CN106480222B - 基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的探针、引物、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的探针、引物、检测试剂盒及检测方法。本发明通过将检测遗传性耳聋基因突变的探针分别与不同编码的微珠进行偶联、混合后得到悬浮微珠阵列，然后用本发明的特异性引物对待检样本进行多重PCR扩增，PCR产物与悬浮微珠阵列进行杂交，再用链霉亲和素R‑藻红蛋白进行显色，通过悬浮微珠阵列读取仪读取检测结果。本发明的基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的探针和引物，能同时检测4个主要的遗传性耳聋基因的20个突变位点，可极大地缩短检测时间，提高检测效率和准确性。
Description
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一组基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的探针、引物、检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
听力残疾居我国残疾之首。中国残联公布的“2010年末全国残疾人总数及各类、不同残疾等级人数”显示，我国8502万残疾人当中，听力残疾有2054万人，占比接近1/4。并且新出生的聋儿以每年3万例的速度在增加。中国人耳聋的病因中，遗传因素约占60％。为此进行遗传性耳聋检测能从源头上阻断大部分遗传性耳聋的发生。
遗传性耳聋包括非综合征性耳聋(nonsyndromic hearing impairment，NSHI)和综合征性耳聋(syndromic hearing impairment，SHI)。非综合征性耳聋(NSHI)一般只表现单一的听觉症状，占了遗传性耳聋超过70％的比例。属于常染色体隐性遗传的GJB2基因和SLC26A4基因突变导致的耳聋又占NSHI的80％以上。GJB3基因是我国本土上克隆的第一个遗传疾病耳聋基因。另外，线粒体12S rRNA基因突变会引发氨基糖苷类抗生素引发的耳聋。
因此针对GJB2、GJB3、SLC26A4、12S rRNA基因进行耳聋基因筛查，是社会效益和经济性价比最好的一种遗传性耳聋基因检测方式。目前市面上检测遗传性耳聋基因的技术和产品，也多是针对以上四个基因的突变位点进行检测；例如北京博奥生物有限公司采用基于玻璃基质的基因芯片检测以上4个基因的9个及15个突变位点；广东潮州凯普生物化学有限公司采用基于尼龙膜的导流杂交芯片也是检测以上4个基因的9个突变位点；北京中生北控生物科技公司采用荧光定量PCR方法检测以上4个基因的4个突变位点；等等。这些产品各有其特点，但都存在一定的局限性；例如基于荧光定量方法的耳聋基因检测产品所检测位点太少，容易漏检；基于玻璃基质的基因芯片对DNA量要求较大，使得干血片样本难以满足检测的要求；另一方面，随着最近几年我国研究人员对国人遗传性耳聋基因的研究，发现这4个基因的其他高频致病性突变位点，例如GJB2基因的109G>A突变是高频的致病性突变位点，而这些新发现的突变位点在目前市面上的耳聋基因检测产品中是没有被覆盖的。因此有必要建立一种检测位点较目前产品更多、检测样本通量大、检测灵敏度更高的耳聋基因突变检测方法及产品，以实现对临床大样本人群快速而准确的检测。
悬浮微珠阵列技术是属于生物芯片技术的一种，它不同于玻璃基质或者尼龙膜基质以固体平面来固定支持探针，而是以一种可以在液体中悬浮流动的微珠为介质来固定支持探针，探针就能以流动的方式和样本进行杂交；而固体平面上的探针则是不能流动的，这样悬浮微珠阵列技术中核酸分子的杂交动力学就会优于固态表面的杂交，并且悬浮微珠阵列技术容易实现自动化操作。
悬浮微珠阵列技术的技术核心是微珠的编码和解码。固体平面上的探针是通过有序的行与列的位置关系来实现探针的寻址的；而微珠悬浮阵列技术中，微珠是流动的，自然就无法通过位置来寻址了，因此只能通过对微珠本身进行编码。目前国际上有两种微珠编码技术，一种是Luminex公司的基于红外材料的荧光编码技术，就是把两种红外材料按照不同的配比混合，使之发出不同波段的荧光，达到编码微珠的目的，称为荧光编码，例如99％的A材料+1％的B材料混合后，编码1号微珠；98％的A材料+2％的B材料混合后，编码2号微珠，诸如类推，这样至少可以编码100种微珠。另外一种悬浮微珠技术是Applied BioCode公司的二维编码技术，是通过电脑微加工技术，在硅质的颗粒上蚀刻出不同方向的痕迹，产生横向和纵向的二维编码，最多可产生2的12次方共计4096种编码的微珠。
这两种悬浮微珠阵列技术尽管各自的编码技术不同，但对于临床应用来说，都可以满足一次试验检测指标多、容易自动化操作、单位时间检测样本量多的需求。
发明内容：
本发明的首要目的在于克服现有遗传性耳聋基因检测技术和产品的缺点与不足，提供基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的探针、引物、检测试剂盒及检测方法。
本发明的第一个目的是提供一组基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的探针，其特征在于，所述的探针序列如下所示：
GJB2-512N：5’-ACAAGGCCAGGCGTTGCACTT-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
GJB2-512M：5’-AAGGCCAGGCGTTCGTTGCAC-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
GJB2-299N：5’-CTTCTTCTCATGTCTCCGGTA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
GJB2-299M：5’-TCTTCTTCTCGTCTCCGGTAG-3’(如SEQ ID NO.4所示)；
GJB2-235N：5’-ATCAGCTGCAGGGCCCATAGC-3’(如SEQ ID NO.5所示)；
GJB2-235M：5’-TCAGCTGCAGGCCCATAGC-3’(如SEQ ID NO.6所示)；
GJB2-176N：5’-TAGCACACGTTCTTGCAGCCT-3’(如SEQ ID NO.7所示)；
GJB2-176M：5’-TAGTGATCGTAGCTGGCTGCA-3’(如SEQ ID NO.8所示)；
GJB2-109N：5’-CAGCCACAACGAGGATCAT-3’(如SEQ ID NO.9所示)；
GJB2-109M：5’-CAGCCACAATGAGGATCAT-3’(如SEQ ID NO.10所示)；
GJB2-35N：5’-TTAGTTCACACCCCCCAGGA-3’(如SEQ ID NO.11所示)；
GJB2-35M：5’-TTAGTTCACACCCCCAGGAT-3’(如SEQ ID NO.12所示)；
GJB3-538N：5’-TACATTGCCCGACCTACCG-3’(如SEQ ID NO.13所示)；
GJB3-538M：5’-TACATTGCCTGACCTACCG-3’(如SEQ ID NO.14所示)；
SLC-754N：5’-GGAGTTCTCTCTATTATCT-3’(如SEQ ID NO.15所示)；
SLC-754M：5’-GGAGTTCTCCCTATTATCT-3’(如SEQ ID NO.16所示)；
SLC-7-2N：5’-GTTTTATTTCAGACGATAATT-3’(如SEQ ID NO.17所示)；
SLC-7-2M：5’-GTTTTATTTCGGACGATAATT-3’(如SEQ ID NO.18所示)；
SLC-1174N：5’-GGGATCAGCAACATCTTCT-3’(如SEQ ID NO.19所示)；
SLC-1174M：5’-GGGATCAGCTACATCTTCT-3’(如SEQ ID NO.20所示)；
SLC-1226N：5’-GCTCTTTCCCGCACGGCCGTC-3’(如SEQ ID NO.21所示)；
SLC-1226M：5’-GCTCTTTCCCACACGGCCGTC-3’(如SEQ ID NO.22所示)；
SLC-1229N：5’-CTTTCCCGCACGGCCGTCCAG-3’(如SEQ ID NO.23所示)；
SLC-1229M：5’-TTTCCCGCATGGCCGTCCA-3’(如SEQ ID NO.24所示)；
SLC-1692N：5’-CGATGGTTTTAAAAAATGTAT-3’(如SEQ ID NO.25所示)；
SLC-1692M：5’-GATGGTTTTAAAAAAATGTAT-3’(如SEQ ID NO.26所示)；
SLC-15+5N：5’-TCCACAGTAAGTATTTTATCC-3’(如SEQ ID NO.27所示)；
SLC-15+5M：5’-TCCACAGTAAATATTTTATCC-3’(如SEQ ID NO.28所示)；
SLC-1975N：5’-CCATAGCCTTGTGCTTGACTG-3’(如SEQ ID NO.29所示)；
SLC-1975M：5’-CCATAGCCTTCTGCTTGACTG-3’(如SEQ ID NO.30所示)；
SLC-2027N：5’-TGAGATCACTGCGGGTG-3’(如SEQ ID NO.31所示)；
SLC-2027M：5’-TGAGATCACAGCGGGTG-3’(如SEQ ID NO.32所示)；
SLC-2086N：5’-TGCATCACTTCAAGGTAAATA-3’(如SEQ ID NO.33所示)；
SLC-2086M：5’-TGCATCACTTTAAGGTAAATA-3’(如SEQ ID NO.34所示)；
SLC-2168N：5’-TGACGGTCCATGATGCTAT-3’(如SEQ ID NO.35所示)；
SLC-2168M：5’-TGACGGTCCGTGATGCTAT-3’(如SEQ ID NO.36所示)；
12S-1494N：5’-GCCCGTCACCCTCCTCAAG-3’(如SEQ ID NO.37所示)；
12S-1494M：5’-GCCCGTCACTCTCCTCAAG-3’(如SEQ ID NO.38所示)；
12S-1555N：5’-ATAGAGGAGACAAGTCGTA-3’(如SEQ ID NO.39所示)；
12S-1555M：5’-ATAGAGGAGGCAAGTCGTA-3’(如SEQ ID NO.40所示)；
其中，N表示野生型探针；M表示突变型探针；探针的5’端连接有连接臂。连接臂上的-NH2可以和微珠上的-COOH发生化学缩合反应，使得探针连接到微珠上。
优选，所述的连接臂为NH2-C18连接臂。
本发明的第二个目的是提供一组基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的引物，其特征在于，所述的引物序列如下所示：
deaf-1F：5’-GACACAAAGCAGTCCACA-3’，deaf-1R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCTTCTATGTCATGTACGACGG-3’；
deaf-2F：5’-TTTTGATCTCCTCGATGTCCT-3’，deaf-2R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCCCGACTTTGTCTGCAACAC-3’；
deaf-13F：5’-TTTTGATCTCCTCGATGTCCT-3’，deaf-13R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCCGCTCCTAGTGGCCATGC-3’；
deaf-3F：5’-CTCATCTCCCCACACCTCCT-3’，deaf-3R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCGCCCAGAGTAGAAGATGGAT-3’；
deaf-4F：5’-CACTCTCTGGCATGGCTT-3’，deaf-4R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCATGAGGTAGCAGAGCTCACA-3’；
deaf-5F：5’-TTGCAGATTGGATTCATAGTGAG-3’，deaf-5R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCAATGAACAGTGACCCATC-3’；
deaf-6F：5’-AGTTCAGCATTATTTGGTTGACA-3’，deaf-6R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCGGAACACCACACTCACCC-3’；
deaf-7F：5’-TGAAATACTCAGCGAAGGTCT-3’，deaf-7R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCTCTGTTGCCATTCCTCGAC-3’；
deaf-8F：5’-CCTCTGAGCAACTGTGAC-3’，deaf-8R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCGGCCTATTCCTGATTGGAC-3’；
deaf-9F：5’-GTGCCAATCCATAGCCTT-3’，deaf-9R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCACCCACATCATTTTACTATTGC-3’；
deaf-10F：5’-TGCTACTGAATTATGGGCAGA-3’，deaf-10R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCCCCAGATAGGAGAAAGGGCTT-3’；
deaf-11F：5’-TGATAGAAAAGCTGGAGCAAT-3’，deaf-11R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCAAAATGGAACCTTGACCCTC-3’；
deaf-12F：5’-CCCCAGAAAACTACGATAGCC-3’，deaf-12R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCCAGGTTTCAATTTCTATCGCCTA-3’；
deaf-Tag：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCC-3’；
在与上述的探针的互补序列的引物的5’端进行生物素修饰。
本发明的第三个目的是提供一种基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的检测试剂盒，其特征在于，包括上述的基于悬浮微珠阵列系统诊断遗传性耳聋的探针和上述的基于悬浮微珠阵列系统诊断遗传性耳聋的引物。
优选，所述的检测试剂盒还包括多重PCR反应液、DNA聚合酶和微珠。
优选，所述的微珠为荧光编码微珠或者二维编码微珠。所述的荧光编码微珠优选为美国Luminex公司的表面羧基修饰的微珠。
本发明的第四个目的是提供一种基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)悬浮微珠阵列的制备：将上述的探针分别与不同编码的微珠偶联；然后根据检测目的将偶联探针的微珠混合，得到悬浮微珠阵列；
2)样本PCR扩增：提取待测样本基因组DNA，利用上述的引物对样本基因组DNA进行多重PCR扩增，得到PCR产物；
3)将PCR产物与悬浮微珠阵列进行杂交，得到杂交产物，再用链霉亲和素R-藻红蛋白对杂交产物进行标记，通过悬浮微珠阵列检测仪读出检测结果，判断样本中的基因突变位点。
优选，所述的多重PCR扩增，其PCR反应体系为25μL；包括1×PCR缓冲液、dNTPs0.2mM、Mg2+2mM、1U Taq DNA聚合酶，基因组DNA25ng，上述的引物各0.2μM；PCR扩增程序为：37℃10min；95℃10min；95℃30s，52℃60s，65℃60s，30次循环；95℃30s，65℃45s，72℃45s，25次循环；72℃5min。
本发明的基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的优点包括：①由于微珠上的探针和待检的PCR产物都能处于液体悬浮流动状态，因此杂交动力学较固相基因芯片好，结果稳定；②检测耗时短，操作步骤简单，整个检测流程能在6个小时内完成；③自动化程度和检测通量高，整个反应可以在96孔板中完成，中间手工操作步骤少，一次可以同时检测96个样品；④可以在一次测试中同时检测4个主要的遗传性耳聋基因的20个突变位点，较目前市面上所用的荧光定量PCR和基因芯片方法要多；⑤结果通过数字化方式呈现，不受人为主观影响。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例：
本发明基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的引物和探针，可以兼容两种悬浮微珠阵列系统来检测遗传性耳聋基因突变，在一次试验中可实现对GJB2基因6个位点(235delC、299_300delAT、35delG、176_191del16、512insAACG、109G>A)；GJB3基因1个位点(538C>T)；SLC26A4基因11个位点(IVS7-2A>G、2168A>G、1174A>T、1229C>T、1226G>A、1975G>C、2027T>A、IVS15+5G>A、1693insA、754T>C、2086C>T)；线粒体12S rRNA基因2个位点rRNA(1494C>T、1555A>G)共计20个突变位点的检测。
1、多重PCR引物设计
为了实现对20个遗传性耳聋基因突变位点的检测，一共需要进行20重PCR扩增。这20个突变位点对应的PCR引物序列见表1，其中，反向引物(R)的5’端加有一段通用引物(deaf-Tag)。在与探针互补序列的PCR引物的5’端进行生物素修饰。
表1多重PCR引物序列
注：F表示正向引物；R表示反向引物
2、探针设计
本发明一共设计了40条探针，包括针对20个突变位点设计的40条探针，即每个突变位点设计一条野生型探针(N)和一条突变型探针(M)(如表2所示)。探针的5’端连接有NH2-C18连接臂，氨基可以微珠上的羧基反生缩合反应将探针连接到微珠上。
表2探针序列
注:N表示野生型探针；M表示突变型探针，探针的5’端连接有NH2-C18连接臂
3、悬浮微珠阵列的制备
将荧光编码微珠(或者二维编码微珠)与表2所述的探针分别偶联，然后根据检测目的将偶联好探针的编码微珠混合，得到悬浮微珠阵列。按照一万人份理论量计算，一种探针与一个编码的微珠进行偶联，具体实验步骤为：
a、从-20℃取出密封干燥保存的二氯乙烷(EDC)粉末，使其恢复至室温。
b、融化已配置好的100μM的探针溶液，涡旋5s混匀并3000rpm离心30s。
c、轻柔涡旋悬浮原料检验合格的微珠(2-8℃储存)，超声处理30-60s。
d、取1.5mL低吸附离心管编好号(微珠编号+探针号)固定于磁力架上，将微珠轻柔颠倒5-10次，避免剧烈震荡，移液器反复吹吸3次后吸取12.5×106个(1mL)微珠，靠磁力架内壁加至对应离心管中，吸附1min。
e、小心移去上清(左手往磁力架方向压住管身，右手缓慢吸净上清，枪头始终应尽量靠远离磁力架方向，若有微珠跟进枪头，则需重新吹打均匀，待其重新吸附后再次尝试)；加入60μL 0.1M，pH＝4.5的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)溶液，超声处理30-60s，涡旋5s混匀，得到偶联体系。
f、在偶联体系中加入15μL 100μM探针。
g、称量10mg的EDC粉末至于1.5mL离心管管中，加入1mL纯水至终浓度10mg/mL，涡旋5s混匀，立即取10μL加入到偶联体系中，涡旋5s混匀。
h、偶联体系室温避光孵育30min，期间每隔10min涡旋5s混匀。
i、重复步骤G和H两次。
j、加入1mL 0.02％Tween-20，涡旋5s混匀，3000rmp离心1min，上磁力架1min。
k、轻轻开盖并小心移除上清，加入1mL 0.1％SDS，涡旋5s重悬，3000rmp离心1min，上磁力架1min。
l、轻轻开盖并小心移除上清，加入500μL 1×TE(pH8.0，包括10mM Tris-HCl和1mMEDTA)超声处理30-60s后涡旋5s重悬。
m、取1μL稀释100倍用细胞计数板在显微镜下进行计数(有自动计数仪亦可)，计算回收率计算微珠总数。
n、每种微珠根据两种不同的系统要求进行混合配制(Luminex公司的微珠按照每人份每种微珠2000颗进行混合；Applied BioCode公司的微珠按照每人份每种微珠50颗进行混合)，得到悬浮微珠阵列。
o、2-8℃避光保存，有效期14个月。
4、样本检测：
从样本中提取基因组DNA，以表1中的PCR引物进行多重PCR扩增(还可以根据检测目的选择表1所示的引物进行多重PCR扩增)，得到PCR产物(待分析的目标片段)。
多重PCR反应体系：包括1×PCR缓冲液、dNTPs 0.2mM、Mg2+2mM、1U Taq DNA聚合酶，基因组DNA25ng，表1的多重PCR引物各0.2μM，dd H2O补足至25μL。
PCR扩增程序如表3所示：
表3 PCR扩增程序
取步骤3所配制的悬浮微珠阵列，分装至96孔板中，每孔45μL(包含有40种编码的微珠，每种微珠各2000个)，然后加入5μL的PCR产物；在95℃变性5min后，60℃杂交15min，得到杂交产物，然后加入25μL 1×TMAC杂交液稀释的链霉亲和素R-藻红蛋白0.04μg(1×TMAC杂交液包括3M TMAC、质量体积比0.1％的十二烷基肌氨酸钠、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、4mMEDTA(pH 8.0))，吸打10-20下以充分混匀，于60℃显色7min。
用Luminex公司的悬浮微珠阵列读取仪对显色后的杂交产物的微珠进行解码并读取各探针的荧光信号值MFI(检测温度设定为60℃，检测体积为50μL)，同时通过Luminex附带XPonent 3.1数据收集软件获得突变型探针(M)和野生型探针(N)的探针信号值的比值(N/M)，结果如表4～8所示。根据基因突变位点判断标准(如表9所示)，对表4～8的检测结果进行判断分析，24个样本的突变位点分析结果见表10。如果微珠为二维编码微珠就用Applied BioCode公司的悬浮微珠阵列读取仪对微珠进行解码并读取各探针的荧光信号值MFI。
表4 24个样本的检测结果
表5 24个样本的检测结果
表6 24个样本的检测结果
表7 24个样本的检测结果
表8 24个样本的检测结果
表9判断标准
表10 24个样本的突变位点分析结果
可见，本发明能准确检出遗传性耳聋患者。使用本发明所述的方法和试剂盒，约6小时能得出结果。现在临床上使用的Sanger方法，需要2日才能完成。而且，对于大样本量检测，本发明与Sanger测序方法相比，更具有优势。
应用本发明所述的方法和试剂盒对230例的样本进行了检测，与经典的测序方法比较准确率达100％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州中心法则生物科技有限公司
<120> 基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的探针、引物、检测试剂盒及检测方法
<160> 40
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acaaggccag gcgttgcact t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaggccaggc gttcgttgca c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttcttctca tgtctccggt a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcttcttctc gtctccggta g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atcagctgca gggcccatag c 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcagctgcag gcccatagc 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tagcacacgt tcttgcagcc t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tagtgatcgt agctggctgc a 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cagccacaac gaggatcat 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cagccacaat gaggatcat 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttagttcaca ccccccagga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttagttcaca cccccaggat 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tacattgccc gacctaccg 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tacattgcct gacctaccg 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggagttctct ctattatct 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggagttctcc ctattatct 19
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gttttatttc agacgataat t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gttttatttc ggacgataat t 21
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gggatcagca acatcttct 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gggatcagct acatcttct 19
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gctctttccc gcacggccgt c 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gctctttccc acacggccgt c 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctttcccgca cggccgtcca g 21
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tttcccgcat ggccgtcca 19
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cgatggtttt aaaaaatgta t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gatggtttta aaaaaatgta t 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tccacagtaa gtattttatc c 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tccacagtaa atattttatc c 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ccatagcctt gtgcttgact g 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ccatagcctt ctgcttgact g 21
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tgagatcact gcgggtg 17
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tgagatcaca gcgggtg 17
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tgcatcactt caaggtaaat a 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tgcatcactt taaggtaaat a 21
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tgacggtcca tgatgctat 19
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tgacggtccg tgatgctat 19
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gcccgtcacc ctcctcaag 19
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gcccgtcact ctcctcaag 19
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
atagaggaga caagtcgta 19
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
atagaggagg caagtcgta 19
Claims (4)
1.一种基于悬浮微珠阵列系统检测遗传性耳聋的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下引物和探针：
所述引物如下：
deaf-1F：5’-GACACAAAGCAGTCCACA-3’，
deaf-1R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCTTCTATGTCATGTACGACGG-3’；
deaf-2F：5’-TTTTGATCTCCTCGATGTCCT-3’，
deaf-2R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCCCGACTTTGTCTGCAACAC-3’；
deaf-13F：5’-TTTTGATCTCCTCGATGTCCT-3’，
deaf-13R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCCGCTCCTAGTGGCCATGC-3’；
deaf-3F：5’-CTCATCTCCCCACACCTCCT-3’，
deaf-3R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCGCCCAGAGTAGAAGATGGAT-3’；
deaf-4F：5’-CACTCTCTGGCATGGCTT-3’，
deaf-4R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCATGAGGTAGCAGAGCTCACA-3’；
deaf-5F：5’-TTGCAGATTGGATTCATAGTGAG-3’，
deaf-5R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCAATGAACAGTGACCCATC-3’；
deaf-6F：5’-AGTTCAGCATTATTTGGTTGACA-3’，
deaf-6R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCGGAACACCACACTCACCC-3’；
deaf-7F：5’-TGAAATACTCAGCGAAGGTCT-3’，
deaf-7R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCTCTGTTGCCATTCCTCGAC-3’；
deaf-8F：5’-CCTCTGAGCAACTGTGAC-3’，
deaf-8R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCGGCCTATTCCTGATTGGAC-3’；
deaf-9F：5’-GTGCCAATCCATAGCCTT-3’，
deaf-9R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCACCCACATCATTTTACTATTGC-3’；
deaf-10F：5’-TGCTACTGAATTATGGGCAGA-3’，
deaf-10R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCCCCAGATAGGAGAAAGGGCTT-3’；
deaf-11F：5’-TGATAGAAAAGCTGGAGCAAT-3’，
deaf-11R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCAAAATGGAACCTTGACCCTC-3’；
deaf-12F：5’-CCCCAGAAAACTACGATAGCC-3’，
deaf-12R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCCAGGTTTCAATTTCTATCGCCTA-3’；
deaf-Tag：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCC-3’；
所述探针如下：
GJB2-512N：5’-ACAAGGCCAGGCGTTGCACTT-3’；
GJB2-512M：5’-AAGGCCAGGCGTTCGTTGCAC-3’；
GJB2-299N：5’-CTTCTTCTCATGTCTCCGGTA-3’；
GJB2-299M：5’-TCTTCTTCTCGTCTCCGGTAG-3’；
GJB2-235N：5’-ATCAGCTGCAGGGCCCATAGC-3’；
GJB2-235M：5’-TCAGCTGCAGGCCCATAGC-3’；
GJB2-176N：5’-TAGCACACGTTCTTGCAGCCT-3’；
GJB2-176M：5’-TAGTGATCGTAGCTGGCTGCA-3’；
GJB2-109N：5’-CAGCCACAACGAGGATCAT-3’；
GJB2-109M：5’-CAGCCACAATGAGGATCAT-3’；
GJB2-35N：5’-TTAGTTCACACCCCCCAGGA-3’；
GJB2-35M：5’-TTAGTTCACACCCCCAGGAT-3’；
GJB3-538N：5’-TACATTGCCCGACCTACCG-3’；
GJB3-538M：5’-TACATTGCCTGACCTACCG-3’；
SLC-754N：5’-GGAGTTCTCTCTATTATCT-3’；
SLC-754M：5’-GGAGTTCTCCCTATTATCT-3’；
SLC-7-2N：5’-GTTTTATTTCAGACGATAATT-3’；
SLC-7-2M：5’-GTTTTATTTCGGACGATAATT-3’；
SLC-1174N：5’-GGGATCAGCAACATCTTCT-3’；
SLC-1174M：5’-GGGATCAGCTACATCTTCT-3’；
SLC-1226N：5’-GCTCTTTCCCGCACGGCCGTC-3’；
SLC-1226M：5’-GCTCTTTCCCACACGGCCGTC-3’；
SLC-1229N：5’-CTTTCCCGCACGGCCGTCCAG-3’；
SLC-1229M：5’-TTTCCCGCATGGCCGTCCA-3’；
SLC-1692N：5’-CGATGGTTTTAAAAAATGTAT-3’；
SLC-1692M：5’-GATGGTTTTAAAAAAATGTAT-3’；
SLC-15+5N：5’-TCCACAGTAAGTATTTTATCC-3’；
SLC-15+5M：5’-TCCACAGTAAATATTTTATCC-3’；
SLC-1975N：5’-CCATAGCCTTGTGCTTGACTG-3’；
SLC-1975M：5’-CCATAGCCTTCTGCTTGACTG-3’；
SLC-2027N：5’-TGAGATCACTGCGGGTG-3’；
SLC-2027M：5’-TGAGATCACAGCGGGTG-3’；
SLC-2086N：5’-TGCATCACTTCAAGGTAAATA-3’；
SLC-2086M：5’-TGCATCACTTTAAGGTAAATA-3’；
SLC-2168N：5’-TGACGGTCCATGATGCTAT-3’；
SLC-2168M：5’-TGACGGTCCGTGATGCTAT-3’；
12S-1494N：5’-GCCCGTCACCCTCCTCAAG-3’；
12S-1494M：5’-GCCCGTCACTCTCCTCAAG-3’；
12S-1555N：5’-ATAGAGGAGACAAGTCGTA-3’；
12S-1555M：5’-ATAGAGGAGGCAAGTCGTA-3’；
其中，N表示野生型探针；M表示突变型探针；探针的5’端连接有连接臂；
在与上述探针的互补序列的引物的5’端进行生物素修饰。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的连接臂为NH2-C18连接臂。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括多重PCR反应液、DNA聚合酶和微珠。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的微珠为荧光编码微珠或者二维编码微珠。
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