20秒，加入10μl市售消化液，漩涡振荡5秒；
7.将离心管置55℃水浴消化1小时；
8.100℃水浴变性15分钟。
所抽提产物直接用于PCR，如暂时不用，可于-20℃保存。样本
三、PCR扩增
1.按照如下的序列合成HPV PCR扩增的通用引物：
BT/12F
5′生物素-AAATATCCAGATTATTTAAAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGACTATTTAAAAATG 3′
5′生物素-AAATACCCTGATTACTTAAAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGATTATCTAAAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGATTACCTTAAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCAGATTATATTAAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGATTATTTGCAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGACTATTTGCAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGATTATTTACAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGACTATTTACAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCAGATTATTTGGGAATG 3′
5′生物素-AAATACCCAGATTATTTAGGCATG 3′
5′生物素-GGCCAATCTACTCCCAGGG-3′GF
BT/12R
5′生物素-CCAATATGGTTTATTAAATAATTG 3′
5′生物素-CCAATATGGCTTATTAAACAATTG 3′
5′生物素-CCATAAGGGTTTGTTAAACAATTG 3′
5′生物素-CCAATATGGTTTATTAAATATTTG 3′
5′生物素-CCAATAAGGTTTATTGAATATTTG 3′
5′生物素-CCAATATGGTTTATTAAAAATTTG 3′
5′生物素-CCAGTAGGGCTTATTAAATAGTTG 3′
5′生物素-CCAATAAGGCTTATTAAATAACTG 3′
5′生物素-CCAATAGGGCTTGTTAAATAACTG 3′
5′生物素-CCAATATGGTTTATTAAACAACTG 3′
5′生物素-CCAATAAGGCTTATTAAAAATCTG 3′
5′生物素-CCACAATGGCTTGTTAAATATCTG 3′
5′生物素-AGGTTGTCCAGGTGAGCCA-3′GR
2.混合引物工作液的配制：
(1)合成的每条引物配制成100pmol/L的储备液；
(2)分别取各引物储备液4ul加入同一容器中，加入ddH2O 288ul补足体积到400ul，混合均匀为混合引物工作液；
3.HPV PCR扩增：
反应体系：
V0＝20ul
预混缓冲液(2×) 10.0ul
混合引物工作液 5.0ul
模板 5.0ul
扩增程序：95℃5分钟→95℃30秒、52℃1分钟、72℃1分钟(共40个循环)→72℃5分钟→4℃保温。
四、杂交
1.取上述1-5号5份临床样本样本的PCR扩增产物各5ul至1-5号的洁净EP管中，分别加12ul TE缓冲液混匀后95℃变性5分钟，立即放在冰上5分钟；
2.分别加入33ul1.5×杂交液(含六种微球，数量是2000个/种)，混匀，48℃杂交15分钟；
五、信号标记及检测
1、分别加入150ul(内含有2ng/mlPE)TE缓冲液，混匀，48℃保温5分钟，形成微球-探针-PCR产物-Biotin-StrepAvidin-PE复合物；
2、使用Luminex xMAP对杂交的结果进行检测，并根据本发明提供的标准进行结果判定。
样本
结果如下：
六、数据分析
依据本试剂盒判定规则判定上述1-5号样本的检测结果如下：
检测读数/阴性探针读数≥2.0为阳性；
检测读数/阴性探针读数＜2.0为阴性
结果说明
1号样本为HPV06感染；
2号样本未感染以上HPV的亚型；
3号样本为HPV06，HPV11和HPV18混合感染；
4号样本为HPV16和HPV18混合感染；
5号样本为HPV06和HPV16混合感染。
实施例2：
探针混合包被方式
一、检测HPV6、HPV11、HPV53、HPV54、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV59、HPV58和HPV66的芯片的制备：
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针
| HPV06 | 5′NH2TTTTTTTTTTAGACGTTCGATTTCCACTAC 3′ |
| HPV11 | 5′NH2TTTTTTTTTTGGGGGTAATAACAGATCATC 3′ |
| HPV53 | 5′NH2TTTTTTTTTTTTTCCTCACCAATAACGC 3′ |
| HPV54 | 5′NH2TTTTTTTTTTGGAGTTGCAGCATAAATAGA 3′ |
| HPV40 | 5′NH2TTTTTTTTTTCAATAGGAGTCCGACCAG 3′ |
| HPV42 | 5′NH2TTTTTTTTTTGGCAGACATAATTTAGGTAGTA 3′ |
| HPV43 | 5′NH2TTTTTTTTTTTCTAATACCAGGTCCAAAAT 3′ |
| HPV44 | 5′NH2TTTTTTTTTTGCACTTTTAATAACCAGATCCT3′ |
| HPV16 | 5′NH2TTTTTTTTTTGAAAATAATTTGAACTGGCT 3′ |
| HPV16 | 5′NH2TTTTTTTTTTACCTCTGATGCCCAAATA 3′ |
| HPV18 | 5′NH2TTTTTTTTTTCAGGTATGCCTGCTTCAC 3′ |
| HPV31 | 5′NH2TTTTTTTTTTCAGTAGGGACCGATTCAC 3′ |
| HPV33 | 5′NH2TTTTTTTTTTACTACTGCCTCTATTCAAAGC 3′ |
| HPV35 | 5′NH2TTTTTTTTTTGCTGGAACTGTAGGTGAAA 3′ |
| HPV39 | 5′NH2TTTTTTTTTTCCACCATACCACCACGAT 3′ |
| HPV45 | 5′NH2TTTTTTTTTTACGCATATTAGCGCTAGTG 3′ |
| HPV52 | 5′NH2TTTTTTTTTTATACAAGGGTCTAACTCTGGC 3′ |
| HPV51 | 5′NH2TTTTTTTTTTTTCCCCAACACCTACAAG3′ |
| HPV56 | 5′NH2TTTTTTTTTTTTCCCCTCCGAGTTCTGTAT3′ |
| HPV59 | 5′NH2TTTTTTTTTTTTAACCCAGGCAGTTATTTAT3′ |
| HPV66 | 5′NH2TTTTTTTTTTTTGCCACCCTTCCAATACAA3′ |
| HPV58 | 5′NH2TTTTTTTTTTGGGTCCGGTAATACTGC 3′ |
| Globin(阳性对照) | 5′NH2TTTTTTTTTTCCCTGACTTTTATGCCCAG-3′ |
| NC(阴性对照) | 5′NH2TTTTTTTTTTCGTTAGGTCGGAGCTTGATC-3′ |
2.选取编号31、32、33、34、35、36和42号7种微球【Luminex公司】，按照如下对应方式和方法进行探针的包被：
对应方式：
HPV6、HPV11、HPV53、HPV54 对应一种微球L1
HPV40、HPV42、HPV43和HPV44 对应一种微球L2
HPV16、HPV18、HPV31、HPV51 对应一种微球-H1
HPV33、HPV35、HPV39、HPV56 对应一种微球-H2
HPV45、HPV52、HPV58、HPV59、HPV66 对应一种微球H3
Globin 对应一种微球
NC 对应一种微球
方法：
(1)将31、32、33、34、35、36和42号7种微球和-20℃保存的一份EDC粉末置于室温下平衡30分钟；
(2)将HPV6、HPV11、HPV53、HPV54、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV52和HPV58探针用双蒸水溶解，浓度为0.01mM(10pmole/μL)；
(3)用振荡器将微球混合均匀；
(4)各取50ul(6.0×105)微球，放入预先标记号码的洁净的Ep管中；
(5)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，小心弃取上清液；
(6)加入100ul双蒸水，充分振荡悬浮微球，8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(7)弃去上清液，用50ul 0.1M MES(pH 4.5)重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(8)预先配制好适合浓度的探针，使得各组合探针最终浓度仍然保持在10pmole/μL；
(9)每一种探针各自取2ul(10pmole/μL)加到上述步骤中对应的微球悬液中，用振荡器混匀；
(10)按10mg/mL新鲜配制EDC溶液；
(11)取2.5ul上步骤的EDC溶液加入各微球悬液中(25μg or≈[0.5μg/μL]final)，用振荡器混匀；
(12)避光，37℃静置30分钟；
(13)重复(11)-(12)步骤；
(14)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(15)弃去上清液，用1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(16)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(17)弃去上清液，用100ul TE(pH 8.0)重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(18)微球计数：
a.将连接好的微球悬液用水稀释50倍；
b.振荡器混匀；
c.取10ul到计数板上；
d.对四个角上的计数室内的微球计数；
e.计算微球悬液的浓度；
五种微球的计数结果都约为：6×103个/ul
(19)将连接好的微球避光保存在2-10℃条件下。
3.芯片制备：
取等体积的上述包被有探针的微球进行混合，通过离心后调整各种微球的终浓度为1.2×103个/ul，2-10℃条件下避光保存，既是检测HPV6、HPV11、HPV53、HPV54、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV52和HPV58的流式芯片。
二、样本的制备
1～5号宫颈表皮脱落细胞的临床样本按照下面的步骤抽提DNA：
1.将装有样本的市售细胞保存液漩涡振荡5秒，以使脱落细胞悬浮起来；
2.取1ml保存液于1.5ml离心管中，8000转/分钟离心5分钟；
3.小心倾倒丢弃上清；
4.加入500μlpH7.4磷酸缓冲液，漩涡振荡10秒；
5.8000转/分钟离心5分钟，小心倾倒丢弃上清；
6.加入90μlpH7.4磷酸缓冲液，漩涡振荡20秒，加入10μl市售消化液，漩涡振荡5秒；
7.将离心管置55℃水浴消化1小时；
8.100℃水浴变性15分钟。
所抽提产物直接用于PCR，如暂时不用，可于-20℃保存。
样本样本
三、PCR扩增
按照如下的方法对上述的1-5号样本DNA进行扩增：
1.按照如下的序列合成HPV PCR扩增的通用引物：
BT/12F
5′生物素-AAATATCCAGATTATTTAAAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGACTATTTAAAAATG 3′
5′生物素-AAATACCCTGATTACTTAAAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGATTATCTAAAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGATTACCTTAAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCAGATTATATTAAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGATTATTTGCAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGACTATTTGCAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGATTATTTACAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCTGACTATTTACAAATG 3′
5′生物素-AAATATCCAGATTATTTGGGAATG 3′
5′生物素-AAATACCCAGATTATTTAGGCATG 3′
5′生物素-GGCCAATCTACTCCCAGGG-3′GF
BT/12R
5′生物素-CCAATATGGTTTATTAAATAATTG 3′
5′生物素-CCAATATGGCTTATTAAACAATTG 3′
5′生物素-CCATAAGGGTTTGTTAAACAATTG 3′
5′生物素-CCAATATGGTTTATTAAATATTTG 3′
5′生物素-CCAATAAGGTTTATTGAATATTTG 3′
5′生物素-CCAATATGGTTTATTAAAAATTTG 3′
5′生物素-CCAGTAGGGCTTATTAAATAGTTG 3′
5′生物素-CCAATAAGGCTTATTAAATAACTG 3′
5′生物素-CCAATAGGGCTTGTTAAATAACTG 3′
5′生物素-CCAATATGGTTTATTAAACAACTG 3′
5′生物素-CCAATAAGGCTTATTAAAAATCTG 3′
5′生物素-CCACAATGGCTTGTTAAATATCTG 3′
5′生物素-AGGTTGTCCAGGTGAGCCA-3′GR
2.混合引物工作液的配制：
(1)合成的每条引物配制成100pmol/L的储备液；
(2)分别取各引物储备液4ul加入同一容器中，加入ddH2O 288ul补足体积到400ul，混合均匀为混合引物工作液；
3.HPV PCR扩增：
反应体系：
V0＝20ul
预混缓冲液(2×) 10.0ul
混合引物工作液 5.0ul
模板 5.0ul
扩增程序：95℃5分钟→95℃30秒、52℃1分钟、72℃1分钟(共40个循环)→72℃5分钟→4℃保温。
四、杂交
1.取上述1-5号5份临床样本的PCR扩增产物各5ul至1-5号的洁净EP管中，分别加入12ul TE缓冲液混匀后95℃变性5分钟，立即放在冰上5分钟；
2.分别加入33ul1.5×杂交液(含六种微球，数量是2000个/种)，混匀，48℃杂交15分钟；
五、信号标记及检测
1、分别加入150ul(内含有2ng/mlPE)TE缓冲液，混匀，48℃保温5分钟，形成微球-探针-PCR产物-Biotin-StrepAvidin-PE复合物；
2、使用Luminex xMAP对杂交的结果进行检测，并根据本发明提供的标准进行结果判定。
结果如下：
六、数据分析
依据本试剂盒判定规则判定上述1-5号样本的检测结果如下：
检测读数/阴性探针读数≥2.0为阳性；
检测读数/阴性探针读数＜2.0为阴性
结果说明
1号样本为HPV6、HPV11、HPV53、HPV54之一或几种和HPV40、HPV42、HPV43、HPV44之一或几种的混合感染；
2号样本未感染HPV6、HPV11、HPV53、HPV54、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV66中的任何亚型；
3号样本为HPV6、HPV11、HPV53、HPV54之一或几种和HPV16、HPV18、HPV31、HPV51之一或几种及HPV33、HPV35、HPV39、HPV56之一或几种的混合感染；
4号样本为HPV40、HPV42、HPV43、HPV44之一或几种和HPV16、HPV18、HPV31、HPV51之一或几种的混合感染；
5号样本为HPV6、HPV11、HPV53、HPV54之一或几种和HPV16、HPV18、HPV31、HPV51之一或几种及HPV33、HPV35、HPV39、HPV56之一或几种的混合感染。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海透景生命科技有限公司
<120>一种人乳头瘤病毒检测分型方法及试剂盒
<130>055755
<160>54
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>1
agacgttcga tttccactac 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>2
gggggtaata acagatcatc 20
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>3
tttcctcacc aataacgc 18
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>4
ggagttgcag cataaataga 20
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>5
caataggagt ccgaccag 18
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>引物
<400>6
ggcagacata atttaggtag ta 22
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>7
tctaatacca ggtccaaaat 20
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>引物
<400>8
gcacttttaa taaccagatc ct 22
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>9
gaaaataatt tgaactggct 20
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>10
caggtatgcc tgcttcac 18
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>11
cagtagggac cgattcac 18
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>引物
<400>12
actactgcct ctattcaaag c 21
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>13
gctggaactg taggtgaaa 19
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>14
ccaccatacc accacgat 18
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>15
acgcatatta gcgctagtg 19
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>引物
<400>16
atacaagggt ctaactctgg c 21
<210>17
<211>17
<212>DNA
<213>引物
<400>17
gggtccggta atactgc 17
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>引物
<400>18
cccctacatc ttctatttat tc 22
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>19
ttccccaaca cctacaag 18
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>引物
<400>20
ggcattagga actgtacttt t 21
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>21
cccctccgag ttctgtat 18
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>22
aacccaggca gttatttat 19
<210>23
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>23
ttaagggtgc gaatgaca 18
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>24
gccacccttc caatacaa 18
<210>25
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>25
taagggcact gacattcg 18
<210>26
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>26
ctgggatttt atcaccgg 18
<210>27
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>27
ggtgctgcct acctctta 18
<210>28
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>28
taagggtact ggtgctgg 18
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>29
aaatatccag attatttaaa aatg 24
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>30
aaatatcctg actatttaaa aatg 24
<210>31
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>31
aaataccctg attacttaaa aatg 24
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>32
aaatatcctg attatctaaa aatg 24
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>33
aaatatcctg attaccttaa aatg 24
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>34
aaatatccag attatattaa aatg 24
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>35
aaatatcctg attatttgca aatg 24
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>36
aaatatcctg actatttgca aatg 24
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>37
aaatatcctg attatttaca aatg 24
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>38
aaatatcctg actatttaca aatg 24
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>39
aaatatccag attatttggg aatg 24
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>40
aaatacccag attatttagg catg 24
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>41
ccaatatggt ttattaaata attg 24
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>42
ccaatatggc ttattaaaca attg 24
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>43
ccataagggt ttgttaaaca attg 24
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>44
ccaatatggt ttattaaata tttg 24
<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>45
ccaataaggt ttattgaata tttg 24
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>46
ccaatatggt ttattaaaaa tttg 24
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>47
ccagtagggc ttattaaata gttg 24
<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>48
ccaataaggc ttattaaata actg 24
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>49
ccaatagggc ttgttaaata actg 24
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>50
ccaatatggt ttattaaaca actg 24
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>51
ccaataaggc ttattaaaaa tctg 24
<210>52
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>52
ccacaatggc ttgttaaata tctg 24
<210>53
<211>29
<212>DNA
<213>引物
<400>53
tttttttttt ccctgacttt tatgcccag 29
<210>54
<211>30
<212>DNA
<213>引物
<400>54
tttttttttt cgttaggtcg gagcttgatc 30
Claims (10)
1.一种检测人乳头瘤病毒HPV的核酸探针微球集，其特征在于，它包括2-60种不同荧光编码的微球，以及每种所述荧光编码微球上固定有的1～20种人乳头瘤病毒特异性核酸探针，并且至少有一种荧光编码微球上有2-20种人乳头瘤病毒特异性核酸探针；
其中，所述的1～20种人乳头瘤病毒特异性核酸探针选自下组：
(a)针对低危型别HPV的不同亚型的人乳头瘤病毒特异性核酸探针；
(b)针对高危型别HPV的不同亚型的人乳头瘤病毒特异性核酸探针。
2.如权利要求1所述的核酸探针微球集，其特征在于，所述的低危险型别HPV选自下组：HPV6、11、40、42、43、44、53或54型别；
所述的高危险型别HPV选自下组：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73、82或83。
3.如权利要求1所述的核酸探针微球集，其特征在于，固定于所述微球上的人乳头瘤病毒特异性核酸探针选自下组：
(i)HPV6、HPV11、HPV53、HPV54；
(ii)HPV40、HPV42、HPV43和HPV44；
(iii)HPV16、HPV18、HPV31、HPV51
(iv)HPV33、HPV35、HPV39、HPV56；
(v)HPV45、HPV52、HPV58HPV59、HPV66；并且
探针包被在荧光编码的微球上。
4.如权利要求1所述的核酸探针微球集，其特征在于，所述的荧光编码微球的表面共价连接核酸探针。
5.如权利要求1-3任一所述的核酸探针微球集，其特征在于，所述的人乳头瘤病毒特异性核酸探针的序列如下：
HPV06 5′AGACGTTCGATTTCCACTAC3′ SEQ ID NO：1
HPV11 5′GGGGGTAATAACAGATCATC3′ SEQ ID NO：2
HPV53 5′TTTCCTCACCAATAACGC3′ SEQ ID NO：3
HPV54 5′GGAGTTGCAGCATAAATAGA3′ SEQ ID NO：4
HPV40 5′CAATAGGAGTCCGACCAG3′ SEQ ID NO：5
HPV42 5′GGCAGACATAATTTAGGTAGTA3′ SEQ ID NO：6
HPV43 5′TCTAATACCAGGTCCAAAAT3′ SEQ ID NO：7
HPV44 5′GCACTTTTAATAACCAGATCCT3′ SEQ ID NO：8
HPV16 5′GAAAATAATTTGAACTGGCT3′ SEQ ID NO：9
HPV18 5′CAGGTATGCCTGCTTCAC3′ SEQ ID NO：10
HPV31 5′CAGTAGGGACCGATTCAC3′ SEQ ID NO：11
HPV33 5′ACTACTGCCTCTATTCAAAGC3′ SEQ ID NO：12
HPV35 5′GCTGGAACTGTAGGTGAAA3′ SEQ ID NO：13
HPV39 5′CCACCATACCACCACGAT3′ SEQ ID NO：14
HPV45 5′ACGCATATTAGCGCTAGTG3′ SEQ ID NO：15
HPV52 5′ATACAAGGGTCTAACTCTGGC3′ SEQ ID NO：16
HPV58 5′GGGTCCGGTAATACTGC3′ SEQ ID NO：17
HPV26 5′CCCCTACATCTTCTATTTATTC3′ SEQ ID NO：18
HPV51 5′TTCCCCAACACCTACAAG3′ SEQ ID NO：19
HPV55 5′GGCATTAGGAACTGTACTTTT3′ SEQ ID NO：20
HPV56 5′CCCCTCCGAGTTCTGTAT3′ SEQ ID NO：21
HPV59 5′AACCCAGGCAGTTATTTAT3′ SEQ ID NO：22
HPV61 5′TTAAGGGTGCGAATGACA3′ SEQ ID NO：23
HPV66 5′GCCACCCTTCCAATACAA3′ SEQ ID NO：24
HPV68 5′TAAGGGCACTGACATTCG3′ SEQ ID NO：25
HPV73 5′CTGGGATTTTATCACCGG3′ SEQ ID NO：26
HPV83 5′GGTGCTGCCTACCTCTTA3′ SEQ ID NO：27
HPV82 5′TAAGGGTACTGGTGCTGG3′ SEQ ID NO：28。
6.一种试剂盒，其特征在于，它包括：容器以及位于容器内权利要求1所述的检测人乳头瘤病毒的核酸探针微球集。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括通用引物，杂交试剂和信号标记试剂。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的核酸探针是HPV分型流式芯片。
9.如权利要求1所述的检测人乳头瘤病毒(HPV)的核酸探针微球的用途，其特征在于，所述的用途选自下组：(a)体外检测HPV的存在及其亚型中的应用；(b)制备检测人乳头瘤病毒的试剂盒。
10.一种体外检测样本中是否存在HPV的方法，所述的方法包括：
(a)抽提所述的样本的DNA，并用HPV特异性引物进行扩增，获得扩增产物；
(b)将步骤(a)中的扩增产物与权利要求1所述的检测人乳头瘤病毒(HPV)的核酸探针微球集混合；
(c)检测微球上的核酸探针是否与扩增产物结合，其中微球上的核酸探针与扩增产物结合就表明样本中存在人乳头瘤病毒。
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