CN102277419B - 基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用。本发明设计出用于检测α、β地中海贫血基因缺陷类型的探针,这些探针分别与不同颜色的荧光编码微球交联、混合后得到诊断α、β地中海贫血的液相芯片。本发明通过用本发明的特异性引物对待检样品进行PCR扩增后,得到生物素标记的PCR产物,然后将其与本发明的液相芯片进行杂交,再用藻红蛋白进行荧光标记,最后通过液相芯片检测仪读出检测结果。本发明所述的试剂盒包括PCR引物和特异性探针,能同时检测缺失型和非缺失点突变型α、β地中海贫血,可以极大地缩短临床地中海贫血的诊断时间,提高诊断效率和诊断准确性,且通量高,市场潜力大。
Description
技术领域
本发明涉及一种诊断地中海贫血的方法,特别涉及一种基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用。
背景技术
地中海贫血(简称地贫)是世界上最常见的人类单基因遗传性血液病,是一组由于珠蛋白基因缺失或点突变,使血红蛋白中珠蛋白肽链合成减少或不能合成所致的遗传性溶血性贫血。本病主要见于西自地中海沿岸,中经土耳其、中东各国,东至和东南亚各国和我国南部。我国长江以南各省发病率最高,其中以广东、广西、四川、云南、海南、香港、台湾多见。根据本病缺乏的珠蛋白链的种类及缺乏程度给以命名和分类,分为α、β等几种类型,其中以α、β地中海贫血最多见,也最严重。本病由于珠蛋白缺失的多样性,所致缺乏的珠蛋白链的类型、数量不一,临床表现呈多样性,轻重程度也不同,有在胎儿及婴幼儿即因极重的溶血性贫血致死的,也有需要反复输血进行治疗,也有虽有血红蛋白异常而一生无任何临床症状的。目前该病尚无有效的治疗方法,且一股的治疗费用昂贵,给患者及家庭带来巨大的经济负担和精神痛苦。因此遗传咨询、产前诊断以及在我国南方开展大人群的分子筛查是防治该疾病的首要途径,对控制重型地贫患儿的出生,提高出生人口素质具有重要意义。
随着对地中海贫血的研究的深入,临床上各种地贫表型的分子基础也逐步地被人们认识。目前全世界已报道的珠蛋白基因突变类型有1000多种(http://globin.cse.psu.edu/hbvar/)。其中α-地中海贫血主要是缺失突变,也有少数的非缺失型突变。在中国人群中常见的α-地中海贫血缺失型突变是α基因上的-α3.7、-α4.2和-SEA三种片段缺失;常见的α-地中海贫血非缺失型点突变主要为Hb CS、Hb QS和HbWS三种。β-地中海贫血的基因突变大多数属于非缺失型,是由于β基因点突变造成β-珠蛋白合成异常。β-地中海贫血突变位点较多。这些突变具有种族特异性,各个种族都有几种常见的突变类型。中国大陆人群常见的突变频率较高的突变类型有十几种,其中常见突变位点有8个,大约占中国大陆人群突变发生频率的90%以上(如表1和2所示)。
表1中国人群β珠蛋白基因常见8个突变位点
序号 | 突变位点 |
1 | CD41-42(-TCTT) |
2 | IVS-2-654C>T |
3 | CD17A>T |
4 | -28A>G |
5 | CD26G>A |
6 | CD71-72(+A) |
7 | CD43G>T |
8 | -29A>G |
表格2中国人群β-珠蛋白基因突变频率较高的位点
序号 | 突变位点 | 序号 | 突变位点 |
1 | 起始密码子ATG>AGG | 6 | IVS-1-1G>T |
2 | CD14-15(+G) | 7 | IVS-1-5G>C |
3 | CD27-28(+C) | 8 | CD31(-C) |
4 | -32C>A | 9 | CAP+40-+43(-AAAC) |
5 | -30T>C |
目前,用于地中海贫血基因诊断的方法主要包括:跨跃断裂位点-PCR(gap-PCR)、聚合酶链式反应-等位特异性寡核苷酸杂交(PCR-ASO)、聚合酶链反应-扩增阻抗突变系统(PCR-ARMS)、聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态分析(PCR-RFLP)等,这些方法都广泛用于了地中海贫血的基因检测,但是操作繁琐、检测通量低,难于用于临床大样本量检测。目前临床常用的检测β-地贫突变的方法是PCR反向点杂交(PCR-RDB),该法同样步骤繁琐,操作时间长,不适用于大样本量的检测。
生物芯片(biochip)也称微点阵(microarray),是20世纪90年代初期发展起来的一种新技术,它可将多个生物分子(核酸、抗原、抗体)或细胞以阵列方式固定在面积不大的基片上。因此,可同时分析成千上万种生物分子,它具有高通量、高集成、微型化、连续化和自动化等特点,适用于基因缺陷的检测,目前已有一些产品应用于了临床。液相芯片技术也称悬浮阵列技术(suspension array),是由美国Luminex公司研制开发的最新一代诊断技术平台。其技术核心是把微小的聚苯乙烯小球用荧光染色法进行编码(即通过2种荧光染料对微球染色,调节这2种荧光染料的比例可获得100种不同颜色的微球),然后将每种颜色的微球(或称为荧光编码微球)交联上1种针对某个检测物的特定生物探针(探针通过氨基与羧基结合到微球表面)。应用时,先把针对不同检测物的编码微球混合,再加入微量待检样本,在悬液中靶分子与微球表面交联的探针进行特异性结合,在1个反应孔内可同时完成多达100种不同的生物学反应。最后用激光流式仪鉴定微球颜色以判断结果,同时通过靶分子上的报告分子完成反应的定量分析。由于分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行的,所以其检测速度极快,可在1个微量液相反应体系中同时检测100个指标。它同样具有生物芯片的高通量、高集成、微型化、连续化和自动化等优点,还具有液相反应的高敏感性、高重复性、检测线性范围宽、反应快速等优点,并且该方法操作简便、快捷、样品用量少。可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体、配体识别分析等研究,已有多家公司基于此技术平台开发出了多种基因芯片、蛋白芯片,已有部分产品经FDA批准进入了临床应用。目前已经有用液相芯片检测地中海贫血的报道,但其检测的位点较少,技术也不够成熟,达不到临床的需求,国内外也未见同类产品上市。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法。
本发明的另一目的在于提供实现所述基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法的试剂盒。
本发明的目的在于提供所述的试剂盒的使用方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法,包括以下步骤:
(1)设计PCR引物和探针序列,在与探针互补的一条链的PCR引物(上游引物或下游引物)的5’端进行生物素修饰:PCR引物序列见表3,其中:
表格3 PCR引物序列(均为5’-3’)
SEA For | AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC |
SEA Rev | CCAAGCCCACGTTGTGTTCATG |
α3.7For | CCCCTCGCCAAGTCCACC |
α3.7Rev | TCAAAGCACTCTAGGGTCCAGC |
α4.2For | CAGTTTACCCATGTGGTGCCT |
α4.2Rev | CCCGTTGGATCTTCTCATTTCC |
α2For | TACCCATGTGGTGCCTCCAT |
α2Rev | TTCTCATTTCCCCTCCCTGTCT |
α-M For | CTCTTCTCTGCACAGCTCCTAA |
α-M Rev | CTGCCCACTCAGACTTTATTCAAA |
β-M1 For | CCAATCTACTCCCAGGAGCAG |
β-M1 Rev | TGAGGTTGTCCAGGTGAGC |
β-M2 For | CCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAAT |
β-M2 Rev | GCAGAATGGTAGCTGGATTGTAG |
表中的For表示上游引物,Rev表示下游引物。
探针序列如表4~6所示,探针5’末端进行Aminolinker C12修饰:
表4检测α-地中海贫血非缺失型突变的探针
其中,N为针对野生型探针,M为针对的突变型探针,下同。
表5检测α-地中海贫血缺失型突变的探针
编号 | 探针序列(5’-3’) |
α-del SEA | TGACGCTGTCTGCTTAAGGCCC |
α-del 4.2 | CATGCCTGTAAACCCACCTACT |
α-del 3.7 | TGGAGGAGGGAAAGTGGAGCCA |
α2 | CCGCGCAGGCCCCGCCCGGGAC |
表6检测β-地中海贫血突变型探针
(2)液相芯片的制备:将荧光编码微球与步骤(1)中所述的探针分别偶联,然后根据检测目的将偶联好探针的荧光编码微球混合,得到液相芯片;
(3)标本检测:
从标本中提取基因组DNA,根据检测目的选择步骤(1)中所述的PCR引物分别进行缺失型突变的α珠蛋白基因片段和非缺失型突变的α、β珠蛋白基因片段扩增,分别得到缺失型突变的α珠蛋白基因片段的PCR扩增产物和非缺失型突变的α、β珠蛋白基因片段的PCR扩增产物;接着将两种PCR扩增产物混合后与步骤(2)得到的液相芯片进行杂交,得到杂交产物;再用藻红蛋白对杂交产物进行标记,通过液相芯片检测仪读出检测结果;
步骤(2)中所述的荧光编码微球优选为美国Luminex公司的表面羟基修饰的微球;
步骤(2)中所述的偶联好探针的荧光编码微球优选通过如下步骤进行制备:将荧光编码的微球与0.1M、pH值4.5的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)溶液,混匀,得到偶联体系;接着在偶联体系中加入探针和二氯乙烷(EDC),避光反应,得到偶联好探针的荧光编码微球;
步骤(2)中所述的偶联好探针的荧光编码微球更优选通过如下步骤进行制备:将荧光编码的微球与0.1M、pH值4.5的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)溶液,混匀,得到偶联体系;接着在偶联体系中加入探针和二氯乙烷(EDC),避光反应30min;再加入二氯乙烷(EDC)再次进行避光反应30min;探针在偶联体系中的终浓度为0.02mM,二氯乙烷在偶联体系中的终浓度为0.8~1mg/ml;接着用吐温溶液和十二烷基硫酸钠溶液洗涤,得到偶联好探针的荧光编码微球;
所述的吐温溶液优选为Tween-20溶液,更优选为体积百分比0.02%Tween-20溶液;
所述的十二烷基硫酸钠溶液的浓度优选为质量体积比0.1%;
步骤(3)中所述的缺失型突变的α珠蛋白基因片段的扩增条件为:95℃10分钟;(95℃45秒、60℃1分15秒、72℃2分30秒)×30次循环;72℃10分钟;
所述的非缺失型突变的α、β珠蛋白基因片段的扩增条件为:95℃10分钟;(95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒)×45次循环;72℃10分钟;
步骤(3)中所述的杂交的反应条件优选为95℃变性5min后,55℃杂交15min;
步骤(3)中所述的藻红蛋白优选为链霉亲和素R-藻红蛋白(Streptavidin,R-phycoerythrin conjugate,SAPE);
步骤(3)中所述的液相芯片检测仪为Luminex液相芯片检测仪,参数设置为Count100;Doublet Discriminator Gate Value为5437-24807;
实现上述方法的试剂盒,包括PCR引物、探针和荧光编码微球;其中,PCR引物如表3,探针序列如表4~6;
所述的试剂盒,更优选包括PCR引物和液相芯片,液相芯片为44种偶联好探针的荧光编码微球混合得到;
所述的偶联好探针的荧光编码微球为表4~6中所列的探针分别与不同颜色的荧光编码微球偶联,共44种;
所述的液相芯片优选为将44种偶联好探针的荧光编码微球分散在1.5×TMAC杂交液,每种偶联好探针的荧光编码微球的浓度优选为100个/μl;1.5×TMAC杂交液的组成的物质终浓度如下:4.5M的TMAC(四甲基氯化氨)、质量体积比0.15%的十二烷基肌氨酸钠、pH 8.0的75mM Tris-HCl和pH 8.0的6mM EDTA;
所述的偶联好探针的荧光编码微球优选通过如下步骤得到:将微球和0.1M、pH值4.5的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)溶液,混匀,得到偶联体系,偶联体系中微球的浓度为2×104个/μl;接着在偶联体系中加入探针和二氯乙烷(EDC),避光反应30min;再加入二氯乙烷(EDC)再次进行避光反应30min;探针在偶联体系中的终浓度为0.02mM,二氯乙烷在偶联体系中的终浓度为0.8~1mg/ml;接着用吐温溶液和十二烷基硫酸钠溶液洗涤,得到偶联好探针的荧光编码微球;该偶联好探针的荧光编码微球优选置于pH8.0、1×TE溶液中进行保存;
所述的吐温溶液优选为Tween-20溶液,更优选为体积百分比0.02%Tween-20溶液;
所述的十二烷基硫酸钠溶液的浓度优选为质量体积比0.1%;
所述的试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
(1)PCR扩增:根据检测目的,选择PCR引物分别进行PCR,得到PCR扩增产物;其中:
缺失型α-地中海贫血检测的引物选择为:α3.7For和α3.7Rev检测-α3.7缺失型突变;α4.2For和α4.2Rev检测-α4.2缺失型突变;SEA For和SEA Rev检测-SEA缺失型突变;α2For和α2Rev检测正常α2珠蛋白基因;
非缺失型α、β-地中海贫血检测的引物选择为:β-M1 For、β-M1 Rev、β-M2 For和β-M2 Rev共同检测β地中海贫血非缺失型突变;α-M For和α-M Rev检测的是非缺失型α-地中海贫血点突变Hb CS、Hb QS和Hb WS;
空白对照用无菌水代替标本基因组DNA进行PCR反应;
缺失型突变的α珠蛋白基因片段PCR扩增条件为:95℃10分钟;(95℃45秒、60℃1分15秒、72℃2分30秒)×30次循环;72℃10分钟;
非缺失型突变的α、β珠蛋白基因片段PCR扩增条件为:95℃10分钟;(95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒)×45次循环;72℃10分钟;
(2)杂交
杂交反应体系由如下组成:33μl分散于1.5×TMAC杂交液稀释混合的偶联好探针的荧光编码微球(即液相芯片,包含有44种微球,每种微球的浓度分别为100个/μl),7μl pH8.0的1×TE,10μl PCR产物混合物;杂交程序为:95℃5min,55℃15min,循环1次,加入25μl 1×TMAC杂交液稀释的0.04μg链霉亲和素R-藻红蛋白,混匀,55℃5min;1×TMAC杂交液的物质组成的终浓度如下:3M TMAC、质量体积比0.1%的十二烷基肌氨酸钠、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、4mM EDTA(pH 8.0);
(3)上机检测:使用Luminex液相芯片检测仪,参数设置为Count 100;DoubletDiscriminator Gate Value为5437-24807,通过Luminex附带XPonent 3.1数据收集软件检测突变探针(M)和正常探针(N)的荧光强度比值分析判断;判断标准如下:
①非缺失型突变(点突变)判读标准
A、正常标本
各位点相应的突变探针(M)和正常探针(N)比值(M/N)≤0.5,各位点相应的正常探针(N)和空白对照正常探针(N)比值≥3;
B、突变杂合标本
有突变的基因位点相应的突变探针(M)和正常探针(N)比值0.5≤(M/N)≤1.5,无突变的基因位点相应的突变探针(M)和正常探针(N)比值(M/N)≤0.5,各位点相应的正常探针(N)和空白对照正常探针(N)比值≥3;
C、突变纯合标本
有突变的基因位点相应的突变探针(M)和正常探针(N)比值(M/N)≥2,无突变的基因位点相应的突变探针(M)和正常探针(N)比值(M/N)≤0.5,各位点相应的正常探针(N)和空白对照正常探针(N)比值≥3;
D、突变探针(M)和正常探针(N)比值(M/N)不在上述判断标准范围内的标本的突变类型可疑,需进一步确证(采取技术重复和测序等方法进行确证);
②α-地中海贫血缺失型突变判读标准:
检测α-地贫缺失型突变的探针有4种:α-del SEA、α-del 4.2、α-del 3.7和α2,它们的信号值与相应空白对照比值≥3判读为阳性,信号值与相应空白对照比值≤3为阴性;
A、正常标本
α2探针为阳性,其它3种探针均为阴性;
B、杂合型缺失
α2探针为阳性,其它3种探针有一个为阳性,即为该探针的杂合型缺失;
C、纯合型缺失
α2探针为阴性,其它3种探针有一个为阳性,即为该探针的纯合型缺失;
D、同时两种缺失类型
α2探针为阴性,其它探针中有2种探针为阳性,即发生了两种类型的缺失。
本发明设计的用于检测α、β地中海贫血基因缺陷类型的探针,包括缺失型和非缺失型α-地中海贫血、β-珠蛋白基因突变。这些探针经过和荧光编码的微球交联等处理后就制成了诊断α、β地中海贫血的液相芯片。本发明的液相芯片可以仅包含针对α-珠蛋白基因缺失(α-地中海贫血缺失型突变)检测的液相芯片,或仅包含针对非缺失型α-珠蛋白基因突变(α-地中海贫血非缺失型突变)检测的液相芯片,或仅包含针对β-珠蛋白基因突变(β-地中海贫血突变)检测的液相芯片,也可以同时包含检测α-地中海贫血缺失型突变、非缺失型突变以及β-地中海贫血突变的液相芯片。
本发明设计的用于扩增人类α、β珠蛋白基因的PCR引物,针对缺失α-地中海贫血的PCR引物4对,针对非缺失型α-地中海贫血PCR引物1对,针对β-地中海贫血突变的PCR引物2对。
本发明通过将待检样品用本发明的特异性引物(其中一条5’末端生物素biotin修饰)进行多重PCR扩增后,得到生物素标记的产物,然后与本发明的液相芯片进行杂交,再用藻红蛋白进行荧光标记,最后通过液相芯片检测仪读出检测结果。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
本发明的液相芯片同时具有生物芯片和液相反应的优点:①检测耗时短,操作步骤简单,整个检测流程能在6个小时内完成;②自动化程度和检测通量高,整个反应可以在96孔板中完成,中间手工操作步骤极少,一次可以同时检测96个样品;③可以同时检测α地贫和β地贫,本发明可以同时检测非缺失型和缺失型的α地中海贫血症或/和β地中海贫血症,检测效率大大提高;④结果稳定可靠,每一次反应的计数都在上百次以上,消除了偶然实验波动造成的影响,增加了检测的准确性,仪器直接读出结果,不受人为主观影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本发明基于液相芯片技术,建立了一种诊断α、β地中海贫血基因缺陷的方法。本发明利用液相芯片技术,运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件,对地中海贫血基因缺陷进行序列分析,设计出针对地中海贫血基因缺陷片段的PCR引物和特异性探针,PCR引物反向5’末端进行生物素修饰;特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联制成特异性检测微球,即液相芯片。液相芯片能够特异性的识别地中海贫血基因缺陷片段,经过多重PCR扩增后与液相芯片杂交,最后通过液相芯片检测仪读出检测结果。具体如下:
(一)设计引物
中国人群常见的α-珠蛋白基因缺失型突变有-SEA、-α3.7、-α4.2三种;常见的α-珠蛋白非缺失型突变有Hb CS、Hb QS和Hb WS三种。背景技术中的表1是中国人群常见8个β-珠蛋白基因突变位点,大约占中国大陆人群突变发生频率的98%以上,表2列举的是中国人群β-珠蛋白基因突变频率较高的位点。从NCBI的GenBank上下载所有地中海贫血基因缺陷的核酸序列,对所有基因缺陷的位置在基因组的分布和缺陷类型进行分析,设计的PCR引物(如表3所示)和探针序列(如表4~6所示),其中在与探针互补的链的PCR引物的5’端进行生物素修饰,探针5’末端进行Aminolinker C12修饰。
(二)液相芯片的制备
具体反应过程如下:取出40μl(1×105个)美国Luminex公司研制的表面羟基修饰的微球,12000rpm离心2min后弃上清,在沉淀中加入5μl 0.1M、pH 4.5的MES溶液(2-(N-吗啉代)乙磺酸),混匀得到偶联体系。将探针稀释至0.1mM,在偶联体系中加入1μl。然后加入2.5μl 10mg/ml EDC(二氯乙烷),混匀后避光放置30min。再次加入2.5μl 10mg/ml EDC,混匀避光放置30min。用0.2ml体积百分比0.02%Tween-20和质量体积比0.1%的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液分别各洗一次,最后将微球重新悬浮于10μl 1×TE(pH8.0,其中的物质组成是10mM Tris-HCl、1mM EDTA)溶液中,得到偶联好探针的微球。表4~6中所示的探针分别与不同颜色的荧光编码微球偶联,各探针偶联相对应的微球编号见表7。将偶联好探针的微球混匀,使用血细胞计数器计数微球数量(计数四角4个大方格的数目后换算为每微升微球个数),再4℃避光保存。将上述各种偶联好探针的微球混合,使用1.5×TMAC(组成的物质终浓度如下:4.5M的TMAC(四甲基氯化氨)、质量体积比0.15%的十二烷基肌氨酸钠、pH 8.0的75mMTris-HCl和pH 8.0的6mM EDTA)稀释,使每种微球的浓度分别为100个/μl,得到液相芯片,待进行杂交检测。
表7探针偶联对应的微球编码
(三)标本检测
(1)待检样品的多重PCR扩增
对8个样本进行检测,每个样本有两个反应体系,其中:
检测缺失型突变的α珠蛋白基因片段的体系所用的引物为表3中所示的α3.7For、α3.7Rev、α4.2For、α4.2Rev、SEA For、SEA Rev、α2 For和α2 Rev;每个反应体系50μl,其中10×PCR缓冲液5μl、dNTP(各2.5mM)4μl、Hot Start Taq Enzyme 1.5U、前述引物浓度各为0.25μM、待检样品基因组DNA 100ng;扩增条件为:95℃10分钟;(95℃45秒、60℃1分15秒、72℃2分30秒)×30次循环;72℃10分钟。
检测非缺失型突变的α、β珠蛋白基因片段的体系所用的引物为表3中所示的α-MFor、α-M Rev、β-M1 For、β-M1 Rev、β-M2 For和β-M2 Rev;每个反应体系50μl,其中10×PCR缓冲液5μl、dNTP(各2.5mM)4μl、Hot Start Taq Enzyme 1.5U、前述引物浓度各为0.25μM、待检样品基因组DNA 100ng;扩增条件为:95℃10分钟;(95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒)×45次循环;72℃10分钟。
PCR产物混合后置4℃待杂交检测。
(2)扩增产物与液相芯片的杂交
将PCR产物与步骤(二)制备的液相芯片进行杂交,杂交体系为50μl,其中含液相芯片33μl,PCR产物10μl,加入1×TE(pH 8.0,其中的物质组成是10mM Tris-HCl、1mM EDTA)补充体积至反应体积为50μl。95℃变性5min后,55℃杂交15min。加入25μl 1×TMAC杂交液(其中的物质的终浓度如下:3M TMAC、体积百分比0.1%十二烷基肌氨酸钠溶液、50mM Tris-HCl pH 8.0、4mM EDTApH 8.0)稀释的0.04μg链霉亲和素R-藻红蛋白,混匀,55℃5min,得到杂交产物,等待上机检测;
(3)上机检测
杂交产物上机检测(Luminex液相芯片检测仪参数设置为Count 100;DoubletDiscriminator Gate Value为5437-24807),仪器读出各探针荧光信号值MFI,通过Luminex附带XPonent 3.1数据收集软件获得突变探针(M)和正常探针(N)的荧光强度比值及α珠蛋白基因缺失型突变检测探针的荧光信号值进行判断分析检测结果,结果如表8~10所示。
表8 8个样本的检测结果(荧光信号值MFI)
表9样本的点突变类型分析结果
表10样本的缺失型突变分析结果
样本号 | α2 | α-del 3.7 | α-del 4.2 | α-del SEA | 测序检测结果 | 液相芯片检测结果 |
7 | 阳性 | 阳性 | 阴性 | 阴性 | -α3.7杂合突变 | -α3.7杂合突变 |
8 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | -α4.2杂合突变 | -α4.2杂合突变 |
可见,本发明能准确检出地贫患者。使用本发明所述的方法和试剂盒,约6小时能得出结果。现在临床上使用的PCR-RDB方法,需要2日才能完成。而且,对于大样本量检测,本发明与PCR-RDB方法相比,更具有优势。
应用本发明所述的方法和试剂盒对230例的样本进行了检测,与经典的测序方法比较准确率达100%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种基于液相芯片系统诊断地中海贫血的试剂盒,其特征在于包括如下所示的PCR引物、如下所示的探针和不同颜色的荧光编码微球:
PCR引物序列如下:
SEA For:5’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’;
SEA Rev :5’-CCAAGCCCACGTTGTGTTCATG-3’;
α3.7 For:5’- CCCCTCGCCAAGTCCACC-3’;
α3.7 Rev:5’- TCAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’;
α4.2 For :5’-CAGTTTACCCATGTGGTGCCT-3’;
α4.2 Rev :5’-CCCGTTGGATCTTCTCATTTCC-3’;
α2 For:5’- CACAGTGAACCACGACCTCTA-3’;
α2 Rev:5’- CACAGAAGCCAGGAACTTGTC-3’;
α-M For:5’- CTCTTCTCTGCACAGCTCCTAA-3’;
α-M Rev :5’-CTGCCCACTCAGACTTTATTCAAA-3’;
β-M1 For :5’- CCAATCTACTCCCAGGAGCAG-3’;
β-M1 Rev:5’- TGAGGTTGTCCAGGTGAGC -3’;
β-M2 For:5’- CCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAAT -3’;
β-M2 Rev:5’- GCAGAATGGTAGCTGGATTGTAG -3’;
探针序列如下,探针5’末端进行Aminolinker C12修饰:
α-mut 1(N):5’-GCGGTGCACGCCTCCC-3’;
α-mut 1(M):5’- TGCGGTGCAGGCCTCCC -3’;
α-mut 2(N):5’- CACGCCTCCCTGGACAAGTTC -3’;
α-mut 2(M):5’- CACGCCTCCCCGGACAAGTT -3’;
α-mut 3(N):5’- GCAAATACCGTTAAGCTGGAGCC -3’;
α-mut 3(M):5’- GCAAATACCGTCAAGCTGGAGC -3’;
α-del SEA:5’- TGACGCTGTCTGCTTAAGGCCC-3’;
α-del 4.2 :5’- CATGCCTGTAAACCCACCTACT-3’;
α-del 3.7:5’-TGGAGGAGGGAAAGTGGAGCCA-3’;
α2:5’- CCGCGCAGGCCCCGCCCGGGAC-3’;
β-mut 1(N):5’- CAGGGCTGGGCATAAAAGTCA -3’;
β-mut 1(M):5’- CCAGGGCTGGGAATAAAAGTCA-3’;
β-mut 2(N):5’- GGGCTGGGCATAAAAGTCAGG -3’;
β-mut 2(M):5’- GGCTGGGCACAAAAGTCAGG -3’;
β-mut 3(N):5’- GGCTGGGCATAAAAGTCAGGG -3’;
β-mut 3(M):5’- GCTGGGCATGAAAGTCAGGG -3’;
β-mut 4(N):5’- GCTGGGCATAAAAGTCAGGGC -3’;
β-mut 4(M):5’- CTGGGCATAGAAGTCAGGGCA -3’;
β-mut 5(N):5’- CTAGCAACCTCAAACAGACACCA -3’;
β-mut 5(M):5’- CACTAGCAACCTCAGACACCATG -3’;
β-mut 6(N):5’- ACAGACACCATGGTGCATCTG -3’;
β-mut 6(M):5’- ACAGACACCAGGGTGCATCT -3’;
β-mut 7(N):5’- TACTGCCCTGTGGGGCAAG -3’;
β-mut 7(M):5’- TACTGCCCTGGTGGGGCA -3’;
β-mut 8(N):5’- CTGTGGGGCAAGGTGAACG -3’;
β-mut 8(M):5’- CTGTGGGGCTAGGTGAACG -3’;
β-mut 9(N):5’- AGTTGGTGGTGAGGCCCTG -3’;
β-mut 9(M):5’- AGTTGGTGGTAAGGCCCTGG -3’;
β-mut 10(N):5’- GTGGTGAGGCCCTGGGC -3’;
β-mut 10(M):5’- TGGTGAGGCCCCTGGGC -3’;
β-mut 11(N):5’- CCCTGGGCAGGTTGGTATCAA -3’;
β-mut 11(M):5’- CCCTGGGCAGTTTGGTATCAAG -3’;
β-mut 12(N):5’- TGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTA -3’;
β-mut 12(M):5’- TGGGCAGGTTGCTATCAAGGTTA -3’;
β-mut 13(N):5’- ACCCTTAGGCTGCTGGTGG -3’;
β-mut 13(M):5’- CACCCTTAGGTGCTGGTGGT -3’;
β-mut 14(N):5’- ACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTT -3’;
β-mut 14(M):5’- GGACCCAGAGGTTGAGTCCTTT -3’;
β-mut 15(N):5’- GAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGG -3’;
β-mut 15(M):5’- GAGGTTCTTTTAGTCCTTTGGGGA -3’;
β-mut 16(N):5’- CGGTGCCTTTAGTGATGGCC -3’;
β-mut 16(M):5’- CGGTGCCTTTAAGTGATGGCC -3’;
β-mut 17(N):5’- CTGGGTTAAGGCAATAGCAATATC -3’;
β-mut 17(M):5’- CTGGGTTAAGGTAATAGCAATATCTC -3’;
N表示正常探针,M表示突变探针。
2.根据权利要求1所述的基于液相芯片系统诊断地中海贫血的试剂盒,其特征在于:所述的试剂盒包括液相芯片和权利要求1所述的PCR引物,液相芯片为权利要求1中所述的探针分别与不同颜色的荧光编码微球偶联后得到的44种偶联好探针的荧光编码微球混合得到。
3.根据权利要求2所述的基于液相芯片系统诊断地中海贫血的试剂盒,其特征在于:所述的液相芯片为将44种偶联好探针的荧光编码微球分散在1.5×TMAC杂交液得到,每种偶联好探针的荧光编码微球的浓度为100个/μl。
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