CN1690223A - 人乳头瘤病毒分型基因芯片检测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人乳头瘤病毒分型基因芯片检测系统,包括用于检测人乳头瘤病毒各亚型的基因芯片和从待测样本中扩增人乳头瘤病毒各亚型核酸的PCR引物,其中基因芯片包括一基底和固定于所述基底上的探针,所述探针为可分别与人乳头瘤病毒各种亚型病毒的核酸杂交的核苷酸。本发明构建了针对人乳头瘤病毒15种高危亚型和3种低危亚型的HPV分型基因芯片检测系统,可快速、准确检测临床样本中的HPV病毒亚型,通量大、灵敏度高、特异性强,对于HPV的临床诊断和宫颈癌的早期预防有重要的意义,可广泛用于临床高效诊断和女性体检。
Description
技术领域
本发明涉及含有人乳头瘤病毒(HPV)各亚型探针的基因芯片;
本发明还涉及用于检测样本中人乳头瘤病毒各亚型的检测试剂。
背景技术
乳头瘤病毒(Papillomaviruses)属于嗜上皮性病毒,在人和动物中分布广泛,有高度的特异性,种间不存在交叉感染。人类乳头瘤病毒(HumanPapillomaviruses,HPV),属DNA病毒,是一类定向感染人体皮肤及粘膜的复层鳞状上皮上的一类乳头瘤病毒。目前确定的HPV型别约有100余种。依据不同型HPV与癌发生的危险性高低分为低危险型HPV如HPV6,11,42,43,44等,常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CIN1),高危险型HPV如HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CIN2/3)的发生相关,尤其是HPV16和18型。由于女性宫颈癌发生的主要原因为长期反复的高危型HPV感染,故HPV DNA的快速检测为预防和治疗宫颈癌的最重要手段之一。
核酸检测以其操作简单、特异性高、灵敏度高等有点已经广泛被用于临床检测。但是普通的PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。随着越来越多高危型HPV种类的确定,必须建立一种能够同时检测至少15种高危型HPV的检测方法。目前快速、灵敏、准确、高通量且成本低廉的检测方法就是以PCR和膜芯片技术为基础的基因芯片技术平台。
以尼龙膜为载体的DNA芯片技术,采用的是微量点样DNA微阵列技术。其主要的基本原理如下:DNA探针为含有特定DNA序列的寡核苷酸片段,其末端带有氨基标记。经活化处理的尼龙膜带有负电荷基团,可以与氨基形成共价结合。利用这种方法可将DNA探针按一定的排列规律永久的固定在尼龙膜的表面。其主要优点是简便易行,技术要求低,并且探针不受探针分子大小种类的限制,能根据使用者的要求简便地制出符合目的的芯片。在此基础上结合PCR技术对微量待测样品进行大量快速扩增,扩增后含有相应标记物的待测样品与芯片上的探针进行特异性杂交,此后对杂交信号强弱和有无进行分析,即可判断样品中靶分子的数量和性质。
基因芯片的制作流程如图1所示。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测人乳头瘤病毒各亚型的基因芯片;
本发明的另一目的在于提供一种可快速、高通量地检测样本中人乳头瘤病毒各亚型的检测试剂。
根据本发明的一方面,本发明的基因芯片包括一基底和固定于该基底上的探针,所述基底可以是例如玻片、各种纤维膜、尼龙膜等各种类型,优选为尼龙膜,所述固定于基底上的探针为可与人乳头瘤病毒18种常见亚型的几种或全部的病毒核酸杂交的特异型探针。
本发明的人乳头瘤病毒常见亚型的特异型探针的设计则是利用人乳头瘤病毒L1区的变异区域,针对不同的亚型设计特异性探针,通过严格条件下的杂交对HPV进行分型。HPV各亚型的特异性探针序列如下:
HPV6(5’-3’)
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gtatgtggaatatgtagttacggatgcacata(SEQ ID NO.2)
HPV11(5’-3’)
tgtgcatctgtgtctaaatctgctacatacact(SEQ ID NO.3)
agtgtatgtagcagatttagacacagatgcaca(SEQ ID NO.4)
HPV31(5’-3’)
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gtttgcaattgcagcacaaacagacatattgg(SEQ ID NO.6)
HPV33(5’-3’)
tttatgcacacaagtaactagtgacagtacta(SEQ ID NO.7)
tatgatctgtcactagttacttgtgtgcataaa(SEQ ID NO.8)
HPV35(5’-3’)
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HPV16(5’-3’)
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tgtagtttctgaagtagatatggcagcacataatg(SEQ ID NO.12)
HPV18(5’-3’)
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HPV42(5’-3’)
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HPV45(5’-3’)
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HPV66(5’-3’)
actattaatgcagctaaaagcacattaactaaata(SEQ ID NO.33)
tatttagttaatgtgcttttagctgcattaatagt(SEQ ID NO.34)
HPV68(5’-3’)
ctttgtctactactactgaatcagctgtaccaaata(SEQ ID NO.35)
tatttggtacagctgattcagtagtagtagacaaag(SEQ ID NO.36)
在上述序列中,针对每一HPV亚型设计了正、反两条序列,在使用时可选择每一亚型的任一个(正或反)序列中的任意连续17~25个碱基的序列作为检测探针固定于尼龙膜上。
在上述设计的各亚型序列的基础上,本领域技术人员可以通过本领域熟知的方法进行探针合成,并对其5’端或3’端进行氨基标记。优选对探针进行3’端氨基标记,其相较5’端氨基标记的探针,具有更好的杂交效果。
在本发明的一个实施方案中,制备芯片的方法为将尼龙膜经EDAC(N-乙基-N′-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐)预处理30分钟后,激活表面负电荷基团;同时,将在3’端带有氨基标记的探针用缓冲液稀释到适当的浓度后,按阵列顺序点加于尼龙膜相应位置上,此时,氨基与活化的负电荷基团发生反应生成稳定的共价键,从而将探针固定在尼龙膜表面,最后,用0.1~0.5mol/L的NaOH处理尼龙膜,封闭未结合探针的表面负电荷基团,膜芯片制作完成。
根据本发明的另一方面,用于检测样本中HPV各亚型的检测试剂至少包括一对用于扩增样本中HPV基因的PCR引物以及上述本发明的基因芯片。本发明的PCR引物根据HPV基因组的特点,利用人乳头瘤病毒L1区保守区域设计简并引物,通过一次PCR反应可广谱扩增18种不同亚型的HPV基因。在本发明的一个较佳实施方案中,设计了如SEQ ID NO.37~38所示的2对PCR引物,引物序列如下:
SEQ ID NO.37:5’-tttnthachkkdgtdgayachachmshagyachaa-3’
SEQ ID NO.38:5’-gaaahayaaacygyavdtcawaytcytcnvcrtg-3’
其中:r代表a或g;m代表a或c;w代表a或t;s代表g或c;k代表g或t;y代表c/t;v代表a或c或g;h代表a或c或t;d代表a或g或t;n代表a或g或c或t。
在使用时,可以选择上述给出序列中任意连续17-25个碱基序列作为合成的引物序列。上述本发明的引物可以通过本领域技术人员熟知的方法进行合成,可以使用混合引物。同时为便于结果检测,可以在上述引物合成时进行适当的标记,在本发明的一个实施方案中,对引物进行生物素标记,使得合成的PCR产物的5’端带有生物素标记,以在后续的显色反应方便读取结果。
根据本发明的另一方面,提供一种用于检测人乳头瘤病毒的试剂盒,其至少包括本发明的上述检测试剂,本发明的试剂盒还可以进一步包含下述试剂中的一种或几种:
从待检样本中提取DNA的样本处理试剂;
PCR扩增试剂;
杂交试剂;以及
显色试剂。
上述样本处理试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂以及显色试剂均可以使用本领域技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种试剂,这些试剂必要时可以包括在试剂盒中,也可以将其配方列明在试剂盒的说明书中由使用者按照说明书中的指示自行配制。
本发明的试剂盒中还可以包括相应的阴性对照和/或阳性对照样本。
根据本发明的再一方面,提供一种评估待测样本中宫颈癌或其他与HPV相关的病变发生的可能性的方法。将来自待检测个体的样本使用本发明的检测试剂检测,通过样本中HPV各亚型表达情况评估该个体宫颈癌或其他与HPV相关的病变(例如,外生殖器湿疣或宫颈上皮内低度病变等)发生的可能性。
本发明亦提供一种评估待测样本中宫颈癌愈后及复发可能性的方法。将来自宫颈癌治疗后个体的样本使用本发明的检测试剂检测,通过样本中HPV各亚型表达情况评估该个体的愈后情况和以后宫颈癌复发的可能性。
本发明构建了针对人乳头瘤病毒15种高危亚型和3种低危亚型的HPV分型基因芯片检测系统,可快速、准确检测临床样本中的HPV病毒亚型,通量大、灵敏度高、特异性强,对于HPV的临床诊断和宫颈癌的早期预防有重要的意义,可广泛用于临床高效诊断和女性体检。
通过目前临床上常用的检测方法与本发明检测系统的比较,可使本发明的优点更为明了:
优点 | 缺点 | |
膜芯片杂交系统(本发明) | 1.通量大,一次可以检测18种HPV亚型(3种低危型HPV和15种高危型HPV),同时给出分型结果2.灵敏度高3.特异性高4.取材方便5.无需特殊设备,仪器投入低 | 操作步骤较多 |
荧光定量PCR | 1.灵敏度高2.操作方便,耗时短3.取材方便 | 1.通量少,一次只能检测1-2个亚型,且不能确切分型。目前市场上只有HPV6/11、HPV16/18单联荧光定量PCR试剂2.需要荧光定量PCR仪,设备投入大 |
普通PCR | 1.成本相对较低2.操作简单 | 1.检测容量小,只能检测特定的亚型(如HPV16、HPV18)2.灵敏度较低 |
组织涂片 | 1.成本相对较低2.操作简单 | 1.灵敏度有限,存在一定的假阳性和假阴性2.不能分型 |
组织切片 | 1.成本相对较低2.操作简单 | 1.可以观察到细胞形态的变化,但不能确定发生细胞形态变化的病因2.取样的部位决定检测的结果 |
ELISA | 1.成本相对较低2.操作简单 | 1.灵敏度有限,存在一定的假阳性和假阴性2.不能分型 |
附图说明
图1为基因芯片的一般制作流程图;
图2为HPV分型基因芯片阅读图;
图3为3’氨基端标记探针和5’端标记探针的阳性样品杂交结果;
图中:1--3’端氨基标记探针杂交阳性样品;
2--5’端氨基标记探针杂交阳性样品;
3--3’端氨基标记探针杂交阴性样品;
4--5’端氨基标记探针杂交阴性样品;
图4为以不同碱基数的探针序列制膜后,HPV16和HPV58样本PCR扩增产物与膜条的杂交结果。
发明的具体实施方式
下面,结合附图,通过对本发明较佳实施方式的描述,详细说明但不限制本发明。
【实施例1】HPV分型检测芯片的制备
1.生产原材料的厂商、规格
名称 | 厂商 | 规格 | 商品名 |
EDAC | Sigma | ||
尼龙膜 | Pall | Pore size:0.45uM30cm×3M | Biodyne CMembrane |
探针序列设计如SEQ ID 1~36所示,按照本领域技术人员熟知的方法由上海博亚生物技术有限公司合成3’端氨基标记探针。
2.生产膜条
将膜条按要求裁剪
↓
新鲜配制EDAC溶液泡膜30分钟
↓
用蒸馏水洗膜3-4次,2’/次,滤纸上晾干,将膜片固定在滤纸上
↓
用探针稀释液将探针母液稀释
各探针的终浓度为5~15μM
↓
按照膜上的格子按顺序每格点入1ul探针
↓
点好的膜室温放置20分钟晾干
↓
用0.1~0.5N NaOH浸泡膜条5分钟
↓
弃去NaOH,用蒸馏水洗3-4次
↓
充分晾干后,裁成条状,干燥瓶内保存备用
【实施例2】HPV分型芯片检测试剂盒样本检测
2003年8月~10月,分别在北京大学深圳医院和深圳市人民医院进行了临床验证,结果证明,本发明的检测系统通量大、灵敏度高,基因芯片技术的引入使得该方法具有与荧光定量PCR相当的灵敏度。具体试剂、检测方法如下:
●试剂盒组成
组成成分 | 数量 | 保存条件 | 组成成分 | 数量 | 保存条件 |
裂解液PCR Mix膜条PC | 50人份50管50张1管(100μL) | 4℃-20℃室温干燥存放-20℃ | POD母液TMB(2mg/mL)矿物油无菌纯水 | 1管(100μL)1瓶(20mL)1管1管 | 4℃4℃室温-20℃ |
其中PCR Mix含SEQ ID NO.37~38的引物。
●需配备的仪器及配制的试剂
PCR仪 DNA电泳仪
分子杂交箱 摇床
3%H2O2
其他需要的试剂按照以下配方配制:
20×SSC(溶液的pH值直接影响显色结果)NaCl 175.3g柠檬酸钠 88.2g加H2O溶至1000mL,用pH计调pH至7.0,高压灭菌 | 10%SDS,pH7.0将20gSDS加H2O180mL溶解,用HCl调pH至7.0最后定容至200mL |
A液(2×SSC,0.1%SDS,pH7.4)20×SSC 100mL10%SDS 10mL加H2O溶至1000mL,调pH至7.4 | B液(0.5×SSC,0.1%SDS,pH7.4)20×SSC 25mL10%SDS 10mL加H2O溶至1000mL,调pH至7.4 |
C液(0.1M柠檬酸钠,pH5.0)柠檬酸钠 14.7g溶于450mL水,用浓HCl调pH至5.0,最后定容至500mL |
●操作步骤
1.样本收集及保存方法
HPV的临床样本主要是用拭子取表皮脱落细胞及活检组织。
对于生殖器或肛周有疣体增生,怀疑为尖锐湿疣的患者,采集疣体表皮脱落细胞。用生理盐水浸润棉拭子,用力来回擦拭疣状组织表面几次,取得脱落细胞。
对于其他可疑感染者,采集女性宫颈口或男性尿道口棉拭子样本。采样前,用棉拭子将宫颈口或尿道口过多的分泌物轻轻擦拭干净,更换棉拭子,用生理盐水浸润棉拭子,紧贴宫颈口或尿道口粘膜,稍用力转动两周,以取得分泌物或脱落细胞。
将取样后的棉拭子放入备有1mL无菌生理盐水的试管中,充分漂洗后将棉拭子贴壁挤干丢弃。
采集的样本在室温放置不超过2小时,4℃保存不超过24小时,-20℃保存不超过3个月。样本应避免反复冻融。
2.样本处理方法
将漂洗过棉拭子的生理盐水全部转移到1.5mL微量离心管中,13000rpm离心10分钟,弃去上清,保留管底的细胞块。
加入50μL裂解液悬浮沉淀,100℃加热10分钟。13000rpm离心10分钟,保留上清待用。
3.PCR扩增
取PCR反应管一支,在管壁上做好标记,于5000rpm离心2秒,而后分别加入已提取的待测样品DNA 5μL,反应总体系为25μL。每次实验,必须设置一个阴性对照,即以5μL无菌纯水为模板。
按以下条件进行扩增: 50℃ 15min
95℃ 10min
72℃ 5min
4.杂交
取15mL塑料离心管,标明患者编号,放入同样标有患者编号的膜条(应在膜条的一角用铅笔标记),加入A液5mL及PCR产物,将盖拧上,但不要过紧。将塑料管放入沸水中加热10分钟(确保杂交液液面完全位于水浴液面之下),取出拧紧盖子,放入51℃杂交箱杂交1小时。
取一只50mL塑料管,加入40mL B液于杂交箱或水浴箱中预热至51℃。
对照:取10μL PC加到阴性对照的杂交管中进行杂交,方法同上。
5.洗膜
取出膜条,移至装有预热B液的50mL管中,于51℃轻摇洗涤15分钟(每管40mL溶液,最多可同时洗涤4张膜)。
6.显色
用A液配制1∶2000的POD(过氧化物酶)溶液(单做两张膜只需4μLPOD母液,配制成8mL使用液,做四张膜可用6μLPOD母液,配制成12mL使用液),室温轻摇浸泡30分钟,弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗两次,每次5分钟。用C液室温洗膜1-2分钟,同时配制显色液(显色液需新鲜配制,配法:19mL 0.1M柠檬酸钠 1mL TMB 10μL 3%H2O2)。将膜条浸泡于显色液中避光显色5分钟左右即可见斑点显现,显色完毕后将膜条浸泡在水中清洗并于4℃保存。
7.结果判定
作为对照的杂交膜条会在PC位置出现蓝色斑点,提示本次杂交、显色正常工作;同时其他位点不应该显色,此时结果的判读视为有效。
结果见图2。
膜条上的探针排列顺序
HPV6 | HPV16 | HPV18 | HPV31 | HPV33 | HPV35 | HPV39 |
HPV11 | HPV45 | HPV51 | HPV52 | HPV53 | HPV56 | HPV58 |
HPV42 | HPV59 | HPV66 | HPV68 | PC |
由斑点显现的位置即可断定HPV的亚型。
高危型:HPV16,HPV18,HPV31,HPV33,HPV35,HPV39,HPV45,HPV51,HPV52,HPV53,HPV56,HPV58,HPV59,HPV66,HPV68
低危型:HPV6,HPV11,HPV42
【实施例3】3’端氨基标记探针与5’端氨基标记探针杂交效果比较
杂交探针可以在寡核苷酸的3’端或5’端进行氨基标记,以下实验比较了3’端和5’端氨基标记探针的杂交效果:
分别合成3’端氨基标记和5’端氨基标记的探针,以实施例1中的方法制备尼龙膜,分别以阳性对照样品和阴性对照样品按照实施例2的方法进行杂交,结果见图3,由图3的结果可见,在同等条件下,3’端氨基标记的效果要优于5’端的标记效果;3’端氨基标记探针的杂交效果要优于5’端氨基标记,而且并没有降低杂交的特异性。
【实施例4】不同碱基数的探针杂交效果比较
在本发明中,对于SEQ ID NO.1~36中所示序列的探针实际使用时可以选择任意连续17~25个碱基序列来合成探针,以下实验旨在证明上述碱基数的差异并不影响结果的灵敏度和特异性:
针对HPV16和HPV58两种亚型的序列合成不同长度的探针:
序列A:SEQ ID NO.11的第9~30位碱基序列(共22个碱基),即:
5’-gctgccatatctacttcagaaa-NH2-3’
序列B:SEQ ID NO.31的第8~30位碱基序列(共23个碱基),即:
5’-tatgcactgaagtaactaaggaa-NH2-3’
序列C:SEQ ID NO.11的第6~25位碱基序列(共20个碱基),即:
5’-tgtgctgccatatctacttc-NH2-3’
序列D:SEQ ID NO.32的第7~29位碱基序列(共23个碱基),即:
5’-ttccttagttacttcagtgcata-NH2-3’
以上述序列合成的探针按照实施例1的方法制备膜条A和B,按照实施例2的方法以已知亚型HPV16、HPV58样本PCR扩增产物分别与膜条A、B杂交,不同亚型的样本互为阴性对照,结果见图4,图4中:
A-1中HPV16位置用序列A探针点膜
A-2中HPV58位置用序列B探针点膜
B-1中HPV16位置用序列C探针点膜
B-2中HPV58位置用序列D探针点膜
由图4结果可见,不同长度的探针均获得了很好的杂交结果,因此证明不同碱基数的探针均有很好的灵敏度和特异性。
以上对本发明的描述并不限制本发明,本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明所附权利要求的范围。
04P100141.seq.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>亚能生物技术(深圳)有限公司
<120>人乳头瘤病毒分型基因芯片检测系统
<130>SZ65-04P100141
<160>38
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial(人工序列)
<400>1
tatgtgcatc cgtaactaca tcttccacat ac 32
<210>2
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial(人工序列)
<400>2
gtatgtggaa gatgtagtta cggatgcaca ta 32
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<212>DNA
<213>Artificial(人工序列)
<400>3
tgtgcatctg tgtctaaatc tgctacatac act 33
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial(人工序列)
04P100141.seq.ST25
<400>4
agtgtatgta gcagatttag acacagatgc aca 33
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<212>DNA
<213>Artificial(人工序列)
<400>5
ccaatatgtc tgtttgtgct gcaattgcaa ac 32
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<212>DNA
<213>Artificial(人工序列)
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gtttgcaatt gcagcacaaa cagacatatt gg 32
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tttatgcaca caagtaacta gtgacagtac ata 33
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<212>DNA
<213>Artificial(人工序列)
<400>8
tatgtactgt cactagttac ttgtgtgcat aaa 33
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<212>DNA
<213>Artificial
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gtgtgttctg ctgtgtcttc tagtgacagt acatat 36
04P100141.seq.ST25
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<211>36
<212>DNA
<213>Artificial
<400>10
atatgtactg tcactagaag acacagcaga acacac 36
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>11
cattatgtgc tgccatatct acttcagaaa ctaca 35
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<211>35
<212>DNA
<213>Artificial
<400>12
tgtagtttct gaagtagata tggcagcaca taatg 35
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<211>36
<212>DNA
<213>Artificial
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cctgggcaat atgatgctac caaatttaag cagtat 36
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<212>DNA
<213>Artificial
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atactgctta aatttggtag catcatattg cccagg 36
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<212>DNA
04P100141.seq.ST25
<213>Artificial
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gtgtgccact gcaacatctg gtgatacata t 31
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<212>DNA
<213>Artificial
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atatgtatca ccagatgttg cagtggcaca c 31
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>17
atgtgcctct acacaaaatc ctgtgccaag ta 32
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<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<400>18
tacttggcac aggattttgt gtagaggcac at 32
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<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<400>19
cctctataga gt cttccata cctt ctacat atg 33
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<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
04P100141.seq.ST25
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catatgtaga aggtatggaa gactctatag agg 33
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<213>Artificial
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tttaactatt agcactgcca ctgctgcggt tt 32
<210>22
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<400>22
aaaccgcagc agtggcagtg ctaatagtta aa 32
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<212>DNA
<213>Artificial
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tatgtgctga ggttaaaaag gaaagcacat a 31
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<211>31
<212>DNA
<213>Artificial
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tatgtgcttt cctttttaac ctcagcacat a 31
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<212>DNA
<213>Artificial
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ctttccgcaa ccacacagtc tatgtctaca tataa 35
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04P100141.seq.ST25
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<213>Artificial
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ttatatgtag acatagactg tgtggttgcg gaaag 35
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<213>Artificial
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actattagta ctgctacaga acagttaagt aaat 34
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<211>34
<212>DNA
<213>Artificial
<400>28
atttacttaa ctgttctgta gcagtactaa tagt 34
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>29
atctttctgt gtgtgcttct actacttctt ctat 34
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<211>34
<212>DNA
<213>Artificial
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atagaagaag tagtagaagc acacacagaa agat 34
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<212>DNA
04P100141.seq.ST25
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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tgtaccttcc ttagttactt cagtgcataa tgtcat 36
<210>33
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actattaatg cagctaaaag cacattaact aaata 35
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<213>Artificial
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tatttagtta atgtgctttt agctgcatta atagt 35
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<213>Artificial
<400>35
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<210>36
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial
<400>36
04P100141.seq.ST25
tatttggtac agctgattca gtagtagtag acaaag 36
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<211>35
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(35)
<223>r=a/g;m=a/c;w=a/t;s=g/c;k=g/t;y=c/t;v=a/c/g;h=a/c/t;d=a/g
/t;n=a/g/c/t
<400>37
tttnthachk kdgtdgayac hachmshagy achaa 35
<210>38
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(34)
<223>r=a/g;m=a/c;w=a/t;s=g/c;k=g/t;y=c/t;v=a/c/g;h=a/c/t;d=a/g
/t;n=a/g/c/t
<400>38
gaaahayaaa cygyavdtca waytcytcnv crtg 34
Claims (12)
1、用于检测人乳头瘤病毒各亚型的基因芯片,包括
一基底,其特征在于它还包括
固定于所述基底上的探针,所述探针为可分别与人乳头瘤病毒各种亚型病毒的核酸杂交的核苷酸。
2、权利要求1所述的基因芯片,其特征在于所述基底为尼龙膜,所述探针的3’末端进行氨基标记。
3、权利要求1或2所述的基因芯片,其特征在于所述探针包括选自下述核苷酸序列的几种或全部:SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12的任意连续17~25个碱基、SEQID NO.13或SEQ ID NO.14的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.15或SEQID NO.16的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22的任意连续17~25个碱基、SEQ IDNO.23或SEQ ID NO.24的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.25或SEQ IDNO.26的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.28的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.29或SEQ ID NO.30的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.34的任意连续17~25个碱基和SEQ ID NO.35或SEQ IDNO.36的任意连续17~25个碱基。
4、用于检测人乳头瘤病毒各亚型的检测试剂,其特征在于它至少包括
检测人乳头瘤病毒各亚型的基因芯片;以及
从待测样本中扩增人乳头瘤病毒各亚型核酸的PCR引物。
5、权利要求4所述的检测试剂,其特征在于所述基因芯片包括一基底以及固定于所述基底上的探针,所述探针为可分别与人乳头瘤病毒各种亚型病毒的核酸杂交的核苷酸。
6、权利要求5所述的检测试剂,其特征在于所述探针包括选自下述核苷酸序列的几种或全部:SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12的任意连续17~25个碱基、SEQID NO.13或SEQ ID NO.14的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.15或SEQID NO.16的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22的任意连续17~25个碱基、SEQ IDNO.23或SEQ ID NO.24的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.25或SEQ IDNO.26的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.28的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.29或SEQ ID NO.30的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32的任意连续17~25个碱基、SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.34的任意连续17~25个碱基和SEQ ID NO.35或SEQ IDNO.36的任意连续17~25个碱基。
7、权利要求4所述的检测试剂,其特征在于所述PCR引物含有SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示核苷酸序列的任意连续17~25碱基。
8、权利要求7所述的检测试剂,其特征在于所述引物的末端进行生物素标记。
9、一种用于检测人乳头瘤病毒各亚型的试剂盒,其特征在于它包括
检测人乳头瘤病毒各亚型的基因芯片;
从待测样本中扩增人乳头瘤病毒各亚型核酸的PCR引物;以及
下述试剂的一种或几种:
从待检样本中提取DNA的样本处理试剂;
PCR扩增试剂;
杂交试剂;和
显色试剂。
10、权利要求8所述的试剂盒,其特征在于它进一步包含一阴性对照和/或阳性对照样本。
11、一种评估待测样本中宫颈癌或其他与HPV相关的病变发生的可能性的方法,其特征在于将来自待检测个体的样本使用权利要求4所述检测试剂检测,通过样本中HPV各亚型表达情况评估该个体的宫颈癌或其他与HPV相关的病变发生的可能性。
12、一种评估待测样本中宫颈癌愈后及复发可能性的方法,其特征在于将来自宫颈癌治疗后个体的样本使用权利要求4所述检测试剂检测,通过样本中HPV各亚型表达情况评估该个体的愈后情况和以后宫颈癌复发的可能性。
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