CN1276094C - 用于诊断地中海贫血的dna芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于诊断地中海贫血的DNA芯片及其制备方法，提供一种用于临床诊断α-型和β-型地贫的DNA芯片，芯片由一基底和固定于基底上的探针组成，根据迄今已知的α-和β-球蛋白突变基因的序列，根据DNA序列特异性识别的原理设计的诊断这些突变的DNA探针。本发明的用于地中海贫血疾病诊断的DNA芯片，可提高诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短诊断时间。
Description
技术领域
本发明涉及用于诊断地中海贫血的DNA芯片，具体地说涉及用于诊断α-型和β-型地中海贫血的DNA芯片。
本发明还涉及诊断地中海贫血的DNA芯片的制备方法。
本发明还涉及用于扩增待检样品中DNA的PCR引物；
本发明还涉及用于诊断地中海贫血的试剂盒以及检测待检样品中是否存在地中海贫血的相关基因的方法。
背景技术
地中海贫血(也称地贫)是一种常见的遗传性疾病，世界各地都有发作，最多见于西自地中海区域，中经土耳其、中东各国，东至东南亚和我国南部。在我国β-型地中海贫血最多见于西南和华南一带，包括云南、贵州、四川、广西、广东、海南各省区，在苗、瑶、黎、壮等少数民族中尤为多见，其次为长江以南各地，北方很少见。据全国血红蛋白病协作组调查，β-型地中海贫血发生率为0.67％。α-型地中海贫血在我国高发于西南及华南一带，全国协作组调查国内α-地中海贫血发生率为2.93％，是我国南方最常见、危害最为严重的遗传病种之一。地中海贫血症的临床表型多样，可以从正常到需要反复输血，甚至危及生命，导致患者在未成年前天折甚至死胎。
由于该病在我国南方的高发病率，对社会和家庭产生巨大的精神和经济压力。然而目前尚缺乏有效的治疗措施，因此做好遗传咨询和产前诊断，阻止该类病重症患儿的出生，对有效监控此类疾病，提高人口素质有重要意义。
由于地中海贫血的临床症状具有较大的变异性，轻型患者及携带者的检测易出现漏检。随着地中海贫血症分子遗传学研究的进展，使基因诊断成为可能。其中α-地中海贫血的基因缺陷主要为缺失型突变，当α-球蛋白链基因中的1条或多条丧失功能时就会引发α-型地中海贫血症，在中国地区普遍发生的3种α-地中海贫血症分别是由α基因上-α3.7，-α4.2和-SEA的片段缺失引起的。β-地中海贫血的基因只有一对，基因缺陷绝大多数属于非缺失型，即由于基因点突变造成β-球蛋白合成异常。β-地中海贫血症具有种族特异性，表现为许多突变仅发生在某个别种族中，而且几乎每一种族都具有几种常见的突变。到1998年，在中国β-地中海贫血群体中已发现23种不同的突变类型(见表1)。其中5种突变在中国人群中表现出较高的发病频率，约占总发生率的90％以上。大陆各省份共发现22种(其中3种仅见于少数民族)，台湾共发现18种(其中4种仅现于台湾)。
α-地中海贫血症的传统基因诊断技术主要采用Southern印迹杂交方法，技术准确可靠，但操作繁琐，而且依赖用同位素，难以大面积推广。另外还有PCR扩增技术，这种方法简单快速，但容易出现假阳性。β-地中海贫血症常用诊断技术有：反向点杂交(RDB)、PCR-SSCP、PCR-异源双链分析、PCR-DGGE、PCR-ARMS、PCR-ASO、PCR-RFLP以及PCR-错配化学裂解等技术。
DNA芯片技术适用于基因缺陷的检测，一个芯片能同时容纳许多个探针，和PCR扩增技术结合，具有技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低的特点。
DNA芯片技术是一种高度集成的DNA检测技术。首先采用专用自动化设备将已知DNA寡核苷酸探针排列在玻片或硅片上，然后将待检测样本中的所有DNA成分与芯片探针杂交，有相对应的靶DNA就会出现相应的杂交信号。理论上就可以做到一次实验检测多个基因。
DNA芯片技术的设想可以追溯到90年代初，美国Affymetrix公司首先开始这方面的研究(http://www.affymetrix.com)。由于这项技术的广泛的应用前景以及巨大的经济效益，目前美国的斯坦福大学、美国橡树岭国家实验室、德国的自动化公司(http://www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/～autom)、Incyte商业公司和Hyseq公司都在进行全力研究，竞争市场份额。国内也有单位开始跟进了DNA芯片的研究。由于该技术需要高精度的DNA探针点样设备或光刻合成设备和专用的激光扫描检测装置，尚未普及应用。
临床上，遗传病诊断与检测、细菌及病毒的检测、白细胞配型是DNA芯片应用的最具潜力的方面。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于临床诊断α-型和β-型地贫的DNA芯片，其利用现有的激光扫描仪，可以用于地中海贫血疾病的诊断并可提高诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短诊断时间。
本发明的另一目的在于提供诊断地中海贫血的DNA芯片的制备方法；
本发明的再一目的是提供用于扩增待检样品中DNA的PCR引物；
本发明的又一目的是提供用于诊断地中海贫血的试剂盒以及检测待检样品中是否存在地中海贫血相关基因的方法。
根据本发明的一方面，用于诊断α-型和β-型地贫的DNA芯片由一基底和固定于基底上的探针组成，用于该DNA芯片的基底可以是任何适于固定DNA探针的载体，例如，市售的EMS Electronic Microscopy Science CompanyLtd.生产的聚-L-赖氨酸包被并硅烷化的显微镜玻片，固定于基底上的探针则根据迄今已知的α-和β-球蛋白突变基因的序列，根据DNA序列特异性识别的原理设计的诊断这些突变的DNA探针。通过点样装置将探针按照一定规律排列在载体玻片或硅片上，经过固定和相关处理后就制成了DNA芯片。本发明的DNA芯片上可以仅包含针对α-球蛋白缺失基因设计的用于检测α-型地贫的DNA探针，或仅包含针对β-球蛋白突变基因设计的用于检测β-型地贫的DNA探针，也可以同时包含检测α-型和β-型地贫的DNA探针。
根据本发明的另一方面，提供一种用于诊断地贫的DNA芯片的制备方法，该方法包括合成探针、将合成的探针及相应的对照组DNA按一定的顺序点样并排列于基底上、将点样后的探针DNA固定于基底上而制备得到DNA芯片。
为了使DNA探针能有效地固定在玻片上，通常采用两种方法，第一种，在DNA探针合成后进行DNA探针5’末端活性基团的标记，这些活性基团有氨基、硫基等，固定DNA的玻片也需要进行活化处理，使之表面带有醛基或氨基，可以与DNA探针形成共价键。在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用消毒双蒸水稀释至200pmol/ul和等量1.0M1-Ethy1-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC)和1.0MN-Hydroxysuccinimide(NHS)混合，进行点样。第二种，将DNA探针与点样缓冲液混合，用玻片点样机点在玻片上，80℃加热1到4小时，使用UVStratalinker 2400紫外交联仪在60mJ/cm2强度下进行紫外交联，然后用终止液终止反应。
根据本发明的再一方面，提供用于扩增待检样品中DNA的PCR引物，该引物根据α-型和β-型地贫症基因突变的序列资料设计，其中α-型地贫的引物包括4对引物，检测β-型地贫的引物包括2对引物。
在对待检样品进行PCR扩增后，为进行荧光标记，本发明进一步设计了延伸引物，延伸引物的Tm值为50-65℃，3’端与突变位点相邻。与β-地中海贫血症基因的20种点突变类型及α-地中海贫血症3种缺失突变类型相对应设计了20条和4条引物。
根据本发明的又一方面，提供了用于检测地中海贫血症的试剂盒，其中包含用于诊断地中海贫血的本发明的DAN芯片以及用于扩增待检样品中DNA的本发明的PCR引物。
本发明同时还提供了检测待检样品中是否存在地贫相关基因的方法，通过将待检样品用本发明特异性引物进行PCR扩增后，再用延伸因为对扩增产物进行荧光标记，将标记后的产物与诊断地贫的本发明DNA芯片进行杂交，然后用相应的仪器读取信号并对信号进行分析获得结果。
本发明的用于地中海贫血疾病诊断的DNA芯片，可提高诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短诊断时间。
附图的简要说明
图1为本发明的DNA芯片的检测结果图；其中扫描得到的杂交信号a图和b图经图像处理得到图表c，图表c代表玻片上不同的点的突变型和野生型信号强度的比值。根据图表c，-28号位点突变型和野生型信号强度比值特别高，说明样品的-28位点处发生突变。a图和b图扫描图像上黄色方框标出了代表-28突变的探针位置。
发明的详细描述
实施例1 用于检测α-型和β-型地贫的DNA芯片的制备
1、探针的设计
表1为23种β-地中海贫血症中常见的基因突变类型和位点
表1β-球蛋白基因中常见的突变
(A) 在中国人群中最常见的5个等位基因突变
| 突变位点 | 突变频率 |
| 密码子41-42(-CTTT) | 39％ |
| IVS-2 nt 654(C突变成T) | 22％ |
| TATA盒nt-28(A突变成G) | 12％ |
| 密码子17(A突变成T) | 13％ |
| 密码子71-72(+A或T) | 4％ |
(B)在南亚人群中发现的18个最常见的β-球蛋白基因突变
| 序号 | 突变位点 | 序号 | 突变位点 |
| 1 | TATA盒nt-29(A突变成G) | 10 | 密码子14-15(+G) |
| 2 | TATA盒nt-30(T突变成C) | 11 | 密码子26(G突变成A) |
| 3 | TATA盒nt-32(C突变成A) | 12 | 密码子30(A突变成G) |
| 4 | IVS-1 nt 1(G突变成T) | 13 | 密码子31(-C) |
| 5 | IVS-1 nt 5(G突变成C) | 14 | 密码子37(G突变成A) |
| 6 | IVS-1 nt 3’(T突变成G) | 15 | 密码子95(+A) |
| 7 | IVS-2 nt 5(G突变成C) | 16 | 密码子27-28(+C) |
| 8 | 密码子8(-AA) | 17 | 密码子41(+T) |
| 9 | 密码子8-9(+C) | 18 | 密码子43(G突变成T) |
为检测α-和β-地中海贫血症常见的突变类型，共设计了24条探针及阳性对照，探针的长度一般在15-30个碱基左右，这些探针的DNA序列如表2和表3。试验探针估计可覆盖地中海贫血症超过98％的发生率。在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用1M NHS，1M EDC混合，进行点样。完成DNA探针的合成之后，启动DNA点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置。完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。
表2：α-球蛋白基因的探针DNA序列
| 探针 | 碱基长度 | 序列编号 | 序列 |
| UP-ALPHA2-R | 18 | SEQ ID NO.1 | 5’-GGGCCCTCCTCCCCTCCT-3’ |
| 19 | SEQ ID NO.2 | 5’-GGGCCCTCCTCCCCTCCTT-3’ | |
| 20 | SEQ ID NO.3 | 5’-GGGCCCTCCTCCCCTCCTTG-3’ | |
| 21 | SEQ ID NO.4 | 5’-GGGCCCTCCTCCCCTCCTTGC-3’ | |
| 18 | SEQ ID NO.5 | 5’-CCCAACGGGCCCTCCTCC-3’ | |
| 19 | SEQ ID NO.6 | 5’-CCCAACGGGCCCTCCTCCC-3’ | |
| 20 | SEQ ID NO.7 | 5’-CCCAACGGGCCCTCCTCCCC-3’ |
| 21 | SEQ ID NO.8 | 5’-CCCAACGGGCCCTCCTCCCCT-3’ | |
| 19 | SEQ ID NO.9 | 5’-CCCTCCTCCCCTCCTTGCA-3’ | |
| 20 | SEQ ID NO.10 | 5’-CCCTCCTCCCCTCCTTGCAC-3’ | |
| 21 | SEQ ID NO.11 | 5’-CCCTCCTCCCCTCCTTGCACC-3’ | |
| 22 | SEQ ID NO.12 | 5’-CCCTCCTCCCCTCCTTGCACCG-3’ | |
| UP-3.7/50.2-R | 18 | SEQ ID NO.13 | 5’-GCGAAGTCCAGCTGGAAA-3’ |
| 19 | SEQ ID NO.14 | 5’-GCGAAGTCCAGCTGGAAAA-3’ | |
| 20 | SEQ ID NO.15 | 5’-GCGAAGTCCAGCTGGAAAAA-3’ | |
| 21 | SEQ ID NO.16 | 5’-GCGAAGTCCAGCTGGAAAAAC-3’ | |
| 19 | SEQ ID NO.17 | 5’-ACCGCGAAGTCCAGCTGGA-3’ | |
| 20 | SEQ ID NO.18 | 5’-ACCGCGAAGTCCAGCTGGAA-3’ | |
| 21 | SEQ ID NO.19 | 5’-ACCGCGAAGTCCAGCTGGAAA-3’ | |
| 22 | SEQ ID NO.20 | 5’-ACCGCGAAGTCCAGCTGGAAAA-3’ | |
| 18 | SEQ ID NO.21 | 5’-GAGCCACCGCGAAGTCCA-3’ | |
| 19 | SEQ ID NO.22 | 5’-GAGCCACCGCGAAGTCCAG-3’ | |
| 20 | SEQ ID NO.23 | 5’-GAGCCACCGCGAAGTCCAGC-3’ | |
| 21 | SEQ ID NO.24 | 5’-GAGCCACCGCGAAGTCCAGCT-3’ | |
| 8866 | 17 | SEQ ID NO.25 | 5’-TTCAGGCTGTGGGCAGA-3’ |
| 18 | SEQ ID NO.26 | 5’-TTCAGGCTGTGGGCAGAG-3’ | |
| 19 | SEQ ID NO.27 | 5’-TTCAGGCTGTGGGCAGAGT-3’ | |
| 20 | SEQ ID NO.28 | 5’-TTCAGGCTGTGGGCAGAGTC-3’ | |
| 20 | SEQ ID NO.29 | 5’-TCCTTCAGGCTGTGGGCAGA-3’ | |
| 21 | SEQ ID NO.30 | 5’-TCCTTCAGGCTGTGGGCAGAG-3’ | |
| 22 | SEQ ID NO.31 | 5’-TCCTTCAGGCTGTGGGCAGAGA-3’ | |
| 23 | SEQ ID NO.32 | 5’-TCCTTCAGGCTGTGGGCAGAG-3’ | |
| 19 | SEQ ID NO.33 | 5’-GGCTGTGGGCAGAGTCAGA-3’ | |
| 20 | SEQ ID NO.34 | 5’-GGCTGTGGGCAGAGTCAGAA-3’ | |
| 21 | SEQ ID NO.35 | 5’-GGCTGTGGGCAGAGTCAGAAA-3’ | |
| 22 | SEQ ID NO.36 | 5’-GGCTGTGGGCAGAGTCAGAAAG-3’ | |
| UP-SEA-R | 18 | SEQ ID NO.37 | 5’-TCATCACCCAGGCAGCCA-3’ |
| 19 | SEQ ID NO.38 | 5’-TCATCACCCAGGCAGCCAC-3’ | |
| 20 | SEQ ID NO.39 | 5’-TCATCACCCAGGCAGCCACA-3’ | |
| 21 | SEQ ID NO.40 | 5’-TCATCACCCAGGCAGCCACAG-3’ | |
| 22 | SEQ ID NO.41 | 5’-TCATCACCCAGGCAGCCACAGC-3’ | |
| 18 | SEQ ID NO.42 | 5’-CACTCATCACCCAGGCAG-3’ | |
| 19 | SEQ ID NO.43 | 5’-CACTCATCACCCAGGCAGC-3’ | |
| 20 | SEQ ID NO.44 | 5’-CACTCATCACCCAGGCAGCC-3’ | |
| 19 | SEQ ID NO.45 | 5’-GGCAGCCACAGCCATGAAC-3’ | |
| 20 | SEQ ID NO.46 | 5’-GGCAGCCACAGCCATGAACA-3’ | |
| 21 | SEQ ID NO.47 | 5’-GGCAGCCACAGCCATGAACAC-3’ | |
| 22 | SEQ ID NO.48 | 5’-GGCAGCCACAGCCATGAACACA-3’ |
在上表中包括了4组探针序列，即UP-ALPHA2-R、UP-3.7/50.2-R、8866和UP-SEA-R，每组分别包括12条探针，覆盖了α-球蛋白可能的突变位点，在选择探针时，可以从每组中任选一条，但在一个芯片中应同时包括来自四组的4条探针。
表3：不同长度的β-球蛋白基因21个点突变位点探针DNA序列
| 探针 | 长度 | 序列号 | 序列 |
| 8-CP | 16 | SEQ ID NO.49 | 5′-CTCCTCAGGAGTCAGG-3′ |
| 17 | SEQ ID NO.50 | 5′-CTCCTCAGGAGTCAGGT-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.51 | 5′-CTCCTCAGGAGTCAGGTG-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.52 | 5′-CTCCTCAGGAGTCAGGTGC-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.53 | 5′-CTCCTCAGGAGTCAGGTGCA-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.54 | 5′-CTCCTCAGGAGTCAGGTGCAC-3′ | |
| 22 | SEQ ID NO.55 | 5′-CTCCTCAGGAGTCAGGTGCACC-3′ | |
| 23 | SEQ ID NO.56 | 5′-CTCCTCAGGAGTCAGGTGCACCA-3′ | |
| 8-9-CP | 14 | SEQ ID NO.57 | 5′-TCTGCCGTTACTGC-3′ |
| 15 | SEQ ID NO.58 | 5′-TCTGCCGTTACTGCC-3′ | |
| 16 | SEQ ID NO.59 | 5′-TCTGCCGTTACTGCCC-3′ | |
| 17 | SEQ ID NO.60 | 5′-TCTGCCGTTACTGCCCT-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.61 | 5′-TCTGCCGTTACTGCCCTG-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.62 | 5′-TCTGCCGTTACTGCCCTGT-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.63 | 5′-TCTGCCGTTACTGCCCTGTG-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.64 | 5′-TCTGCCGTTACTGCCCTGTGG-3′ | |
| 14-15(2)-CP | 12 | SEQ ID NO.65 | 5′-GGTGGGGCAAGG-3′ |
| 13 | SEQ ID NO.66 | 5′-GGTGGGGCAAGGT-3′ | |
| 14 | SEQ ID NO.67 | 5′-GGTGGGGCAAGGTG-3′ | |
| 15 | SEQ ID NO.68 | 5′-GGTGGGGCAAGGTGA-3′ | |
| 16 | SEQ ID NO.69 | 5′-GGTGGGGCAAGGTGAA-3′ | |
| 17 | SEQ ID NO.70 | 5′-GGTGGGGCAAGGTGAAC-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.71 | 5′-GGTGGGGCAAGGTGAACG-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.72 | 5′-GGTGGGGCAAGGTGAACGT-3′ | |
| 17(2)-CP | 16 | SEQ ID NO.73 | 5′-AGGTGAACGTGGATGA-3′ |
| 17 | SEQ ID NO.74 | 5′-AGGTGAACGTGGATGAA-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.75 | 5′-AGGTGAACGTGGATGAAG-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.76 | 5′-AGGTGAACGTGGATGAAGT-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.77 | 5′-AGGTGAACGTGGATGAAGTT-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.78 | 5′-AGGTGAACGTGGATGAAGTTG-3′ | |
| 22 | SEQ ID NO.79 | 5′-AGGTGAACGTGGATGAAGTTGG-3′ | |
| 23 | SEQ ID NO.80 | 5′-AGGTGAACGTGGATGAAGTTGGT-3′ |
| 26-CP | 16 | SEQ ID NO.81 | 5′-ACCACCAACTTCATCC-3′ |
| 17 | SEQ ID NO.82 | 5′-ACCACCAACTTCATCCA-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.83 | 5′-ACCACCAACTTCATCCAC-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.84 | 5′-ACCACCAACTTCATCCACG-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.85 | 5′-ACCACCAACTTCATCCACGT-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.86 | 5′-ACCACCAACTTCATCCACGTT-3′ | |
| 22 | SEQ ID NO.87 | 5′-ACCACCAACTTCATCCACGTTC-3′ | |
| 23 | SEQ ID NO.88 | 5′-ACCACCAACTTCATCCACGTTCA-3′ | |
| 30-CP | 11 | SEQ ID NO.89 | 5′-GCCCAGGGCCT-3′ |
| 12 | SEQ ID NO.90 | 5′-GCCCAGGGCCTC-3′ | |
| 13 | SEQ ID NO.91 | 5′-GCCCAGGGCCTCA-3′ | |
| 14 | SEQ ID NO.92 | 5′-GCCCAGGGCCTCAC-3′ | |
| 15 | SEQ ID NO.93 | 5′-GCCCAGGGCCTCACC-3′ | |
| 16 | SEQ ID NO.94 | 5′-GCCCAGGGCCTCACCA-3′ | |
| 17 | SEQ ID NO.95 | 5′-GCCCAGGGCCTCACCAC-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.96 | 5′-GCCCAGGGCCTCACCACC-3′ | |
| 31-CP | 15 | SEQ ID NO.97 | 5′-CAGCCTAAGGGTGGG-3′ |
| 16 | SEQ ID NO.98 | 5′-CAGCCTAAGGGTGGGA-3′ | |
| 17 | SEQ ID NO.99 | 5′-CAGCCTAAGGGTGGGAA-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.100 | 5′-CAGCCTAAGGGTGGGAAA-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.101 | 5′-CAGCCTAAGGGTGGGAAAA-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.102 | 5′-CAGCCTAAGGGTGGGAAAAT-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.103 | 5′-CAGCCTAAGGGTGGGAAAATA-3′ | |
| 22 | SEQ ID NO.104 | 5′-CAGCCTAAGGGTGGGAAAATAG-3′ | |
| 37-CP | 16 | SEQ ID NO.105 | 5′-AAGGGTAGACCACCAG-3′ |
| 17 | SEQ ID NO.106 | 5′-AAGGGTAGACCACCAGC-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.107 | 5′-AAGGGTAGACCACCAGCA-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.108 | 5′-AAGGGTAGACCACCAGCAG-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.109 | 5′-AAGGGTAGACCACCAGCAGC-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.110 | 5′-AAGGGTAGACCACCAGCAGCC-3′ | |
| 22 | SEQ ID NO.111 | 5′-AAGGGTAGACCACCAGCAGCCT-3′ | |
| 23 | SEQ ID NO.112 | 5′-AAGGGTAGACCACCAGCAGCCTA-3′ | |
| 41-42-CP | 15 | SEQ ID NO.113 | 5′-AACCTCTGGGTCCAA-3′ |
| 16 | SEQ ID NO.114 | 5′-AACCTCTGGGTCCAAG-3′ | |
| 17 | SEQ ID NO.115 | 5′-AACCTCTGGGTCCAAGG-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.116 | 5′-AACCTCTGGGTCCAAGGG-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.117 | 5′-AACCTCTGGGTCCAAGGGT-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.118 | 5′-AACCTCTGGGTCCAAGGGTA-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.119 | 5′-AACCTCTGGGTCCAAGGGTAG-3′ | |
| 22 | SEQ ID NO.120 | 5′-AACCTCTGGGTCCAAGGGTAGA-3′ | |
| 43(3)CP | 16 | SEQ ID NO.121 | 5′-TCAAAGAACCTCTGGG-3′ |
| 17 | SEQ ID NO.122 | 5′-TCAAAGAACCTCTGGGT-3′ |
| 18 | SEQ ID NO.123 | 5′-TCAAAGAACCTCTGGGTC-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.124 | 5′-TCAAAGAACCTCTGGGTCC-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.125 | 5′-TCAAAGAACCTCTGGGTCCA-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.126 | 5′-TCAAAGAACCTCTGGGTCCAA-3′ | |
| 22 | SEQ ID NO.127 | 5′-TCAAAGAACCTCTGGGTCCAAG-3′ | |
| 23 | SEQ ID NO.128 | 5′-TCAAAGAACCTCTGGGTCCAAGG-3′ | |
| 71-72-CP | 15 | SEQ ID NO.129 | 5′-TAAAGGCACCGAGCA-3′ |
| 16 | SEQ ID NO.130 | 5′-TAAAGGCACCGAGCAC-3′ | |
| 17 | SEQ ID NO.131 | 5′-TAAAGGCACCGAGCACT-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.132 | 5′-TAAAGGCACCGAGCACTT-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.133 | 5′-TAAAGGCACCGAGCACTTT-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.134 | 5′-TAAAGGCACCGAGCACTTTC-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.135 | 5′-TAAAGGCACCGAGCACTTTCT-3′ | |
| 22 | SEQ ID NO.136 | 5′-TAAAGGCACCGAGCACTTTCTT-3′ | |
| 95-CP | 16 | SEQ ID NO.137 | 5′-TTGTCACAGTGCAGCT-3′ |
| 17 | SEQ ID NO.138 | 5′-TTGTCACAGTGCAGCTC-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.139 | 5′-TTGTCACAGTGCAGCTCA-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.140 | 5′-TTGTCACAGTGCAGCTCAC-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.141 | 5′-TTGTCACAGTGCAGCTCACT-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.142 | 5′-TTGTCACAGTGCAGCTCACTC-3′ | |
| 22 | SEQ ID NO.143 | 5′-TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3′ | |
| 23 | SEQ ID NO.144 | 5′-TTGTCACAGTGCAGCTCACTCAG-3′ | |
| -32-CP | 11 | SEQ ID NO.145 | 5′-CCCAGCCCTGG-3′ |
| 12 | SEQ ID NO.146 | 5′-CCCAGCCCTGGC-3′ | |
| 13 | SEQ ID NO.147 | 5′-CCCAGCCCTGGCT-3′ | |
| 14 | SEQ ID NO.148 | 5′-CCCAGCCCTGGCTC-3′ | |
| 15 | SEQ ID NO.149 | 5′-CCCAGCCCTGGCTCC-3′ | |
| 16 | SEQ ID NO.150 | 5′-CCCAGCCCTGGCTCCT-3′ | |
| 17 | SEQ ID NO.151 | 5′-CCCAGCCCTGGCTCCTG-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.152 | 5′-CCCAGCCCTGGCTCCTGC-3′ | |
| -29-CP | 16 | SEQ ID NO.153 | 5′-AAAGTCAGGGCAGAGC-3′ |
| 17 | SEQ ID NO.154 | 5′-AAAGTCAGGGCAGAGCC-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.155 | 5′-AAAGTCAGGGCAGAGCCA-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.156 | 5′-AAAGTCAGGGCAGAGCCAT-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.157 | 5′-AAAGTCAGGGCAGAGCCATC-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.158 | 5′-AAAGTCAGGGCAGAGCCATCT-3′ | |
| 22 | SEQ ID NO.159 | 5′-AAAGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3′ | |
| 23 | SEQ ID NO.160 | 5′-AAAGTCAGGGCAGAGCCATCTAT-3′ | |
| -28-CP | 13 | SEQ ID NO.161 | 5′-TATGCCCAGCCCT-3′ |
| 14 | SEQ ID NO.162 | 5′-TATGCCCAGCCCTG-3′ | |
| 15 | SEQ ID NO.163 | 5′-TATGCCCAGCCCTGG-3′ | |
| 16 | SEQ ID NO.164 | 5′-TATGCCCAGCCCTGGC-3′ |
| 17 | SEQ ID NO.165 | 5′-TATGCCCAGCCCTGGCT-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.166 | 5′-TATGCCCAGCCCTGGCTC-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.167 | 5′-TATGCCCAGCCCTGGCTCC-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.168 | 5′-TATGCCCAGCCCTGGCTCCT-3′ | |
| IVS-1-1(3)-CP | 12 | SEQ ID NO.169 | 5′-CTGCCCAGGGCC-3′ |
| 13 | SEQ ID NO.170 | 5′-CTGCCCAGGGCCT-3′ | |
| 14 | SEQ ID NO.171 | 5′-CTGCCCAGGGCCTC-3′ | |
| 15 | SEQ ID NO.172 | 5′-CTGCCCAGGGCCTCA-3′ | |
| 16 | SEQ ID NO.173 | 5′-CTGCCCAGGGCCTCAC-3′ | |
| 17 | SEQ ID NO.174 | 5′-CTGCCCAGGGCCTCACC-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.175 | 5′-CTGCCCAGGGCCTCACCA-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.176 | 5′-CTGCCCAGGGCCTCACCAC-3′ | |
| IVS-1-5-CP | 13 | SEQ ID NO.177 | 5′-CAACCTGCCCAGG-3′ |
| 14 | SEQ ID NO.178 | 5′-CAACCTGCCCAGGG-3′ | |
| 15 | SEQ ID NO.179 | 5′-CAACCTGCCCAGGGC-3′ | |
| 16 | SEQ ID NO.180 | 5′-CAACCTGCCCAGGGCC-3′ | |
| 17 | SEQ ID NO.181 | 5′-CAACCTGCCCAGGGCCT-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.182 | 5′-CAACCTGCCCAGGGCCTC-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.183 | 5′-CAACCTGCCCAGGGCCTCA-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.184 | 5′-CAACCTGCCCAGGGCCTCAC-3′ | |
| IVS-2-1-CP | 17 | SEQ ID NO.185 | 5′-CCTGAAGTTCTCAGGAT-3′ |
| 18 | SEQ ID NO.186 | 5′-CCTGAAGTTCTCAGGATC-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.187 | 5′-CCTGAAGTTCTCAGGATCC-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.188 | 5′-CCTGAAGTTCTCAGGATCCA-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.189 | 5′-CCTGAAGTTCTCAGGATCCAC-3′ | |
| 22 | SEQ ID NO.190 | 5′-CCTGAAGTTCTCAGGATCCACG-3′ | |
| 23 | SEQ ID NO.191 | 5′-CCTGAAGTTCTCAGGATCCACGT-3′ | |
| 24 | SEQ ID NO.192 | 5′-CCTGAAGTTCTCAGGATCCACGTG-3′ | |
| IVS-2-5-CP | 16 | SEQ ID NO.193 | 5′-TCTATGGGACCCTTGA-3′ |
| 17 | SEQ ID NO.194 | 5′-TCTATGGGACCCTTGAT-3′ | |
| 18 | SEQ ID NO.195 | 5′-TCTATGGGACCCTTGATG-3′ | |
| 19 | SEQ ID NO.196 | 5′-TCTATGGGACCCTTGATGT-3′ | |
| 20 | SEQ ID NO.197 | 5′-TCTATGGGACCCTTGATGTT-3′ | |
| 21 | SEQ ID NO.198 | 5′-TCTATGGGACCCTTGATGTTT-3′ | |
| 22 | SEQ ID NO.199 | 5′-TCTATGGGACCCTTGATGTTTT-3′ | |
| 23 | SEQ ID NO.200 | 5′-TCTATGGGACCCTTGATGTTTTC-3′ | |
| IVS-2-654-CP | 24 | SEQ ID NO.201 | 5′-AATAGCAATATTTCTGCATATAAA-3′ |
| 25 | SEQ ID NO.202 | 5′-AATAGCAATATTTCTGCATATAAAT-3′ | |
| 26 | SEQ ID NO.203 | 5′-AATAGCAATATTTCTGCATATAAATA-3′ | |
| 27 | SEQ ID NO.204 | 5′-AATAGCAATATTTCTGCATATAAATAT-3′ | |
| 28 | SEQ ID NO.205 | 5′-AATAGCAATATTTCTGCATATAAATATT-3′ | |
| 29 | SEQ ID NO.206 | 5′-AATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTT-3′ |
| 30 | SEQ ID NO.207 | 5′AATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTC-3′ | |
| 31 | SEQ ID NO.208 | 5′-AATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCT-3′ |
在上表中共包括20组探针，每组探针分别包括8条可任选的序列，在检测β-地贫的芯片中应同时包含从20组的每一组中选择的一个序列。此外，为了增加适宜的碳链长度，在表3的各序列5’末端还可以修饰了15～30个dT，形成连拉臂。这些间隔的连接臂将增加探针与玻片表面的距离，有利于探针与被检测DNA的杂交体的形成。
2、DNA探针的点样和固定
1)探针的点样和排列
在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用1M NHS，1M EDC混合，进行点样。完成DNA探针的合成之后，启动DNA点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置。完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。
2)DNA探针的固定方法
本发明采用两种方法将探针固定在玻片表面：第一种，通过活性基团的标记，包括氨基、巯基的标记。固定DNA的玻片也需要进行活化处理。通常进行活化处理的表面带有醛基或氨基，可以与DNA探针形成共价键。第二种，首先将DNA探针与点样缓冲液混合后点样，80℃加热1～4小时，然后使用UV Stratalinker 2400紫外交联仪在60mJ/cm2强度下进行紫外交联，最后用终止液终止反应。
实施例2 用于扩增待检样品中DNA的引物的设计及检测方法
1、用于扩增待检样品中DNA的PCR引物的设计
根据α-地中海贫血症基因突变的序列资料设计了4对引物用于检测。这4对引物的序列信息以及在基因簇上的位置见表4，四对引物分别为：第一对上游引物A2/3.7-F、下游引物A2-R；第二对上游引物A2/3.7-F、下游A3.7-R；第三对上游引物A4.2-F、下游引物A4.2-R；第四对上游引物SEA-F、下SEA-F游引物SEA-R；表4中的每一上游或下游引物均包括一组分别由8条引物组成的序列，在选择时，可以从一组引物中任选一个序列作为一个引物，但应同时包含来自八组的8个引物。每50μL反应体积包括了10ng基因组DNA、8个引物、10xbuffer、1.5mM MgCl2、200μM dNTPs、1xQ-solution和2.5UHotStarTaq DNA聚合酶。反应条件为：96℃15min，98℃变性45 s、60℃退火90sec、72℃延伸3min，共35个循环，最后一步72℃延伸15min。
表4：不同长度的α-球蛋白基因扩增引物的DNA序列
| 引物分组 | 碱基长度 | 序列号SEQID NO. | 序列 | Tm(℃) |
| A2/3.7-F | 18 | 209 | 5’-CCCTCGCCAAGTCCACCC-3’ | 66.3 |
| 19 | 210 | 5’-CCCCTCGCCAAGTCCACCC-3’ | 69.6 | |
| 20 | 211 | 5’-CTGGACTCCTGGACCTCCCA-3’ | 64.9 | |
| 21 | 212 | 5’-CTGGACTCCTGGACCTCCCAC-3’ | 65.5 | |
| 22 | 213 | 5’-CTGGACTCCTGGACCTCCCACC-3’ | 68.7 | |
| 22 | 214 | 5’-ACTGGACTCCTGGACCTCCCAC-3’ | 66.1 | |
| 23 | 215 | 5’-ACTGGACTCCTGGACCTCCCACC-3’ | 69.2 | |
| 23 | 216 | 5’-CACTGGACTCCTGGACCTCCCAC-3’ | 68.7 | |
| A2-R | 20 | 217 | 5’-TCAAAGACCAGGAAGGGCCG-3’ | 66.9 |
| 21 | 218 | 5’-TTCAAAGACCAGGAAGGGCCG-3’ | 67.8 | |
| 22 | 219 | 5’-ATTCAAAGACCAGGAAGGGCCG-3’ | 67.6 | |
| 23 | 220 | 5’-ATTCAAAGACCAGGAAGGGCCGG-3’ | 70.3 | |
| 19 | 221 | 5’-AGACCAGGAAGGGCCGGTG-3’ | 67.0 | |
| 20 | 222 | 5’-AAGACCAGGAAGGGCCGGTG-3’ | 67.9 | |
| 21 | 223 | 5’-AAAGACCAGGAAGGGCCGGTG-3’ | 68.8 | |
| 21 | 224 | 5’-CAAAGACCAGGAAGGGCCGGT-3’ | 68.8 | |
| A3.7-R | 22 | 225 | 5’-CCTCAAAGCACTCTAGGGTCCA-3’ | 62.8 |
| 23 | 226 | 5’-CCTCAAAGCACTCTAGGGTCCAG-3’ | 63.6 | |
| 24 | 227 | 5’-CCTCAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’ | 66.7 |
| 21 | 228 | 5’-AAAGCACTCTAGGGTCCAGCG-3’ | 62.9 | |
| 22 | 229 | 5’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGCG-3’ | 65.5 | |
| 23 | 230 | 5’-TCAAAGCACTCTAGGGTCCAGCG-3’ | 67.0 | |
| 24 | 231 | 5’-CTCAAAGCACTCTAGGGTCCAGCG-3’ | 67.6 | |
| 25 | 232 | 5’-CCTCAAAGCACTCTAGGGTCCAGCG-3’ | 70.2 | |
| A4.2-F | 21 | 233 | 5’-GGTTTACCCATGTGGTGCCTC-3’ | 63.6 |
| 22 | 234 | 5’-CGGTTTACCCATGTGGTGCCTC-3’ | 67.8 | |
| 20 | 235 | 5’-CATGTGGTGCCTCCATGGAC-3’ | 64.7 | |
| 21 | 236 | 5’-CCATGTGGTGCCTCCATGGAC-3’ | 68.2 | |
| 19 | 237 | 5’-CCCATGTGGTGCCTCCATG-3’ | 65.8 | |
| 20 | 238 | 5’-CCCATGTGGTGCCTCCATGG-3’ | 69.2 | |
| 22 | 239 | 5’-CTTCCCATGTGGTGCCTCCATG-3’ | 69.1 | |
| 23 | 240 | 5’-CCTTCCCATGTGGTGCCTCCATG-3’ | 71.9 | |
| A4.2-R | 19 | 241 | 5’-CTTCCCCCGTTGGATCTTC-3’ | 61.6 |
| 20 | 242 | 5’-GCTTCCCCCGTTGGATCTTC-3’ | 65.2 | |
| 21 | 243 | 5’-CCAGCTTAGCAATGCTTCCCC-3’ | 65.2 | |
| 23 | 244 | 5’-GACCAGCTTAGCAATGCTTCCCC-3’ | 67.3 | |
| 22 | 245 | 5’-GACCAGCTTAGCAATGCTTCCC-3’ | 64.4 | |
| 22 | 246 | 5’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCC-3’ | 64.0 | |
| 23 | 247 | 5’-CCCGTTGGATCTTCTCATTTCCC-3’ | 67.0 | |
| 24 | 248 | 5’-CCCCGTTGGATCTTCTCATTTCCC-3’ | 69.6 | |
| SEA-F | 15 | 249 | 5’-CGGAGCGATCTGGGC-3’ | 59.7 |
| 16 | 250 | 5’-GGAGCGATCTGGGCTC-3’ | 57.4 | |
| 17 | 251 | 5’-CGGAGCGATCTGGGCTC-3’ | 63.0 | |
| 19 | 252 | 5’-CGGAGCGATCTGGGCTCTG-3’ | 66.8 | |
| 19 | 253 | 5’-CGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’ | 59.1 | |
| 21 | 254 | 5’-CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC-3’ | 62.2 | |
| 20 | 255 | 5’-GCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’ | 63.2 | |
| 22 | 256 | 5’-GCGATCTGGGCTCTGTGTTCTC-3’ | 65.7 | |
| SEA-R | 18 | 257 | 5’-CCCACGTTGTGTTCATGG-3’ | 59.0 |
| 19 | 258 | 5’-GCCCACGTTGTGTTCATGG-3’ | 63.3 | |
| 20 | 259 | 5’-CCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’ | 63.5 | |
| 20 | 260 | 5’-AGCCCACGTTGTGTTCATGG-3’ | 64.2 | |
| 20 | 261 | 5’-GCCCACGTTGTGTTCATGGC-3’ | 67.1 | |
| 22 | 262 | 5’-CCACGTTGTGTTCATGGCTGTG-3’ | 67.0 | |
| 21 | 263 | 5’-AGCCCACGTTGTGTTCATGGC-3’ | 67.7 | |
| 22 | 264 | 5’-AAGCCCACGTTGTGTTCATGGC-3’ | 68.6 |
用两对特异性的、具有不同长度和Tm值的引物扩增出β-球蛋白基因的2个片段。引物的核酸序列见表5，其中第一对引物上游为HBB-1、下游为HBB-2；第二对引物上游为HBB-3、下游为HBB-4，表5中每组引物包括8条可任选的序列。每50μL反应体积包括了100-200ng基因组DNA、从4组引物中分别选择4个引物、10xbuffer、1.5mMgCl2、200μM dNTPs和5UTaq DNA聚合酶。热循环反应条件为：95℃ 2min，94℃变性30s、60℃退火30sec、72℃延伸30sec，共30个循环，最后一步72℃延伸5min。将PCR产物纯化和定量。
表5：不同长度的β-球蛋白基因扩增引物DNA序列
| 引物分组 | 碱基长度 | 序列号SEQ IDNO. | 序列 | Tm(℃) |
| HBB-1 | 19 | 313 | 5’-GGGTTGGCCAATCTACTCC-3’ | 59.1 |
| 20 | 314 | 5’-GGGTTGGCCAATCTACTCCC-3’ | 62.8 | |
| 20 | 315 | 5’-AGGGTTGCCAATCTACTCC-3’ | 60.1 | |
| 21 | 316 | 5’-TAGGGTTGGCCAATCTACTCC-3’ | 60.2 | |
| 22 | 317 | 5’-CTAGGGTTGGCCAATCTACTCC-3’ | 61.0 | |
| 22 | 318 | 5’-CCTAGGGTTGGCCAATCTACTC-3’ | 61.0 | |
| 21 | 319 | 5’-CCCTAGGGTTGGCCAATCTAC-3’ | 61.8 | |
| 22 | 320 | 5’-CCCTAGGGTTGGCCAATCTACT-3’ | 62.6 | |
| HBB-2 | 21 | 321 | 5’-ACGATCCTGAGACTTCCACAC-3’ | 58.9 |
| 22 | 322 | 5’-ACGATCCTGAGACTTCCACACT-3’ | 60.0 | |
| 21 | 323 | 5’-AACGATCCTGAGACTTCCACA-3’ | 59.5 | |
| 22 | 324 | 5’-AACGATCCTGAGACTTCCACAC-3’ | 60.4 | |
| 22 | 325 | 5’-AAACGATCCTGAGACTTCCACA-3’ | 60.9 | |
| 22 | 326 | 5’-AAAACGATCCTGAGACTTCCAC-3’ | 59.4 | |
| 23 | 327 | 5’-AAAACGATCCTGAGACTTCCACA-3’ | 62.1 | |
| 23 | 328 | 5’-TAAAACGATCCTGAGACTTCCAC-3’ | 59.5 | |
| HBB-3 | 20 | 329 | 5’-CATGCCTCTTTGCACCATTC-3’ | 61.4 |
| 21 | 330 | 5’-CATGCCTCTTTGCACCATTCT-3’ | 62.3 | |
| 19 | 331 | 5’-TGCCTCTTTGCACCATTCT-3’ | 59.1 | |
| 20 | 332 | 5’-ATGCCTCTTTGCACCATTCT-3’ | 59.5 | |
| 20 | 333 | 5’-TGCCTCTTTGCACCATTCTA-3’ | 59.2 | |
| 21 | 334 | 5’-TGCCTCTTTGCACCATTCTAA-3’ | 60.6 | |
| 21 | 335 | 5’-ATGCCTCTTTGCACCATTCTA-3’ | 59.5 | |
| 22 | 336 | 5’-ATGCCTCTTTGCACCATTCTAA-3’ | 60.8 | |
| HBB-4 | 20 | 337 | 5’-TGCTCAAGGCCCTTCATAAT-3’ | 59.5 |
| 21 | 338 | 5’-ATGCTCAAGGCCCTTCATAAT-3’ | 59.8 | |
| 22 | 339 | 5’-GATGCTCAAGGCCCTTCATAAT-3’ | 60.3 | |
| 23 | 340 | 5’-AGATGCTCAAGGCCCTTCATAAT-3’ | 61.2 | |
| 20 | 341 | 5’-TGCTCAAGGCCCTTCATAAT-3’ | 59.5 |
| 21 | 342 | 5’-TGCTCAAGGCCCTTCATAATA-3’ | 59.5 | |
| 22 | 343 | 5’-ATGCTCAAGGCCCTTCATAATA-3’ | 59.8 | |
| 23 | 344 | 5’-ATGCTCAAGGCCCTTCATAATAT-3’ | 60.0 |
2、PCR产物的延伸和荧光标记
1)延伸引物的设计
延伸引物的Tm值为50-65℃，3’端与突变位点相邻。与α-地中海贫血症3种缺失突变类型及β-地中海贫血症基因的20种点突变类型相对应设计了4条和20条引物，见表6和表7。
表6：α-球蛋白基因的延伸引物DNA序列
| 引物分组 | 长度(bp) | 序列号SEQ IDNO. | Sequence | Tm(℃) |
| A2 | 14 | 265 | 5’-AGGAGGGGAGGAGG-3’ | 49.7 |
| 15 | 266 | 5’-AAGGAGGGGAGGAGG-3’ | 52.2 | |
| 16 | 267 | 5’-CAAGGAGGGGAGGAGG-3’ | 55.9 | |
| 17 | 268 | 5’-GCAAGGAGGGGAGGAGG-3’ | 60.5 | |
| 12 | 269 | 5’-GGAGGAGGGCCC-3’ | 48.6 | |
| 13 | 270 | 5’-GGGAGGAGGGCCC-3’ | 54.5 | |
| 14 | 271 | 5’-GGGGAGGAGGGCCC-3’ | 59.5 | |
| 15 | 272 | 5’-AGGGGAGGAGGGCCC-3’ | 60.7 | |
| 14 | 273 | 5’-TGCAAGGAGGGGAG-3’ | 50.3 | |
| 15 | 274 | 5’-GTGCAAGGAGGGGAG-3’ | 52.0 | |
| 16 | 275 | 5’-GGTGCAAGGAGGGGAG-3’ | 57.1 | |
| 17 | 276 | 5’-CGGTGCAAGGAGGGGAG-3’ | 62.7 | |
| A3.7 | 16 | 277 | 5’-TTTCCAGCTGGACTTC-3’ | 48.3 |
| 17 | 278 | 5’-TTTTCCAGCTGGACTTC-3’ | 51.1 | |
| 18 | 279 | 5’-TTTTTCCAGCTGGACTTC-3’ | 53.3 | |
| 19 | 280 | 5’-GTTTTTCCAGCTGGACTTC-3’ | 54.5 | |
| 16 | 281 | 5’-TCCAGCTGGACTTCGC-3’ | 56.3 | |
| 17 | 282 | 5’-TTCCAGCTGGACTTCGC-3’ | 58.2 | |
| 18 | 283 | 5’-TTTCCAGCTGGACTTCGC-3’ | 59.8 | |
| 19 | 284 | 5’-TTTTCCAGCTGGACTTCGC-3’ | 61.3 | |
| 14 | 285 | 5’-TGGACTTCGCGGTG-3’ | 52.9 | |
| 15 | 286 | 5’-CTGGACTTCGCGGTG-3’ | 54.7 | |
| 16 | 287 | 5’-GCTGGACTTCGCGGTG-3’ | 59.8 | |
| 17 | 288 | 5’-AGCTGGACTTCGCGGTG-3’ | 61.0 | |
| A4.2 | 14 | 289 | 5’-TCTGCCCACAGCCT-3’ | 50.9 |
| 15 | 290 | 5’-CTCTGCCCACAGCCT-3’ | 52.8 | |
| 16 | 291 | 5’-ACTCTGCCCACAGCCT-3’ | 54.3 | |
| 17 | 292 | 5’-GACTCTGCCCACAGCCT-3’ | 56.8 | |
| 15 | 293 | 5’-TGCCCACAGCCTGAA-3’ | 55.8 | |
| 16 | 294 | 5’-CTGCCCACAGCCTGAA-3’ | 57.3 | |
| 17 | 295 | 5’-TCTGCCCACAGCCTGAA-3’ | 59.8 | |
| 18 | 296 | 5’-CTCTGCCCACAGCCTGAA-3’ | 60.9 | |
| 16 | 297 | 5’-TCTGACTCTGCCCACA-3’ | 51.1 | |
| 17 | 298 | 5’-TTCTGACTCTGCCCACA-3’ | 53.6 | |
| 18 | 299 | 5’-TTTCTGACTCTGCCCACA-3’ | 55.7 | |
| 19 | 300 | 5’-CTTTCTGACTCTGCCCACA-3’ | 57.1 | |
| A-SEA | 13 | 301 | 5’-TGGCTGCCTGGGT-3’ | 5 1.8 |
| 14 | 302 | 5’-GTGGCTGCCTGGGT-3’ | 53.5 | |
| 15 | 303 | 5’-TGTGGCTGCCTGGGT-3’ | 57.6 | |
| 16 | 304 | 5’-CTGTGGCTGCCTGGGT-3’ | 58.9 | |
| 17 | 305 | 5’-GCTGTGGCTGCCTGGGT-3’ | 63.5 | |
| 15 | 306 | 5’-CTGCCTGGGTGATGA-3’ | 51.4 | |
| 16 | 307 | 5’-GCTGCCTGGGTGATGA-3’ | 57.0 | |
| 17 | 308 | 5’-GGCTGCCTGGGTGATGA-3’ | 61.7 | |
| 16 | 309 | 5’-GTTCATGGCTGTGGCT-3’ | 52.7 | |
| 17 | 310 | 5’-TGTTCATGGCTGTGGCT-3’ | 56.6 | |
| 18 | 311 | 5’-GTGTTCATGGCTGTGGCT-3’ | 57.8 | |
| 19 | 312 | 5’-TGTGTTCATGGCTGTGGCT-3’ | 61.1 |
表7：β-球蛋白基因点突变延伸引物的DNA序列
| 引物分组 | 长度(bp) | 序列号SEQ IDNO. | Sequence | Tm(℃) |
| 8 | 16 | 345 | 5′-CCTGACTCCTGAGGAG-3′ | 47.6 |
| 17 | 346 | 5′-ACCTGACTCCTGAGGAG-3′ | 49.3 | |
| 18 | 347 | 5′-CACCTGACTCCTGAGGAG-3′ | 53.3 | |
| 19 | 348 | 5′-GCACCTGACTCCTGAGGAG-3′ | 58.2 | |
| 20 | 349 | 5′-TGCACCTGACTCCTGAGGAG-3′ | 61.4 | |
| 21 | 350 | 5′-GTGCACCTGACTCCTGAGGAG-3′ | 62.3 | |
| 22 | 351 | 5′-GGTGCACCTGACTCCTGAGGAG-3′ | 65.8 | |
| 23 | 352 | 5′-TGGTGCACCTGACTCCTGAGGAG-3′ | 68.4 | |
| 8-9 | 14 | 353 | 5′-GCAGTAACGGCAGA-3′ | 44.9 |
| 15 | 354 | 5′-GGCAGTAACGGCAGA-3′ | 51.0 | |
| 16 | 355 | 5′-GGGCAGTAACGGCAGA-3′ | 56.1 | |
| 17 | 356 | 5′-AGGGCAGTAACGGCAGA-3′ | 57.5 | |
| 18 | 357 | 5′-CAGGGCAGTAACGGCAGA-3′ | 60.8 | |
| 19 | 358 | 5′-ACAGGGCAGTAACGGCAGA-3′ | 61.7 |
| 20 | 359 | 5′-CACAGGGCAGTAACGGCAGA-3′ | 64.6 | |
| 21 | 360 | 5′-CCACAGGGCAGTAACGGCAGA-3′ | 67.8 | |
| 14-15(2) | 12 | 361 | 5’-CCTTGCCCCACC-3’ | 47.5 |
| 13 | 362 | 5’-ACCTTGCCCCACC-3’ | 49.5 | |
| 14 | 363 | 5’-CACCTTGCCCCACC-3’ | 53.9 | |
| 15 | 364 | 5’-TCACCTTGCCCCACC-3’ | 56.6 | |
| 16 | 365 | 5’-TTCACCTTGCCCCACC-3’ | 58.5 | |
| 17 | 366 | 5’-GTTCACCTTGCCCCACC-3’ | 59.6 | |
| 18 | 367 | 5’-CGTTCACCTTGCCCCACC-3’ | 64.8 | |
| 19 | 368 | 5’-ACGTTCACCTTGCCCCACC-3’ | 65.5 | |
| 17(2) | 16 | 369 | 5′-TCATCCACGTTCACCT-3′ | 49.6 |
| 17 | 370 | 5′-TTCATCCACGTTCACCT-3′ | 52.1 | |
| 18 | 371 | 5′-CTTCATCCACGTTCACCT-3′ | 53.7 | |
| 19 | 372 | 5′-ACTTCATCCACGTTCACCT-3′ | 55.0 | |
| 20 | 373 | 5′-AACTTCATCCACGTTCACCT-3′ | 56.7 | |
| 21 | 374 | 5′-CAACTTCATCCACGTTCACCT-3′ | 59.8 | |
| 22 | 375 | 5′-CCAACTTCATCCACGTTCACCT-3′ | 63.4 | |
| 23 | 376 | 5′-ACCAACTTCATCCACGTTCACCT-3′ | 64.1 | |
| 26 | 16 | 377 | 5′-GGATGAAGTTGGTGGT-3′ | 47.7 |
| 17 | 378 | 5′-TGGATGAAGTTGGTGGT-3′ | 51.8 | |
| 18 | 379 | 5′-GTGGATGAAGTTGGTGGT-3′ | 53.5 | |
| 19 | 380 | 5′-CGTGGATGAAGTTGGTGGT-3′ | 59.1 | |
| 20 | 381 | 5′-ACGTGGATGAAGTTGGTGGT-3′ | 60.1 | |
| 21 | 382 | 5′-AACGTGGATGAAGTTGGTGGT-3′ | 61.5 | |
| 22 | 383 | 5′-GAACGTGGATGAAGTTGGTGGT-3′ | 63.3 | |
| 23 | 384 | 5′-TGAACGTGGATGAAGTTGGTGGT-3′ | 65.9 | |
| 30 | 11 | 385 | 5′-AGGCCCTGGGC-3′ | 46.8 |
| 12 | 386 | 5′-GAGGCCCTGGGC-3′ | 50.2 | |
| 13 | 387 | 5′-TGAGGCCCTGGGC-3′ | 54.7 | |
| 14 | 388 | 5′-GTGAGGCCCTGGGC-3′ | 56.2 | |
| 15 | 389 | 5′-GGTGAGGCCCTGGGC-3′ | 61.0 | |
| 16 | 390 | 5′-TGGTGAGGCCCTGGGC-3′ | 64.4 | |
| 17 | 391 | 5′-GTGGTGAGGCCCTGGGC-3′ | 65.2 | |
| 18 | 392 | 5′-GGTGGTGAGGCCCTGGGC-3′ | 68.7 | |
| 31 | 15 | 393 | 5′-CCCACCCTTAGGCTG-3′ | 52.1 |
| 16 | 394 | 5′-TCCCACCCTTAGGCTG-3′ | 54.8 | |
| 17 | 395 | 5′-TTCCCACCCTTAGGCTG-3′ | 56.7 | |
| 18 | 396 | 5′-TTTCCCACCCTTAGGCTG-3′ | 58.4 | |
| 19 | 397 | 5′-TTTTCCCACCCTTAGGCTG-3′ | 59.9 | |
| 20 | 398 | 5′-ATTTTCCCACCCTTAGGCTG-3′ | 60.1 | |
| 21 | 399 | 5′-TATTTTCCCACCCTTAGGCTG-3′ | 60.1 | |
| 22 | 400 | 5′-CTATTTTCCCACCCTTAGGCTG-3′ | 61.0 |
| 37 | 16 | 401 | 5′-CTGGTGGTCTACCCTT-3′ | 47.1 |
| 17 | 402 | 5′-GCTGGTGGTCTACCCTT-3′ | 52.6 | |
| 18 | 403 | 5′-TGCTGGTGGTCTACCCTT-3′ | 56.1 | |
| 19 | 404 | 5′-CTGCTGGTGGTCTACCCTT-3′ | 57.4 | |
| 20 | 405 | 5′-GCTGCTGGTGGTCTACCCTT-3′ | 61.5 | |
| 21 | 406 | 5′-GGCTGCTGGTGGTCTACCCTT-3′ | 64.9 | |
| 22 | 407 | 5′-AGGCTGCTGGTGGTCTACCCTT-3′ | 65.6 | |
| 23 | 408 | 5′-TAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTT-3′ | 65.4 | |
| 41-42 | 15 | 409 | 5′-TTGGACCCAGAGGTT-3′ | 48.3 |
| 16 | 410 | 5′-CTTGGACCCAGAGGTT-3′ | 50.3 | |
| 17 | 411 | 5′-CCTTGGACCCAGAGGTT-3′ | 55.3 | |
| 18 | 412 | 5′-CCCTTGGACCCAGAGGTT-3′ | 59.7 | |
| 19 | 413 | 5′-ACCCTTGGACCCAGAGGTT-3′ | 60.6 | |
| 20 | 414 | 5′-TACCCTTGGACCCAGAGGTT-3′ | 60.6 | |
| 21 | 415 | 5′-CTACCCTTGGACCCAGAGGTT-3′ | 61.5 | |
| 22 | 416 | 5′-TCTACCCTTGGACCCAGAGGTT-3′ | 63.2 | |
| 43(3) | 17 | 417 | 5′-CCCAGAGGTTCTTTGA-3′ | 48.5 |
| 18 | 418 | 5′-ACCCAGAGGTTCTTTGA-3′ | 50.1 | |
| 19 | 419 | 5′-GACCCAGAGGTTCTTTGA-3′ | 52.7 | |
| 20 | 420 | 5′-GGACCCAGAGGTTCTTTGA-3′ | 57.3 | |
| 21 | 421 | 5′-TGGACCCAGAGGTTCTTTGA-3′ | 60.4 | |
| 22 | 422 | 5′-TTGGACCCAGAGGTTCTTTGA-3′ | 61.8 | |
| 23 | 423 | 5′-CTTGGACCCAGAGGTTCTTTGA-3′ | 62.7 | |
| 24 | 424 | 5′-CCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGA-3′ | 65.8 | |
| 71-72 | 15 | 425 | 5′-TGCTCGGTGCCTTTA-3′ | 51.9 |
| 16 | 426 | 5′-GTGCTCGGTGCCTTTA-3′ | 53.5 | |
| 17 | 427 | 5′-AGTGCTCGGTGCCTTTA-3′ | 54.8 | |
| 18 | 428 | 5′-AAGTGCTCGGTGCCTTTA-3′ | 56.6 | |
| 19 | 429 | 5′-AAAGTGCTCGGTGCCTTTA-3′ | 58.3 | |
| 20 | 430 | 5′-GAAAGTGCTCGGTGCCTTTA-3′ | 60.2 | |
| 21 | 431 | 5′-AGAAAGTGCTCGGTGCCTTTA-3′ | 61.1 | |
| 22 | 432 | 5′-AAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTA-3′ | 62.3 | |
| 95 | 16 | 433 | 5′-AGCTGCACTGTGACAA-3′ | 48.0 |
| 17 | 434 | 5′-GAGCTGCACTGTGACAA-3′ | 51.1 | |
| 18 | 435 | 5′-TGAGCTGCACTGTGACAA-3′ | 55.1 | |
| 19 | 436 | 5′-GTGAGCTGCACTGTGACAA-3′ | 56.4 | |
| 20 | 437 | 5′-AGTGAGCTGCACTGTGACAA-3′ | 57.8 | |
| 21 | 438 | 5′-GAGTGAGCTGCACTGTGACAA-3′ | 60.0 | |
| 22 | 439 | 5′-TGAGTGAGCTGCACTGTGACAA-3′ | 63.1 | |
| 23 | 440 | 5′-CTGAGTGAGCTGCACTGTGACAA-3′ | 64.0 | |
| -32 | 11 | 441 | 5′-CCAGGGCTGGG-3′ | 44.5 |
| 12 | 442 | 5′-GCCAGGGCTGGG-3′ | 51.6 |
| 13 | 443 | 5′-AGCCAGGGCTGGG-3′ | 53.6 | |
| 14 | 444 | 5′-GAGCCAGGGCTGGG-3′ | 56.4 | |
| 15 | 445 | 5′-GGAGCCAGGGCTGGG-3′ | 61.2 | |
| 16 | 446 | 5′-AGGAGCCAGGGCTGGG-3′ | 62.2 | |
| 17 | 447 | 5′-CAGGAGCCAGGGCTGGG-3′ | 65.4 | |
| 18 | 448 | 5′-GCAGGAGCCAGGGCTGGG-3′ | 69.0 | |
| -29 | 16 | 449 | 5′-GCTCTGCCCTGACTTT-3′ | 51.0 |
| 17 | 450 | 5′-GGCTCTGCCCTGACTTT-3′ | 55.9 | |
| 18 | 451 | 5′-TGGCTCTGCCCTGACTTT-3′ | 59.2 | |
| 19 | 452 | 5′-ATGGCTCTGCCCTGACTTT-3′ | 59.6 | |
| 20 | 453 | 5′-GATGGCTCTGCCCTGACTTT-3′ | 61.5 | |
| 21 | 454 | 5′-AGATGGCTCTGCCCTGACTTT-3′ | 62.4 | |
| 22 | 455 | 5′-TAGATGGCTCTGCCCTGACTTT-3′ | 62.4 | |
| 23 | 456 | 5′-ATAGATGGCTCTGCCCTGACTTT-3′ | 62.5 | |
| -28 | 13 | 457 | 5′-AGGGCTGGGCATA-3′ | 47.3 |
| 14 | 458 | 5′-CAGGGCTGGGCATA-3′ | 51.7 | |
| 15 | 459 | 5′-CCAGGGCTGGGCATA-3′ | 56.9 | |
| 16 | 460 | 5′-GCCAGGGCTGGGCATA-3′ | 61.6 | |
| 17 | 461 | 5′-AGCCAGGGCTGGGCATA-3′ | 62.6 | |
| 18 | 462 | 5′-GAGCCAGGGCTGGGCATA-3′ | 64.5 | |
| 19 | 463 | 5′-GGAGCCAGGGCTGGGCATA-3′ | 67.9 | |
| 20 | 464 | 5′-AGGAGCCAGGGCTGGGCATA-3′ | 68.5 | |
| IVS-1-1(3) | 12 | 465 | 5′-GGCCCTGGGCAG-3′ | 51.6 |
| 13 | 466 | 5′-AGGCCCTGGGCAG-3′ | 53.6 | |
| 14 | 467 | 5′-GAGGCCCTGGGCAG-3′ | 56.4 | |
| 15 | 468 | 5′-TGAGGCCCTGGGCAG-3′ | 60.2 | |
| 16 | 469 | 5′-GTGAGGCCCTGGGCAG-3′ | 61.2 | |
| 17 | 470 | 5′-GGTGAGGCCCTGGGCAG-3′ | 65.3 | |
| 18 | 471 | 5′-TGGTGAGGCCCTGGGCAG-3′ | 68.2 | |
| 19 | 472 | 5′-GTGGTGAGGCCCTGGGCAG-3′ | 68.8 | |
| IVS-1-5 | 13 | 473 | 5′-CCTGGGCAGGTTG-3′ | 48.1 |
| 14 | 474 | 5′-CCCTGGGCAGGTTG-3′ | 54.7 | |
| 15 | 475 | 5′-GCCCTGGGCAGGTTG-3′ | 59.4 | |
| 16 | 476 | 5′-GGCCCTGGGCAGGTTG-3′ | 63.7 | |
| 17 | 477 | 5′-AGGCCCTGGGCAGGTTG-3′ | 64.6 | |
| 18 | 478 | 5′-GAGGCCCTGGGCAGGTTG-3′ | 66.4 | |
| 19 | 479 | 5′-TGAGGCCCTGGGCAGGTTG-3′ | 69.2 | |
| 20 | 480 | 5′-GTGAGGCCCTGGGCAGGTTG-3′ | 69.7 | |
| IVS-2-1 | 17 | 481 | 5′-ATCCTGAGAACTTCAGG-3′ | 46.4 |
| 18 | 482 | 5′-GATCCTGAGAACTTCAGG-3′ | 49.3 | |
| 19 | 483 | 5′-GGATCCTGAGAACTTCAGG-3′ | 54.1 | |
| 20 | 484 | 5′-TGGATCCTGAGAACTTCAGG-3 ′ | 57.5 |
| 21 | 485 | 5′-GTGGATCCTGAGAACTTCAGG-3′ | 58.8 | |
| 22 | 486 | 5′-CGTGGATCCTGAGAACTTCAGG-3′ | 63.2 | |
| 23 | 487 | 5′-ACGTGGATCCTGAGAACTTCAGG-3′ | 63.9 | |
| 24 | 488 | 5′-CACGTGGATCCTGAGAACTTCAGG-3′ | 66.4 | |
| IVS-2-5 | 16 | 489 | 5′-TCAAGGGTCCCATAGA-3′ | 48.8 |
| 17 | 490 | 5′-ATCAAGGGTCCCATAGA-3′ | 49.9 | |
| 18 | 491 | 5′-CATCAAGGGTCCCATAGA-3′ | 53.6 | |
| 19 | 492 | 5′-ACATCAAGGGTCCCATAGA-3′ | 54.8 | |
| 20 | 493 | 5′-AACATCAAGGGTCCCATAGA-3′ | 56.6 | |
| 21 | 494 | 5′-AAACATCAAGGGTCCCATAGA-3′ | 58.1 | |
| 22 | 495 | 5′-AAAACATCAAGGGTCCCATAGA-3′ | 59.5 | |
| 23 | 496 | 5′-GAAAACATCAAGGGTCCCATAGA-3′ | 61.3 | |
| IVS-2-654 | 24 | 497 | 5′-TTTATATGCAGAAATATTGCTATT-3′ | 52.2 |
| 25 | 498 | 5′-ATTTATATGCAGAAATATTGCTATT-3′ | 52.8 | |
| 26 | 499 | 5′-TATTTATATGCAGAAATATTGCTATT-3′ | 53.0 | |
| 27 | 500 | 5′-ATATTTATATGCAGAAATATTGCTATT-3′ | 53.5 | |
| 28 | 501 | 5′-AATATTTATATGCAGAAATATTGCTATT-3′ | 54.7 | |
| 29 | 502 | 5′-AAATATTTATATGCAGAAATATTGCTATT-3′ | 55.9 | |
| 30 | 503 | 5′-GAAATATTTATATGCAGAAATATTGCTATT-3′ | 57.2 | |
| 31 | 504 | 5′-AGAAATATTTATATGCAGAAATATTGCTATF-3′ | 58.0 |
5)PCR产物的荧光标记
在用Tris、MgCl2、延伸引物(分别从表6和/或表7的各组引物中任选一条序列，对于检测α-型地贫，延伸引物应包含分别来自表6中四组引物中的四条引物，对于检测β-型地贫，延伸引物应包含分别来自表7中20组引物中的20条引物)、DNA聚合酶、TAMRA-ddATP、TAMRA-ddCTP、Cy5-ddGTP和ROX-ddUTP配成的SBE溶液5μL中加入10μLPCR产物。SBE反应包括30个循环的变性(96℃ 30s)、退火(50℃ 30s)和延伸(60℃ 1min)。
6)杂交
将5-10μL的荧光标记产物与杂交液(包含8xSSC、0.2mg/ml的鲑鱼精DNA和0.4％的SDS)混合，与固定在玻片上的探针杂交，盖上盖玻片，放入潮湿的杂交仓内50℃孵育4小时。然后将玻片用2xSSC、0.1％SDS洗一次，用2xSSC洗3次，再用0.2xSSC洗一次。将玻片1300rpm离心5分钟甩干，在ScanArray 4000扫描仪上进行扫描。扫描结果图例见图一a和b。
7)检测
杂交信号检测可以通过专用激光芯片扫描仪进行检测。扫描获得的图像，用芯片图像专用分析软件分析每个基片的杂交信号的强弱，从而确定突变有没有发生。如图一c。
以上对本发明的实施例的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，这些改变和变形均应属于本发明后附的权利要求所定义的范围。
SEQUENCE LISTING
<110>亚能生物技术(深圳)有限公司
<120>用于诊断地中海贫血的DNA芯片及其制备方法
<130>PI02952 <160> 504
<170>PatentIn version 3.1
<210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 1
gggccctcct cccctcct 18
<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 2
gggccctcct cccctccttg 20
<210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 3
gggccctcct cccctccttg 20
<210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 4
gggccctcct cccctccttg c 21
<210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 5
cccaacgggc cctcctcc 18
<210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 6
cccaacgggc cctcctccc 19
<210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 7
cccaacgggc cctcctcccc 20
<210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 8
cccaacgggc cctcctcccc t 21
<210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 9
ccctcctccc ctccttgca 19
<210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 10
ccctcctccc ctccttgcac 20
<210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 11
ccctcctccc ctccttgcac c 21
<210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 12
ccctcctccc ctccttgcac cg 22
<210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 13
gcgaagtcca gctggaaa 18
<210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 14
gcgaagtcca gctggaaaa 19
<210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 15
gcgaagtcca gctggaaaaa 20
<210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 16
gcgaagtcca gctggaaaaa c 21
<210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 17
accgcgaagt ccagctgga 19
<210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 18
accgcgaagt ccagctggaa 20
<210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 19
accgcgaagt ccagctggaa a 21
<210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 20
accgcgaagt ccagctggaa aa 22
<210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 21
gagccaccgc gaagtcca 18
<210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 22
gagccaccgc gaagtccag 19
<210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 23
gagccaccgc gaagtccagc 20
<210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 24
gagccaccgc gaagtccagc t 21
<210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 25
ttcaggc tgt gggcaga 17
<210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 26
ttcaggctgt gggcagag 18
<210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 27
ttcaggctgt gggcagagt 19
<210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 28
ttcaggctgt gggcagagtc 20
<210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 29
tccttcaggc tgtgggcaga 20
<210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 30
tccttcaggc tgtgggcaga g 21
<210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 31
tccttcaggc tgtgggcaga ga 22
<210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 32
tccttcaggc tgtgggcaga g 21
<210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 33
ggctgtgggc agagtcaga 19
<210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 34
ggctgtgggc agagtcagaa 20
<210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 35
ggctgtgggc agagtcagaa a 21
<210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 36
ggctgtgggc agagtcagaa ag 22
<210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 37
tcatcaccca ggcagcca 18
<210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 38
tcatcaccca ggcagccac 19
<210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 39
tcatcaccca ggcagccaca 20
<210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 40
tcatcaccca ggcagccaca g 21
<210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 41
tcatcaccca ggcagccaca gc 22
<210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 42
cactcatcac ccaggcag 18
<210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 43
cactcatcac ccaggcagc 19
<210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 44
cactcatcac ccaggcagcc 20
<210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 45
ggcagccaca gccatgaac 19
<210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 46
ggcagccaca gccatgaaca 20
<210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 47
ggcagccaca gccatgaaca c 21
<210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 48
ggcagccaca gccatgaaca ca 22
<210> 49 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 49
ctcctcagga gtcagg 16
<210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 50
ctcc tcagga gtcaggt 17
<210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 51
ctcctcagga gtcaggtg 18
<210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 52
ctcctcagga gtcaggtgc 19
<210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 53
ctcctcagga gtcaggtgca 20
<210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 54
ctcctcagga gtcaggtgca c 21
<210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 55
ctcctcagga gtcaggtgca cc 22
<210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 56
ctcctcagga gtcaggtgca cca 23
<210> 57 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 57
tctgccgtta ctgc 14
<210> 58 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 58
tctgccgtta ctgcc 15
<210> 59 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 59
tctgccgtta ctgccc 16
<210> 60 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 60
tctgccgtta ctgccct 17
<210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 61
tctgccgtta ctgccctg 18
<210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 62
tctgccgtta ctgccctgt 19
<210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 63
tctgccgtta ctgccctgtg 20
<210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 64
tctgccgtta ctgccctgtg g 21
<210> 65 <211> 12 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 65
ggtggggcaa gg 12
<210> 66 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 66
ggtggggcaa ggt 13
<210> 67 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 67
ggtggggcaa ggtg 14
<210> 68 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 68
ggtggggcaa ggtga 15
<210> 69 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 69
ggtggggcaa ggtgaa 16
<210> 70 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 70
ggtggggcaa ggtgaac 17
<210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 71
ggtggggcaa ggtgaacg 18
<210> 72 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 72
ggtggggcaa ggtgaacgt 19
<210> 73 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 73
aggtgaacgt ggatga 16
<210> 74 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 74
aggtgaacgt ggatgaa 17
<210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 75
aggtgaacgt ggatgaag 18
<210> 76 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 76
aggtgaacgt ggatgaagt 19
<210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 77
aggtgaacgt ggatgaagtt 20
<210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 78
aggtgaacgt ggatgaagtt g 21
<210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 79
aggtgaacgt ggatgaagtt gg 22
<210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 80
aggtgaacgt ggatgaagtt ggt 23
<210> 81 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 81
accaccaact tcatcc 16
<210> 82 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 82
accaccaact tcatcca 17
<210> 83 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 83
accaccaact tcatccac 18
<210> 84 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 84
accaccaact tcatccacg 19
<210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 85
accaccaact tcatccacgt 20
<210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 86
accaccaact tcatccacgt t 21
<210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 87
accaccaact tcatccacgt tc 22
<210> 88 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 88
accaccaact tcatccacgt tca 23
<210> 89 <211> 11 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 89
gcccagggcc t 11
<210> 90 <211> 12 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 90
gcccagggcc tc 12
<210> 91 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 91
gcccagggcc tca 13
<210> 92 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 92
gcccagggcc tcac 14
<210> 93 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 93
gcccagggcc tcacc 15
<210> 94 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 94
gcccagggcc tcacca 16
<210> 95 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 95
gcccagggcc tcaccac 17
<210> 96 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 96
gcccagggcc tcaccacc 18
<210> 97 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 97
cagcctaagg gtggg 15
<210> 98 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 98
cagcctaagg gtggga 16
<210> 99 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 99
cagcctaagg gtgggaa 17
<210> 100 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 100
cagcctaagg gtgggaaa 18
<210> 101 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 101
cagcctaagg gtgggaaaa 19
<210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 102
cagcctaagg gtgggaaaat 20
<210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 103
cagcctaagg gtgggaaaat a 21
<210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 104
cagcctaagg gtgggaaaat ag 22
<210> 105 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 105
aagggtagac caccag 16
<210> 106 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 106
aagggtagac caccagc 17
<210> 107 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 107
aagggtagac caccagca 18
<210> 108 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 108
aagggtagac caccagcag 19
<210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 109
aagggtagac caccagcagc 20
<210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 110
aagggtagac caccagcagc c 21
<210> 111 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 111
aagggtagac caccagcagc ct 22
<210> 112 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 112
aagggtagac caccagcagc cta 23
<210> 113 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 113
aacctctggg tccaa 15
<210> 114 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 114
aacctctggg tccaag 16
<210> 115 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 115
aacctctggg tccaagg 17
<210> 116 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 116
aacctctggg tccaaggg 18
<210> 117 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 117
aacctctggg tccaagggt 19
<210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 118
aacctctggg tccaagggta 20
<210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 119
aacctctggg tccaagggta g 21
<210> 120 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 120
aacctctggg tccaagggta ga 22
<210> 121 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 121
tcaaagaacc tctggg 16
<210> 122 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 122
tcaaagaacc tctgggt 17
<210> 123 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 123
tcaaagaacc tctgggtc 18
<210> 124 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 124
tcaaagaacc tctgggtcc 19
<210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 125
tcaaagaacc tctgggtcca 20
<210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 126
tcaaagaacc tctgggtcca a 21
<210> 127 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 127
tcaaagaacc tctgggtcca ag 22
<210> 128 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 128
tcaaagaacc tctgggtcca agg 23
<210> 129 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 129
taaaggcacc gagca 15
<210> 130 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 130
taaaggcacc gagcac 16
<210> 131 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 131
taaaggcacc gagcact 17
<210> 132 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 132
taaaggcacc gagcactt 18
<210> 133 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 133
taaaggcacc gagcacttt 19
<210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 134
taaaggcacc gagcactttc 20
<210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 135
taaaggcacc gagcactttc t 21
<210> 136 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 136
taaaggcacc gagcactttc tt 22
<210> 137 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 137
ttgtcacagt gcagct 16
<210> 138 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 138
ttgtcacagt gcagctc 17
<210> 139 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 139
ttgtcacagt gcagctca 18
<210> 140 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 140
ttgtcacagt gcagctcac 19
<210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 141
ttgtcacagt gcagctcact 20
<210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 142
ttgtcacagt gcagctcact c 21
<210> 143 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 143
ttgtcacagt gcagctcact ca 22
<210> 144 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 144
ttgtcacagt gcagctcact cag 23
<210> 145 <211> 11 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 145
cccggccctg g 11
<210> 146 <211> 12 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 146
cccagccctg gc 12
<210> 147 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 147
cccagccctg gct 13
<210> 148 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 148
cccagccctg gctc 14
<210> 149 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 149
cccagccctg gctcc 15
<210> 150 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 150
cccagccctg gctcct 16
<210> 151 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 151
cccagccctg gctcctg 17
<210> 152 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 152
cccagccctg gctcctgc 18
<210> 153 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 153
aaagtcaggg cagagc 16
<210> 154 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 154
aaagtcaggg cagagcc 17
<210> 155 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 155
aaagtcaggg cagagcca 18
<210> 156 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 156
aaagtcaggg cagagccat 19
<210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 157
aaagtcaggg cagagccatc 20
<210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 158
aaagtcaggg cagagccatc t 21
<210> 159 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 159
aaagtcaggg cagagccatc ta 22
<210> 160 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 160
aaagtcaggg cagagccatc tat 23
<210> 161 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 161
tatgcccagc cct 13
<210> 162 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 162
tatgcccagc cctg 14
<210> 163 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 163
tatgcccagc cctgg 15
<210> 164 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 164
tatgcccagc cctggc 16
<210> 165 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 165
tatgcccagc cctggct 17
<210> 166 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 166
tatgcccagc cctggctc 18
<210> 167 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 167
tatgcccagc cctggctcc 19
<210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 168
tatgcccagc cctggctcct 20
<210> 169 <211> 12 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 169
ctgcccaggg cc 12
<210> 170 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 170
ctgcccaggg cct 13
<210> 171 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 171
ctgcccaggg cctc 14
<210> 172 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 172
ctgcccaggg cctca 15
<210> 173 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 173
ctgcccaggg cctcac 16
<210> 174 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 174
ctgcccaggg cctcacc 17
<210> 175 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 175
ctgcccaggg cctcacca 18
<210> 176 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 176
ctgcccaggg cctcaccac 19
<210> 177 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 177
caacctgccc agg 13
<210> 178 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 178
caacctgccc aggg 14
<210> 179 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 179
caacctgccc agggc 15
<210> 180 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 180
caacctgccc agggcc 16
<210> 181 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 181
caacctgccc agggcct 17
<210> 182 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 182
caacctgccc agggcctc 18
<210> 183 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 183
caacctgccc agggcctca 19
<210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 184
caacctgccc agggcctcac 20
<210> 185 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 185
cctgaagttc tcaggat 17
<210> 186 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 186
cctgaagttc tcaggatc 18
<210> 187 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 187
cctgaagttc tcaggatcc 19
<210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 188
cctgaagttc tcaggatcca 20
<210> 189 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 189
cctgaagttc tcaggatcca c 21
<210> 190 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 190
cctgaagttc tcaggatcca cg 22
<210> 191 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 191
cctgaagttc tcaggatcca cgt 23
<210> 192 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 192
cctgaagttc tcaggatcca cgtg 24
<210> 193 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 193
tctatgggac ccttga 16
<210> 194 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 194
tctatgggac ccttgat 17
<210> 195 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 195
tctatgggac ccttgatg 18
<210> 196 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 196
tctatgggac ccttgatgt 19
<210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 197
tctatgggac ccttgatgtt 20
<210> 198 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 198
tctatgggac ccttgatgtt t 21
<210> 199 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 199
tctatgggac ccttgatgtt tt 22
<210> 200 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 200
tctatgggac ccttgatgtt ttc 23
<210> 201 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 201
aatagcaata tttctgcata taaa 24
<210> 202 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 202
aatagcaata tttctgcata taaat 25
<210> 203 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 203
aatagcaata tttctgcata taaata 26
<210> 204 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 204
aatagcaata tttctgcata taaatat 27
<210> 205 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 205
aatagcaata tttctgcata taaatatt 28
<210> 206 <211> 29 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 206
aatagcaata tttctgcata taaatattt 29
<210> 207 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 207
aatagcaata tttctgcata taaatatttc 30
<210> 208 <211> 31 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 208
aatagcaata tttctgcata taaatatttc t 31
<210> 209 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221> 引物 <222> (1)..
(18) <223>
<400> 209
ccctcgccaa gtccaccc 18
<210> 210 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 210
cccctcgcca agtccaccc 19
<210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 211
ctggactcct ggacctccca 20
<210> 212 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 212
ctggactcct ggacctccca c 21
<210> 213 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 213
ctggactcct ggacctccca cc 22
<210> 214 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 214
actggactcc tggacctccc ac 22
<210> 215 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 215
actggactcc tggacctccc acc 23
<210> 216 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 216
cactggactc ctggacctcc cac 23
<210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 217
tcaaagacca ggaagggccg 20
<210> 218 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 218
ttcaaagacc aggaagggcc g 21
<210> 219 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 219
attcaaagac caggaagggc cg 22
<210> 220 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 220
attcaaagac caggaagggc cgg 23
<210> 221 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 221
agaccaggaa gggccggtg 19
<210> 222 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 222
aagaccagga agggccggtg 20
<210> 223 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 223
aaagaccagg aagggccggt g 21
<210> 224 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 224
caaagaccag gaagggccgg t 21
<210> 225 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 225
cctcaaagca ctctagggtc ca 22
<210> 226 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 226
cctcaaagca ctctagggtc cag 23
<210> 227 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 227
cctcaaagca ctctagggtc cagc 24
<210> 228 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 228
aaagcactctagggtccagc g 21
<210> 229 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 229
caaagcactc tagggtccag cg 22
<210> 230 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 230
tcaaagcact ctagggtcca gcg 23
<210> 231 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 231
ctcaaagcac tctagggtcc agcg 24
<210> 232 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 232
cctcaaagca ctctagggtc cagcg 25
<210> 233 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 233
ggtttaccca tgtggtgcct c 21
<210> 234 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 234
cggtttaccc atgtggtgcc tc 22
<210> 235 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 235
catgtggtgc ctccatggac 20
<210> 236 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 236
ccatgtggtg cctccatgga c 21
<210> 237 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 237
cccatgtggt gcctccatg 19
<210> 238 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 238
cccatgtggt gcctccatgg 20
<210> 239 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 239
cttcccatgt ggtgcctcca tg 22
<210> 240 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 240
ccttcccatg tggtgcctcc atg 23
<210> 241 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 241
cttcccccgt tggatcttc 19
<210> 242 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 242
gcttcccccg ttggatcttc 20
<210> 243 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 243
ccagcttagc aatgcttccc c 21
<210> 244 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 244
gaccagctta gcaatgcttc ccc 23
<210> 245 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 245
gaccagctta gcaatgcttc cc 22
<210> 246 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 246
ccgttggatc ttctcatttc cc 22
<210> 247 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 247
cccgttggat cttctcattt ccc 23
<210> 248 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 248
ccccgttgga tcttctcatt tccc 24
<210> 249 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 249
cggagcgatc tgggc 15
<210> 250 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 250
ggagcgatct gggctc 16
<210> 251 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 251
cggagcgatc tgggctc 17
<210> 252 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 252
cggagcgatc tgggctctg 19
<210> 253 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 253
cgatctgggc tctgtgttc 19
<210> 254 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 254
cgatctgggc tctgtgttct c 21
<210> 255 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 255
gcgatctggg ctctgtgttc 20
<210> 256 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 256
gcgatctggg ctctgtgttc tc 22
<210> 257 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 257
cccacgttgt gttcatgg 18
<210> 258 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 258
gcccacgttg tgttcatgg 19
<210> 259 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 259
ccacgttgtg ttcatggctg 20
<210> 260 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 260
agcccacgtt gtgttcatgg 20
<210> 261 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 261
gcccacgttg tgttcatggc 20
<210> 262 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 262
ccacgttgtg ttcatggctg tg 22
<210> 263 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 263
agcccacgtt gtgttcatgg c 21
<210> 264 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 264
aagcccacgt tgtgttcatg gc 22
<210> 265 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 265
aggaggggag gagg 14
<210> 266 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 266
aaggagggga ggagg 15
<210> 267 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 267
caaggagggg aggagg 16
<210> 268 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 268
gcaaggaggg gaggagg 17
<210> 269 <211> 12 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 269
ggaggagggc cc 12
<210> 270 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 270
gggaggaggg ccc 13
<210> 271 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 271
ggggaggagg gccc 14
<210> 272 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 272
aggggaggag ggccc 15
<210> 273 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 273
tgcaaggagg ggag 14
<210> 274 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 274
gtgcaaggag gggag 15
<210> 275 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 275
ggtgcaagga ggggag 16
<210> 276 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 276
cggtgcaagg aggggag 17
<210> 277 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 277
tttccagctg gacttc 16
<210> 278 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 278
ttttccagct ggacttc 17
<210> 279 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 279
tttttccagc tggacttc 18
<210> 280 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 280
gtttttccag ctggacttc 19
<210> 281 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 281
tccagctgga cttcgc 16
<210> 282 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 282
ttccagctgg acttcgc 17
<210> 283 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 283
tttccagctg gacttcgc 18
<210> 284 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 284
ttttccagct ggacttcgc 19
<210> 285 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 285
tggacttcgc ggtg 14
<210> 286 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 286
ctggacttcg cggtg 15
<210> 287 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 287
gctggacttc gcggtg 16
<210> 288 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 288
agctggactt cgcggtg 17
<210> 289 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 289
tctgcccaca gcct 14
<210> 290 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 290
ctctgcccac agcct 15
<210> 291 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 291
actctgccca cagcct 16
<210> 292 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 292
gactctgccc acagcct 17
<210> 293 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 293
tgcccacagc ctgaa 15
<210> 294 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 294
ctgcccacag cctgaa 16
<210> 295 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 295
tctgcccaca gcctgaa 17
<210> 296 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 296
ctctgcccac agcctgaa 18
<210> 297 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 297
tctgactctg cccaca 16
<210> 298 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 298
ttctgactct gcccaca 17
<210> 299 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 299
tttctgactc tgcccaca 18
<210> 300 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 300
ctttctgact ctgcccaca 19
<210> 301 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 301
tggctgcctg ggt 13
<210> 302 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 302
gtggctgcct gggt 14
<210> 303 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 303
tgtggctgcc tgggt 15
<210> 304 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 304
ctgtggctgc ctgggt 16
<210> 305 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 305
gctgtggctg cctgggt 17
<210> 306 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 306
ctgcctgggt gatga 15
<210> 307 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 307
gctgcctggg tgatga 16
<210> 308 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 308
ggctgcctgg gtgatga 17
<210> 309 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 309
gttcatggct gtggct 16
<210> 310 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 310
tgttcatggc tgtggct 17
<210> 311 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 311
gtgttcatgg ctgtggct 18
<210> 312 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 312
tgtgttcatg gctgtggct 19
<210> 313 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 313
gggttggcca atctactcc 19
<210> 314 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 314
gggttggcca atctactccc 20
<210> 315 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 315
agggttgcca atctactcc 19
<210> 316 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 316
tagggttggc caatctactc c 21
<210> 317 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 317
ctagggttgg ccaatctact cc 22
<210> 318 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 318
cctagggttg gccaatctac tc 22
<210> 319 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 319
ccctagggtt ggccaatcta c 21
<210> 320 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 320
ccctagggtt ggccaatcta ct 22
<210> 321 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 321
acgatcctga gacttccaca c 21
<210> 322 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 322
acgatcctga gacttccaca ct 22
<210> 323 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 323
aacgatcctg agacttccac a 21
<210> 324 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 324
aacgatcctg agacttccac ac 22
<210> 325 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 325
aaacgatcct gagacttcca ca 22
<210> 326 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 326
aaaacgatcc tgagacttcc ac 22
<210> 327 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 327
aaaacgatcc tgagacttcc aca 23
<210> 328 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 328
taaaacgatc ctgagacttc cac 23
<210> 329 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 329
catgcctctt tgcaccattc 20
<210> 330 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 330
catgcctctt tgcaccattc t 21
<210> 331 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 331
tgcctctttg caccattct 19
<210> 332 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 332
atgcctcttt gcaccattct 20
<210> 333 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 333
tgcctctttg caccattcta 20
<210> 334 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 334
tgcctctttg caccattcta a 21
<210> 335 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 335
atgcctcttt gcaccattct a 21
<210> 336 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 336
atgcctcttt gcaccattct aa 22
<210> 337 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 337
tgctcaaggc ccttcataat 20
<210> 338 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 338
atgctcaagg cccttcataa t 21
<210> 339 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 339
gatgctcaag gcccttcata at 22
<210> 340 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 340
agatgctcaa ggcccttcat aat 23
<210> 341 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 341
tgctcaaggc ccttcataat 20
<210> 342 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 342
tgctcaaggc ccttcataat a 21
<210> 343 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 343
atgctcaagg cccttcataa ta 22
<210> 344 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 344
atgctcaagg cccttcataa tat 23
<210> 345 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 345
cctgactcct gaggag 16
<210> 346 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 346
acctgactcc tgaggag 17
<210> 347 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 347
cacctgactc ctgaggag 18
<210> 348 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 348
gcacctgact cctgaggag 19
<210> 349 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 349
tgcacctgac tcctgaggag 20
<210> 350 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 350
gtgcacctga ctcctgagga g 21
<210> 351 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 351
ggtgcacctg actcctgagg ag 22
<210> 352 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 352
tggtgcacct gactcctgag gag 23
<210> 353 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 353
gcagtaacgg caga 14
<210> 354 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 354
ggcagtaacg gcaga 15
<210> 355 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 355
gggcagtaac ggcaga 16
<210> 356 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 356
agggcagtaa cggcaga 17
<210> 357 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 357
cagggcagta acggcaga 18
<210> 358 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 358
acagggcagt aacggcaga 19
<210> 359 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 359
cacagggcag taacggcaga 20
<210> 360 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 360
ccacagggca gtaacggcag a 21
<210> 361 <211> 12 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 361
ccttgcccca cc 12
<210> 362 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 362
accttgcccc acc 13
<210> 363 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 363
caccttgccc cacc 14
<210> 364 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 364
tcaccttgcc ccacc 15
<210> 365 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 365
ttcaccttgc cccacc 16
<210> 366 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 366
gttcaccttg ccccacc 17
<210> 367 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 367
cgttcacctt gccccacc 18
<210> 368 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 368
acgttcacct tgccccacc 19
<210> 369 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 369
tcatccacgt tcacct 16
<210> 370 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 370
ttcatccacg ttcacct 17
<210> 371 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 371
cttcatccac gttcacct 18
<210> 372 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 372
acttcatcca cgttcacct 19
<210> 373 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 373
aacttcatcc acgttcacct 20
<210> 374 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 374
caacttcatc cacgttcacc t 21
<210> 375 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 375
ccaacttcat ccacgttcac ct 22
<210> 376 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 376
accaacttca tccacgttca cct 23
<210> 377 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 377
ggatgaagtt ggtggt 16
<210> 378 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 378
tggatgaagt tggtggt 17
<210> 379 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 379
gtggatgaag ttggtggt 18
<210> 380 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 380
cgtggatgaa gttggtggt 19
<210> 381 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 381
acgtggatga agt tggtggt 20
<210> 382 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 382
aacgtggatg aagttggtgg t 21
<210> 383 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 383
gaacgtggat gaagttggtg gt 22
<210> 384 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 384
tgaacgtgga tgaagttggt ggt 23
<210> 385 <211> 11 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 385
aggccctggg c 11
<210> 386 <211> 12 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 386
gaggccctgg gc 12
<210> 387 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 387
tgaggccctg ggc 13
<210> 388 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 388
gtgaggccct gggc 14
<210> 389 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 389
ggtgaggccc tgggc 15
<210> 390 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 390
tggtgaggcc ctgggc 16
<210> 391 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 391
gtggtgaggc cctgggc 17
<210> 392 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 392
ggtggtgagg ccctgggc 18
<210> 393 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 393
cccaccctta ggctg 15
<210> 394 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 394
tcccaccctt aggctg 16
<210> 395 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 395
ttcccaccct taggctg 17
<210> 396 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 396
tttcccaccc ttaggctg 18
<210> 397 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 397
ttttcccacc cttaggctg 19
<210> 398 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 398
attttcccac ccttaggctg 20
<210> 399 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 399
tattttccca cccttaggct g 21
<210> 400 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 400
ctattttccc acccttaggc tg 22
<210> 401 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 401
ctggtggtct accctt 16
<210> 402 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 402
gctggtggtc taccctt 17
<210> 403 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 403
tgctggtggt ctaccctt 18
<210> 404 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 404
ctgctggtgg tctaccctt 19
<210> 405 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 405
gctgctggtg gtctaccctt 20
<210> 406 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 406
ggctgctggt ggtctaccct t 21
<210> 407 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 407
aggctgctgg tggtctaccc tt 22
<210> 408 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 408
taggctgctg gtggtctacc ctt 23
<210> 409 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 409
ttggacccag aggtt 15
<210> 410 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 410
cttggaccca gaggtt 16
<210> 411 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 411
ccttggaccc agaggtt 17
<210> 412 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 412
cccttggacc cagaggtt 18
<210> 413 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 413
acccttggac ccagaggtt 19
<210> 414 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 414
tacccttgga cccagaggtt 20
<210> 415 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 415
ctacccttgg acccagaggt t 21
<210> 416 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 416
tctacccttg gacccagagg tt 22
<210> 417 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 417
cccagaggtt ctttga 16
<210> 418 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 418
acccagaggt tctttga 17
<210> 419 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 419
gacccagagg ttctttga 18
<210> 420 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 420
ggacccagag gttctttga 19
<210> 421 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 421
tggacccaga ggttctttga 20
<210> 422 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 422
ttggacccag aggttctttg a 21
<210> 423 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 423
cttggaccca gaggttcttt ga 22
<210> 424 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 424
ccttggaccc agaggttctt tga 23
<210> 425 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 425
tgctcggtgc cttta 15
<210> 426 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 426
gtgctcggtg ccttta 16
<210> 427 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 427
agtgctcggt gccttta 17
<210> 428 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 428
aagtgctcgg tgccttta 18
<210> 429 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 429
aaagtgctcg gtgccttta 19
<210> 430 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 430
gaaagtgctc ggtgccttta 20
<210> 431 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 431
agaaagtgct cggtgccttt a 21
<210> 432 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 432
aagaaagtgc tcggtgcctt ta 22
<210> 433 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 433
agctgcactg tgacaa 16
<210> 434 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 434
gagctgcact gtgacaa 17
<210> 435 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 435
tgagctgcac tgtgacaa 18
<210> 436 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 436
gtgagctgca ctgtgacaa 19
<210> 437 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 437
agtgagctgc actgtgacaa 20
<210> 438 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 438
gagtgagctg cactgtgaca a 21
<210> 439 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 439
tgagtgagct gcactgtgac aa 22
<210> 440 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 440
ctgagtgagc tgcactgtga caa 23
<210> 441 <211> 11 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 441
ccagggctgg g 11
<210> 442 <211> 12 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 442
gccagggctg gg 12
<210> 443 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 443
agccagggct ggg 13
<210> 444 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 444
gagccagggc tggg 14
<210> 445 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 445
ggagccaggg ctggg 15
<210> 446 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 446
aggagccagg gctggg 16
<210> 447 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <4D0> 447
caggagccag ggctggg 17
<210> 448 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 448
gcaggagcca gggctggg 18
<210> 449 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 449
gctctgccct gacttt 16
<210> 450 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 450
ggctctgccc tgacttt 17
<210> 451 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 451
tggctctgcc ctgacttt 18
<210> 452 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 452
atggctctgc cctgacttt 19
<210> 453 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 453
gatggctctg ccctgacttt 20
<210> 454 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 454
agatggctct gccctgactt t 21
<210> 455 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 455
tagatggctc tgccctgact tt 22
<210> 456 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 456
atagatggct ctgccctgac ttt 23
<210> 457 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 457
agggctgggc ata 13
<210> 458 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 458
cagggctggg cata 14
<210> 459 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 459
ccagggctgg gcata 15
<210> 460 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 460
gccagggctg ggcata 16
<210> 461 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 461
agccagggct gggcata 17
<210> 462 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 462
gagccagggc tgggcata 18
<210> 463 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 463
ggagccaggg ctgggcata 19
<210> 464 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 464
aggagccagg gctgggcata 20
<210> 465 <211> 12 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 465
ggccctgggc ag 12
<210> 466 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 466
aggccctggg cag 13
<210> 467 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 467
gaggccctgg gcag 14
<210> 468 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 468
tgaggccctg ggcag 15
<210> 469 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 469
gtgaggccct gggcag 16
<210> 470 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 470
ggtgaggccc tgggcag 17
<210> 471 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 471
tggtgaggcc ctgggcag 18
<210> 472 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 472
gtggtgaggc cctgggcag 19
<210> 473 <211> 13 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 473
cctgggcagg ttg 13
<210> 474 <211> 14 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 474
ccctgggcag gttg 14
<210> 475 <211> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 475
gccctgggca ggttg 15
<210> 476 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 476
ggccctgggc aggttg 16
<210> 477 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 477
aggccctggg caggttg 17
<210> 478 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 478
gaggccctgg gcaggttg 18
<210> 479 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 479
tgaggccctg ggcaggttg 19
<210> 480 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 480
gtgaggccct gggcaggttg 20
<210> 481 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 481
atcctgagaa cttcagg 17
<210> 482 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 482
gatcctgaga acttcagg 18
<210> 483 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 483
ggatcctgag aacttcagg 19
<210> 484 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 484
tggatcctga gaacttcagg 20
<210> 485 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 485
gtggatcctg agaacttcag g 21
<210> 486 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 486
cgtggatcct gagaacttca gg 22
<210> 487 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 487
acgtggatcc tgagaacttc agg 23
<210> 488 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 488
cacgtggatc ctgagaactt cagg 24
<210> 489 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 489
tcaagggtcc cataga 16
<210> 490 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 490
atcaagggtc ccataga 17
<210> 491 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 491
catcaagggt cccataga 18
<210> 492 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 492
acatcaaggg tcccataga 19
<210> 493 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 493
aacatcaagg gtcccataga 20
<210> 494 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 494
aaacatcaag ggtcccatag a 21
<210> 495 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 495
aaaacatcaa gggtcccata ga 22
<210> 496 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 496
gaaaacatca agggtcccat aga 23
<210> 497 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 497
tttatatgca gaaatattgc tatt 24
<210> 498 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 498
atttatatgc agaaatattg ctatt 25
<210> 499 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 499
tatttatatg cagaaatatt gctatt 26
<210> 500 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 500
atatttatat gcagaaatat tgctatt 27
<210> 501 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 501
aatatttata tgcagaaata ttgctatt 28
<210> 502 <211> 29 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 502
aaatatttat atgcagaaat attgctatt 29
<210> 503 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 503
gaaatattta tatgcagaaa tattgctatt 30
<210> 504 <211> 31 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 504
agaaatattt atatgcagaa atattgctat t 31
Claims (7)
1、一种用于诊断地中海贫血的DNA芯片，包括
一基底；以及
固定于所述基底上的探针；其特征在于
所述探针为针对α-和/或β-球蛋白缺失或突变基因的特异性探针，其中：
所述针对α-球蛋白缺失或突变基因的特异性探针包括选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.13～SEQ IDNO.24中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.36中的至少一个序列的DNA和选自SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.48中的至少一个序列的DNA；
所述针对β-球蛋白缺失或突变基因的特异性探针包括选自SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.56中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.57～SEQ IDNO.64中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.65～SEQ ID NO.72中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.73～SEQ ID NO.80中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.88中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.89～SEQ ID NO.96中的至少一个序列的DNA、选自SEQ IDNO.97～SEQ ID NO.104中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.105～SEQ ID NO.112中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.113～SEQ IDNO.120中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.121～SEQ ID NO.128中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.129～SEQ ID NO.136中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.137～SEQ ID NO.144中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.145～SEQ ID NO.152中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.153～SEQ ID NO.160中的至少一个序列的DNA、选自SEQID NO.161～SEQ ID NO.168中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.169～SEQ ID NO.176中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.177～SEQID NO.184中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.185～SEQ ID NO.192中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.193～SEQ ID NO.200中的至少一个序列的DNA以及选自SEQ ID NO.201～SEQ ID NO.208中的至少一个序列的DNA。
2、根据权利要求1所述的DNA芯片，其中所述各DNA序列的5’端进一步连接一10～30个碱基的连拉臂。
3、用于扩增待检测样品中DNA的PCR引物，其特征在于所述引物的扩增产物含有可与权利要求1所述的α-和/或β-球蛋白突变基因的特异性探针杂交的DNA序列，其中：
所述扩增产物含有可与α-型球蛋白突变基因的特异性探针杂交的DNA序列的引物，包括四对引物，其中所述第一对引物含有选自SEQ ID NO.209～SEQ ID NO.216中的至少一个序列的DNA及选自SEQ ID NO.217～SEQID NO.224的至少一个序列的DNA、所述第二对引物含有选自SEQ ID NO.209～SEQ ID NO.216中的至少一个序列的DNA及选自SEQ ID NO.225～SEQID NO.232的至少一个序列的DNA、所述第三对引物含有选自SEQ ID NO.233～SEQ ID NO.240中的至少一个序列的DNA及选自SEQ ID NO.241～SEQID NO.248的至少一个序列的DNA、所述第四对引物含有选自SEQ ID NO.249～SEQ ID NO.256中的至少一个序列的DNA及选自SEQ ID NO.257～SEQID NO.264的至少一个序列的DNA；
所述扩增产物含有可与β-型球蛋白突变基因的特异性探针杂交的DNA序列的引物，包括二对引物，其中所述第一对引物含有选自SEQ ID NO.313～SEQ ID NO.319中的至少一个序列的DNA以及选自SEQ ID NO.320～SEQ ID NO.328中的至少一个序列的DNA、所述第二对引物含有选自SEQ ID NO.329～SEQ ID NO.336中的至少一个序列的DNA以及选自SEQ IDNO.337～SEQ ID NO.344中的至少一个序列的DNA。
4、根据权利要求3所述的引物，其中所述扩增产物含有可与α-型球蛋白突变基因的特异性探针杂交的DNA序列的引物，进一步包括一延伸引物，所述延伸引物含有选自SEQ ID NO.265～SEQ ID NO.276中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.277～SEQ ID NO.288中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.289～SEQ ID NO.300中的至少一个序列的DNA以及选自SEQID NO.301～SEQ ID NO.312中的至少一个序列的DNA。
5、根据权利要求3所述的引物，其中所述扩增产物含有可与β-型球蛋白突变基因的特异性探针杂交的DNA序列的引物，进一步包括一延伸引物，所述延伸引物含有选自SEQ ID NO.345～SEQ ID NO.352中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.353～SEQ ID NO.360中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.361～SEQ ID NO.368中的至少一个序列的DNA、选自SEQ IDNO.369～SEQ ID NO.376中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.377～SEQ ID NO.384中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.385～SEQID NO.392中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.393～SEQ ID NO.400中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.401～SEQ ID NO.408中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.409～SEQ ID NO.416中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.417～SEQ ID NO.424中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.425～SEQ ID NO.432中的至少一个序列的DNA、选自SEQID NO.433～SEQ ID NO.440中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.441～SEQ ID NO.448中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.449～SEQID NO.456中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.457～SEQ ID NO.464中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.465～SEQ ID NO.472中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.473～SEQ ID NO.480中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.481～SEQ ID NO.488中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.489～SEQ ID NO.496中的至少一个序列的DNA以及选自SEQ ID NO.497～SEQ ID NO.504中的至少一个序列的DNA。
6、一种用于诊断地中海贫血的试剂盒，其特征在于它包含权利要求1所述的用于诊断地中海贫血的DNA芯片；以及权利要求3所述的用于扩增待检样品中DNA的PCR引物。
7、一种检测待检样品中是否存在地中海贫血的相关基因的方法，包含下述步骤：
1)将待检样品用权利要求3所述的特异性引物进行PCR扩增；
2)用延伸引物对扩增产物进行荧光标记；
3)将标记后的产物与权利要求1所述的用于诊断地中海贫血的DNA芯片进行杂交；
4)检测结果。
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